tema 9j opticki, piezo i kalorimetrijski biosenzori.ppt

OptiOptički, piezo i čki, piezo i kalorimetrijski kalorimetrijski

biosenzoribiosenzori

OptiOptički, piezo i čki, piezo i kalorimetrijski kalorimetrijski

biosenzoribiosenzori

BH

Oblast biosenzora koji koriste optičku detekciju jako je razvijena poslednjih godina uglavnom zbog prednosti optičkih sistema

Osnova ovih sistema su enzimske reacije koje menjaju optičke osobine nekih supstanci i na taj način im omogućavaju da emituju svetlost pri osvetljvanju (ekscitaciji)

Načini optičke detekcije obuhvataju fluorescencu, fosforescencu, hemi/bioluminiscenciju

OPTIOPTIČČKI BIOSENZORIKI BIOSENZORI

Prednosti optičkih biosenzora obuhvataju:

– moguća je minimizacija upotrebnom optičkih vlakana

– moguća su in situ merenja

– moguća su in vivo merenja

– diodna merenja omogućavaju multi-analitičku detekciju

– signal ne ometaju elektromegnetne interferencije

Mane optičkih biosenzora su:

– ambijenata svetlost jako smeta

– optička vlakna su vrlo skupa

– indikator faza može biti spran tokom vremena

Optička vlakna su subklasa optičkih talasovoda koji rade na principu totalne unutrašnje refleksije

Svetlost koja je pala na međupovršinu između dve dielektrične sredine biće ili reflektovana ili reflektovana prema Snell’s Law –ovom zakonu

A

BB

Prevlaka

Jezgro

Totalna unutrašnja refleksija

Ako svetlost uđe u optičko vlakno (okruženo sredinom manjeg indeksa prelamanja) pod dovoljno malim uglom svetlost će se zadržati unutar vlakna

Zbog toga se optičko vlakno sastoji od jezgra visokog indeksa prelamanja, okruženog prevlakom nešto nižeg indeksa prelamanja, a celo vlakno je zaštićeno neoptičkim omotačem

OmotačPrevlaka

Jezgro

Prevlaka

Omotač

qmax

Ulazna svetlost, a samim tim i izlazna zavise od prečnika vlakana

Kako se za fleksibilna vlakna, zahteva veoma mali prečnik, ova veličina je ograničavajući faktor u proizvodnji vlakana

Zbog toga se vlakna prave od snopova koji imaju prednost efikasnog skupljanja svetlosti i fleksibilnost

Na tržištu se mogu naći, snopovi od 8, 16 i više vlakana.

Generalno biosenzori bazirani na optičkim vlaknima koriste fluorescenciju ili hemiluminiscenciju

Ovo se bazira na činjenici da je fluorescencija bitno osetljivija od apsorbance

Ovakvo baziran biosenzor je mnogo feksibilniji zbog činjenice da je poznato da veliki broj analita i faktora menjaju emisiju odgovarajućih fluorofora

U osnovi postoje dve različite konfiguracije koje se koriste na vrhu sonde optičkog vlakana

– konfiguracija distalne kivete

– konfiguracija vezanih talasovoda

Konfiguracija distalne kivet obuhvata detekciju imobilizovanog molekula u poriznoj transparentnoj sredini na vrhu vlakna

Fluorescencija se manja kada analit difunduje i kada je vezan

Ekscitacija dolazi izvan vlakan i emisija se kupluje u vlaknu

Sonda na optičkom vlaknu

Molekul koji se detektuje

Analit

Tip konfiguracije sa vezivajućim talasovodom obuhvata vezivanje detektorskih molekula, sa obeleženim fluorescentnim (npr. antitela), sa kovalentno pričvršćenim molekulima analita na površinu vlakna

Pošto je obeleživač blizu površine on se ekscituje prolaznim talasom koji se emitije iz vlakna, a rezultujuća fluorescencija se kupluje u vlakno

Slobodni analit se takmiči za vezivajuća mesta molekula za prepoznavanje, omogućujući im da difunduju dalje od površine što za rezultat ima smanjenje fluorescence

Slobodni antigen

Imobilisani analit

Obeleženi fluorescent koji prepoznaje molekul

PIEZOELEKTRIČNI PRETVATRAČ

Princip ovog tipa senzora se bazira na otkrivanju, postoji li linearan odnos između promene u frakvenciji oscilovanja piezoelektričnog (PZ) kristala i varijacije mase na njegovoj površini

Sauerbrey je 1959. god. otkrio da je promena mase obrnuto proporcionalna promeni frekvencije rezonirajućeg kristala (obično na MHz).

F = -2.3x106F2DM/A (Sauerbrey jednačina)

Promena u masi se odigrava kada analit specifično interaguje sa bispecifičnim agensom koji je imobilizovan na površini kristala

Kristal može biti prevučen antitelima, enzimima ili organskim materijalom

Mogu se meriti promene frakvancije manje od 1MHz čime se postiže nanogramska osetljivost

Tanak kvarcAu

Električni kontakt

SAW PRETVARAČI

Surface acoustic wave (SAW). Uređaji sa akustičnim talasima sa površine rade na principu prostiranja akustoelektričnih talasa bilo duž površine kristala bilo kroz kombinaciju celokupne zapremine i površine.

Oscilacija kristala u SAW uređajima je veća , bar za faktor 10 od oscilacije kristala koji se koriste u PZ uređajima

KALORIMETRIJSKI PRETVARAČI

Enzimom katalizovane reakcije pokazuju istu promenu entalpije kao spontane hemijske reakcije

Primećeno je znatno oslobađanje toplote (5-100 kJ/mol).

Zbog toga su kalorimetrijski pretvarači univerzalno primenjivi u enzimskim reakcijama

Konstruisani termički senzori baziraju se na:

– direktnim pričvršćivanjem imobilizovanog enzima ili ćelije na termistor.

-imobilizacija enzima je u koloni u koji je termistor umetnut

T = nH/cp

Enzim Substrat -kJ/mol)

Katalaze Vodonik peroksid 100.4Holesterol oksidaza Holesterol52.9Glukoza oksidaza Glukoza 80.0Heksokinaza Glukoza 27.6Laktik dehidrogenaza Piruruvat62.1- Laktamaza Penicilin G67.0Ureaza Urea6.6Urikaza Urinska kiselina 49.1

PisačVeza/Pojačivač

Enzimski reaktor

Termistor

Aluminijumski blok

Izmenjivač toplote

Struja pufera

Uzorak

Poliuretanska izolacija

Izmenjivač toploteSpoljašnja izolacija

Unutrašnji Al blok

Referentni termister

Indikatorski termister

MB reaktor1 ml

NANOSENZOR

Optički nano senzor koji služi za in-vivo analizu u jednoj ćeliji:

-vrh sonde ima prečnik od 40-50 nm

-kraj izolacije na optičkom vlaknu ima prečnik 200 nm

-specifično antitelo je imobilisano na vrhu

-nanometarska veličina obezbeđuje blisko polje ekscitacije

-koristi se za određivanje toksičnih hemikalija (npr. bezo()piren tetrola (BPT) i benzo( )pirena (BaP)

-linija na 325 nm iz HeCd lasera služi za ekcitaciju BPT i BaP

-invertni mikroskop služi za kontrolu postavljanja sonde u pojedinačnu ćeliju

Fluorescentna svetlost se fokusira objektivom mikroskopa i šalje na brojač fotona (fotomultiplikator PMT)

Vrh nanosenzora

Nanosenzor u ćeliji

-nanostruktura je dovoljno mala da bi se locirao unutar subćelijskih struktura (jezgro, mitohondrije)

-mala struktura nanosenzora omogućava da se smesti unutar tipične ćelije sisara a da ne načini nikakvu štetu

-nakon unošenja nnosenzora u pojedinačnu ćeliju ona može nastaviti svoje rutinske funkcije kao što je mitoza

-moguće je detektovati samo nekoliko molekula BPT u pojedinačnoj ćeliji

Shematski prikaz aparture za primenu nanosenzora

-nisko magnetno polje omogućava da se merenje

izvede unutar same ćelije sa neznatnom pozadinom (pozadinski šum)

-odlična osetljivost i reproduktivnost

-određuju se pikomolarne koncentracije u

jednoj ćeliji

-tipično inkubaciono vreme u ćeliji je pet minuta