analisis del polimorfismo genetico de vaca, caga, e icea
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ANALISIS DEL POLIMORFISMO GENETICO DE vacA, cagA, e iceA
EN AISLADOS NATIVOS DE Helicobacter pylori, EN LA POBLACION
COLOMBIANA.
HUERTAS VALERO MONICA GABRIELA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGIA
Santafé de Bogotá, D.C.
2001
2
ANALISIS DEL POLIMORFISMO GENETICO DE vacA, cagA, e iceA
EN AISLADOS NATIVOS DE Helicobacter pylori, EN LA POBLACION
COLOMBIANA
HUERTAS VALERO MONICA GABRIELA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar el título de Bacterióloga
DIRECTOR: Dr. Oscar Orozco
Jefe Grupo Inmunología, Biología Molecular y Genética
Instituto Nacional de Cancerología
CODIRECTOR: Dra. Diana M. Cittelly Piñeros
Bióloga, Investigadora Grupo de Inmunología
Instituto Nacional de Cancerología
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGIA
Santafé de Bogotá, D.C.
2001
3
NOTA DE ADVERTENCIA
Articulo 23 de la Resolución N° 13 de julio de 1946:
"La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus tesis de grado"
4
A Isabel,
mi madre a quien le debo lo que soy
5
AGRADECIMIENTOS
Quiero expresar mis agradecimientos a las personas que contribuyeron a la
realización de este trabajo, especialmente:
Al Dr. Oscar Orozco Díaz, Coordinador del grupo de inmunología del Instituto
Nacional de Cancerología, por la confianza que deposito en mi, por su aporte
científico y acertada dirección en el desarrollo del trabajo.
A la Dra. Diana Cittelly, Bióloga Investigadora del Grupo de Inmunología del
Instituto Nacional de Cancerología, por su constante apoyo humano y científico
en la codirección de este trabajo.
Al comité de investigación en cáncer gástrico del Instituto Nacional de
Cancerología por permitir el uso de varias cepas y la base de datos.
Al grupo de gastroenterología del Instituto Nacional de Cancerología por su
colaboración en la toma de muestras
Al grupo de gastroenterología del Hospital Universitario de la Samaritana, en
particular al Dr. Julián Martínez por su colaboración en la toma de muestras.
6
A la Dra. Sandra Henao del Hospital Universitario de la Samaritana por su
colaboración en la toma de muestras.
A los compañeros del laboratorio de Inmunología en el Instituto Nacional de
Cancerología. Especialmente a Nina por su amistad y colaboración.
Al Dr. Jesús Enrique Jaimes Osma, Psicólogo - Bioestadístico. Universidad
Católica. Universidad de Chile por su asesoría en la parte estadística del
trabajo.
A la Universidad Javeriana por brindarme el aprendizaje para mi desarrollo
profesional.
Al Instituto Nacional de Cancerología, por brindarme la oportunidad de realizar
este trabajo.
A mis amigos, especialmente, Nana, Juliet, Diana y Edgar, por su constante
apoyo y colaboración. A todas las personas que de una u otra manera
permitieron la realización de este trabajo.
7
TABLA DE CONTENIDO
Pag RESUMEN
1. INTRODUCCION 18
2. MARCO TEORICO
2.1 Helicobacter pylori Y PATOLOGÍA GASTRODUODENAL 21
2.2 Helicobacter pylori 22
2.2.1 Historia 22
2.2.2 Microbiología 23
2.2.3 Genética 24
2.2.4 Patogenicidad 24
2.2.4.1 Factores de colonización y persistencia 25
2.2.4.1.1 Motilidad 25
2.2.4.1.2 Adhesión 26
2.2.4.1.3 Ureasa 26
2.2.4.2 Factores inductores de enfermedad 27
2.2.4.2.1 Inducción de inflamación crónica 27
2.2.4.2.2 Secreción de toxinas y enzimas 27
2.2.4.2.3 Determinantes de virulencia 29
2.2.4.3 Asociación de genotipos de Helicobacter pylori con
enfermedad gástrica 29
8
2.2.4.3.1 vacA 30
2.2.4.3.1.1 Heterogeneidad entre alelos vacA de diferentes cepas
y su asociación con la enfermedad 31
2.2.4.3.1.2 Caracterización de la toxina 33
2.2.4.3.1.3 Blanco y modo de acción de la citotoxina 34
2.2.4.3.2 cagA y el Islote de patogenicidad (PAI) 36
2.2.4.3 iceA 41
2.2.5 Epidemiología de la infección 41
2.2.6 Manifestaciones clínicas 42
2.2.6.1 Gastritis 43
2.2.6.1.1 Gastritis aguda 43
2.2.6.1.2 Gastritis Crónica 43
2.2.6.1.3 Gastritis asociada a Helicobacter pylori 44
2.2.6.2 Ulcera péptica 45
2.2.6.2.1 Ulcera duodenal 45
2.2.6.2.2 Ulcera gástrica 45
2.2.6.2.3 Ulcera asociada a Helicobacter pylori 45
2.2.6.3 Adenocarcinoma gástrico 46
2.2.6.3.1 Difuso o indiferenciado 46
2.2.6.3.2 Intestinal o diferenciado 47
2.2.6.3.3 Carcinoma Gástrico asociado a Helicobacter pylori 47
2.2.6.3 Linfoma tipo MALT 49
9
3. JUSTIFICACION 51
4. OBJETIVOS 55
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 PACIENTES 56
5.1.1 Criterios de inclusión 57
5.1.2 Criterios de exclusión 57
5.1.3 Recolección de información 57
5.2 Aislamiento y cultivo de cepas nativas 58
5.2.1 Transporte 58
5.2.2 Cultivo y preservación de aislados 58
5.3 ESTABLECIMIENTO DE PROTOCOLO PARA OBTENCION
DE DNA 59
5.3.1 Ajuste de la concentración bacteriana 59
5.3.2 Obtención de DNA 60
5.4 ESTABLECIMIENTO DE PROTOCOLO PARA
AMPLIFICACION POR PCR 60
5.4.1 Amplificación gen vacA 60
5.4.2 Amplificación gen cagA 62
5.4.3 Amplificación gen iceA 63
5.5 ANÁLISIS ESTADISTICO 64
6. RESULTADOS
6.1 AISLAMIENTO Y CULTIVO DE Helicobacter pylori 65
6.2 ANALISIS DESCRIPTIVO DE LA POBLACION GENERAL 65
10
EN ESTUDIO
6.2.1 Edad y sexo 65
6.2.2 Procedencia 67
6.2.3 Distribución de la población de acuerdo al diagnóstico
clínico-histopatológico 68
6.3 ANALISIS DEL POLIMORFISMO GENETICO DE vacA, cagA e
iceA DE Helicobacter pylori 68
6.3.1 Distribución general de los diferentes alelos en la población 68
6.3.1.1 Tipificación del gen vacA 68
6.3.1.2 Tipificación del gen cagA 71
6.3.1.1 Tipificación del gen iceA 72
6.3.4 Relacion de los diferentes genotipos con enfermedad
gastroduodenal 73
6.4 COMBINACIONES ALELICAS DE LOS DIFERENTES GENOTIPOS 76
7. DISCUSIÓN 83
7.1 AISLAMIENTO Y CULTIVO DE Helicobacter pylori 84
7.2 OBTENCION DE DNA Y PCR 85
7.3 ANALISIS DEL POLIMORFISMO GENETICO DE vacA, cagA e
iceA DE Helicobacter pylori 86
8. CONCLUSIONES 97
9. PERSPECTIVAS 99
BIBLIOGRAFIA 101
ANEXOS
11
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Factores de virulencia de Helicobacter pylori 25
Tabla 2. Primers utilizados en la amplificación de vacA 61
Tabla 3. Primers utilizados en la amplificación de cagA 62
Tabla 4. Primers utilizados en la amplificación de iceA 64
Tabla 5. Distribución general por sexo 66
Tabla 6. Prevalencia de variantes alélicas de la región s de vacA
en cepas aisladas de pacientes con diferentes patologías 74
Tabla 7. Prevalencia de alelos m1 y m2 en cepas aisladas de
pacientes con diferentes patologías 74
Tabla 8. Prevalencia de cagA en cepas aisladas de pacientes
con diferentes patologías. 75
Tabla 9. Prevalencia de iceA en cepas aisladas de pacientes con
diferentes patologías 76
Tabla 10. Frecuencia de combinaciones alélicas s/m en el gen vacA 77
Tabla 11. Combinación de los genotipos vacA/cagA 77
Tabla 12. Comparación de alelos vacA vs iceA 78
Tabla 13. Prevalencia de los genotipos vacA, cagA e iceA. 79
Tabla 14. Genotipos vacA, cagA e iceA en muestras
que contenían múltiples alelos 82
12
LISTA DE FIGURAS Figura 1. Helicobacter pylori y factores inductores de enfermedad 28
Figura 2. Esquema del gen vacA, que codifica la citotoxina
vacuolizante 31
Figura 3. Toxina vacuolizante 34
Figura 4. Islote de patogenicidad cag 38
Figura 5. Translocación de CagA. Sistema de secreción tipo IV de
Helicobacter pylori 40
Figura 6. Modelo propuesto en la patogenesis del cáncer
gástrico 50
Figura 7. Islote de patogenicidad cag 38
Figura 8. Distribución de edad en la población 67
Figura 9. Procedencia de la población 38
Figura 10. Productos de PCR, Subtipificación de los alelos del gen
vacA de Helicobacter pylori 69
Figura 11. Distribución de alelos en la población 70
Figura 12. Prevalencia de alelos s1a, s1b 70
Figura 13. Tipificación por PCR del gen cagA de H. pylori 71
Figura 14. Distribución de cagA en la población 71
Figura 15. Visualización productos de PCR, alelos del gen iceA
de H. pylori 72
Figura 16. Distribución de iceA en la población 73
13
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Aprobación del paciente para la toma de
muestra gástrica 109
Anexo 2. Formulario de tamizaje de enfermedad gastroduodenal 110
Anexo 3. Pruebas de identificación DE Helicobacter pylori 112
Anexo 4. Curva de calibración para ajustar la concentración
bacteriana de Helicobacter pylori 114
Anexo 5. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 115
14
RESUMEN
Helicobacter pylori es reconocido como factor etiológico importante en el
desarrollo de patologías como gastritis, úlcera péptica; adenocarcinoma
gástrico ó linfoma de MATL en la mucosa gástrica. El objetivo de este estudio
fue analizar el polimorfismo de los genes vacA, cagA e iceA de Helicobacter en
aislados nativos de la población colombiana, provenientes de pacientes con
distintas patologías.
Se analizaron 137 aislados de H. pylori provenientes de 19 (13.9%) pacientes
con diagnóstico de metaplasia intestinal, 23 (16.8%) con gastritis crónica
atrófica, 26 (19%) con de Adenocarcinoma gástrico, 34 (24.8%) con úlcera
péptica y 35 (25.5%) con gastritis crónica. Se realizó PCR con primers
específicos para amplificar los alelos [ s1 (s1a, s1b), s2, m1, m2 ] de vacA,
cagA, iceA1 e iceA2.
En el análisis de resultados se observó que el gen vacA se detectó en todos los
aislados de H. pylori, con mayor prevalencia de cepas vacA s1/m1. El 63.7% y
el 84.4% de los aislados fueron positivos para el gen cagA e iceA
respectivamente. Se encontró con mayor frecuencia el genotipo
s1m1cagA+iceA+ en el 49.6%; estas cepas fueron aisladas en su mayoría de
pacientes con adenocarcinoma gástrico y úlcera péptica.
15
En general, se corroboró la existencia de múltiples genotipos de Helicobacter
pylori en la población estudiada, sin embargo, existe una distribución
homogénea de tales genotipos en las diferentes patologías; la presencia del
genotipo con mayor virulencia (vacAs1/cagA+/iceA+) puede asociarse a la
presencia de las enfermedades más avanzadas (ulcera péptica y cáncer
gástrico) aunque carece de valor pronóstico para definir el riesgo de
carcinogénesis, por lo menos bajo las condiciones de este estudio.
Palabras clave: Helicobacter pylori, vacA, cagA e iceA, gastritis, úlcera
péptica, adenocarcinoma gástrico.
16
1. INTRODUCCION
Helicobacter pylori es un importante patógeno humano y se estima que cerca
del 50% de la población mundial está infectada. Desde la descripción por
Marshall y Warren de H. pylori en 1983, la bacteria ha sido asociada al
desarrollo de gastritis, ulcera péptica, linfoma de MALT y adenocarcinoma
gástrico.
El cáncer gástrico es la primera causa de muerte por cáncer a nivel mundial, y
Colombia es uno de los países que presenta una de las mayores prevalencias
de la enfermedad. Varios estudios epidemiológicos y la experimentación en
modelos animales demuestran la implicación de H. pylori en la carcinogénesis
gástrica; de hecho, en 1994 la Agencia Internacional para Investigaciones del
Cáncer (IARC) lo incluyó como un carcinógeno del grupo I. 1,2
La infección por H. pylori se adquiere usualmente en la infancia y persiste
durante toda la vida; sin embargo no todas las personas infectadas desarrollan
patología gástrica y se encuentran individuos infectados asintomáticos. El
hecho de que una mínima proporción de los infectados desarrolle signos y
síntomas de enfermedad gastroduodenal, parece depender tanto de la
diversidad genética en las cepas de Helicobacter, como de la diferente
susceptibilidad del hospedero y la influencia de factores ambientales.
17
H. pylori sobrevive en el pH ácido del estómago, un ambiente altamente hostil
para la mayoría de los microorganismos. Es un patógeno extracelular capaz de
colonizar la mucosa gástrica y evadir la respuesta del sistema inmune. Así
mismo, estimula la liberación de citoquinas en las células gástricas; induce la
destrucción de las células parietales, endocrinas y superficiales, alterando la
función gástrica con un aumento de la secreción de ácido y pepsinógeno. 3,4,5
Dentro de los factores de virulencia asociados con el desarrollo de las
enfermedades más severas se encuentra la producción de una citotoxina con
actividad vacuolizante codificada por el gen vacA; la presencia de una proteína
antigénica asociada a la citotoxina codificada por el gen cagA conocido como
marcador del islote de patogenicidad cag (PAI cag) y un importante mediador
de IL-8 en la respuesta inflamatoria; asi mismo, la expresión del gen iceA
regulado por el contacto de la bacteria con células epiteliales. 6,7
En Colombia son pocos los programas de investigación sobre H. pylori y su
asociación con las patologías gástricas, por lo que se hacen necesarios
estudios básicos que permitan conocer las características microbiológicas de
las cepas encontradas en nuestra población.8 El polimorfismo genético puede
ser un indicador que permita evaluar el potencial biológico del microorganismo
para inducir úlcera o cáncer gástrico, diferenciando cepas potencialmente
ulcerogénicas o carcinogénicas. Al conocer que tipo de bacterias son
predominantes en nuestro medio es posible proponer y realizar estrategias de
18
prevención y tratamiento que brinden a mediano y largo plazo una solución a
este problema de salud, proporcionando de alguna manera una mejor calidad
de vida a los pacientes afectados.
La caracterización de las cepas más frecuentemente encontradas en pacientes
colombianos, es fundamental para establecer si la patología se relaciona con la
recurrencia de la infección y la interacción biológica bacteria - hospedero. Por
ello, el objetivo de este trabajo es contribuir a la caracterización genotípica de
las cepas de H. pylori aisladas de pacientes con gastritis, úlcera péptica y
cáncer gástrico, mediante el análisis del polimorfismo de los genes vacA, cagA
e iceA y su relación con las diferentes patologías previamente mencionadas.
Para tal fin, fue necesario el aislamiento y cultivo de H. Pylori a partir de
biopsias gástricas de pacientes con las patologías ya mencionadas. Luego
establecer los protocolos de amplificación por PCR (Reacción en cadena de la
polimerasa) para cada uno de los genes en estudio.
19
2. MARCO TEORICO
2.1 Helicobacter pylori Y LA PATOLOGÍA GASTRODUODENAL
El estómago humano es un órgano digestivo, glandular y endocrino en el que
se distinguen cuatro regiones principales: El cardias cuyas glándulas segregan
mucina, el fundus y el cuerpo que contienen células parietales, secretoras de
ácido, y células principales que segregan pepsinógeno; y el antro cuyas
glándulas están formadas por células neuroendocrinas o células G secretoras
de gastrina 9. Varios factores actúan para proteger la mucosa gástrica de la
autodigestión y los efectos corrosivos de la secreción péptica ácida; sin
embargo la influencia de diversos factores genéticos y ambientales son
descritos desde hace tiempo como causantes de enfermedad, ocasionando
malestar gástrico, dispepsia o indigestión.
La patología gástrica incluye manifestaciones clínicas que son consecuencia de
diversos niveles de inflamación en la mucosa esofágica, gástrica o duodenal,
hasta la ulceración e incluso metaplasia de los tejidos afectados; de igual
manera encontramos el proceso de carcinogénesis que puede conducir a
adenocarcinoma gástrico o linfomas (MALT).10 Como se mencionó
anteriormente, las causas de las diferentes patologías se asocian al estilo de
20
vida donde los factores ambientales, dietéticos, genéticos e infecciosos, entre
otros, cumplen una función esencial en el establecimiento y evolución de la
enfermedad.11 En los últimos años se ha resaltado la importancia patogénica de
la infección por Helicobacter pylori que actualmente es reconocido como
agente causal de ciertas patologías gástricas.
2.2 Helicobacter pylori
2.2.1 Historia
En 1982 Warren y Marshall aislaron un microorganismo espirilar productor de
ureasa que se alojaba entre las células epiteliales y la capa de gel mucoso que
las recubre. Aunque la bacteria se conoce desde 1909 y recibió la
denominación inicial de Vibrio fetus, el mérito de su divulgación se acredita a
estos dos investigadores. 12,13
Debido al crecimiento microaerofílico y la similitud encontrada con el género
Campylobacter se llamó Campylobacter pyloridis, con el paso del tiempo se
determinó que por sus características bioquímicas y morfológicas debía
conformar su propio genero Helicobacter, al cual pertenecen varias especies
algunas patógenas como: H. Acinonyx, H.felis, H.cinaedis, H,hepaticus,
H.pulloron.13
21
2.2.5 Microbiología
Es un microorganismo gramnegativo, cocobacilar o en forma curvada (espiral o
en coma), móvil, que posee de 4 a 6 flagelos unipolares, y mide entre 0.3 a
0.6 um; posee extremos romos redondeados y pared celular delgada.13 Puede
presentar formas cocoides luego de cultivo prolongado, que algunos autores
proponen como un estado resistente en el ciclo de vida de la bacteria. Otros
autores afirman que esta forma hace parte del proceso de transmisión, o que
es una forma degenerada y no viable.
Helicobacter pylori es microaerofilico, crece a bajas concentraciones de O2 (2 a
8%) y necesita una atmósfera enriquecida en CO2 (5-10%). El cultivo se
realiza en diferentes medios sólidos o líquidos enriquecidos; su crecimiento es
optimo a 37°C. Se recomienda el uso de antibióticos como trimetropin,
Vancomicina, Cefsulodin, polimixina, ácido nalidixico; estos evitan la
contaminación con otros microorganismos, permitiendo el aislamiento de la
bacteria.
2.2.6 Genética
El genoma de Helicobacter pylori consiste en un cromosoma circular, de 1.6
Mb con 1.590 secuencias codificantes y un alto contenido de Guanina +
22
Citocina (39%). Aproximadamente el 50% de las cepas contienen uno o más
plásmidos con un tamaño entre 1.5-40 kb.14,15,16
El análisis cromosómico indica que la bacteria ha desarrollado un buen sistema
de motilidad, utilización del hierro, restricción y modificación de DNA. También
codifica adhesinas, lipoproteínas y otras proteínas de membrana; así como
varias proteínas que hacen parte de un complejo sistema de interacción
patógeno- hospedero. Los genes que codifican elementos patogénicos de la
bacteria han sido analizados por experimentos de mutagénesis de intercambio
alélico, determinando así que la bacteria posee muchos mecanismos por medio
de los cuales le es posible adaptarse y sobrevivir en el medio ácido del
estómago16. Entre los genes identificados como factores de virulencia
implicados en el desarrollo de enfermedad gástrica, encontramos vacA, cagA y
iceA.
2.2.7 Patogenicidad
Son varias las características de Helicobacter pylori que le permiten
colonizar la mucosa gástrica, persistir durante décadas y a largo plazo inducir
la enfermedad gástrica (Tabla 1).
23
Tabla 1. Factores de virulencia de Helicobacter pylori . Tomado de Covacci
1999.
FACTOR FUNCION DISTRIBUCION
§ Ureasa § Flagelo § NAP § BabA § LPS § Antigenos,Lewisx,y § IceA § VacA § CagPAI § CagA § PicB
Buffer del ácido gástrico Motilidad Activación de neutrofilos Adhesina para Leb
Baja toxicidad Moléculas similares Homologo a endonucleasa de restricción Nla III Citotoxina vacuolizante Genes que codifican para un sistema de secreción tipo IV Antígeno inmunodominante Equivalente a CagE
Todas las cepas Todas las cepas Todas las cepas
Prevalencia en cepas tipo I Todas las cepas Algunas cepas Algunas cepas
Todas las cepas
Cepas tipo I
Cepas tipo I
Cepas tipo I
2.2.4.1 Factores de colonización y persistencia
Son aquellos que le permiten al microorganismo adaptarse y sobrevivir en la
mucosa gástrica del hospedero, superando las condiciones adversas del
medio.
2.2.4.1.1 Motilidad: La bacteria utiliza sus flagelos para penetrar la capa
mucosa y adherirse al epitelio, ubicándose en la interfase entre el epitelio y el
moco. Los flagelos están formados por un filamento central con una cubierta
flagelar cuya función se desconoce, pero esta implicada en la persistencia y
transporte de la bacteria en la mucosa.13,17
24
2.2.4.1.2 Adhesión: Se ha comprobado que Helicobacter pylori posee varias
adhesinas con receptores en la mucosa gástrica; entre ellas una
hemaglutinina, con estructura de tipo afimbrial y diámetro de 2nm,
perteneciente el grupo de los sialoconjugados.
La hemaglutinina de Helicobacter pylori se une preferentemente a un
componente (N-acetil-neuraminil-lactosa), representado entre las
sialoproteinas, tanto de células epiteliales como sanguíneas.17
2.2.4.1.3 Ureasa: Helicobacter pylori posee actividad ureasa, mediante la cual
hidroliza la urea en el jugo gástrico generando iones amonio y bicarbonato,
que rodean a la bacteria protegiéndola del medio ácido.
Así el moco tiene una elevada concentración de amonio el cual puede ser un
lesionante directo de la mucosa gástrica. Esta actividad es común a todas las
cepas y se ha empleado como base de varias pruebas diagnósticas.17.18
2.2.4.2 Factores inductores de enfermedad
La persistencia de Helicobacter en la mucosa gástrica ocasiona cambios
histopatológicos que se asocian con daños en la integridad del tejido epitelial.
Los factores que inducen el daño patológico incluyen algunas proteínas
secretadas que causan daño directo en el epitelio y proteínas superficiales y de
secreción que inducen inflamación crónica. (Figura1)
25
2.2.4.2.1 Inducción de inflamación crónica: Helicobacter pylori induce la
activación de neutrófilos (PNN), ocasionando un infiltrado inflamatorio tipo
crónico en la mucosa gástrica. La infección da lugar a la producción de
citoquinas, aumento de los fenómenos oxidativos locales y a la expresión de
moléculas de adhesión intercelular. También se ha observado un incremento
en la proliferación y diferenciación de linfocitos TCD4+ ocasionando la
producción excesiva de citoquinas y la activación del factor de necrosis
tumoral (TNF)4 La inflamación persistente contribuye al daño de la barrera
epitelial.
2.2.4.2.2 Secreción de toxinas y enzimas: La bacteria secreta diferentes
proteínas con actividad tóxica; la fosfolipasa A, degrada la mucosa y altera la
viscosidad gástrica, la mucinasa, degrada el moco gástrico facilitando la
penetración de la bacteria en la mucosa gástrica y la catalasa, que protege a la
bacteria de reacciones de metabólitos de oxigeno.18
2.2.4.2.3 Determinantes de virulencia: La bacteria posee ciertos factores que
causan daño directo sobre la mucosa gástrica, o que de alguna manera están
activando factores inductores de enfermedad como los ya mencionados. Dentro
de los más estudiados se encuentra la citotoxina vacuolizante, un antígeno
inmunógeno asociado a la citotoxina (cagA) y el gen iceA; cuya presencia se
considera como un marcador de las cepas más virulentas.19
26
2.2.4.3 Asociación de genotipos de Helicobacter pylori con enfermedad
gástrica
El análisis de cepas aisladas de pacientes con diferentes patologías ha
permitido establecer la existencia de genotipos virulentos, asociados con las
enfermedades más severas.
Los blancos principales para identificar cepas virulentas, han sido el gen cagA
(gen asociado a la citotoxina); el gen vacA (codifica la citotoxina vacuolizante),
y recientemente iceA. A continuación se describirán las principales
características de estos genes y sus productos, y su relación con las diferentes
patologías gástricas.
2.2.4.3.1.vacA
El gen vacA codifica una proteína de alto peso molecular, que ocasiona
vacuolización del citoplasma de células epiteliales in vitro. Adicionalmente se
ha demostrado que la administración de la toxina purificada en ratones causa
daño en la mucosa gástrica y producción de anticuerpos en el individuo
infectado. Aunque este gen esta presente en todas las cepas; no en todas se
expresa la citotoxina; característica que llevo a la clasificación de las cepas
como toxigénicas (VacA+) o no toxigénicas (VacA-).20,21
27
El análisis del gen vacA en múltiples cepas indica que ciertas regiones están
relativamente conservadas mientras que existen otras altamente divergentes.
Se han encontrado dos regiones notablemente diferentes; una de 50pb
localizada en la segunda mitad de la secuencia señal (s) y otra de 700pb
localizada en la región media del gen (m).22,23 El gen vacA carece de homología
con otros genes de toxinas bacterianas conocidos.
Figura 2. Esquema del gen vacA, que codifica la citotoxina vacuolizante.
Tomado de ATHERTON 1998
2.2.4.3.1.1. Heterogeneidad entre alelos vacA de diferentes cepas y su
asociación con enfermedad.
Estudios realizados con sondas para PCR basados en secuencias de vacA de
cepas toxigénicas y no toxigénicas, ha llevado a la identificación de variantes
alélicas en cada región. Así, la región s presenta dos alelos s1 y s2, de los
vacA 3,9 kb
m s
50pb 700pb
m 1
m 2
s1a
s1b
s1c
s2
28
cuales s1 puede tener tres presentaciones: s1a (igual al de cepas toxigénicas),
s1b (codifica un péptido similar pero con diferencias consistentes en seis
aminoácidos) y recientemente s1c (similar a s1a).22 El alelo s2 codifica un
péptido completamente diferente en el extremo carboxiterminal similar al
encontrado en cepas no toxigénicas. Los aislados que contienen secuencia
señal s2 no inducen vacuolización celular in vitro y no producen actividad
citotóxica detectable.24
Se conocen dos tipos de región media: m1(común a las cepas toxigénicas) y
m2 presente en las cepas no toxigénicas. Recientemente se han reportado dos
subtipos de la región m2, llamados m2a y m2b23 que al parecer son
variaciones de tipo geográfico que permiten identificar la bacteria de acuerdo a
la zona de donde proviene.23
Existe una fuerte asociación entre la combinación de alelos s/m y la actividad
vacuolizante. Las cepas m1 son casi siempre toxigénicas mientras que las m2
raramente lo son. Entre las cepas m1, aquellas con secuencia señal s1a
producen mayores niveles de vacuolización que las s1b. Así, algunos
experimentos muestran que cepas s1/m1 producen mayor nivel de actividad
citotóxica, mientras que las cepas s2/m2 son carentes de esta actividad.25,26
Las cepas toxigénicas están asociadas a la presencia de los alelos s1a/m1,
relacionadas con inflamación gástrica y úlcera. Las cepas s2/m2 son
asociadas a menor inflamación y baja prevalencia de úlcera.
29
La influencia de la región media de vacA sobre la toxigenicidad no es
sorprendente ya que esta región codifica el extremo C-terminal de la
subunidad vacA madura, y puede esperarse que altere la función de vacA. Sin
embargo la asociación del péptido señal con la toxicidad es menos esperada
debido a que este segmento es removido de la proteína durante su salida de la
bacteria. Se han hecho estudios para probar la importancia de la secuencia
señal y la región promotora introduciendo secuencias s1a en cepas s2/m2 y
secuencias S2 en cepas s1/m123. Las primeras tuvieron un aumento en la
actividad vacuolizante y las segundas una disminución en esta actividad, lo
cual prueba que estas regiones están involucradas directamente en la
regulación del nivel de actividad, probablemente afectando la cantidad de
vacA producida. Queda por esclarecer si la secuencia señal en si misma es
importante o si es un marcador para diferencias en la región promotora que
modifica el nivel de transcripción del gen.22,24,27
2.2.4.3.1.2 Caracterización de la toxina
La citotoxina vacuolizante ha sido objeto de numerosas investigaciones desde
que Figura y col en 198927, demostraron que las cepas mas toxigénicas son
aisladas con más frecuencia de pacientes con úlcera péptica o gastritis atrófica.
Estos estudios han permitido establecer su estructura, su efecto sobre las
células epiteliales y su importancia clínica.
30
En la actualidad, se sabe que la toxina es sintetizada como un precursor de
140 kD que es proteolisado durante su exportación a la membrana externa,
formando un monómero de 90kD. Este monómero se organiza en un complejo
multimérico con forma de flor hexagonal de 30nm, conformado por un anillo
central de 15nm encerrado (rodeado) por 6 pétalos de 6 nm.27,28,29,30 Algunos
autores sugieren que la toxina forma oligómeros únicamente luego de
liberarse de la bacteria en el medio ácido.
Figura 3. Toxina vacuolizante: Complejo multimérico de 12 subunidades.
2.2.4.3.1.3 Blanco y modo de acción de la citotoxina
La toxina vacA, posee características de los miembros de la familia AB de
toxinas bacterianas, estas exponen una subunidad (B, subunidad de unión)
para penetrar y adherirse a la célula blanco, la otra subunidad (A, subunidad
activa) muestra la actividad toxica27. La toxina dentro de los compartimentos
intracelulares es activada por la disminución del pH, luego la subunidad B se
31
inserta dentro de la membrana, facilitando o permitiendo la entrada de la
subunidad A enzimáticamente activa.
La citotoxina tiene tres ATPasas como receptores in vivo: H+ ATPasa, Na+K-
ATPasa, H+ K- ATPasa, ubicadas en la superficie de las células eucariotas.24 El
blanco de la citotoxina es una ATPasa intracelular que debido a su estimulación
produce un gradiente de pH, atrayendo sustancias alcalinas que al ser
tamponadas en el interior de la célula, captan agua por osmosis, lo que origina
en un principio la vacuolización alrededor del núcleo y finalmente el estallido y
la muerte celular.27,31
VacA produce variedad de efectos en las células blanco, forma un canal iónico
transmembranal y provoca un incremento en la secreción extracelular de
hidrolasas acídicas y una reducción en el potencial degradativo de endosomas
tardíos y marcadores lisosomales, también causa alteraciones en el
citoesqueleto y rearreglamiento de actina en células en cultivo. Recientemente,
Hotchin et al. Reporta que la actividad de la toxina es regulada por Rac1
GTPase; este un miembro de la familia Rho de las proteínas de unión-GTP que
se encargan de regular la reorganización del citoesqueleto; y que al parecer
inicia e incrementa el trafico de eventos en la membrana.32, 33
Las lesiones de la mucosa gástrica colonizadas por cepas citotóxicas muestran
daños en la matriz extracelular, reducción en la viscosidad mucosa,
32
debilitamiento de las uniones intercelulares ocasionando espacios que pueden
ser invadidos por la bacteria.
La citotoxina también estimula la proliferación de células epiteliales, produce
cicatrización ulcerosa, e induce la expresión del factor de crecimiento
epidermal (EGF). También se ha encontrado que VacA reduce la estimulación
de células T CD4+ inducida por medio de las células presentadoras de antígeno
(APC), en particular VacA inhibe la presentación de antígenos por medio de
moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad tipo II, expuestas sobre
la superficie de la célula presentadora. Esta actividad inhibitoria puede
contribuir a la persistencia de la infección a través de la estimulación
diferencial de la subpoblación T helper.27,34
2.2.4.3.2 cagA y el Islote de patogenicidad (PAI)
En los primeros estudios de los factores de virulencia de Helicobacter pylori,
se encontró una proteína de 120 kD asociada con el efecto citotóxico de
algunas cepas (CagA), incluso se pensó que esta proteína era responsable de
la actividad vacuolizante de Helicobacter pylori.35
El gen cagA no esta presente en todas las cepas de H.pylori, y su tamaño
exacto varía entre cepas dependiendo del número de regiones repetitivas
localizadas en la región 3’ del gen26 .
33
La proteína CagA es reconocida como un antígeno inmunógeno cuya función
esta siendo dilucidada. Estudios recientes demuestran que esta proteína es
translocada al interior de células epiteliales in vitro, en un proceso mediante el
cual es fosforilada activando una cascada de señalización que conduce a la
activación del factor de transcripción NF-Κβ. Esto explica por qué las cepas
cagA+ están asociadas con niveles altos de inflamación y expresión de
citoquinas pro-inflamatorias.37,38,39
Las cepas más virulentas aisladas de pacientes con úlcera péptica y cáncer
gástrico contienen una inserción denominada “islote de patogenicidad” (PAI),
de aprox 40 kb con 31 genes aprox, cuyo marcador es cagA. En algunas
bacterias, este islote puede estar divido en dos partes, cagII una región de
aprox 14 genes y cagI una región de 16 genes.40,41
Figura 4. Islote de patogenicidad cag. Tomado de Atherton 1998
PAI cag: 40 KB
M L I H G E cagA
cag II
cag I Elemento de inserción (IS605/IS606)
34
El PAI cagA comparte 6 genes homólogos a otros contenidos en operones de
otras bacterias como: Escherichia coli, Bordetella pertussis. Agrobacteriun
tumefacien, Rickettsia y Legionella. Estos operones codifican una maquinaria
de exportación tipo IV, especializada en transferir una variedad de complejos
multimoleculares a través de la membrana bacteriana al espacio extracelular o
al interior de otras células.36,42,43,44
Varios estudios muestran que las proteínas codificadas por los genes cagE,
cagG, cagH, cagI, cagL y cagM parecen ser parte de dicha estructura
multimérica,y son necesarios para producir la cascada de transducción de
señales que conduce a la activación del factor de transcripción NF-Κβ. Por otro
lado, se han encontrado niveles elevados de citoquinas como IL-1Beta, IL-6,
TNF-alfa, IL-8, asociadas a la presencia del PAI.37,45. Estudios recientes,
demuestran que el gen cagE, es un marcador importante dentro de los genes
mayormente implicados en la inducción de IL-8; la infección con cepas cagE+
se asocia con enfermedad ulcero-peptica.,46
Según el modelo planteado por Covacci et al, las proteínas codificadas en el
PAI (que hacen parte del sistema de secrecion tipo IV) son necesarias para la
translocación de CagA. Así, CagA es fosforilada en un residuo de tirosina y
posteriormente translocada al interior de las células epiteliales en donde ocurre
la fosforilación de varias proteínas celulares. Este evento seria el responsable
de la activación de la cascada de señalización que conduce a la producción de
35
IL-8.39,47,48 En la figura 5, se muestra una representación esquemática de un
posible mecanismo de señalización en el sistema de secreción tipo IV,
mostrando la trasnlocación de CagA dentro de la célula.
Algunos investigadores han demostrado que la presencia del gen cagA, no
necesariamente indica la presencia intacta del PAI, al igual que no todas las
cepas que poseen el gen cagA son productoras de la proteína CagA;
Sin embargo la presencia intacta del PAI parece ser una condición necesaria
para el desarrollo de enfermedad gastroduodenal.40,49,50
2.2.4.3 iceA
iceA es un gen reportado recientemente cuya expresión es inducida por
contacto con células epiteliales in vitro. Existen dos variantes alelicas iceA1 e
iceA2, de las cuales iceA1 se encuentra presente en las cepas mas toxigénicas
y se ha asociado con ulcera péptica.51,52
Aun no se conoce el producto de este gen pero presenta homología con una
endonucleasa de restricción de Neisseria lactamica, patógeno que causa
meningitis en humanos. Su acción esta relacionada con la producción de IL-8,
como mediador de inflamación.53
36
2.2.5. Epidemiología de la infección
La mucosa gástrica de humanos es conocida como reservorio natural de
Helicobacter pylori. Su transmisión se efectúa por diseminación de persona a
persona vía oral-oral , fecal – oral ó por aguas contaminadas. Dentro de los
factores de riesgo para contraer la infección encontramos: bajo nivel socio -
cultural, pobreza, condiciones higiénico - sanitarias deficientes, ciertos hábitos
dietéticos, factor genético (gen HLS-DQA 1)
La distribución de la infección de Helicobacter pylori es mundial, el patrón de
comportamiento difiere entre países desarrollados y en vía de desarrollo. Su
prevalencia aumenta con la edad, en países como el nuestro la incidencia por
año llega al 10% entre los 2 y 8 años, de manera que a los 20 años la
prevalencia es cercana al 85%, siendo sintomático solo 1 de 6 infectados.54
La prevalencia de la infección se observa en un 80% en pacientes con
gastritis; los pacientes con ulcera duodenal tienen tasas de prevalencia cerca
del 80%-100%, en ulcera gástrica de 58-94%; y en cáncer gástrico de 44% -
79%, convirtiendo a Helicobacter pylori en uno de los agentes infecciosos de
mayor prevalencia en humanos.
37
2.2.6. Manifestaciones clínicas
Diversos estudios han establecido que Helicobacter pylori es un factor
contribuyente o modificador de algunas enfermedades gástricas, su presencia
refleja una asociación comensal extremadamente frecuente que difiere en
localización y desarrollo.55
2.2.6.1 Gastritis
De acuerdo con sus características puede dividirse en dos grupos:
2.2.6.1.1 Gastritis aguda: es un proceso inflamatorio generalmente transitorio,
puede estar acompañada de hemorragia y de erosión en la mucosa superficial.
2.2.6.1.2 Gastritis Crónica: son alteraciones inflamatorias crónicas como su
nombre lo indica que producen finalmente atrofia de la mucosa y
metaplasia intestinal; por esta razón se pueden identificar dos subgrupos:
§ Gastritis crónica superficial: Consiste en una infiltración ligera de linfocitos
y células plasmáticas en el epitelio superficial. Se presenta edema que
separa las glándulas.
§ Gastritis crónica atrófica: Posee infiltrados extendidos en la totalidad de la
lamina propia, y a porciones profundas de la mucosa, esta tiende a la
atrófia y pueden aparecer focos hísticos de metaplasia intestinal. Las
38
glándulas de la mucosa están alteradas, irregulares de forma y disminuidas
en número. En general se caracteriza por la perdida de glándulas gástricas.
2.2.6.1.3. Gastritis asociada a Helicobacter pylori
La mayoría de los casos de gastritis crónica son asociados a la infección por
Helicobacter pylori, la bacteria esta presente en un alto porcentaje de
pacientes con gastritis crónica de antro y cuerpo; los índices de colonización
aumentan con la edad. En humanos voluntarios sanos que han ingerido una
gran dosis del microorganismo se ha desarrollado una gastritis con síntomas
agudos. Por otro lado los pacientes con gastritis crónica y Helicobacter pylori
normalmente mejoran cuando se les trata con antibióticos y las recidivas están
asociadas con la reinfección del microorganismo.56,57
La patogénesis asociada a Helicobacter pylori inicia con una gastritis aguda
acompañada de dolor abdominal a causa de la inflamación; dada la infección
persistente se convierte en gastritis crónica crónica, se caracteriza por una
infiltración de la lamina propia de la mucosa gástrica por leucocitos
polimorfonucleares que tapizan la capa de células epiteliales. La gastritis
crónica se caracteriza por un infiltrado inflamatorio de predominio linfocitico y
de células plásticas. Se presentan cambios epiteliales conduciendo a
hiperplasia celular.58,59
39
2.2.6.2 Ulcera péptica
Las úlceras se definen como una interrupción en la mucosa del tracto digestivo
que puede perforar la pared gástrica; comprende un grupo de enfermedades
ulcerosas de los tramos altos del aparato gastrointestinal expuesto a los jugos
pépticos, particularmente la porción proximal del duodeno y el estómago,
tienen en común la participación de ácido y la pepsina en su patogenia. Existen
dos tipos de ulcera péptica:
2.2.6.2.1. Ulcera duodenal: La enfermedad es un síndrome que reconoce
múltiples etiologías, es típicamente crónica y recidivante, son ulceras
profundas y muy marcadas, penetran a través de la mucosa y la submucosa.
2.2.6.2.2. Ulcera gástrica: Son ulceras profundas, penetran mas allá de la
mucosa del estómago, van acompañadas de una gastritis extensa a su
alrededor.
2.2.6.2.3. Ulcera asociada a Helicobacter pylori
El papel de Helicobacter pylori en la ulcerogénesis no es claro; sin embargo, el
90 a 95% de los pacientes con ulcera duodenal y el 60 a 70% de pacientes con
ulcera gástrica tienen colonización gástrica por Helicobacter. Se considera que
la infección del microorganismo es un factor perturbador en la barrera
40
mucosa, que de alguna manera queda debilitada a la agresión ácido péptica;
así el daño epitelial causado por la bacteria da inicio a la ulcerogénesis. La
presencia de la bacteria se relaciona con hipergastrinemia que estimula las
células parietales a producir ácido y en menor proporción a secretar mucina;
se observa una aumentada respuesta inflamatoria que induce la evolución a
metaplasia gástrica. 60, 61,62
2.2.6.3 Adenocarcinoma gástrico
Un 90% de los casos de cáncer de estomago son adenocarcinomas, los cuales
pueden dividirse en dos grupos según sus características histológicas:
2.2.6.3.1. Difuso o indiferenciado: no existe cohesión entre las células, lo que
da lugar a una infiltración de células con engrosamiento de la pared del
estómago. Afecta en su mayoría a personas jóvenes e invade todo el
estómago incluido el cardias.
2.2.6.3.2. Intestinal o diferenciado: caracterizado por la cohesión de las células
neoplásicas que forman estructuras de tipo glandular. Son ulcerativos y suelen
afectar el antro, están precedidos de un proceso precanceroso, en el cual la
atrofia gástrica y la metaplasia intestinal son eventos previos.
41
2.2.6.3.3. Carcinoma Gástrico asociado a Helicobacter pylori
Helicobacter pylori esta relacionado con varias patologías gastroduodenales lo
cual hace pensar en una evolución desde la mucosa normal hasta la aparición
de cáncer gástrico. Una de las evidencias que liga la infección con el cáncer
gástrico es de tipo histopatológico puesto que la bacteria esta presente en
zonas adyacentes al tumor. De igual manera, recientes estudios en modelos
animales (Mongolian gerbils) demuestran que H. pylori induce adenocarcimona
gástrico luego de largos periodos de infección.1,63
Se ha encontrado la presencia de H. pylori en un 60-94% de los pacientes con
lesiones precancerosas o carcinoma gástrico; la bacteria se considera como
agente etiologico del cáncer porque dispara eventos genéticos y alteraciones
fenotípicas de la mucosa gástrica aumentando las lesiones precancerosas.64
El modelo más aceptado de carcinogénesis gástrica describe una secuencia de
eventos que comienza con el desarrollo de gastritis superficial, continúa con
gastritis crónica multifocal, subsecuentemente atrofia gástrica seguida de
displasia y finalmente carcinoma gástrico.64 Al aceptar la relación causal se
tiene en cuenta que a más temprana adquisición de la bacteria mayor es el
riesgo de la aparición de cáncer.
42
La demostración de carcinoma gástrico luego de la infección por H. pylori
durante décadas, confirma que se necesitan largos periodos de latencia para
establecer las alteraciones genotipicas y fenotípicas dirigidas a desarrollar
cáncer.64, 65
La bacteria reduce nitratos a nitritos y puede predisponer a la formación de
nitrosaminas carcinogénicas; también por medio de la respuesta inmune las
células generan superoxido y oxido nitrico que puede concertirse en oxigeno
reactivo y nitrosaminas con efecto carcinogénico.66
Aun no se conoce la razón por la cual la infección ocasiona enfermedades
diferentes, sin embargo se tienen en cuenta factores como la dieta, la
predisposición genética y la heterogeneidad de las cepas.
2.2.6.4 Linfoma tipo MALT
Esta enfermedad se desarrolla en respuesta a la infección por Helicobacter
pylori. Normalmente no se encuentra tejido linfoide en el estomago, pero con
la infección aparece un tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT), que se
puede convertir en un linfoma gástrico de células B. El microorganismo no
incrementa la posibilidad de desarrollo del linfoma en localización
extragástrica. La erradicación de la bacteria es fundamental en el tratamiento
con lo cual se logra regresión del tumor.65
43
FIGURA 6. Modelo propuesto en la patogenesis del cancer gástrico.
Tomado de Mc Farlane67
Infección por Helicobacter pylori
Gastritis Aguda
Gastritis crónica superficial Linfoma Ulcera péptica
Gastritis crónica atrófica
Metaplasia intestinal
Displasia
Cáncer Gástrico
Mutagenos inflamatorios
Compuestos Nitrosos, sales
Acido Ascórbico
Factores ambientales Predisposición genética
44
3. JUSTIFICACION
En Colombia, el cáncer gástrico es un problema de salud de alta prioridad dado
que es una de las primeras causas de mortalidad por cáncer tanto en hombres
como en mujeres. El pronóstico de esta enfermedad es deficiente, pues
generalmente no se logra un diagnóstico temprano y en la mayoría de los
casos solo es posible una terapia paliativa.
La distribución de Helicobacter pylori es mundial, y su prevalencia en países
como Colombia es cercana al 85% en adultos mayores de 20 años, siendo
sintomático solo 1 de cada 6 infectados54. Helicobacter es reconocido como un
factor etiológico importante en el desarrollo de enfermedad acido-péptica como
gastritis ó ulcera duodenal; también en la cadena de eventos que conlleva al
desarrollo de carcinoma gástrico. Su papel patogénico es indiscutible y la
infección induce una u otra patología debido a factores de la bacteria
(patogenicidad), del hospedero (genética) y de la interacción de los dos con el
medio ambiente.
El potencial de H. pylori para inducir alteraciones estructurales y funcionales
en la mucosa gástrica depende de sus características patogénicas, incluyendo
su adherencia, la producción de enzimas como ureasa, enzimas proteolíticas,
45
su colonización indefinida, el procesamiento de mediadores proinflamatorios
estimulando sustancias que ejercen efecto lesivo en las células gástricas, entre
otros.13
No es claro cómo patologías diferentes como la enfermedad acido-péptica y el
cáncer gástrico se asocian a la infección por H. pylori. La variabilidad en las
manifestaciones clínicas de la infección parece estar relacionada con las
diferencias genotípicas en las cepas infectantes. Se han descrito como
marcadores de virulencia la presencia de los genes vacA, cagA y iceA, en
cepas citotóxicas implicadas en enfermedades severas.
Todas las cepas de H. pylori poseen el gen vacA, aunque solo el 50% produce
la citotoxina. Esta proteína causa vacuolización de células eucariotas in vitro,
razón por la cual se afirma que causa vacuolización en las células epiteliales
gástricas. La toxina ha sido aislada frecuentemente de pacientes con ulcera
duodenal y cáncer gástrico; el gen que la codifica presenta diversidad alelica
relacionada con la diferente patogenicidad de las cepas.68, 69
Adicionalmente, la mayoría de las cepas poseen un islote de patogenicidad cag,
cuyo marcador es el gen cagA, este islote contiene alrededor de 31 genes que
codifican proteínas formadoras de un sistema se secreción tipo IV.
Recientemente ha sido identificado un nuevo gen iceA, que se expresa cuando
la bacteria entra en contacto con las células epiteliales. Como se mencionó
anteriormente, existe una fuerte asociación entre cepas capaces de conducir a
46
resultados patológicos y al desarrollo de las enfermedades mas agresivas. De
esta manera las cepas que son cagA+,vacA(s1/m1),iceA+ son consideradas
más virulentas.69,70 Es probable que en presencia de cepas mas virulentas, la
respuesta inmunológica del hospedero influya en la determinación del
desarrollo de una y otra patología.
Estudios preliminares realizados en el laboratorio de inmunología del Instituto
Nacional de Cancerología en la población colombiana, demuestran la existencia
de diferencias antigénicas importantes en los aislados nativos de Helicobacter
pylori. Sugieren también que las diferencias en inmunogenicidad de las cepas
bacterianas relacionadas con úlcera péptica y cáncer gástrico puedan depender
de la expresión de diferentes epítopes en proteínas comunes. Observaciones
anteriores mediante inmunotransferencia muestran variaciones importantes en
la expresión de las bandas de pesos similares a los productos de cagA y vacA,
sugiriendo que la patogenicidad de las cepas puede deberse no sólo a la
expresión de toxinas, sino a la cantidad en que son expresadas por cada
cepa.71
Con este trabajo, se pretende contribuir al conocimiento y análisis del
polimorfismo genético en aislados nativos de Helicobacter pylori,
particularmente de los genes cagA, vacA e iceA para evaluar su asociación con
las diferentes patologías en aislados nativos de la población colombiana.
47
En Colombia no se ha profundizado sobre aspectos biológicos de la interacción
bacteria-hospedero en la infección por H. pylori, razón por la cual es necesario
conocer que tipo de bacterias son predominantes en nuestro medio. Así
mismo, el presente estudio contribuirá la descripción molecular de las cepas
nativas de H pylori, lo cual puede ser una herramienta potencial para el
desarrollo de vacunas, el análisis de sensibilidad a antimicrobianos y la
identificación de pruebas bioquímicas destinadas al diagnóstico, prevención o
detección de la enfermedad, todo esto en beneficio del paciente.
48
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Analizar el polimorfismo de los genes vacA, cagA e iceA de Helicobacter pylori
en aislados nativos de la población colombiana, provenientes de pacientes con
gastritis, ulcera péptica y cáncer gástrico.
4.2 Objetivos Específicos
§ Aislar y cultivar Helicobacter pylori a partir de biopsias de mucosa gástrica
de pacientes con gastritis, ulcera péptica y cáncer gástrico.
§ Establecer la metodología para la amplificación por PCR (Reacción en
cadena de la polimerasa) de los genes vacA, cagA y iceA de Helicobacter
pylori.
§ Determinar el polimorfismo de los genes cagA, vacA e iceA de los aislados
nativos de Helicobacter pylori provenientes de las patologías mencionadas.
§ Evaluar si las diferencias alélicas en los genes mencionados están
relacionadas con la patología gástrica.
49
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 PACIENTES
Se tomaron muestras de 39 pacientes con patología gástrica: 2 con gastritis
atrófica, 3 con diagnóstico de Adenocarcinoma gástrico, 24 con ulcera péptica,
y 10 con gastritis crónica, que asistieron a la consulta de gastroenterología del
Hospital Universitario de la Samaritana y el Instituto Nacional de Cancerología.
De cada paciente se tomaron dos biopsias de tejido epitelial gástrico: Una de
antro y otra de cuerpo o zonas no comprometidas con lesión cuando se
encontró cáncer. Se tomo una muestra de sangre, de donde se recuperó y
almacenó suero estableciendo un banco de muestras para ser utilizado
posteriormente. La toma de biopsias gástricas se realizo previo
consentimiento del paciente durante el examen endoscópico. (Anexo1)
Adicionalmente, se incluyeron cepas previamente obtenidas en el laboratorio
de inmunología del INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGÍA,
correspondientes al programa de cáncer gástrico de esta institución y a
trabajos previos. Estos aislados fueron obtenidos de pacientes que cumplían
con los criterios de inclusión para el estudio.18,71
50
5.1.1 Criterios de inclusión
Pacientes con enfermedad gastroduodenal que acudieron a consulta al
Hospital Universitario de la Samaritana y al INC con los diagnósticos antes
mencionados.
5.1.2 Criterios de exclusión
Pacientes que recibieron tratamiento con antibióticos o antiácidos en un
periodo de tres meses previo a ingresar al estudio. Pacientes que hubieran
recibido quimioterapia o radioterapia en su tratamiento.
5.1.3 Recolección de información
De cada paciente se tomaron datos epidemiológicos como edad, sexo,
procedencia, enfermedad que presentó y tratamientos recibidos.
(Anexo 2).
5.2. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE CEPAS NATIVAS
5.2.1 Transporte
Las biopsias fueron recogidas en medio de transporte: Tioglicolato, cuando la
51
muestra se proceso antes de 12 horas luego de su recolección; Caldo Brucella
con 20% de glicerol, cuando la biopsia fue congelada a –70° para su
recuperación posterior.
5.2.2 Cultivo y preservación de aislados
Las muestras fueron maceradas y cultivadas en agar Helicobacter pylori
Médium, suplementado con suero equino al 7%, isovitalex 1% y suplemento
selectivo Campylobacter (Merck). Incubadas en atmósfera microaerofilica a
37º C durante 4 -7 días, según protocolos previamente estandarizados. Los
aislados obtenidos del Banco de cepas de Helicobacter pylori del laboratorio de
Inmunología del INC, fueron recultivados bajo las mismas condiciones.
Las cepas de Helicobacter pylori fueron identificadas por la observación de
colonias translúcidas, pequeñas, elevadas, con bordes irregulares (colonias en
gota de rocío), confirmadas con pruebas de ureasa y catalasa positivas y
observados como bacilos gramnegativos a la coloración de Gram. (Anexo 3)
Los aislados viables se preservaron a -70º en crioviles con caldo Brucella al
20% de glicerol.
52
5.3. ESTABLECIMIENTO DE PROTOCOLO PARA OBTENCION DE DNA
5.3.1 Ajuste de la concentración bacteriana
Se estableció un sistema de cuantificación bacteriana para Helicobacter pylori,
relacionando densidad bacteriana en solución con la DO. Se seleccionaron
cuatro cepas diferentes y se resuspendieron en un volumen conocido de PBS, a
partir del cual se hizo dilución seriada. Se determinó el número de bacterias en
cada dilución mediante recuento directo en cámara de Neubauer y se leyó en
la densidad óptica a 450nm en un volumen de 200 ul (Multiskan 300). Con
estos datos se obtuvo una ecuación lineal a partir de la cual se determinó la
concentración bacteriana.
Los aislados bacterianos se llevaron a una concentración de 5x108 Bac/ml;
para esto, los pellet fueron resuspendidos en 1ml de H2O estéril, se realizó la
dilución correspondiente, se leyó la DO y se llevo a la curva de calibración para
determinar el número de Bac/ml. Según fuera el caso se diluyo o se concentro
la muestra hasta obtener la concentración bacteriana adecuada. (5x108
Bac/ml)
53
5.3.2 Obtención de DNA
Para la obtención de DNA se utilizó el método descrito por Gómez J y Col.31
Una vez ajustadas las concentraciones de todas las cepas a 5x108UFC/ml, las
muestras se hirvieron durante 10min, y posteriormente se centrifugaron a
13000rpm durante 1min. El sobrenadante fue alicuotado y almacenado a –20°
hasta uso posterior.
5.4. ESTABLECIMIENTO DE PROTOCOLO PARA AMPLIFICACION POR PCR
El polimorfismo genético de Helicobacter pylori ha sido muy estudiado en los
últimos años, por lo tanto los genes y las regiones variables que se requieren
estudiar son conocidas y específicas. (Anexo 5)
5.4.1 Amplificación gen vacA
Se detecto la presencia de cada uno de los alelos de las regiones variables del
gen vacA siguiendo el método utilizado por Atherton JC y Yamaoka Y.38,22,72
Las regiones de vacA analizadas y los diferentes primers empleados se
resumen en la tabla 2.
54
Tabla 2. Primers utilizados en la amplificación de vacA
REGIÓN PRIMER SECUENCIA (5’ 3’) TAMAÑO Y LOCALIZACION
AMPLIFICADA PRODUCTO
vacA m1 VA3-F GGTCAAAATGCGGTCATGG VA3-R CCATTGGTACCTGTAGAAAC 290bpa (2741-3030) vacA m2 VA4-F GGAGCCCCAGGAAACATTG VA4-R CATAACTAGCGCCTTGCAC 352bpb (976-1327) vacA s1 VA1-F ATGGAAATACAACAAACACAC VA1-R CTGCTTGAATGCGCCAAAC 259bpa (797-1055) vacA s2 VA1-F ATGGAAATACAACAAACACAC VA1-R CTGCTTGAATGCGCCAAAC 286bpc (284-569) vacA s1a S1A-F GTCAGCATCACACCGCAAC VA1-R CTGCTTGAATGCGCCAAAC 190bpa (866-1055)
vacAs1b SS3-F AGCGCCATACCGCAAGAG VA1-R CTGCTTGAATGCGCCAAAC 187bpd
a Posiciones nucleotídicas en gen vacA de H,pylori 60190(m1) b Posiciones nucleotídicas en gen vacA de H,pylori 87-203(m2) c Posiciones nucleotídicas del gen vacA de H,pylori Tx30a (s2) d Especifico para cada alelo pero no se conocen sus coordenadas exactas
La mezcla de PCR utilizada contenía 1U de Taq polimerasa (Gibco BRL); 2,5
mM de MgCl2; 0,2 mM de cada desoxinucleotido (dNTPS); 0,5 µM de cada
primer; Buffer de reacción con 50mM KCL, 10mM Tris-HCL (pH:9.0), 0.1%
Tritón X-100; y 25 µl de DNA para llevar a un volumen final de 50ul.
La reacción en cadena de la polimerasa se realizó en 35 ciclos de amplificación
en el termociclador 9600 Perkin-Elmer. En cada ciclo se realizo un paso de
denaturación a 94°C por 1 minuto, hibridación por 1 minuto a 52°C, una
extensión de 1 minuto a 72°C. Con el fin de asegurar una extensión completa
de DNA amplificado se hizo elongación final por 5 minutos a 72°C.
Los productos fueron visualizados en gel de agarosa al 2%, teñido con
bromuro de etidio 0,5 µg/ml de gel, utilizando buffer TBE 0.5X, corrido
55
inicialmente a 100 voltios durante 20 minutos y luego a 120 voltios durante 40
minutos. Se emplearon 5µl del producto amplificado, mezclados con 1 µl de
buffer-carga de glicerol. El gel se visualizó mediante la utilización de un
transluminador de luz ultravioleta.
5.4.2. Amplificación gen cagA
Para la amplificación del gen cagA se emplearon los primers cagAF/cagAR
generando un fragmento de 183 pb correspondientes a la región media
conservada del gen.38,67,72,73. Ver Tabla 3.
Tabla 3. Primers utilizados en la amplificación de cagA
REGIÓN PRIMER SECUENCIA TAMAÑO
AMPLIFICADA PRODUCTO
cagA cagAF TTGACCAACAACCACAAACCGAAG cagAR CTT CCCTTAATTGCGAGATTCC 183bp a a Posiciones de acuerdo al ORF cagA en Genbank secuencia L11714
La PCR se realizó en un volumen final de 50 µl, cuyos componentes y
cantidades son similares a los descritos anteriormente con una mezcla que
contenía 1U de Taq polimerasa (Gibco BRL), 2,5 mM de MgCl2; 0,2 mM de cada
desoxinucleotido (dNTPS); 0,25 µM de cada primer; Buffer de reacción (50mM
KCL, 10mM Tris-HCL (pH:9.0), 0.1% Triton 100X) y se utilizaron 25 µl de
DNA .
56
Para la amplificación se hizo denaturación inicial con una preincubación de 9
minutos a 94° C, seguida de 40 ciclos compuesto cada uno por un paso de
denaturación (30seg a 95°C); hibridación (45seg a 50°C); Extensión (45seg a
72°C). Se realizó una extensión Final por 5 minutos a 72°C para asegurar una
extensión completa del DNA amplificado. Los productos fueron analizados
mediante gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio, observados
visualmente al iluminar el gel con luz ultravioleta tal como se describió
anteriormente.
5.4.3 Amplificación gen iceA
En la amplificación del gen iceA se detectó la presencia de uno de sus dos
alelos para lo cual se usaron dos set de primers como se indica en la tabla 4.
Para el alelo iceA2 se amplificaron fragmentos de diferentes tamaños de
acuerdo a la existencia de secuencias repetitivas de 105 nucleótidos en el
gen.38
Tabla 4. Primers utilizados en la amplificación de iceA
REGIÓN PRIMER SECUENCIA TAMAÑO Y LOCALIZACION
AMPLIFICADA DEL PRODUCTO
iceA1 iceA1-F GTGTTTTTAACCAAAGTATC iceA1-R CTATAGCCASTYTCTTTGCAa 247bp (857-1103)b
iceA2 iceA2-F GTTGGGTATATCACAATTTAT iceA2-R TTRCCCTATTTTCTAGTAGGTa 229 ó 334bp a S= G o C, Y= C o T, R= G o A b Posición nucleotídica del gen iceA de H,pylori 60190
57
La mezcla y el programa de amplificación para este gen fue el mismo utilizado
en el protocolo de amplificación del gen cagA. Los productos de PCR se
visualizaron igualmente en gel de agarosa al 2%.
NOTA: En la amplificación de los diferentes genes se utilizó como control
negativo ADN de Escherichia coli ATCC 35218 y como control positivo cepas de
Helicobacter pylori NCTC 11638 y NCTC 2543. Tipificadas por el Dr. David
Graham en el laboratorio de Houston Texas.
5.5 ANÁLISIS ESTADISTICO
En este estudio, se evalúo la presencia de los alelos de los genes vacA, cagA e
iceA en aislados nativos de Helicobacter pylori en la población colombiana, en
las diferentes patologías. Para el análisis se empleo el paquete estadístico
SPSS versión 6.1 bajo Windows. y se aplicaron las pruebas de chi-cuadrado
(X2), y el test exacto de Fisher. Se consideró como diferencia significativa
cuando P<0.05.
58
6. RESULTADOS
6.1 AISLAMIENTO Y CULTIVO DE Helicobacter pylori
En el Hospital Universitario de la Samaritana se recogieron 39 biopsias
gástricas de antro o cuerpo y se tomaron las respectivas muestras de sangre
de pacientes con las patologías ya mencionadas. Se lograron 33.3% (13/39)
aislamientos nuevos que fueron incluidos en el estudio. Del banco de muestras
de Helicobacter pylori del laboratorio de Inmunología del INC se recuperaron
124 aislados. Para un total de 137 aislados analizados.
6.2ANALISIS DESCRIPTIVO DE LA POBLACION GENERAL EN ESTUDIO
6.2.1. Edad y sexo
Los aislados provenían de 55 mujeres (40.1 %) y 82 hombres (59.9 %). La
tabla 5 muestra la distribución por sexo en cada patología. La edad media de la
totalidad de los pacientes fue de 51 años, con una mínima de 19 y una máxima
de 85, distribuidos en la población según lo indica la Figura 8.
Se observó un mayor número de pacientes con gastritis crónica atrófica y
pacientes con cáncer gástrico en edades entre los 50 a 59 años (13/22 y 10/25
59
respectivamente), seguido de pacientes con gastritis crónica superficial en
edades entre los 40 a 59 años (24/34). En general se observó un mayor
número de pacientes con patología gastroduodenal en edades entre los 50 a 59
años. (Figura 8)
Tabla 5. Distribución general por sexo
SEXO PATOLOGIA
FEMENINO
n (%)
MASCULINO
n (%)
TOTAL
N
GASTRITIS CRONICA
SUPERFICIAL
18 (51.4) 17 (48.6) 35
ULCERA PEPTICA 12 (35.3) 22 (64.7) 34
GASTRITIS CRONICA
ATROFICA
7 (30.4) 16 (69.6) 23
METAPLASIA INTESTINAL 10 (52.6) 9 (47.4) 19
ADENOCARCINOMA GASTRICO 8 (30.7) 18 (69.3) 26
TOTAL 55 (40.1) 82 (59.9) 137
60
Figura 8. Distribución de edad en la población.
6.2.2. Procedencia
El 68.4% de la población total de pacientes inclu idos en el estudio provenían
del Altiplano-Cundiboyacense y el 15.4% de Santafé de Bogotá (Figura 9).
Figura 9. Procedencia de la población
Esta distribución responde a la ubicación de los centros de referencia
empleados para la toma de muestras.
1% 15%
69%
4% 8% 3%
N O S A B E / N OR E S P O N D E
S A N T A F E D E B O G O T A
A L T I P L A / C U N D I B O Y
C O S T A
A M A Z O N A S / L L A N O S
O T R A SP R O C E D E N C I A S
7%
8%
23%
37%
20%
5%
MENOS DE 30AÑOS 30-39 AÑOS
40-49AÑOS
50-59AÑOS
60-69AÑOS
70 O MASAÑOS
61
6.2.3 Distribución de la población de acuerdo al diagnóstico clínico-
histológico.
Se analizaron 137 aislados de Helicobacter pylori provenientes de 19 (13.9%)
pacientes con diagnóstico de metaplasia intestinal, 23 (16.8%) pacientes con
gastritis atrófica, 26(19%) pacientes con diagnóstico de Adenocarcinoma
gástrico, 34 (24.8%) con diagnóstico de ulcera péptica y 35 (25.5%) con
gastritis crónica.
6.3 ANÁLISIS DEL POLIMORFISMO GENETICO DE vacA, cagA e iceA DE
Helicobacter pylori
6.3.1 Distribución general de los diferentes alelos en la población
Mediante la amplificación por PCR, en las 137 muestras analizadas se realizó la
detección de los genes vacA, cagA e iceA implicados en la mayor
patogenicidad de Helicobacter pylori, encontrando una alta frecuencia de los
alelos asociados con más virulencia.
62
6.3.1.1 Tipificación del gen vacA.
El gen vacA se detectó en todos los aislados de Helicobacter pylori en estudio.
Figura10. Productos de PCR, Subtipificación de los alelos del gen vacA de H. pylori. Gel de
agarosa 2%. Patrón molecular: DNA Mass Ladder 100 pb.
Todas las cepas amplificaron el fragmento correspondiente a los alelos s1 y
s2; y se observó una mayor prevalencia de cepas con el genotipo vacA_s1
(P=0.008). Con respecto a la región media (m1 y m2) se observó una mayor
prevalencia del alelo m1(P=0.001). En dos aislados se detectaron ambos alelos
s1/s2 y en 9 m1/m2. En la Figura 11 se muestra la distribución de cada uno
de los alelos en la población estudiada.
286 pb
259 pb
212 pb
187 pb
352 pb
290 pb
s1/s2
s1a
s1b
m2
m1
PM
s1a/
m1
s1a/
m2
s1b/
m1
s1b/
m2
s2/m
2
s1 /
s2
63
Figura 11. Distribución de alelos del gen vacA en la población
De la región s1 se amplificaron los subtipos s1a y s1b, observando con más
frecuencia el alelo s1a en 49/92 (52.7%) de los aislados. (Figura 12)En todos
los aislados se encontró al menos una de las 6 combinaciones alélicas de las
regiones s y m. (s1a/m1, s1a/m2, s1b/m1, s1b/m2 ó s2/m2, s2/m1).
Figura 12. Prevalencia de alelos s1a, s1b
n=8(8.6%)
n=36(38.7%)
n=49(52.7%)
v a c _ A s 1 a
v a c _ A s 1 b
v a c _ A s 1 a / s 1 b
vacA_s
n=43
(31,4%)
n=2(1,5%)
n=92
(67,2%)
vacA_s1
vacA_s2
vacA_s1/s2
(P=0.008)
vacA_m
n=46
(33.6%)n=82
(59.8%)
n=9(6.6%)
vacA_m1
vacA_m2
vacA_m1/m2
(P=0.001)
64
6.3.3 Tipificación del gen cagA
La presencia del gen cagA se observó amplificando un fragmento de 186 pb.
Figura 13. Tipificación por PCR del gen cagA de H. pylori. Gel de agarosa 2%. Patron
Molecular: DNA Ladder 100pb.
Como se observa en la Figura 13, 86/135 (63.7%) aislados presentaban el gen
cagA. Del total de la muestra (137 aislados) fueron excluidos dos casos en los
cuales no se realizó amplificación de este gen.
Figura 14. Distribución de cagA en la población
n=49(36.3%)
n=86(63.7%)
Positivo
Negativo
186 pb
PM cagA
65
6.3.4 Tipificación del gen iceA
El 84.4% de los aislados de Helicobacter pylori fueron positivos para iceA
amplificando al menos uno de sus dos variantes alélicas (iceA1,iceA2) .En 18
casos se encontraron ambos alelos iceA1/iceA2. Al igual que el gen cagA, se
excluyeron dos aislados a los cuales no se les realizó amplificación.
En la figura 15 se observa la distribución de estos alelos en la población.
Figura 15. Visualización productos de PCR, alelos del gen iceA de H. Pylori. Gel de
agarosa 2%, Patron Molecular: DNA Ladder 100pb
PM
iceA1 iceA1
334 pb
247 pb
229 pb
66
Figura 16. Distribución de iceA en la población
6.3.4 Relación de los diferentes genotipos con enfermedad
gastroduodenal
Para determinar la asociación de los diferentes genotipos con el desarrollo de
las patologías gástricas; se relacionó la presencia de cada alelo con las
enfermedades en estudio.
Como se puede observar en la Tabla 6, no se encontraron diferencias
estadísticamente significativas en la prevalencia del alelo s1 en cepas aisladas
de pacientes con metaplasia intestinal, ulcera péptica, adenocarcinoma
gástrico y gastritis crónica atrófica; sin embargo, en las cepas aisladas de
pacientes con gastritis crónica se observó una prevalencia más baja de este
alelo en comparación con las demás patologías (P=0.008).
n=18
(13.3%)
n=49
(36.3%)
n=47
(34.8%)n=21(15.6%)
i c e A 1
i c e A 2
iceA1/ iceA2
i c e A -
67
Tabla 6. Prevalencia de variantes alélicas de la región s en cepas aisladas de
pacientes con diferentes patologías.
GEN vacA PATOLOGIA ALELO s1/s2
G. CRONICA SUPERFICIAL(
%)
(n=35)*
ULCERA PEPTICA
(%)
(n=34)
G.CRONICA ATROFICA
(%)
(n=23)
METAPLASIA INTESTINAL(
%) (n=19)
CANCER GASTRICO(
%)
(n=26) vacAs1 42.9 76.5 60.9 84.2 80.8 vacAs2 51.4 23.5 39.1 15.8 19.2
vacAs1/s2 5.7 0 0 0 0 Ulcera péptica vs Gastritis crónica P=0.009 Metaplasia intestinal vs Gastritis crónica P= 0.006 Adenocarcinoma gástrico vs Gastritis crónica P=0.005 Otras comparaciones: No se encontraron diferencias estadísticamente significativas * En estas comparaciones se excluyeron los casos de alelos múltiples s1/s2
En la región media de vacA, las cepas aisladas de pacientes con
adenocarcinoma gástrico, úlcera péptica y metaplasia intestinal presentaron
una mayor prevalencia del alelo m1, mientras que no se observaron diferencias
significativas en la distribución los alelos m1 y m2 en pacientes con gastritis
crónica atrófica y gastritis crónica (12/23 y 11/23 respectivamente, P=0.007).
En la tabla 7 se muestra la distribución alélica de la región m del gen vacA.
68
Tabla 7. Prevalencia de alelos m1 y m2 en cepas aisladas de pacientes con
diferentes patologías
GEN vacA PATOLOGIA
ALELO m1/m2
G. CRONICA SUPERFICIAL
(%) (n=35)*
ULCERA PEPTICA
(%)
(n=34)*
G.CRONICA ATROFICA
(%)
(n=23)
METAPLASIA INTESTINAL (%) (n=19)
CANCER GASTRICO
(%)
(n=26) vacA_m1 40 55.9 52.2 84.2 80.8 vacA_m2 51.4 26.5 47.8 15.8 19.2 vacA_m1/
m2 8.6 17.6 0 0 0
Metaplasia intestinal vs Gastritis crónica atrófica P=0.028 Gastritis crónica vs Adenocarcinoma gástrico P=0.004 Adenocarcinoma gástrico vs Gastritis crónica atrófica P=0.033 Gastritis crónica vs Metaplasia intestinal P=0.004 *En las comparaciones se excluyeron los casos de alelos múltiples m1/m2
Se encontró una alta frecuencia de cepas cagA+ en el total de la población. No
se observaron diferencias significativas al comparar la prevalencia de cepas
cagA+ en metaplasia intestinal, adenocarcinoma gástrico, ulcera péptica y
gastritis crónica atrófica excepto cuando se compararon con gastritis crónica.
En este grupo no se observan diferencias significativas en la presencia de cagA
(Tabla 8).
Tabla 8. Prevalencia de cagA en cepas aisladas de pacientes con diferentes
patologías.
PATOLOGIA
Gen cagA G. CRONICA
SUPERFICIAL(%) (n=35)
G.CRONICA ATROFICA
(%)
(n=23)
ULCERA PEPTICA
(%)
(n=34)
METAPLASIA INTESTINAL(%
) (n=19)
CANCER GASTRICO(%)
(n=26)
CagA+ 51.4 60.9 66.7 63.2 80
CagA- 48.6 39.1 33.3 36.8 20 Adenocarcinoma gástrico vs Gastritis crónica P=0.023 Otras comparaciones: No se encontraron diferencias estadísticamente significativas
69
Se encontró una alta prevalencia del gen iceA en los aislados analizados. No se
observaron diferencias estadísticamente significativas al comparar la presencia
del gen iceA en los aislados de las patologías en estudio. Se observo mayor
prevalencia del alelo iceA1 en aislados de pacientes con ulcera péptica, al
igual, que el alelo iceA2 con mayor frecuencia en aislados de pacientes con
adenocarcinoma gástrico (15/34 y 10/26 respectivamente, P=0.076). En la
tabla 9 se muestra la distribución alélica del gen iceA.
Tabla 9. Prevalencia de iceA en cepas aisladas de pacientes con diferentes
patologías
GEN iceA PATOLOGIA ALELO iceA1/iceA2
G. CRONICA SUPERFICIAL(%
) (n=35)
G.CRONICA ATROFICA
(%)
(n=23)
ULCERA PEPTICA
(%)
(n=34)
METAPLASIA INTESTINAL (%) (n=19)
CANCER GASTRICO (%) (n=26)
IceA_1 36.7 52.7 48.4 42.9 23.8
IceA_2 50.0 36.8 29.0 57.1 47.6 IceA_1/ IceA_2*
13.3 10.5 22.6 0 28.6
No se encontraron diferencias significativas en ninguna de las comparaciones * En las comparaciones se excluyeron los casos de alelos múltiples iceA1/iceA2
6.4 COMBINACIÓNES ALELICAS DE LOS DIFERENTES GENOTIPOS
En este estudio se analizaron 11 combinaciones diferentes, basados en la
estructura en mosaico del gen vacA para la región s y m respectivamente, y la
presencia o ausencia de los genes cagA e iceA. Como se observa en la tabla 10
se encontró asociación estadísticamente significativa entre la presencia del
alelo s1 con el alelo m1 y el s2 con m2. (P=0.000) En el análisis estadístico se
70
excluyeron las cepas que presentaron alelos múltiples. (2 aislados s1/s2 y 9
aislados m1/m2)
Tabla 10. Frecuencia de combinaciones alélicas s/m en el gen vacA
ALELOS
vac_A
m1
n(%)
m2
n(%)
s1 81 (63.3) 6 (4.7)
s2 1 (0.8) 40 (31.2)
TOTAL 128*
*Fueron excluidos los aislados con alelos múltiples
Dentro de las cepas con el alelo s1, se presento una mayor frecuencia del
subalelo s1a (57.6%) en comparación con el s1b, aunque esta diferencia no
fue estadísticamente significativa (P=0.071). Se encontraron 8 aislados con
alelos múltiples s1a/s1b respectivamente.
Con respecto a la relación entre los diferentes genes, se encontró una
asociación estadísticamente significativa entre la presencia del genotipo s1/m1
y cagA; así, el 56.2% de la población presentaba el genotipo s1m1cagA+, el
26.6% el genotipo s2m2cagA-, y las demás combinaciones posibles se
encontraron en menor proporción (P<0.000)(Tabla 11).
71
TABLA 11. Combinación de los genotipos vacA/cagA
vac_A
cagA
Alelos cagA+
(n/%)
CagA –
(n/%)
s1m1 72 (56.2) 9 (7.0)
s1m2 2 (1.6) 4 (3.1)
s2m1 1 (0.8) 0 0
s2m2 6 (4.7) 34 (26.6)
TOTAL 128*
*Fueron excluidos los casos con alelos múltiples
La comparación entre la presencia del gen iceA y los alelos de vacA, no mostró
asociaciones significativas (Tabla 12).
TABLA 12. Comparación de alelos vacA vs iceA
vac_A iceA
Alelos
IceA-
n(%) (n=21)
IceA+
n(%) (n=114)
s1 (n=90) 13 (10.0) 77 (57.2)
s2 (n= 43) 8 (6.4) 35 (26.4)
TOTAL 135*
*Fueron excluidos dos casos e n los que no se determino el
gen iceA y dos alelos múltiples s1/s2 de vacA.
72
En cuanto al análisis según los diferentes genotipos y su relación con las
patologías en estudio, se observó que la frecuencia con la que se encuentra el
genotipo s1/cagA+ en las diferentes patologías gástricas es muy similar; el
genotipo s2/cagA se presenta con una mayor frecuencia en pacientes con
gastritis crónica (P<0.04). De igual manera, al analizar la región media de
vacA se encontró un mayor número de cepas s1m1cagA+, distribuidos
uniformemente en los diferentes grupos (P<0.009).
Teniendo en cuenta el análisis de la región vacA y la presencia o ausencia de
los genes cagA e iceA, se encontraron 11 combinaciones genotipicas
diferentes, la prevalencia de cada uno de los genotipos se muestra en la tabla
13.
Tabla 13. Prevalencia de los genotipos vacA,cagA e iceA.
GENOTIPO FRECUENCIA PORCENTAJE
s1m1cagA+IceA+ 62 49.6
s1m1CagA+IceA- 8 6.4
s1m1CagA-IceA+ 6 4.8
s1m1CagA-IceA- 3 2.4
s1m2CagA+IceA+ 2 1.6
s1m2CagA-IceA- 2 1.6
s1m2CagA-IceA+ 2 1.6
s2m2CagA+IceA+ 5 4.0
s2m2CagA+IceA- 1 0.8
s2m2CagA-IceA+ 27 21.6
s2m2CagA-IceA- 7 5.6 *Fueron excluidos los aislados con alelos múltiples para s1/s2 y m1/m2 respectivamente
73
Se observó que el genotipo s1m1cagAiceA se encontró en el 63.2% de los
aislados, el genotipo s1m1cagA+iceA+ en el 49.6%; y estas últimas cepas
fueron aisladas en su mayoría de pacientes con adenocarcinoma gástrico y
ulcera péptica (P<0.008). Es importante resaltar que le genotipo
s1m1cagA+iceA- se encuentra con mayor frecuencia en pacientes con
adenocarcinoma gástrico y gastritis atrófica. Del genotipo s2m2cagAiceA
(32% de los aislados) se observaron 27 (21.6%) cepas s2m2cagA-iceA+ de
las cuales 12 (9.6%) fueron aisladas de pacientes con gastritis crónica. El
genotipo s2m2cagA+iceA- se encontró solo en 1 aislado en ulcera péptica. Las
demás combinaciones se encontraron en frecuencias intermedias distribuidos
en las diferentes patologías en estudio.(P<0.008) La figura 17 muestra la
distribución genotipica en las diferentes patologías.
Respecto a los aislados que contenían múltiples genotipos indicando la
presencia de diferentes cepas, como se menciono anteriormente, se
encontraron 2 aislados s1/s2. 9 m1/m2 y 18 iceA1/iceA2. La tabla 14 muestra
la distribución de estos genotipos en la población.
74
Tabla 14. Genotipos vacA, cagA e iceA en muestras que contenían múltiples
alelos.
vacA(s) vacA(m) cagA iceA1 iceA2
s1a/s1b/s2 s1a/s1b/s2
s1a/s1b s1a/s1b s1a/s1b s1a/s1b s1a/s1b s1a/s1b s1a/s1b s1a/s1b s1a/s1b s1a/s1b s1a/s1b
s1a s1a s1a s1a s1a s1a s1b s1b s1b s1b s1b s2 s2 s2 s2 s2
m1/m2 m1/m2 m1/m2
m1 m1 m1 m1 m1 m1 m1 m1 m1 m1 m1 m1
m1/m2 m1 m1 m1
m1/m2 m1/m2
m1 m1 m1
m1/m2 m1/m2 m1/m2
m2 m2
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + - + + - -
- + + + + + - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+ + -
nd - + + + - + - + + + + + + + + + + + + + - -
nd + +
75
7. DISCUSION
El papel patogénico de Helicobacter pylori como agente causal de patologías
benignas y neoplásicas gastroduodenales constituye una de los enigmas por
resolver en la investigación microbiológica y la práctica médica en
gastroenterología. Los trabajos realizados en Colombia sobre la infección por
Helicobacter pylori han sido en su mayoría de tipo epidemiológico, permitiendo
confirmar la asociación entre la infección y la presencia de enfermedad
gastroduodenal 8
Dada la alta prevalencia de esta infección y de las enfermedades
gastroduodenales en nuestro medio, es necesario estudiar la interacción
bacteria-hospedero, analizando la presencia de cepas mas virulentas que
puedan servir como base para el estudio posterior de la historia natural de la
infección en el desarrollo de diferentes patologías gástricas. El análisis de
genes que codifican factores de virulencia de H. pylori, es uno de los primeros
estudios que se han realizado en Colombia con aislados de la población.
7.1 AISLAMIENTO Y CULTIVO DE Helicobacter pylori
Este trabajo se basó en protocolos ya estandarizados para el aislamiento de la
bacteria, sin embargo, se observó que Helicobacter pylori es un
76
microorganismo bastante exigente y para su crecimiento requiere factores
nutricionales importantes.
Para el aislamiento a partir de las biopsias gástricas, se utilizaron medios
selectivos y no selectivos en donde se observó un mejor crecimiento en medio
no selectivo, aunque los medios selectivos son necesarios para evitar la
contaminación ya sea al manipular la muestra o por la flora bacteriana
acompañante.
El cultivo prolongado de la bacteria (más de 4 días de incubación) ocasiona la
aparición de formas cocoides que al parecer son consecuencia de deficiencias
nutricionales; las bacterias permanecen en periodo de latencia y cuando son
sembradas nuevamente recuperan su forma espiralada. El éxito del
aislamiento y recuperación de la bacteria depende en gran parte del transporte
y almacenamiento de las biopsias gástricas, la siembra de las mismas no debe
sobrepasar las 12 horas luego de su recolección.
7.2 OBTENCION DE DNA Y PCR
La estandarización de la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
en aislados de Helicobacter pylori es importante porque se puede utilizar tanto
en diagnóstico molecular como en el análisis de la expresión de genes, y es
77
base indispensable para estudios posteriores en los diferentes factores de
virulencia expresados por la bacteria y su interacción con el hospedero en las
distintas patologías gástricas.
En el protocolo que se desarrolló no fue necesario aislar el DNA, la técnica es
muy sensible y se conocían los primers específicos para amplificar las
secuencias deseadas. Para la amplificación de cada uno de los genes se
utilizaron cantidades especificas y en proporciones equivalentes según
protocolos para PCR ya establecidos.
En los ensayos iniciales se comparó la cantidad de taq polimerasa necesaria
para obtener un producto adecuado y se concluyó que 1U de la enzima es
suficiente para la amplificación de los fragmentos evaluados en este estudio.
7.3 ANÁLISIS DEL POLIMORFISMO GENETICO DE vacA, cagA e iceA DE
Helicobacter pylori
Las diferentes investigaciones sobre Helicobacter pylori demuestran una
heterogeneidad entre cepas que puede jugar un papel importante en la
variabilidad de manifestaciones clínicas en los individuos infectados. De
acuerdo a estudios realizados previamente en el laboratorio de inmunología, en
este trabajo se confirmó asociación entre la infección por H. pylori y las
78
diferentes patologías en estudio como gastritis, ulcera péptica y
adenocarcinoma gástrico.
La tipificación de las 137 muestras analizadas confirma la importancia del
polimorfismo genético de Helicobacter pylori en el desarrollo de patología
gastroduodenal. La asociación entre la infección por cepas mas virulentas ha
sido descrita en diferentes estudios. Aunque todas las cepas poseen el gen
vacA solo aproximadamente el 50% de las cepas producen la citotoxina
vacuolizante 22,32,74. Como se menciono anteriormente, el gen vac A posee una
estructura en mosaico que permite identificar diferentes combinaciones, entre
las cuales las cepas s1/m1 son mas citotóxicas. Asi, las cepas con actividad
vacuolizante han sido aisladas en su mayoría de pacientes con enfermedad
ulcero-péptica y adenocarcinoma gástrico. Particularmente, se ha reportado
que las cepas que poseen el alelo s1a están asociadas con enfermedad ulcero-
péptica, mientras las cepas s2 son aisladas de pacientes con enfermedad no-
ulcerosa. 75
En nuestra población, se detectó el gen vacA en todos los aislados analizados
siendo la combinación s1m1 la más prevalente. Entre los aislados con genotipo
s1, no se observaron diferencias significativas en la frecuencia de los alelos s1a
y s1b en las diferentes patologías, aunque se observa una tendencia en la cual
los pacientes con adenocarcinoma gástrico presentan mayor proporción de
cepas s1a mientras que los pacientes con ulcera péptica presentan una mayor
79
frecuencia de cepas s1b. Respecto a la región media de vacA, vale la pena
destacar que se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la
distribución de los alelos m1 y m2 en las diferentes patologías; el alelo m1 se
aíslo en mayor frecuencia de pacientes con adenocarcinoma gástrico y ulcera
péptica.
Estos resultados son similares a lo reportado por Yamaoka y col. quien
describe una mayor prevalencia del alelo s1a/m1 en aislados colombianos de
pacientes con gastritis, ulcera duodenal y cáncer gástrico38. En concordancia
con estos hallazgos Tytgat et al. describe que en Centro y Sur América se
encuentra en mayor proporción el alelo vacA-s1a. Sin embargo, en contraste
con estos estudios, Van Doorn y col. en una investigación de 735 aislados de
24 ciudades diferentes reportan que en Centro y Sur América todas las cepas
s1 fueron s1b en su mayoría m125. A este respecto se confirma que las cepas
de Helicobacter están distribuidas geográficamente con alelos característicos
en cada una de las regiones, y que esta variabilidad puede estar implicada en
el desarrollo de las diferentes patologías en diversos países.
Las diferencias observadas en la distribución alélica del gen vacA en las
patologías en estudio, sugieren que en nuestra población existe una alta
prevalencia de cepas con mayor potencial patogénico, lo cual explicaría en
parte, la alta prevalencia de enfermedades gástricas en esta población.
80
En este estudio se observó una prevalencia relativamente alta de cepas s2/m2
en aislados de pacientes con gastritis crónica, lo cual puede ser una explicación
para el hecho de que gran parte de la población infectada desarrolla gastritis
asintomática. De igual forma, los pacientes con cepas virulentas tendrían
mayor probabilidad de desarrollar enfermedades severas, definidas también
por factores ambientales, costumbres alimenticias y factores genéticos.
Atherton y col.22 sugieren que la existencia de las diferentes combinaciones en
la secuencia señal y región media de los alelos de vacA, puede ser resultado de
la recombinación genética in vivo. De hecho, los eventos de recombinación
entre diversas cepas H. pylori son comunes y parecen estar limitados a
diferentes áreas geográficas.
Diferentes estudios, muestran que entre el 60 y 70% de las cepas de
Helicobacter pylori poseen el gen cagA31,76,77 lo cual esta de acuerdo a los datos
obtenidos en nuestra población puesto que se encontró que 63.7% de los
aislados fueron cagA+. Existe controversia acerca de la utilidad de cagA como
marcador de cepas mas virulentas puesto que las cepas cagA+ han sido
aisladas con mayor frecuencia de pacientes con ulcera péptica.
Aunque el análisis estadístico no mostró diferencias significativas que permitan
relacionar la infección por diferentes cepas con determinadas patologías, se
encontró que el 80% de los aislados de H. pylori de pacientes con
81
adenocarcinoma gástrico fueron cagA+, de la misma manera, se observó una
alta prevalencia del gen cagA+ en los aislados de pacientes con diagnostico de
ulcera péptica. Estos hallazgos sugieren que aunque las cepas cagA+ están
asociadas a las patologías mas severas la presencia del gen no sirve como
marcador que permita diferenciar cepas ulcerogénicas y carcinogénicas en la
población estudiada. Se requieren estudios adicionales que permitan
determinar si existen diferencias en la expresión de estos genes en los
diferentes aislados.
Algunos investigadores reportan que se requiere la presencia completa del PAI
cag para que la bacteria pueda inducir el daño epitelial. En nuestra población,
hace falta investigar si los aislados de Helicobacter pylori que contienen el gen
cagA expresan la proteína (Cag A) y en qué forma contienen el PAI cag. Maeda
et al. en un estudio con aislados japoneses, afirma que la presencia del gen
cagA no necesariamente indica la presencia intacta del PAIcag y por lo tanto no
puede ser usado como marcador de cepas mas virulentas.40
Estudios varios muestran que la región 5’ en la estructura del gen cagA es la
región conservada; la región 3’ es conocida como la región variable y se
caracteriza por poseer regiones repetitivas implicadas en la producción y el
tamaño de la proteína CagA78. En este estudio, los primers utilizados
(cagAF/cagAR) para evaluar la presencia del gen cagA amplifican un fragmento
de 183 pb de la región 5’ y son conocidos universalmente; por lo tanto, solo
82
nos indican la presencia o ausencia del gen. A este respecto, se hace necesario
estudiar la región 3’ del gen en aislados nativos de la población colombiana,
puesto que las diferencias en la estructura de cagA pueden ser útiles como
marcador molecular y filogenetico en la procedencia de las cepas o como
marcador de una enfermedad especifica.
Otro hecho importante que se observa, es la alta prevalencia del gen iceA en
84.4% de los aislados analizados. Sin embargo, al relacionar la presencia del
gen con las diferentes patologías no se encontraron asociaciones significativas,
lo cual esta de acuerdo a un estudio de Yamaoka y col. comparando aislados
de diferentes ciudades en donde incluyeron 107 cepas de la población
colombiana (Santafé de Bogotá).38
Vale la pena destacar la prevalencia relativamente alta del alelo iceA1(48.4%)
en aislados de ulcera péptica y de iceA2 (47.6%) en pacientes con
adenocarcinoma gástrico. Aunque estas observaciones no son estaditicamente
significativas muestran una tendencia que puede estar subestimada por el
número de aislados analizados. Sin embargo, seria interesante comprobar si la
presencia de un alelo iceA particular es útil para dieferencias cepas
carinogenicas o ulcerogenicas. A este respecto, existe controversia frente al
verdadero papel del gen iceA como marcador de virulencia, pues existen
estudios en los cuales se demuestra una fuerte asociación entre la presencia
del gen iceA1 y enfermedad ulcero-péptica.73 En desacuerdo con estos
83
estudios, Ito et al. demuestra que el genotipo iceA no es un marcador de
virulencia en el desarrollo de gastritis o ulcera péptica y que se requieren otros
genes o factores incluyendo la susceptibilidad genética del hospedero.51
La presencia de cagA fuertemente asociada a cepas vacAs1 fue confirmada en
este estudio 23,71,72. Recientemente VanDoor y col, sugieren que cepas con
genotipo vacAs1/cagA+/iceA1 son más patogénicas y se encuentran
predominantemente en pacientes con enfermedad ulcerosa. En contraste,
cepas vacAs2/cagA-/iceA2 son menos patogénicas y se aíslan de pacientes que
no presentan enfermedad ulcero péptica. El presente estudio muestra la misma
tendencia, observando una alta prevalencia del genotipo vacAs1/cagA+/iceA1
aislado de pacientes con adenocarcinoma gástrico, seguido de los aislados de
pacientes con ulcera péptica. El hecho de que la frecuencia del genotipo
vacAs1/cagA+/iceA1 sea similar entre pacientes con cáncer y úlcera, sugiere
que la bacteria puede jugar un papel patogénico similar en las dos patologías.
Teniendo en cuenta que el genotipo vacAs1/cagA+ se encuentra relacionado
con el efecto citotoxico y la capacidad de la cepa para inducir ulcera péptica ó
adenocarcinoma gástrico, es importante determinar si estos genotipos están
asociados con diferentes grados de citotoxicidad. Es posible, que el desarrollo
de las enfermedades mas severas este relacionado con el tiempo de infección
por Helicobacter, asi, los pacientes que tienen infección con cepas mas
virulentas y no desarrollan síntomas de enfermedad pueden tener la infección
reciente, mientras que en los pacientes que adquirieron la infección durante la
84
infancia la cepa puede persistir por muchos años (toda la vida) en el
hospedero23 y de alguna manera desencadenar patología gástrica.
Es importante resaltar, la presencia de alelos múltiples en varios casos, lo que
implica la presencia de múltiples cepas en un mismo paciente. Este resultado
concuerda con otras investigaciones en las cuales se ha reportado la presencia
de infecciones múltiples especialmente en áreas con una alta prevalencia de
infección con Helicobacter pylori.25,79 Es posible, que los diferentes genotipos
entre cepas de un mismo paciente, puedan ofrecer ventajas a la bacteria para
sobrevivir en los diferentes nichos ecológicos en la mucosa gástrica, o que se
presente cierta competencia entre cepas por mantenerse en el ambiente
gástrico. Es necesario investigar si la infección con genotipos múltiples
incrementa el riesgo de desarrollar las enfermedades mas severas o esto se
presenta como un suceso independiente.
En relación al desarrollo de patología gastroduodenal y su asociación con
Helicobacter pylori, se considera que la bacteria es un factor perturbador en la
barrera mucosa87,88 y que de alguna manera ésta queda desprotegida a la
agresión ácido péptica; el desarrollo de diversas patologías sugiere una
evolución desde la mucosa normal hasta la aparición de cáncer gástrico; de
modo que la bacteria induce eventos genéticos y alteraciones fenotípicas de la
mucosa aumentando las lesiones ocasionando las patologías mas agresivas.
63,80,81 Como se menciono anteriormente, es este estudio se observo alta
85
prevalencia de los alelos (genes) mas citotoxicos lo cual explica en parte la alta
prevalencia de enfermedades gástricas en nuestra población, particularmente
de las enfermedades más severas.
La infección por Helicobacter pylori es curada efectivamente con antibióticos,
mediante el uso de regímenes triples y cuádruples que contienen al menos dos
antibióticos, sales de bismuto, antagonistas de H2, inhibidores de la bomba de
protones entre otros. Recientemente, Van Doorn y col. en un estudio donde
investiga la eficacia en la erradicación de la infección por Helicobacter en
relacion con la presencia de diferentes genotipos vacA y cagA, demostró que
las cepas menos toxigénicas (s2/m2 cag-) son menos resistentes a la terapia
antimicrobiana que las cepas s1/m1/ cag+ y s1/m2 / cag+ respectivamente. Así
como también las cepas mas toxigénicas en respuesta al tratamiento
desencadenan mayor inflamación y daño epitelial.82 83 Así, la población
colombiana infectada con cepas más virulentas, no solamente está expuesta a
un mayor riesgo de desarrollar enfermedades severas, sino que requerirá
tratamientos de errdicación más agresivos que aseguren la eliminación de la
bacteria. La genotipificación de aislados de Helicobacter en nuestra población,
es un aporte importante en la terapia antimicrobiana contra la infección que
puede ser valioso en el tratamiento de enfermedad gastroduodenal empleado
actualmente.
86
Estudios recientes sugieren la existencia separada de linajes bacterianos en
diferentes partes del mundo.84,85,86 La distribución genotipica de Helicobacter
pylori en la población colombiana comparada con otras partes del mundo es de
gran aporte para la realización de estudios filogenéticos, en donde se puedan
establecer las diferentes mutaciones en los aislados nativos, analizar los
diferentes alelos para tener puntos de comparación y discutir el origen de las
variaciones alélicas. Como se observo, en el desarrollo de este estudio, se
encontraron algunas variaciones con respecto a otros estudios, que pueden
obedecer a diferentes causas, entre ellas la selección de pacientes y el grupo
de estudio.
En general, este trabajo permitió corroborar la existencia de múltiples
genotipos de Helicobacter pylori en la población estudiada, si bien es claro que
existe una distribución homogénea de tales genotipos en las diferentes
patologías, particularmente del genotipo asociado a mayor virulencia
(vacAs1/cagA+/iceA+ ). Si bien la presencia del genotipo virulento puede
asociarse con la presencia de las enfermedades más avanzadas (ulcera péptica
y cáncer gástrico), carece de valor pronóstico para definir el riesgo de
carcinogénesis, por lo menos bajo las condiciones de este estudio. Finalmente
la alta prevalencia de los genotipos s1m1caga con mayor resistencia a las
terapias de erradicación es un señal de alerta que debe tenerse en cuenta para
el manejo y tratamiento de la población infectada en Colombia.
87
8. CONCLUSIONES
§ Se adaptaron con éxito los protocolos de PCR (reacción en cadena de la
polimerasa) permitiendo analizar los genes implicados en la mayor de
virulencia de Helicobacter pylori en Colombia, lo cual es de gran
importancia para su uso como herramienta diagnostica y como base para
estudios posteriores.
§ Se logro corroborar la asociación existente entre los alelos s1/m1 de vacA
y la presencia del gen cagA+. Adicionalmente, la presencia del gen iceA ni
de alguno de sus alelos parece estar asociado con el curso clínico de la
enfermedad.
§ El presente estudio permitió determinar que existe una distribución
homogénea de los genotipos de Helicobacter pylori en las diferentes
patologías, sin embargo aunque la presencia del genotipo s1m1cagA+iceA+
puede asociarse con las enfermedades mas graves no es un marcador para
definir el riesgo de desarrollar ulcera péptica ó adenocarcinoma gástrico en
nuestra poblacion. Adicionalmente, se deberán considerar factores medio
ambientales y genéticos del hospedero que posiblemente expliquen el
desarrollo de las diferentes patologías.
88
§ De acuerdo con la distribución genotipica de Helicobacter pylori observada
en este estudio se confirma que las cepas están distribuidas
geográficamente con alelos característicos propios en cada una de las
regiones de donde fue aislada la bacteria y que esta variabilidad puede
estar implicada en el desarrollo de las diferentes patologías.
§ Los resultados muestran que los diferentes genotipos encontrados en la
población colombiana carecen de valor pronóstico que nos permita
diferenciar cepas “carcinogénicas” y “ulcerogénicas”. Sin embargo, el
hallazgo de tan alta prevalencia de genotipos resistentes a la terapia
antimicrobiana es una señal de alerta para evaluar la eficacia del
tratamiento de erradicación en pacientes con enfermedad gástrica.
89
9. PERSPECTIVAS
El estudio del polimorfismo genético de Helicobacter pylori es una herramienta
clave para el desarrollo de estudios posteriores que permitan determinar la
historia natural de la infección que conduce al desarrollo de enfermedad
gastroduodenal como gastritis, ulcera péptica y adenocarcinoma gástrico;
analizar la interacción bacteria – hospedero y la relación con factores
ambientales y genéticos en aislados de la población colombiana.
Es necesario tipificar aislados bacterianos de diferentes zonas geográficas que
permitan un conocimiento mas amplio respecto a la distribución genotipica de
Helicobacter en la población colombiana. Este estudio muestra resultados
importantes para continuar el análisis del polimorfismo genético de
Helicobacter pylori en nuestra población: seria interesante, comprobar si la
presencia del islote de patogenicidad cag completo puede ser usado para
diferenciar cepas ulcerogénicas o carcinogénicas. Las diferencias en la
estructura del PAI cagA pueden ser útiles como marcadores moleculares en la
procedencia de las cepas o como marcadores de una enfermedad especifica.
Es importante estudiar la región 3’ del gen cagA, en aislados nativos puesto
que las diferencias en su estructura pueden ser útiles como marcador
90
molecular y filogenético en la procedencia de las cepas, o como marcador en el
desarrollo de una enfermedad especifica.
El hallazgo de alta prevalencia de genotipos asociados a mayor resistencia
antimicrobiana es una señal de alerta para evaluar la eficacia del tratamiento
de erradicación de la infección en pacientes con enfermedad gastrica en la
población colombiana.
Finalmente, la genotipificación de Helicobacter pylori permitirá a largo plazo el
desarrollo de antibióticos y vacunas que estén de acuerdo con las necesidades
propias de la población colombiana para combatir la enfermedad
gastroduodenal.
91
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99
ANEXO 1
APROBACION DEL PACIENTE PARA LA TOMA DE MUESTRA GASTRICA NOMBRE DEL PACIENTE: __________________________________________ HC: _________________ DIAGNOSTICO:____________________________ FECHA:______________
El INC, en colaboración con el Hospital de la Samaritana, esta realizando un estudio en enfermedad gastroduodenal, en particular, se pretenden establecer las características por las cuales una bacteria (Helicobacter pylori) puede conducir al desarrollo de gastritis, ulcera péptica y cáncer gástrico en la población Colombiana. Su colaboración es de vital importancia para nosotros, porque la investigación en la cual participa traerá consigo beneficios para la comunidad en general. Si Ud. Tiene a gusto colaborar su participación consiste en: 1. Permitir la toma de una biopsia gástrica, la cual será tomada por un medico
especializado por medio de una endoscopia. 2. Obtener una muestra de su sangre. 3. Autorizar la revisión de su historia. 4. Autorizar el procesamiento de las muestras para el estudio. La decisión que Ud. tome es voluntaria y no influirá en el tratamiento que recibe esta institución. Luego de conocido el objetivo de la presente, yo: _________________________________________________________ Identificado CC____________________ acepto mi participación voluntaria en el estudio a realizar. Firma_____________________________
100
ANEXO 2
TAMIZAJE DE ENFERMEDAD GASTRODUODENAL
Número de registro:_________________ I. DATOS GENERALES 1. FECHA DE RECOLECCION DE DATOS:_______________(D/M/A) 2. PACIENTE: _______________________ 3. C.:_________________ 4. EDAD:_______________ (años) SEXO: F M 1. PROCEDENCIA: 0. No sabe 5. Valle y Nariño 1. Bogotá 6. Amazonas y llanos 2. Altiplano C/Boyacense 7. Otro. 3. Costa Atlántica 4. Costa Pacifica II. PATOLOGIA DE BASE 1. GASTRITIS ATROFICA 2. GASTRITIS CRONICA 3. CANCER GASTRICO OTRAS PATOLOGIAS:____________________________________________ III. SIGNOS Y SINTOMAS 0. Asintomático 6. Nauseas y vomito 1. Pirosis 7. Distensión abdominal 2. Ardor retroesternal 8. Perdida de peso 3. Epigastralgia 9. Melenas y/o hematemesis 4. Llenura fácil 10. Dolor bajo Abdominal 5. Acidez 11. Otros IV. TRATAMIENTOS ANTERIORES AL ESTUDIO 0. Ninguno 6. Radioterapia 1. AINES u otro antiinflamatorio 7. antioxidantes 2. AntihistaminicosH2 8.Amoxacilina+Metronidazol+Omeprazol 3. Bloqueadores Bomba de protones 9. Amoxacilina+Bismuto+Ranitidina 4. Protectores de mucosa 10. Lanzoprasole+Claritromicina 5. Quimioterapia 11. Otros
101
V. DIAGNOSTICO ENDOSCOPICO 1. Endoscopia Normal 6. Gastritis Crónica 2. Atrofia Gástrica 7. Gastritis Crónica activa 3. Gastritis Atrofica 8. Ulcera gástrica 4. Metaplasia Intestinal 9. Cáncer Gástrico 5. Gastritis Aguda Erosiva VI. ANALISIS DE LABORATORIO 1. Ureasa Rápida: Positivo Negativo VII. DIAGNOSTICO PATOLOGICO Helicobacter pylori: Positivo Negativo TIPO 1. Normal 2. Gastritis Aguda 3. Gastritis Crónica 4. Atrofia Gástrica 5. Otros
102
ANEXO 3
PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE Helicobacter pylori
Agar Helicobacter pylori medium
Observación de colonias traslúcidas en gota de rocío.
Colonias de Helicobacter pylori en cultivo. Tomada de Lee y Mégraud 1996
Ureasa
Helicobacter pylori posee la enzima ureasa, la cual hidroliza urea produciendo
amonio y CO2. El reactivo utilizado se compone de urea al 10% y rojo de fenol
0.1% en H2O estéril. Se observa un cambio de color en el rojo de fenol debido
a la alcalinización del medio. H.pylori da una reacción positiva en 1-3 min, el
reactivo cambia de color amarillo a fucsia.
Catalasa
La catalasa es una enzima que se encuentra en diferentes especies
bacterianas y es utilizada para su identificación. Descompone el peroxido de
hidrogeno en oxigeno y agua. Se observa la producción de gas (burbujas) al
contacto de las bacterias con el peroxido.
Se debe cuidar la interpretación de falsos positivos, por reacciones con
enzimas distintas a catalasa o por componentes del medio bacteriano.
103
Coloración de Gram
Helicobacter es un bacilo gramnegativo espirilar o curvado con forma de “S” o
“coma”. Cuando se adiciona la safranina en la coloración, la bacteria
adquiere el colorante observándose al microscopio de color rosado o rojo.
104
ANEXO 4
CURVA DE CALIBRACION PARA AJUSTAR LA CONCENTRACION
BACTERIANA DE Helicobacter pylori
Todas las suspenciones bacterianas obtenidas para el aislamiento de DNA,
mediante las DO fueron llevadas a una concentración de 5x108 Bac/ml
utilizando la curva de calibración previamente realizada.
Curva de calibración para la concentración bacteriana
DO vs. Concentración H.pylori
ECUACION 1y = 1E+09x - 7E+07
R2 = 0,9966
0,0,E+00
1,0,E+08
2,0,E+08
3,0,E+08
4,0,E+08
5,0,E+08
6,0,E+08
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
DO (200ul/450nm)
No.
de
Bac
teri
as/m
l
105
ANEXO 5
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Técnica de biología molecular basada en efectuar una replicación repetitiva in
vitro de una secuencia especifica de DNA, mediante la cual es posible obtener
millones de copias idénticas, a partir de un molde inicial. Al amplificar o copiar
varias veces una misma secuencia de DNA aumenta la sensibilidad permitiendo
el diagnóstico molecular y el estudio de la expresión de genes
PROCEDIMIENTO DE PCR
Obtener el material genético de cualquier muestra biológica
Precisar la secuencia de nucleótidos o secuencia especifica a amplificar.
Diseñar o escoger los primer que sirven de señal para que a partir de ellos actúe la DNA polimerasa.
Realizar mezcla de PCR que incluye el DNA en estudio, los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) iones Mg2+CL + , Taq Polimerasa, Buffer
Los tubos de PCR se colocan en un termociclador. ( desnaturalización, hibridación y extensión del DNA)
Los productos de PCR se corren en un gel de agarosa por electroforesis.