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Analisi di laboratorio e prove di campoper la valutazione qualitativa dei compost
Consiglio per la ricerca in agricoltura e l’analisidell’economia agraria, Centro di Ricerca per l'Orticoltura diPontecagnano (SA) (Crea-Ort)
Massimo Zaccardelli
Potenza, 26 Maggio 2016
Azione C1: Monitoring of composting processes andcharacterization of compost quality
Analisi dei compost: pHE.C.attività idrolasica totalefitotossicità/biostimolazione caratterizzazione microbiologica soppressività
Potenza, 26 Maggio 2016
pH, EC, N tot., FDA (attività idrolasica) dei compost
EC N Totale Att. IdrolasicaS cm-1) (%) (μg FDA g-1 d.s. 2h-1)
L1 7,77 1.722 0,69 3,21L2 8,43 1.316 1,28 1,82L3 9,10 2.639 1,55 2,93L7-8 8,82 2.684 1,68 3,83L2C 8,21 1.850 1,85 2,70L1A 7,73 1.620 0,67 7,04L4 8,73 2.258 1,55 8,27L7A 8,20 2.324 2,96 2,6L2A 9,02 1.514 1,68 12,00L3A 8,59 1.564 1,42 11,37L4A 7,00 1.339 1,89 2,60L5/6A 6,95 1.950 1,32 2,7CV 8,57 6.591 1,45 7,66TO M.P. 8,38 2.982 1,79 6,84S.S. TO 7,92 1.904 1,62 16,26
Compost pH
Potenza, 26 Maggio 2016
Caratteristiche microbiologiche dei compost
Potenza, 26 Maggio 2016
Batteri Totali
Funghi Totali
L1 8,59 4,67L2 7,78 4,23L3 7,48 5,92L7-8 7,59 6,36L2C 6,98 4,56L7A 5,88 5,23L1A 7,98 6,00L4 12,56 5,15L2A 6,76 3,30L3A 6,62 4,00L4A 8,12 5,96L5/6A 8,16 5,19CV 6,21 4,78S.S. TO 6,00 3,85TO M.P. 8,78 4,19
Compost(Log10 u.f.c. g-1)
Enterobatteri Clostridi E. coli Salmonella Streptococchi
L1 0 0 0 0 15,0 0,9 0L2 0 4,48 0 0 9,5 4,5 0L3 0 4,00 0 0 25,0 4,5 0L7-8 0 3,68 0 0 9,5 4,5 0L1A 0 2,60 0 0 9,5 0,4 0L4 0 0 0 0 140,0 45,0 0L2A 0 3,73 0 0 0,9 0,4 0L3A 0 3,38 0 0 0 0 0L4A 0 3,78 0 0 0,4 0 0L5/6A 0 0 0 0 7,5 2,5 0L7A 0 3,24 0 0 9,5 0,9 0L2C 0 2,52 0 0 9,5 0 0CV 0 0 0 0 9,5 0 0S.S. TO 0 0 0 0 4,5 0,9 0TO M.P. 0 0 0 0 4,5 0 0
Compost (M.P.N./g)Log10 u.f.c./g)
Coliformi fecali
Coliformi totali
Caratteristiche microbiologiche dei compost
Potenza, 26 Maggio 2016
0
25
50
75
100
L1 L2 L3
L7-8
TO M
.P.
S.S.
TO
L1A L4 CV
L2A
L3A
L4A
L5/6
A
L7A
RhizoctoniaSclerotinia
Inci
denz
a di
pia
ntin
e m
alat
e (%
)
* *
Valutazione della Soppressività dei compost
Potenza, 26 Maggio 2016
Isolamento di batteri antagonisti termoresistenti
Rhizoctonia Sclerotinia
L1 6 0 0L2 11 6 7L3 24 24 5L7-8 19 5 12TO M.P. 16 0 0S.S.TO-MP 14 13 10L1 A 14 4 4L4 8 7 6CV 11 8 8L2A 4 1 0L3A 21 6 9L4A 17 1 1L5/6A 6 0 0L7A 13 7 5
N° Isolati antagonisti di:N° isolati termoresistentiCOMPOST
Potenza, 26 Maggio 2016
Induzione di resistenza in planta
Potenza, 26 Maggio 2016
Valutazione dell’espressione in planta dei principali geni coinvolti nell’induzione diresistenza a seguito dell’interazione pianta microorganismi mediante real time PCR
Pathway metabolici di risposta ai PGPR
Calmoduline (CaM) e calmoduline-like proteins (CMLs) •Calmodulin-like protein - IPR011992 EF-Hand type•Jasmonate ZIM-domain protein 1 - IPR010399 Tify •Calmodulin-like protein - IPR018248 EF hand•Calcium-transporting ATPase 1 - IPR006408
Ethylene-responsive element binding factors (ERF)
•Ethylene-responsive transcription factor 4•Ethylene-responsive transcription factor 10•Ethylene-responsive transcription factor 1•Ethylene responsive transcription factor 2a
Sostanze antibiotiche prodotte dai Bacillus spp.
Potenza, 26 Maggio 2016
2. Bacilisina
1. Surfactina
3. Iturina
5. Fengicina
4. Bacillomicina-D
Patogeni targetBotritis cynereaSclerotinia sclerotiorumFusarium graminearumPenicillium expansumRhizoctonia solani
1 2 3 4 5MW
Potenza, 26 Maggio 2016
Le molecole indicate precedentemente sono peptidi non ribosomiali(NRPS) e quelle appartenenti alla famiglia delle surfactine sono le piùstudiate.
A causa della loro natura anfipatica, le surfactine si integranorapidamente nel doppio strato delle membrane e ne alterano la stabilità.
Meccanismo di azione delle Surfactine
Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)
Potenza, 26 Maggio 2016
• L’analisi si basa sulla digestione, con enzimi four-cutter, di prodotti di PCR ottenuti utilizzando un oligomarcato con fluoroforo (es. FAM, HEX).
• La tecnica fornisce informazioni circa la diversità presente nel microbioma di un determinato campione.• Il risultato di tale tecnica è un elettroferogramma che descrive un profilo di
diversità della comunità microbica in relazione all’altezza ed ampiezza deipicchi presenti nel grafico.
Potenza, 26 Maggio 2016
Al fine di collegare la diversa soppressività dei compost alla diversa composizionemicrobiologica degli stessi, in due compost con differente soppressività (bassa edelevate), si è scelto di applicare un approccio di tipo metagenomico attraverso ilsequenziamento degli ampliconi 16S (batteri) e 18S (funghi).
Next Generation Sequencing per lo studio della biodiversità
elevata soppressivitàbassa soppressività
Compost
Estrazione DNA dal compost
Sequenziamento ampliconi 16S e 18S
Identificazione microorganismi
Analisi bioinformatica
Enzimi coinvolti nei principali cicli dei nutrienti nei suoli:•Fluoresceina diacetato idrolasi•Deidrogenasi•‐glucosidasi•Invertasi•‐galattosidasi•Glucosaminidasi•Fosfomonoesterasi•Arilsolfatasi•Ureasi•Nitrato reduttasi
Proprietà funzionali e metaboliche del suolo:•Carbonio microbico•Biomassa microbica (DNA)•Respirazione•Biolog Ecoplate•Apyzim•Ergosterolo
Potenza, 26 Maggio 2016
Azione C2: Monitoring of soil organic carbon stabilization and the improvement of physical and biological soil fertility
Enzima Substrato Ciclo
‐ glucosidasi e ‐ galattosidasi Cellulosa C
Invertasi Saccarosio
N‐acetyl –‐glucosaminidasi Chitina N
Nitrato reduttasi Nitrati
Ureasi Urea
Fosfatasi (mono‐e diester‐) Esteri fosforici P
Solfatasi Esteri solforati S
Deidrogenasi Enzimi idrolitici coinvolti in molteplici degradazioni
Fluoresceina diacetato idrolasi
Principali enzimi investigati e loro funzione nel suolo
Potenza, 26 Maggio 2016
Biolog Ecoplate
La diversità funzionale dipende da molteplici reazioni metaboliche e interazionimicrobiche pertanto è necessario determinare simultaneamente molteplici attività.
La diversità funzionale del suolo
Piastra con 31 differenti fonti carboniose, intriplicato, con un cromoforo per laquantificazione della crescita microbica
Potenza, 26 Maggio 2016
Analisi del contenuto di ergosterolo
L’ergosterolo è un lipide di membrana presente quasi esclusivamente nelle ife fungine e si degrada
rapidamente dopo la morte dell’ifa
Rappresenta una frazione piuttosto costante della biomassa fungina, circa 0,5 – 1,5 %
Per tali motivi la sua determinazione rappresenta una stima attendibile della biomassa fungina del suolo
Potenza, 26 Maggio 2016
La biomassa microbica come indicatoreLa biomassa microbica del suolo, include batteri, funghi, actinomiceti, alghe eprotozoi, e rappresenta un buon indicatore di qualità del suolo poiché imicrorganismi sono coinvolti in molteplici attività.
Determinazione:•Carbonio associato alla biomassa microbica
•Quantificazione DNA estraibile da suolo
Approccio classico, per mezzodel’ossidazione del carbonio microbico.
Estrazione da suolo
Corsa elettroforetica
Quantificazione fluorimetrica
Potenza, 26 Maggio 2016
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
µg N
H4-
N g
-1 h
-1
Ureasi
0
5
10
15
20
25
30
35
g fl
uore
scei
na g
-1h-
1
Attività idrolasica
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
μg N
O2-
N g
-1h-
1
Nitrato-reduttasi
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
μmol
pN
P g-
1h-
1
Glucosaminidasi
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
μmol
pN
P g-
1h-
1
-Glucosidasi
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
μg T
PF g
-1h-
1
Deidrogenasi
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
μmol
pN
P g-
1h-
1
-Galattosidasi
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
μmol
g-1
h-1
Invertasi
1,5
2
2,5
3
3,5
Shan
non
Inde
x, 9
6h
Biolog Ecoplate – H index
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
24 48 72 96
AW
CD
Tempo di incubazione
ControlloOrgano-mineraleCompost on-farm 10 t/haCompost on-farm 20 t/ha
Biolog Ecoplate – AWCD
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
μmol
pN
Pg-
1h-
1
Fosfomonoesterasi
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
μmol
pN
P g-
1h-
1
Arilsolfatasi
Azione C3:Monitoring of the agronomical, phytopathological and practical sustainability of proposed strategies
Potenza, 26 Maggio 2016
Produzione commerciale di scarola
Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale (75 + 63 kg/ha N)C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza secca + 63 kg/ha N D) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca + 63 kg/ha N
Lettere diverse indicano valori statisticamente differenti per P=0,05 (HSD Tukey test)
Potenza, 26 Maggio 2016
Peso cespo tolettato scarola
Lettere diverse indicano valori statisticamente differenti per P=0,05 (HSD Tukey test)
Potenza, 26 Maggio 2016
Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale (75 + 63 kg/ha N)C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza secca + 63 kg/ha N D) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca + 63 kg/ha N
Contenuto sostanza secca cespo commerciale
Lettere diverse indicano valori statisticamente differenti per P=0,05 (HSD Tukey test)Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale (75 + 63 kg/ha N)C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza secca + 63 kg/ha N D) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca + 63 kg/ha N
Potenza, 26 Maggio 2016
Produzione di ZUCCA
Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale (85 + 40 kg/ha N) C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza secca (40 kg/ha N) D) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca (40 kg/ha N)
B
AB
A
B
AB
AAB AB
Lettere diverse indicano valori statisticamente differenti per P=0,05 (HSD Tukey test)
Potenza, 26 Maggio 2016
ZUCCA – Numero frutti commerciabili per pianta
Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale (85 + 40 kg/ha N) C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza secca (40 kg/ha N) D) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca (40 kg/ha N)
Lettere diverse indicano valori statisticamente differenti per P=0,05 (HSD Tukey test)
Potenza, 26 Maggio 2016
Andamento dei valori SPAD su SCAROLA durante il ciclo 2014‐2015(media delle tre ripetizioni)
Potenza, 26 Maggio 2016
Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale (75 + 63 kg/ha N)C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza secca + 63 kg/ha N D) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca + 63 kg/ha N
Andamento dei valori SPAD su ZUCCA durante il ciclo primaverile‐estivo 2015(media delle tre ripetizion)
Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale (85 + 40 kg/ha N) C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza secca (40 kg/ha N) D) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca (40 kg/ha N) Potenza, 26 Maggio 2016
Monitoraggio dei nitrati del suolo durante la coltivazione di SCAROLA e ZUCCA (ott. 2014‐agosto2015)
‐
10
20
30
40
50
60
70
80
A B C D
NO‐3 ppm estate
Potenza, 26 Maggio 2016
Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza seccaD) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca
‐ 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
A B C D
EC estivo (dSm‐1)
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
A B C D
EC invernale (dSm‐1)
Monitoraggio della conducibilità elettrica del suolo durante la coltivazione di SCAROLA e ZUCCA (ott. 2014‐agosto2015)
Potenza, 26 Maggio 2016
Tesi sperimentali:A) Controllo non concimato B) Concimazione organo‐minerale C) Compost aziendale 10 t/ha di sostanza seccaD) Compost aziendale 20 t/ha di sostanza secca
Potenza, 26 Maggio 2016
Attività in corso e future- Approfondimento della caratterizzazione microbiologica dei compost mediante
metodi non colturabili (T-RFLP);
- Valutazione delle popolazioni microbiche nei 2 compost che hanno mostratoproprietà di soppressività differenziali (NGS);
- Valutazione delle attività enzimatiche nei suoli dopo 4 ammendamenti(2 anni);
- Valutazioni agronomiche dei compost su altri 2 cicli colturali;
- Monitoraggio in pieno campo dei nitrati, della EC e del pH nel suolo
Potenza, 26 Maggio 2016
RingraziamentiRiccardo Scotti e Roberto Sorrentino
Catello PanePaola Iovieno
Antonietta NapolitanoFrancesco Raimo
Alfonso PentangeloGiulia Alfano
Michele Caputo, Domenica Villecco, Armida Del Galdo