Niklas Dahrén

Analysera gifter, droger och läkemedel med högupplösande

vätskekromatografi (HPLC)

GC och HPLC

ü GC=”gaschromatography”ellerpåsvenska”gaskromatografi”.

ü HPLC=”high performance liquid chromatography”ellerpåsvenska”högupplösandevätskekromatografi”.

ü HPLCärenavanceradform avvätskekromatografi.Detfinnsävenandraenklareochmerbegränsadeformeravvätskekromatografi,t.ex.papperskromatografi,tunnskiktskromatografi,jonbyteskromatografiochgelfiltrering.

ü Namnet”kromatografi”kommeravdetgrekiskaordet”chroma” sombetyderfärg.Ibörjananvändeskromatografiska metoderendastförfärgadeämnenmennuanvändsdessaäventillofärgadeämnensånamnetärdärförlitemissvisande.

Vad används GC och HPLC till?

1. Separera(rena)olikaämnensomfinnsiettprov:Vikanskeharettprovsominnehållerettstortantalolikaämnen,menviärenbartintresseradeavettavdessaämnen.VikandåanvändaGCellerHPLCförattsepareraämnenafrånvarandraochdärmed”isolera”detämneviäruteefter.

2. Undersökavilkaokändaämnensomfinnsiettprov:Vikanidentifieraokändaämnen(t.ex.gifter,droger,dopingpreparat,miljögifterellerläkemedel)meddessametoder.OmvidessutomkopplarvårGCellerHPLCtillenmasspektrometer(enspecielldetektor)fårviettmycketkraftfulltverktygförattidentifieraokändaämnen.

3. Bestämmakoncentrationenavolikaämnensomfinnsiettprov:GCochHPLCkanocksåanvändaskvantitativtförattmätakoncentrationenavdeämnensomfinnsiettprov.

4. Renhetstester:Vikanundersökaomettprovärförorenatmedandraämnensomintebörfinnasdär(t.ex.renhetstesteravläkemedelellerlivsmedel).

3 saker är gemensamt för både GC och HPLC

ü Prov:IbådeGCochHPLCtillsättsettprovinnehållandeolikaämnensomskaanalyseras.

ü Mobilfas:IbådeGCochHPLCfinnsens.k.mobilfas(rörligfas).DenmobilafaseniGCbeståravengas(helium,kvävgasellervätgas)medandeniHPLCbeståravenvätska(enblandningavolikaämnen).Syftetmeddenmobilafasenäratttransporteraprovetgenomgas- ellervätskekromatografen,alltsågenomdenmaskinsomskautförasjälvaanalysen.

ü Stationärfas:IbådeGCochHPLCfinnsenkolonn(ettihåligtrör)sompåinsidanärbekläddmedenstationärfas(stillaståendefas)sombeståravolikamolekyler.Denstationärafasenkanvaraifastformellerbeståaventrögflytandevätska.Molekylernasuppgiftidenstationärafasenärattbindatilldeolikaämnenaiprovetsåattdessaämnenbromsasuppinutikolonnen.Vissaämnenkanbindamycketstarkaretillmolekylernaidenstationärafasenochtardärförlängretidpåsiggenomkolonnen.

Principen bakom HPLC

Detektor

Pump

Mobilfas

Ikolonnenseparerasämnenaiprovetfrånvarandraeftersomolikaämnenbinderolikalätttilldenstationärafasenikolonnenochkommerdärförutvidolikatidpunkter.Antingenanvändsenpolärelleropolärstationärfasikolonnen.Polärkolonnomdenmobilafasenäropolär,opolärkolonnomdenmobilafasenärpolär.

Iinjektorntillsättsprovet.

Injektor

Enpumpsompumpardenmobilafasenochprovetgenomhelasystemet.

Detektorngörettkromatogramdärvarjetoppmotsvararettämneiprovet

Detektorn”kännerav”närmolekylernaavettämnepasserarochregistrerarämnetsretentionstidochsignalstyrkan(hurmycketdetfinnsavämnet).

Behållaremeddenmobilafasen(vätska).Denmobilafasenärantingenpolärelleropolär.

Kolonnmedstationärfas

En högupplösande vätskekromatograf (HPLC)

Exempel på ett kromatogram

Bildkälla:"Hplc-perfume-chromatogram"byLukke - Own work.Licensed underCCBY-SA3.0viaCommons -https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Hplc-perfume-chromatogram.png#/media/File:Hplc-perfume-chromatogram.png

Retentionstiden

Intensite

ten(signa

lstyrkan)

ü Retentionstiden:Retentionstidenärspecifikförvarjeämneiettgivetsystemochdärförkanvianvändaretentionstidenförattidentifieraolikaämnen(kvalitativanalys).

ü Toppensarea:Detektornmäterintensiteten(signalstyrkan)avvarjeämnesompasserar,vilketmotsvararhurmångamolekyleravämnetsompasserardetektorn.Utifråndetritasentopputikromatogrammet därareanavtoppenmotsvararhurhögkoncentrationviharämnet(kvantitativanalys).

Exempel: Analys av droger i ett urinprov med hjälp av HPLC

Bildkälla:ByJamesHeilman,MD(Own work)[CCBY-SA3.0(http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)],viaWikimediaCommons.http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/29/Pyuria2011.JPG.

ü Dekemiskaforensikerna påNationelltforensisktcentrum(NFC)iLinköpingfårtilluppgiftattanalyseraetturinprovfrånenpersonsommisstänkshaintagitnågonformavdrog.

ü Forensikerna väljerattanalyseraprovetmedhjälpavHPLC.

Kända retentionstider för några utvalda ämnen

Utseende: Namn: Retentionstid(min):

Urinämne 2,5

Kokain 6,0

Anabola steroider 8,2

Amfetamin 8,9

ü Innandeutföranalysentardeframentabellmedkändaretentionstiderfördeämnendemisstänkerkanfinnasiurinprovet(obs.påhittaderetentionstider!).Genomattjämföradeerhållnaretentionstidernameddekändasåkandelistautvilkaokändaämnensomfinnsiurinprovet.

Vilket eller vilka ämnen finns i urinprovet?

Ämnensompasserardetektorn:

Retentionstid(min): Identifiering avämnena:

6,0

Slutsats:Urinprovetinnehållerurinämneochkokain.

2,5

Kokain

Urinämne

Stationärfas

StationärfasDetektorn

Kromatogram av urinprovet

02468

101214

1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 Retentionstiden

Intensiteten

Urinämne(urea)

Kokain

Separationen i HPLC sker utifrån polaritet ü Poläramolekyler/ämnen:Poläramolekylerärmolekylersomharensida/delavmolekylensomärpartiellt

positivtladdadochensida/delsomärpartielltnegativtladdad.Poläramolekylerochdipoleräriprincipsammasak.

ü Poläramolekylerkanskapavätebindningarellervanligadipol-dipolbindningar(ochvander Waals-bindningarsomallamolekylerkanskapa).Opolära molekylerkanenbartskapavander Waalsbindningar.

δ+

δ-

δ+

δ-

Metanol Vatten Dietyleter

δ+

δ-

Separationen i HPLC sker utifrån polaritet ü Polaritet:Molekylerkanvarapoläraelleropolära.Dennaindelningärdockintesvartellervitutanvissa

molekylerärmerpoläraänandra.Destomerpoläramolekylernaärdestohögrepolaritetsägermanattdessahar.Polaritetenbestämsbl.a.avhurmångaochhurstarkavätebindningarmolekylenkanskapa,hurlångkolvätekedjamolekylenhar(lång=lägrepolaritet)ochavhurtydligtdipolmomentet är(avståndetmellanladdningarnaochstorlekenavdepartiellaladdningarna).

ü Poläramolekylerkanlösasigivatten:Poläramolekyler,somkanskapavätebindningar,kanlösasigbraivatten.Vattenmolekylerharsjälvvätebindningarmellansinamolekyleroch”trivs”därförmedandraämnensomocksåkanerbjudastarkavätebindningar.Poläraämnensomenbartkanerbjudavanligadipol-dipolbindningarmedvattenharmycketmindrelöslighet.Opolära ämnenlösersigdockinteallsivatten.

δ+

δ-

Metanolärettpolärtämneeftersomdenp.g.a.OH-gruppenharensida/delsomärpartielltpositivtladdadochensida/delsomärpartielltnegativtladdad.OH-gruppenmöjliggörocksåförmetanolattskapavätebindningartillandrametanolmolekylerellertillandramolekylersomocksåkanskapavätebindningar,t.ex.tillvattenmolekyler.Metanolharhöglöslighetivatteneftersommetanolkanskapavätebindningarmedvatten.

δ+δ-

Metanolmolekyl

VattenmolekylVätebindning

Ämnen med OH-grupper har ofta en hög polaritet och kan skapa vätebindningar

ü ÄmnenmedOH-grupperharoftaenhögpolaritet:OH-gruppeninnehållerensyreatommedhögelektronegativitetsomdrartillsigbindningslektronernasomfinnsmellansyretochvätetvilketledertillettpartielltnegativtladdatsyreochettpartielltpositivtladdatväte.

ü MolekylermedOH-grupperkanskapavätebindningarmellanvarandraeftersomettpartielltpositivtvätepådenenamolekylenkanbindatillettpartielltnegativtsyreochettavdessfriaelektronparpådenandramolekylen(Hydro-FON-regelnäruppfylld).DestoflerOH-grupper,destoflervätebindningarkanmolekylenskapa.

Propantriol(glycerol):Molekylvikt:92,1uKokpunkt:290 °C

Pentanol:Molekylvikt:88,1uKokpunkt:138 °C

Heptan:Molekylvikt:100,2uKokpunkt:98,4 °C

Högpolaritet Medelhögpolaritet Ingenpolaritet(opolär)

HPLC-analyser kan utföras på 2 olika sätt

1. Normal-fas-kromatografi(polärkolonn):Poläraämnenbindermedstarkavätebindningar(ellerdipol-dipolbindningar)tilldenpolärastationärafasenoch”bromsas”därförmestikolonnen.Opoläraämnenbinderintelikastarkttilldenstationärafasenochåkerdärförutförstgenomkolonnen.

2. Omvänd-fas-kromatografi(opolärkolonn):OpoläraämnenbeståroftaavlångakolvätekedjorochkandärförskaparelativtstarkavanderWaalsbindningartilldenopolärastationärafasensomocksåbeståravlångakolvätekedjor.Samtidigt”trivs”depoläraämnenabättreidenmobilafaseneftersomdekanbindatillämnenaidenmedstarkavätebindningar(ellerdipol-dipolbindningar).Dettasammantagetledertillattdepoläraämnenaåkerutförstgenomkolonnen.

ü Förattlättareförståskillnadenmellande2varianternasåtestarviattköraettprovbeståendeavföljande3ämnenienHPLCmedpolärresp.opolärkolonn:

HPLC-analyser kan utföras på 2 olika sätt

Högstpolaritetförst

Polärstationärfas(OH-grupper)

Omvänd-fas-kromatografi(reversed phase)

Normal-fas-kromatografi(straight-phase)Opolärmobilfas (t.ex.enblandningavhexanochkloroform)

Polärmobilfas(t.ex.enblandningavvattenochmetanol)

Lägstpolaritetförst

Opolärstationärfas(kolväten,t.ex.C18)

Obs.Demobilafasernabeståravblandningaravolikaämnenmedolikapolaritet.Vivillnämligenintehaenmobilfassomär100%poläreller100%opoläreftersomallaämnentillslutskakunnatasigigenomkolonnen.Efteretttagkanmanocksåförändrapolaritetenavdenmobilafasenföratt”lockaut”deämnensomsitterväldigthårtbundnatilldenstationärafasen.

Glycerolkanbindamedmångastarkavätebindningartilldenpolärastationärafasen.Fårlängstretentionstid.

Heptan kanejbindamedvätebindningar(ellervanligadipol-dipolbindningar)tilldenpolärakolonnen.Heptan kandäremotskaparelativtstarka(många)vanderWaalsbindningarmeddeopoläramolekylernaidenmobilafasen.Fårkortastretentionstid.

Glycerolkanbindamedmångastarkavätebindningartillmolekylernaidenpoläramobilafasen.Fårkortastretentionstid.

Heptan kanejbindamedvätebindningar(ellervanligadipol-dipolbindningar)tillmolekylernaidenpoläramobilafasen.Däremotkanheptan skaparelativtstarka(många)vanderWaalsbindningarmeddelångakolvätenaidenopolärastationärafasen.Fårlängstretentionstid.

Pentanol kanskapavätebindningartilldenstationärafasen,menintelikamångasomglycerol.Harävenenganskalångkolvätekedjaochkanskaparelativtstarka(många)vander Waalsbindningar tilldenmobilafasen.Fårdärförenmedellångretentionstid.

Pentanol kanskapavätebindningartilldenmobilafasen,menintelikamångasomglycerol.Harävenenganskalångkolvätekedjaochkanskaparelativtstarka(många)vander Waalsbindningar tilldenstationärafasen.Fårdärförenmedellångretentionstid.

Uppgift 1: Ett prov med okända ämnen analyseras med hjälp av HPLC (opolär kolonn). Tre retentionstider erhålls; 2,5, 7,7 och 12,3. Kemisterna

identifierar nedanstående tre ämnen i provet. Men vilken retentionstid tillhör vilket ämne?

Pentan Butanol2-metylbutan

Pentan:OpolärmolekylmedavlångstrukturvilketmöjliggörflervanderWaalsbindningar medmolekylernaidenstationärafasen,ijämförelsemed2-metylbutan.Harretentionstiden;12,3.

2-metylbutan:Opolärmolekylmedenmersfärsisk/rundformijämförelsemedpentan.Antaletvander Waalsbindningarmedmolekylernaidenstationärafasenblirdärförfärre.Harretentionstiden;7,7.

Butanol:Polärmolekyl(OH-grupp)vilketmöjliggörvätebindningarmeddepoläramolekylernaidenmobilafasen.Binderalltsåstarkasttilldenmobilafasenochkommerutförst.Harretentionstiden;2,5.

Lösning:Kolonneninnehållerenopolär stationärfas.Detinnebärsamtidigtattdenmobilafasenärpolär.Opolära ämnen(oftakolväten)kanbindastarkaretilldenopolära stationärafasenikolonnenäntilldepoläramolekylernaidenmobilafasen(kanskapamångavander Waalsbindningar meddelångakolvätenaidenstationärafasen).Samtidigt”trivs”depoläraämnenbättreidenmobilafaseneftersomdekanbindatilldenmedstarkavätebindningar(alt.vanligadipol-dipolbindningar).

Uppgift 2: Ett prov med okända ämnen analyseras med hjälp av HPLC (polär

kolonn). Vilket ämne kommer få kortast retentionstid?

Butan ButanolGlycerol

Butan:Opolärt ämnep.g.a.enbartkol- ochväteatomer,kanejbildavätebindningarellerdipol-dipolbindningarmeddenpolärakolonnen.Kandäremotskaparealtivt starka(många)vander Waalsbindningar meddeopolära ämnenaidenmobilafasen.Kortastretentionstid.

Glycerol:Glycerolärettmycketpolärtämnep.g.a.3OH-grupper.Glycerolkandärförbildamångavätebindningarmeddenpolärakolonnen.Högstretentionstid.

Butanol:Polärtämne p.g.a.1OH-grupp.Kanbildavätebindningarmeddenpolärakolonnen.Dockfärrevätebindningaränglycerolochbromsasdärförintelikamycketinutikolonnen.Medellångretentionstid.

Lösning:IenHPLCmedenpolärkolonnkommerdetämnesomharhögstpolaritetbromsasuppmestikolonneneftersomdetämnetkanskapastarkastoch/ellerflestbindningartilldenpolärastationärafasenikolonnen.

Uppgift 3: Ett prov med okända ämnen analyseras med hjälp av HPLC (opolär kolonn). Tre retentionstider erhålls; 3,5, 8,2 och 11,7. Kemisterna

identifierar nedanstående tre ämnen i provet. Men vilken retentionstid tillhör vilket ämne?

Heptanol ButanolEtanol

Heptanol:HarenOH-grupp,menharävenenlångkolvätekedjavilketinnebärattpolaritetenärganskalågtrotsOH-gruppen.Denlångakolvätekedjankanskapamångavander Waalsbindningar meddenopolära kolonnen.Bromsasdärföruppmestikolonnenavde3ämnena.Harretentionstiden;11,7.

Etanol:HarenOH-gruppochenkortkolvätekedja.Hardärförhögstpolaritetochbinderstarkttilldenpoläramobilafasen.KaninteskapasåmångavanderWaalsbindningar tilldenopolärakolonnen.Harretentionstiden;3,5.

Butanol:HarenOH-gruppochenganskalångkolvätekedja.Hardärförmedelhögpolaritet.Kanskapaganskamångavander Waalsbindningar meddenopolära kolonnen.Harretentionstiden;8,2.

Lösning:Kolonneninnehållerenopolär stationärfas.Detinnebärsamtidigtattdenmobilafasenärpolär.AllaovanståendeämnenharenOH-grupp.Dekanalltsåskapavätebindningar.Skillnadenmellanämnenaärhurlångkolvätekedjanär.EnlångkolvätekedjainnebärattmolekyleninteblirsåpolärtrotsförekomstenavenOH-grupp.Depoläramolekylernasomfinnsidenpoläramobilafasen”störs”avdenlångakolvätekedjanochvilldärförintesågärnaskapavätebindningarmeddentypenavmolekylerutanbinderdåhellremedvätebindningartillandramolekyler.SamtidigtsåkommerdenlångakolvätekedjankunnaskapamångavanderWaalsbindningar meddenopolära kolonnen.Dettatillsammansledertillattmolekylermedlångakolvätekedjorbinderhellretilldenopolära stationärafasenjämförtmeddenpoläramobilafasen,trotsförekomstenavenOH-grupp.

För den bästa kvalitativa analysen krävs dock en masspektrometer som detektor

ü Mångaproverärkomplexaochinnehållerettstortantalämnenmedlikartaderetentionstider.DessaärdärförsvåraattidentifieramedenbartGCellerHPLCkoppladtillen”vanlig”detektor.OmvidäremotkopplarvårGCellerHPLCtillendetektorsomheter”masspektrometer”(MS)såkommervifåettmycketkraftfulltverktyg.DessaanalysmetoderkallasförGC-MSresp.HPLC-MS.

ü Medhjälpavenmasspektrometerkanmassanavdeolikaämnenaiprovetbestämmas.Masspektrometernkanäven”lista”utvilkadelarsomfinnsideolikaämnenasmolekylereftersommolekylerna”slåssönder”imindrebeståndsdelarochsedanvägsvarjebeståndsdel.Varjebeståndsdelimolekylenkandåidentifierasochvikangöraenstrukturbestämningavhelamolekylen.Masspektrometernskaparpådettasättettkemisktfingeravtryckförvarjeämne.Därmedkanviidentifieraheltnyaämnen(t.ex.heltnyadroger).

Vad är de viktigaste skillnaderna mellan GC och HPLC?

ü Olikamobilafaser:Igaskromatografianvändsengassommobilfas(helium,kvävgasellervätgas)medanenvätska(enblandningavolikaämnen)användsvidHPLC.

ü HPLCkananvändasförflerämnen:GCkanenbartsepareraochanalyseraämnensomärflyktiga(kanövergåigasformrelativtlätt)ochsomärvärmetåliga.GaserochlättflyktigavätskorkananalyserasmedGCmedandeflestavanligavätskorejkananalyseras.Detärenbartämnensomharenlägrekokpunktän350gradersomkananalyserasmedGC,vilketmotsvararca15-20%avallakändaämnen.HPLCkandäremotanvändasävenförickeflyktigaämnenochförämnensomärvärmekänsliga ochhardärförettstörreanvändningsområde (t.ex.användsHPLCförkolhydrater,fetterochproteinerochhardärförstorbetydelseinombiokemi,medicinetc.).

ü FördelenmedGCframförHPLCärframföralltattdetärensnabbareochliteenklaremetodattgenomföra.

SegärnaflerfilmeravNiklasDahrén:http://www.youtube.com/Kemilektionerhttp://www.youtube.com/Medicinlektioner