skripsi - core.ac.uk · dilaporkan bahwa tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung dengan...
Post on 16-Mar-2019
234 Views
Preview:
TRANSCRIPT
KANDUNGAN GLIKOSIDA JANTUNG DAN PROFIL PERTUMBUHAN KALUS DAUN KAMBOJA JEPANG
( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) DALAM MEDIA TUMBUH MURASHIGE - SKOOG
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Melissa Wijaya
NIM : 038114112
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2007
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
The fear of the LORD is the beginning of knowledge,
But fools despise wisdom and instruction.
( Proverbs 1 : 7 )
Trust in the LORD with all your heart,
And lean not on your own understanding.
In all your ways acknowledge HIM,
And He shall direct your paths.
( Proverbs 3 : 5‐6 )
I can do all things through Christ who strengthens me.
( Philippians 4: 13 )
I dedicated this masterpiece to :
My Savior Jesus Christ
My beloved Dad and Mom
My Brother Samuel
My Benny Bear
My Almamater
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah Bapa di surga, atas limpahan berkat dan
kasih-Nya yang tak terhingga, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang
berjudul “Kandungan Glikosida Jantung dan Profil Pertumbuhan Kalus Daun
Kamboja Jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) Dalam Media
Tumbuh Murashige-Skoog”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat
memperoleh gelar sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi, Universitas
Sanata Dharma, Yogyakarta.
Skripsi ini dapat terselesaikan karena bantuan, bimbingan, saran,
dukungan, cinta dan doa yang tulus dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan
segala kerendahan hati, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih kepada:
1. Kedua orang tua penulis, Kusnadi Widjaja dan Tuti Setiawati, dan kakak
penulis, Samuel Wijaya, terima kasih atas doa, cinta, kasih sayang dan
pengorbanannya.
2. Rita Suhadi M, Si., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta.
3. Ign.Y. Kristio Budiasmoro, M.Si selaku dosen pembimbing yang telah
berkenan membimbing, mengarahkan dan memberikan saran kepada penulis
dalam menyelesaikan skripsi ini.
4. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt selaku dosen penguji yang bersedia untuk
menguji dan memberi saran dalam skripsi ini.
5. Christine Patramurti, M.Si., Apt selaku dosen penguji yang bersedia untuk
menguji dan memberikan saran dalam skripsi ini.
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6. Benny Sugientoro, S.Farm., buat cinta, dukungan, doa, perhatian, semangat
dan kasih sayangnya.
7. Mas Sigit, Mas Wagiran, Mas Andri dan Pak Mukmin yang banyak membantu
penulis selama bekerja di laboratorium.
8. Mbak Christin, Mbak Mina, Mbak Vero, Mas Didit, Donny, Ko Vekeh, Pak
Eko dan Ci Vivien, terima kasih atas semua doa, dukungan dan bantuannya.
9. Teman-teman angkatan 2003 teristimewa kelas C, terima kasih buat kasih
persahabatan dan kebersamaannya selama ini.
10. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah mendukung
dalam penyusunan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih ada kekurangan yang harus
diperbaiki, oleh karena itu saran dan kritik yang bersifat membangun sangat
diharapkan. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak
Yogyakarta, Februari 2007
Penulis
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ..................................................................................
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .........................................
HALAMAN PENGESAHAN.....................................................................
HALAMAN PERSEMBAHAN..................................................................
PRAKATA .................................................................................................
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA......................................................
DAFTAR ISI ..............................................................................................
DAFTAR TABEL ......................................................................................
DAFTAR GAMBAR .................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................
INTISARI...................................................................................................
ABSTRACT ..................................................................................................
BAB I PENGANTAR ................................................................................
A. Latar Belakang ..............................................................................
1. Rumusan Permasalahan ..........................................................
2. Keaslian Penelitian ..................................................................
3. Manfaat Penelitian ..................................................................
B. Tujuan Penelitian ............................................................................
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ........................................................
A. Uraian Tanaman Kamboja Jepang ..................................................
i
ii
iii
iv
v
vii
viii
xii
xiii
xiv
xv
xvi
1
1
2
3
3
4
5
5
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
B. Kultur Jaringan Tanaman .............................................................
1. Eksplan ......................................................................................
2. Media.........................................................................................
3. Lingkungan................................................................................
C. Glikosida Jantung............................................................................
D. Kromatografi Lapis Tipis ................................................................
E. Landasan Teori ...............................................................................
F. Hipotesis..........................................................................................
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ...................................................
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ......................................................
B. Definisi Operasional .......................................................................
C. Alat dan Bahan Penelitian ...............................................................
1. Alat penelitian ...........................................................................
2. Bahan Penelitian........................................................................
D. Tata Cara Penelitian .......................................................................
1. Determinasi tanaman .................................................................
2. Pembuatan stok ..........................................................................
3. Pembuatan media.......................................................................
4. Sterilisasi alat dan ruangan ........................................................
5. Sterilisasi dan penanaman eksplan ...........................................
6. Pengamatan waktu inisiasi kalus ...............................................
7. Subkultur....................................................................................
8. Pemanenan .................................................................................
5
7
9
21
23
25
28
29
30
30
30
31
31
33
35
35
35
37
38
38
39
39
40
ix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9. Analisis pertumbuhan kalus.......................................................
10. Pengeringan dan pembuatan serbuk daun kamboja jepang .......
11. Pembuatan ekstrak kalus daun kamboja jepang ........................
12. Pembuatan ekstrak daun kamboja jepang..................................
13. Uji KLT ekstrak kalus daun kamboja jepang dan ekstrak daun
tanaman asalnya. .........................................................................
E. Analisis Hasil .................................................................................
1. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data
penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus ...............
2. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data
biomassanya .............................................................................
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................
A. Determinasi Tanaman .....................................................................
B. Pemilihan Eksplan, Sterilisasi, dan Penanaman..............................
C. Deskripsi Kalus dan Waktu Inisiasi Kalus ......................................
D. Subkultur dan Panen........................................................................
E. Profil Pertumbuhan Kalus ...............................................................
1. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data
penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus. ..............
2. Biomassa kalus selama masa pertumbuhan 42 hari. ................
F. Persen Kadar Air Kalus...................................................................
G. Kromatografi Lapis Tipis ................................................................
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .....................................................
41
43
43
44
44
44
45
45
47
47
47
50
52
54
54
58
58
60
64
x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
A. Kesimpulan .....................................................................................
B. Saran ...............................................................................................
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................
LAMPIRAN ...............................................................................................
BIOGRAFI PENULIS ................................................................................
64
64
65
68
82
xi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR TABEL
I.
II
Waktu inisiasi kalus rata-rata daun kamboja jepang.........................
Hasil pengamatan KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan
fase gerak etil asetat : metanol : air ( 81 : 11 : 8 v/v ) ......................
51
61
xii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Strukur glikosida jantung..................................................................
Eksplan dalam bentuk irisan melintang daun ...................................
Inisiasi kalus daun kamboja jepang ..................................................
Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan
bobot kalus basah..............................................................................
Persen kadar air kalus daun kamboja jepang ....................................
Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi asam sulfat (97 %) ..
Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi Kedde......................
Foto tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.)
Roem. & Schult.) ..............................................................................
Foto daun kamboja jepang ................................................................
Foto kalus siap subkultur ..................................................................
Foto kalus siap panen........................................................................
Foto kalus basah................................................................................
Foto kalus kering...............................................................................
Foto serbuk kalus ..............................................................................
Foto hasil KLT secara visual ............................................................
Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi asam sulfat ( 97% ) ...........
Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi Kedde ................................
24
49
52
56
59
61
62
69
69
70
70
70
70
70
71
72
73
xiii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
1. Surat Determinasi Tumbuhan ..............................................................
2. Foto-foto Hasil Penelitian ....................................................................
3. Komposisi media tumbuh Murashige-Skoog ( MS ) ...........................
4. Data penimbangan bobot kalus basah dan bobot kalus kering dalam
media tumbuh MS................................................................................
5. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot
kalus basah ...........................................................................................
6. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot
kalus kering ..........................................................................................
7. Data persen kadar air kalus kamboja jepang........................................
68
69
74
76
77
79
81
xiv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
INTISARI
Tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) selama ini biasanya digunakan sebagai tanaman hias. Penggunaan kultur jaringan untuk menghasilkan metabolit sekunder dari tanaman bertujuan untuk membuktikan bahwa jaringan dapat menggantikan tanaman asal secara fungsional, termasuk menghasilkan metabolit sekunder. Dalam penelitian ini, metabolit sekunder yang diteliti yaitu glikosida jantung dari kalus daun kamboja jepang.
Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh informasi tentang pertumbuhan in vitro kalus daun tanaman kamboja jepang dengan cara mengukur waktu inisiasi kalus dan profil pertumbuhan kalus serta membandingkan kandungan kimia kalus dengan tanaman asal. Eksplan untuk menghasilkan kalus didapat dari jaringan daun kamboja jepang yang ditanam secara in vitro pada media tumbuh MS (Murashige-Skoog) dengan penambahan zat pengatur tumbuh asam 2,4-Diklorofenoksiasetat (analog auksin). Kalus kemudian diekstrak dengan campuran kloroform-metanol (1 : 10 v/v)
Analisis profil pertumbuhan kalus dilakukan berdasarkan bobot kalus basah dan bobot kalus kering. Uji KLT dilakukan dengan membandingkan harga Rf bercak-bercak hasil pengembangan ekstrak kalus daun kamboja jepang dengan ekstrak daun kamboja jepang dalam fase diam silika gel GF254, fase gerak etil asetat : metanol : aquadest ( 81 :11 : 8 v/v ) dengan jarak pengembangan 10 cm. Deteksi yang digunakan yaitu sinar UV 254 dan 365 nm, serta pereaksi Kedde dan pereaksi asam sulfat berdasarkan acuan (Wagner,1984).
Dari hasil penelitian, diketahui bahwa waktu inisiasi kalus adalah 10,3 hari. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang mengikuti pola pertumbuhan sigmoid fase lag, fase eksponensial dan fase stasioner. Hasil KLT yang diperoleh menunjukkan bahwa ekstrak kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in vitro tidak mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya.
Kata kunci : Adenium obesum , kalus, glikosida jantung.
xv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
Kamboja jepang ( Adenium obesum ( Forssk.) Roem & Schult.) during the time is usually used as decorative plant. Usage of tissue culture to provide secunder metabolit from plant aim to prove that the tissue can act as a complete plant system functionally, including provide secunder metabolit. The experiment’s secunder metabolite is cardiac glycoside from callus of kamboja jepang leaf.
The purpose of this experiment is to get information of growth callus kamboja jepang by in vitro by measuring callus initiation time and profile of callus growth and also compare chemical content of callus with the whole plant leaf. Explan to yield callus got from kamboja jepang leaf planted by in vitro at media growth MS ( Murashige-Skoog) with addition regulator of growth 2,4-Dichlorophenoksiacetate (an auxin analogue). Then, callus be extracted with mixture of chloroform-methanol ( 1 : 10 v / v).
Analysis of growth profile of callus based on wet callus weight and dry callus weight. Test of KLT be done by comparing Rf value of KLT spots of extract callus and the whole plant leaf at silica gel GF254 as stationary phase, ethyl acetate: methanol : aquadest ( 81 : 11 : 8 v / v ) as mobile phase with distance of elution is 10 cm. The detection include UV 254 and 365 light, and Kedde reagent and sulphate acid reagent according to Wagner (1984). From the result of experiment, it be known that callus initiation time is 10,3 days. Callus growth profile follow sigmoid pattern which consist of lag phase, exponensial phase and stasioner phase. From the result of TLC indicate that extract of callus kamboja jepang leaf which conducting by in vitro do not contain cardiac glycoside like its herbs. Keywords: Adenium obesum , callus, cardiac glycoside.
xvi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) selama ini
lebih dikenal sebagai tanaman hias ( Soenanto, 2005). Pada penelitian terdahulu
dilaporkan bahwa tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung
dengan kandungan utama berupa oleandrigenin beta-gentiobiosyl-beta-D-
thevetoside, neridienone A dan 16,17-dihydroneridienone A ( Yamauchi dan Abe,
1990 ). Ekstrak dari daun tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung
yang memiliki efek sitotoksik yang berpotensi sebagai antikanker ( Nakamura
et.al., 2000). Ekstrak akar dan kulit batang dari kamboja jepang juga berpotensi
sebagai agen terapeutik untuk pengobatan trypanosomiasis ( Atawodi, et al.,
2003; Freiburghaus et al., 1996). Ekstrak kulit batang kamboja jepang juga
berpotensi sebagai acaricidal ( Mgbojikwe dan Okoye, 2001).
Di dalam pencarian metode produksi metabolit sekunder dari tumbuhan
berkhasiat obat, pendekatan bioteknologi, khususnya kultur jaringan, berpotensi
sebagai alternatif di dalam produksi metabolit-metabolit bioaktif tumbuhan untuk
skala industri ( Ramachandra dan Ravishankar, 2002).
Kultur jaringan tanaman merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan
menggunakan potongan kecil jaringan atau sel atau organ, yang dipelihara dalam
suatu medium dan dikerjakan seluruhnya dalam kondisi aseptik. Organ, jaringan
dan sel tanaman yang ditumbuhkan tersebut disebut eksplan ( Katuuk, 1989 ).
1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun karena daun lebih
mudah didapat daripada bagian tanaman yang lain dan memiliki jaringan
parenkim yang akan berdediferensiasi serta mudah untuk disterilisasi.
Eksplan yang telah ditumbuhkan dalam media dapat membentuk kalus
yaitu massa amorf yang tersusun atas sel-sel parenkim berdinding sel tipis yang
berkembang dari hasil proliferasi sel-sel jaringan induk ( Yuwono, 2006 ). Ide
memperbanyak tanaman dengan jalan mengkulturkan bagian kecil organ, jaringan
atau sel tersebut dilakukan berdasarkan teori totipotensi sel yaitu : setiap sel
tanaman hidup mempunyai informasi genetik dan perangkat fisiologis yang
lengkap untuk dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang utuh, jika
kondisinya sesuai ( Yusnita, 2003 ). Media yang digunakan dalam penelitian ini
adalah media Murashige-Skoog (MS) karena menurut Hendaryono dan Wijayani
(1994) media tersebut cocok sebagai media kultur untuk membudidayakan
tanaman hias.
Penelitian ini bertujuan untuk mengkulturkan tanaman kamboja jepang
dari bagian daun serta mengidentifikasi metabolit sekunder glikosida jantung yang
dihasilkan oleh kalus yang dibentuk dari hasil budidaya in vitro. Kultur kalus
yang dihasilkan oleh teknik kultur jaringan ini diharapkan memiliki profil
pertumbuhan sigmoidal, dimana pada fase stasionernya menghasilkan kandungan
glikosida jantung yang optimum.
1. Rumusan Permasalahan
Berdasarkan latar belakang yang telah disebutkan di atas, dapat
dirumuskan permasalahan sebagai berikut:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
a. Apakah eksplan yang berasal dari daun kamboja jepang dapat
menghasilkan kalus jika dikembangkan secara in vitro dalam media
Murashige-Skoog ( MS ) ?
b. Bagaimana pola pertumbuhan kalus daun kamboja jepang yang
dikulturkan?
c. Apakah kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in vitro dapat
menghasilkan glikosida jantung seperti tanaman asalnya ?
2. Keaslian Penelitian
Sejauh pengetahuan penulis, penelitian tentang kandungan glikosida
jantung dan profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang ( Adenium obesum
(Forssk.) Roem. & Schult. ) dalam media tumbuh MS belum pernah diteliti.
3. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan memiliki beberapa manfaat antara lain:
a. Manfaat Teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam mengembangkan bidang
ilmu kefarmasian, khususnya dalam mengeksplorasi kandungan glikosida
jantung dari tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem.
& Schult.) yang ditumbuhkan secara in vitro.
b. Manfaat Praktis
Penelitian ini juga diharapkan dapat membantu para peneliti selanjutnya
untuk mempelajari secara lebih mendalam mengenai kultur jaringan
tanaman sehingga mempermudah dalam produksi metabolit sekundernya.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
B. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah :
a. Menumbuhkan kalus dari eksplan daun kamboja jepang.
b. Mengetahui pola pertumbuhan kalus daun kamboja jepang.
c. Membuktikan bahwa ekstrak kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in
vitro dapat menghasilkan glikosida jantung seperti tanaman asalnya.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Uraian Tanaman Kamboja Jepang
Kamboja jepang dengan nama spesies Adenium obesum (Forssk) Roem &
Schult berasal dari famili Apocynaceae dan memiliki nama sinonim yaitu
Plumeria rubra L.cv. acutifolia.( Anonim, 2006 ).
Secara morfologis tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.)
Roem. & Schult. ) memiliki akar yang mampu membesar seperti umbi dan
diselimuti oleh rambut-rambut akar yang sangat banyak; berbatang lunak dan
tidak berkayu; daunnya berbentuk lanset dengan ujung membulat, tebal dan
berserat, berwarna hijau, tampak mengkilap dan licin; bunganya berwarna merah
muda sampai merah tua, memiliki 5 helai mahkota bunga yang bagian tengahnya
berwarna putih; buahnya tumbuh secara berpasangan, terletak di ujung tunas,
berbentuk pipih panjang, berwarna hijau waktu masih muda dan kemudian
berangsur-angsur berubah menjadi cokelat; bijinya berada dalam buah, berwarna
cokelat. Tanaman ini dapat tumbuh hingga dua meter ( Soenanto, 2005).
Tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung dengan
kandungan utama berupa oleandrigenin beta-gentiobiosyl-beta-D-thevetoside,
neridienone A dan 16,17-dihydroneridienone A ( Yamauchi dan Abe, 1990 ).
B. Kultur Jaringan Tanaman
Kultur jaringan dalam bahasa asing disebut sebagai tissue culture, weefsel
cultuur atau Gewebe kultur. Kultur artinya budidaya dan jaringan artinya
5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Maka kultur
jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil
yang mempunyai sifat yang sama dengan induknya ( Dixon, 1985).
Kultur jaringan in vitro (mikropopagasi) adalah perbanyakan tanaman
dengan menggunakan potongan kecil jaringan atau sel yang dipelihara dalam satu
medium dan dikerjakan seluruhnya dalam kondisi aseptik ( Katuuk, 1989).
Ide memperbanyak tanaman dengan jalan mengkulturkan bagian kecil
jaringan atau organ muncul dari pendapat bahwa tanaman tinggi terdiri dari
sekumpulan sel. Sel-sel yang sama membentuk jaringan yang melakukan tugas
tertentu pada setiap organ dalam tubuh tanaman. Sel-sel ini mempunyai
kemampuan untuk melakukan seluruh proses hidup. Kemampuan sel ini disebut
“totipotency” ( Katuuk, 1989).
Teori totipotensi sel dikemukakan oleh Schwann dan Schleiden pada tahun
1838. Menurut teori ini, setiap sel tanaman hidup mempunyai informasi genetik
dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk dapat tumbuh dan berkembang
menjadi tanaman yang utuh, jika kondisinya sesuai ( Yusnita, 2003 ).
Kultur jaringan dalam skala besar ditemukan sebagai pendekatan alternatif
yang menarik terhadap metode penanaman tradisional dimana kultur jaringan
dapat menyediakan metabolit-metabolit sekunder yang terkontrol ( Sajc et al.,
2000 ).
Keuntungan dari sistem kultur jaringan ini sebagai berikut:
a. Kandungan–kandungan zat yang berguna dapat diproduksi di bawah kondisi
yang terkontrol, terbebas dari perubahan iklim dan keadaan tanah.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
b. Hasil kultur akan terbebas dari mikroba dan serangga.
c. Sel-sel kebanyakan tumbuhan mudah untuk berkembangbiak dalam
menghasilkan metabolit-metabolit yang spesifik.
d. Kontrol automatis dari pertumbuhan sel dan proses pengaturan metabolit yang
rasional dalam bioreaktor akan mengurangi biaya tenaga kerja dan
meningkatkan produktivitas.
e. Substansi organik dapat diekstrak dari kultur kalus. ( Dicosmo dan Misawa,
1995 ).
Faktor-faktor yang menentukan keberhasilan dalam kultur jaringan
tanaman antara lain:
1. Eksplan
Eksplan adalah bagian kecil jaringan atau organ yang dikeluarkan atau
dipisahkan dari tanaman induk kemudian dikulturkan. Berhasil tidaknya
pengkulturan eksplan tergantung pada faktor yang dimiliki oleh eksplan itu
sendiri. Faktor-faktor itu meliputi:
a. Ukuran eksplan.
Ukuran eksplan sangat menentukan proses pengkulturan. Bagian
tanaman yang dikerat masih mengandung suplai makanan serta hormon
untuk potongan itu sendiri, sehingga makin besar keratan, makin besar
kemampuan keratan ini untuk dirangsang tumbuh dan beregenerasi. Namun
dibalik itu harus dipikirkan pula bahwa makin besar eksplan, makin besar
kemungkinan mendapatkan jaringan yang terkontaminasi. Ukuran eksplan
yang paling baik adalah 0,5 sampai 1,0 cm, namun ukuran ini dapat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
bervariasi, tergantung pada material tanaman yang dipakai serta jenis
tanaman ( Katuuk, 1989).
b.Umur eksplan.
Umur eksplan sangat mempengaruhi tipe serta daya morfogenesis.
Jaringan yang masih muda serta belum banyak berdiferensiasi terdapat pada
bagian meristematik. Dari semua jenis tanaman bagian inilah yang paling
banyak berhasil. Sel atau jaringan yang masih muda yang dinamakan
juvenile akan tetap muda dalam pengkulturan sehingga daya untuk
beregenerasi tetap ada, sedangkan sel-sel tua, kesanggupan untuk
beregenarasi sudah berkurang. Selain dari kandungan jaringan meristematik
yang berkurang, jaringan yang sudah tua ada kemungkinan sudah
mengandung banyak patogen ( Katuuk, 1989 ).
c. Sumber eksplan.
Tanaman yang dijadikan sumber eksplan hendaknya dari tanaman
yang sehat, yang bertumbuh baik / normal. Pengaruh perubahan suhu,
cahaya, musim serta kelembaban terhadap tanaman induk sangat
mempengaruhi perkembangan eksplan. Tanaman induk dituntut untuk
berkecukupan zat hara, lama penyinaran, intensitas cahaya serta hormon
tumbuh. Pendek kata pertumbuhannya harus optimum ( Katuuk, 1989 ).
d.Genotip eksplan.
Genotip adalah faktor endogen yang paling utama mempengaruhi
perkembangan jaringan eksplan, dibandingkan faktor-faktor lain. Perbedaan
kemampuan untuk beregenerasi disebabkan oleh genotip jelas dapat dilihat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
pada tanaman monokotil, dikotil dan gymnospermae. Dari ketiga kelompok
ini, kemampuan untuk beregenerasi yang paling rendah adalah tanaman
gymnospermae, kemudian diikuti oleh tanaman monokotil, dan terakhir oleh
tanaman dikotil. Selanjutnya dikatakan bahwa apabila satu jenis tanaman
dengan mudah beregenerasi in vivo maka sifat ini berlaku juga pada in vitro
(Katuuk, 1989 ).
2. Media
Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan
perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur
telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan
tanaman yang dikulturkan. Murashige dan Skoog mempublikasikan formulasi
media MS (singkatan dari Murashige dan Skoog) yang sampai sekarang
terbukti cocok untuk kultur jaringan banyak tanaman dan banyak digunakan di
laboratorium kultur jaringan di seluruh dunia ( Yusnita, 2003 ).
Komponen media kultur yang digunakan dalam kultur jaringan adalah
sebagai berikut :
a. Air.
Air memegang peranan penting dalam proses kultur jaringan karena
95% dari media kultur terdiri dari air. Air yang digunakan dalam media
serta dalam seluruh proses kultur jaringan adalah air suling. Hal ini karena
di dalam air ledeng atau air sumur terlarut sejumlah kontaminan yang dapat
merusak proses perkembangan kultur eksplan. Kontaminan yang dimaksud
adalah substansi atau mikroorganisme yang mengganggu kultur. Air suling
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
disimpan dalam kondisi steril dengan tidak memberi peluang pada bakteri
untuk hidup dan berkembang ( Katuuk, 1991 ).
b. Garam anorganik.
Beberapa garam anorganik yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah
takaran yang banyak dikenal sebagai unsur makro. Unsur makro adalah
unsur yang dibutuhkan dalam jumlah yang besar. Jenis-jenis yang termasuk
unsur makro adalah nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Sulfur (S),
Kalsium (Ca), dan Magnesium (Mg). Unsur NPK adalah unsur yang mutlak
dibutuhkan oleh tanaman, yang berarti harus selalu tersedia sedangkan
unsur S,Ca, dan Mg boleh ada dan boleh tidak. Namun, karena fungsinya
sangat mendukung pertumbuhan jaringan maka akan lebih baik apabila
unsur-unsur tersebut juga tersedia ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).
Adapun kegunaan dari unsur makro tersebut adalah unsur N
dipergunakan terutama untuk pertumbuhan vegetatif tanaman dan juga
berperan di dalam pembentukan hijau daun yang mana berguna untuk
proses fotosintesis dalam menghasilkan karbohidrat; unsur P dibutuhkan
tanaman untuk pembentukan karbohidrat; unsur K berfungsi berguna untuk
pembelahan sel, sintesa karbohidrat dan protein, pembuatan klorofil serta
untuk mereduksi nitrat; unsur S berperanan untuk pembentukan beberapa
jenis protein seperti asam amino dan vitamin B1; unsur Ca bertugas
merangsang pembentukan bulu-bulu akar dan bersama-sama dengan Mg
akan memproduksi cadangan makanan sedangkan unsur Mg dapat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
meningkatkan kandungan fosfat yang berguna untuk pembentukan sejumlah
protein ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).
Selain unsur makro, ada pula unsur mikro, yaitu unsur yang
dibutuhkan tanaman dalam jumlah sedikit namun harus tersedia. Unsur-
unsur tersebut adalah Besi(Fe), Mangan(Mn), Boron (B), Seng (Zn), Cobalt
(Co), Tembaga(Cu), dan Molibdenum (Mo) ( Hendaryono dan Wijayani,
1994 ).
Kegunaan dari unsur mikro tersebut adalah unsur Fe berfungsi dalam
pembentukan hijau daun (chlorophyl); unsur Mn berguna untuk
pemebentukan membran kloroplas; unsur B memegang peran penting dalam
perombakan gula; unsur Zn berperan dalam pembentukan protoplas; unsur
Co berguna untuk mengikat N dan untuk pembentukan asam inti; unsur Cu
berperan dalam konversi energi; unsur Mo berperan dalam pembentukan
klorofil ( Katuuk, 1989 ).
Unsur-unsur makro biasanya diberikan dalam bentuk NH4NO3, KNO3,
CaCl2.2H20, MgSO4.7H2O dan KH2PO4. Sedangkan unsur-unsur mikro
biasa diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3, KI,
NaMo4.2H2O, CuSO4.5H2O dan CoCl2.6H2O ( Hendaryono dan Wijayani,
1994).
c. Sumber karbon dan energi.
Media kultur jaringan memerlukan bahan sebagai sumber tenaga.
Biasanya yang merupakan sumber tenaga adalah bahan kimia organik yang
mengandung karbon. Karbohidrat adalah kimia karbon yang meliputi gula,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
pati, dan selulosa. Karbohidrat memiliki 2 fungsi utama yaitu sebagai
sumber energi untuk jaringan dan untuk menjaga keseimbangan tekanan
osmotik potensial minimum dalam media. Ada banyak jenis karbohidrat
yang dipakai dalam kultur jaringan namun yang paling banyak digunakan
adalah sukrosa atau D-glukosa ( Katuuk, 1989).
d. Myo-inositol, Vitamin dan asam amino.
Penambahan myo-inositol pada media bertujuan untuk membantu
diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan. Bila myo-inositol
diberikan bersama dengan auksin, kinetin dan vitamin, maka dapat
mendorong pertumbuhan jaringan kalus ( Hendaryono dan Wijayani, 1994).
Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam media kultur jaringan
antara lain adalah Tiamin (vitamin B1), Piridoksin (vitamin B6), dan asam
nikotinat. Tiamin adalah vitamin yang esensial untuk hampir semua kultur
jaringan tumbuhan. Fungsi tiamin adalah untuk mempercepat pembelahan
sel pada meristem akar, juga berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang
menghasilkan energi dari karbohidrat. Asam nikotinat juga penting dalam
reaksi-reaksi enzimatik, di samping berperan sebagai prekursor dari
beberapa alkaloid. Pemberian vitamin C biasanya bertujuan untuk
mencegah terjadinya pencoklatan pada permukaan irisan jaringan
(Hendaryono dan Wijayani, 1994 ). Sedangkan fungsi dari vitamin B6
adalah sebagai ko-enzim yang membantu reaksi kimia dalam proses
metabolisme ( Katuuk, 1989 ).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Asam-asam amino berperanan penting untuk pertumbuhan dan
diferensiasi kalus. Kebutuhan asam amino untuk setiap tanaman berbeda-
beda. Asparagin dan Glutamin berperan dalam metabolisme asam amino,
karena dapat menjadi pembawa dan sumber amonia untuk sintesis asam-
asam amino baru dalam jaringan ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).
e. Hormon dan zat pengatur tumbuh.
Keberadaan hormon dan zat pengatur tumbuh dalam kegiatan kultur
jaringan adalah mutlak karena budidaya kultur jaringan adalah budidaya
terkendali. Proses tumbuh dan berkembangnya eksplan dapat disesuaikan
dengan harapan, menjadi kalus saja, organogenesis ataupun embryogenesis.
Pengaturan ini dapat dilakukan dengan mengatur macam dan konsentrasi zat
pengatur tumbuh sehingga menghasilkan kombinasi yang tepat sesuai
dengan harapan. Macam hormon dan zat pengatur tumbuh yang sudah
dikenal hingga saat ini adalah sebagai berikut :
1) Auksin
Auksin pertama kali ditemukan oleh Went, dan diketahui sebagai
asam indolasetat (IAA). Selanjutnya, nama auksin digunakan untuk
nama kelompok hormon dan zat pengatur tumbuh yang menimbulkan
respons khas IAA. Tumbuhan mengandung tiga senyawa lain yang mirip
dengan IAA baik struktur maupun respon yang diakibatkannya, yaitu :
asam 4-kloroindolasetat (4kloroIAA), asam fenilasetat (PAA), dan asam
indolbutirat (IBA) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
Hormon sintetik atau zat pengatur tumbuh yang digolongkan
sebagai auksin yaitu : asam a-naftalenasetat (NAA), asam 2,4-
diklorofenoksiasetat (2,4-D), asam 2-metil 4-klorofenoksiasetat
(MCPA), asam 2-naftalosiasetat (4-CPA), asam p-klorofenoksiasetat
(PCPA), asam 2,4,5-triklorofenoksiasetat (2,4,5-T), asam 3,6-
dikloroanisik (dikamba), asam 4-amino 3,5,6-trikloropikolinik
(pikloram) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).
Dalam aktivitas kultur jaringan, auksin berperan menginduksi
terjadinya kalus, menghambat kerja sitokinin membentuk klorofil dalam
kalus, mendorong proses morfogenesis kalus membentuk akar atau
tunas, mendorong proses embryogenesis, dan mempengaruhi kestabilan
genetis tanaman ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).
2) Sitokinin
Sitokinin merupakan nama kelompok hormon tumbuhan yang
sangat penting sebagai pemacu pertumbuhan dan morfogenesis dalam
kultur jaringan. Seperti auksin, selain sitokinin alami juga terdapat
sintesisnya yang tergolong dalam zat pengatur tumbuh. Sitokinin sintetik
yang umum digunakan dalam kegiatan kultur jaringan adalah FAP (6-
furfurilaminopurin), BAP (Benzylaminopurin), Thidiazuron (N-phenil-
N-1,2,3-thiadiazol-5-penylurea) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).
Dalam kegiatan kultur jaringan sitokinin berperan di dalam
menstimulasi terjadinya pembelahan sel, proliferasi kalus, pembentukan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
tunas, menghambat pembentukan akar, mendorong pembentukan
klorofil pada kalus ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).
3) Gibberilin (GA)
Gibberilin merupakan kelompok lain dari ZPT atau hormon yang
dapat mempengaruhi pemanjangan batang atau ruas batang, mendorong
pembungaan, induksi buah, dan tumbuhnya mata tunas yang dorman.
Secara umum dalam kegiatan kultur jaringan tanaman tanpa penambahan
GA, sesungguhnya kegiatan telah dapat berjalan dan proses induksi serta
diferensiasi dapat dilakukan, meski demikian tidak menutup
kemungkinan bahwa GA endogen dalam eksplan walaupun dalam kadar
yang relatif kecil diduga tetap merupakan komponen yang essensial,
contoh GA sintetik adalah gibberillic acid (Santoso dan Nursandi, 2001).
5) ABA (Abcisic acid)
ABA merupakan hormon tanaman yang secara alamiah disintesis
tanaman bila tanaman berada dalam keadaan stress. ABA tergolong
dalam zat penghambat tanaman atau inhibitor karena kerjanya
berlawanan dengan hormon pendorong seperti auksin, sitokinin, dan
giberelin. Dalam kultur jaringan, ABA dapat menghambat proses inisiasi
dan pertumbuhan sel ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).
f. Bahan pemadat media
Media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh
eksplan. Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media
cair berarti campuran komponen-komponen zat kimia dengan air suling,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
sedangkan media padat adalah media cair tersebut dengan ditambah zat
pemadat ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).
Zat pemadat yang digunakan untuk membuat media padat adalah
berupa agar-agar. Agar adalah campuran berbagai polisakarida dari
galaktosa yang diekstrak dari ganggang laut, terutama Gellidium amansii
dan ganggang lain dari golongan Rhodophyta. Umumnya agar dapat
membentuk gel pada suhu 40-45°C dengan titik cair 80-90°C. Kemampuan
agar dalam memadatkan media tergantung pada cara pengekstrakannya dari
ganggang dan pH larutan media sebelum diautoklaf. Dalam larutan media
dengan pH rendah (kurang dari 4,5), gel yang terbentuk oleh agar sangat
encer, sedangkan larutan dengan pH tinggi (lebih dari atau sama dengan 5,5)
akan berbentuk padat ( Yusnita, 2003 ).
Media kultur jaringan merupakan sumber makanan yang baik untuk
bakteri dan fungi, semua prosedur in vitro harus memuat pencegahan terhadap
kontaminasi mikroba ( Wetherell, 1982 ). Beberapa teknik sterilisasi yang
lazim digunakan dalam kultur jaringan tanaman, yaitu:
a. Sterilisasi panas basah
Cara sterilisasi panas basah adalah dengan menggunakan uap air. Alat
yang digunakan untuk sterilisasi ini ialah autoklaf. Hampir semua mikroba
mati sesudah diberi uap air dengan suhu 121°C selama 10-15 menit. Cara
sterilisasi ini dapat digunakan untuk mensterilkan media kultur, air, alat /
instrumen, gelas serta peralatan plastik yang tahan akan suhu panas. Lama
sterilisasi ada aturannya, untuk mensterilkan media 20-75 ml dibutuhkan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
waktu 15-20 menit, media 75-500 ml dibutuhkan waktu 20-25 menit,
media 500-5000 ml dibutuhkan waktu 25-35 menit, yang semuanya
dilakukan pada suhu 121°C; sedangkan untuk mensterilkan peralatan gelas
dibutuhkan waktu 30 menit dengan suhu 130 °C ( Katuuk, 1989 ).
Manfaat dari sterilisasi ini adalah prosesnya cepat, sederhana, dan
sanggup membasmi virus tertentu. Namun autoklaf juga mempunyai
kekurangan, yaitu:
1) Bila pemanasan terlalu tinggi, gula akan membatu sehingga dapat
menjadi racun dalam media.
2) Bila terlalu lama disterilkan, garam akan mengendap sehingga terjadi
dipolimerisasi agar.
3) Dapat menurunkan pH sekitar 0,3 - 0,5 unit.
4) Dapat merusak substansi yang mudah menguap, misalnya ethrel dan
ethylene ( Katuuk, 1989 ).
b. Sterilisasi panas kering
Cara sterilisasi panas kering adalah dengan menggunakan suhu tinggi
dan dalam kondisi kering. Alat yang digunakan untuk sterilisasi ini ialah
oven. Oven digunakan untuk mensterilkan alat- alat yang tidak mudah
terbakar, antara lain: alat-alat gelas dan alat-alat dari logam. Namun dalam
keadaan tertentu dimana suhu tidak terlalu panas, alat dapat dibungkus
dengan kertas kemudian disterilkan. Bukan pula berarti semua alat dari
bahan logam harus disterilkan dengan cara ini. Alat-alat seperti pisau serta
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
skalpel tidak dapat disterilkan dengan cara ini sebab dapat merusak
ketajaman pisau / alat ( Katuuk, 1989 ).
Lama pemanasan tergantung pada suhu. Biasanya sterilisasi untuk
suhu 160°C, memerlukan waktu 45 menit, 170°C-18 menit, 180°C-7,5
menit, dan 190°C selama 1,5 menit. Suhu harus dikontrol, sebab pada suhu
170°C, kertas mulai hancur. Setelah selesai disterilisasi, alat / instrument
dikeluarkan dan dibawa ke ruang transfer, dimana mereka dapat
disterilkan lagi dengan menggunakan sinar ultraviolet ( Katuuk, 1989 ).
c. Sterilisasi dengan pemijaran
Alat / instrument berupa pisau dan skalpel, dikeluarkan dari
bungkusnya, dicelupkan dalam etanol 70% dan dilewatkan pada nyala
lampu spiritus. Setiap beberapa saat instrument harus dicelupkan ke dalam
etanol kemudian dibakar. Perlakuan ini berjalan terus selama kegiatan
inokulasi yang berlangsung di dalam kotak transfer (LAF) ( Katuuk,1989).
d. Sterilisasi dengan bahan kimia
Sterilisasi dengan bahan kimia merupakan pembasmian mikroba
dengan jalan memakai bahan kimia. Biasanya bahan kimia dipakai untuk
mensterilkan permukaan saja, yang meliputi: material tanaman dapat
disterilkan dengan menggunakan natrium hipoklorit, perak nitrat atau air
brom, sedangkan instrumen, tangan pekerja, serta ruang atau kotak transfer
dapat disterilkan dengan menggunakan alkohol 70% ( Katuuk, 1989 ).
Banyak jenis bahan pencuci yang boleh digunakan untuk sterilisasi
material tanaman. Jenis serta lamanya sterilisasi tergantung pada kepekaan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
material tanaman. Banyak kali terjadi bila terlalu lama dan dengan
konsentrasi bahan pencuci yang tinggi, berakibat bukannya mematikan
mikroba tetapi bahkan merusak jaringan tanaman yang disterilkan. Di
samping itu bahan pencuci hendaknya bersifat lebih mudah larut. Bila
tidak demikian, sisa zat pencuci ini akan tetap pada material tanaman,
yang dapat mengganggu pertumbuhan eksplan ( Katuuk, 1989 ).
e. Sterilisasi dengan sinar ultraviolet
Ruang dan kotak transfer sukar untuk disterilkan hanya dengan
menggosok dengan alkohol atau bahan kimia pada permukaan. Untuk itu
digunakan lampu germisidal dengan sinar ultraviolet. Ada laboratorium
yang sudah memasangnya di langit-langit atau pada tempat lain dengan
maksud agar semua bagian terkena cahaya. Kelemahan menggunakan
sinar ultraviolet adalah pada tempat-tempat yang tidak terkena cahaya,
proses sterilisasi tidak terjadi. Selain itu, sinar ultraviolet hanya mampu
mematikan bentuk fertilisasi bakteri dan jamur, bukan bentuk spora
(Katuuk, 1989 ).
Jika suatu eksplan ditanam pada medium padat atau dalam medium cair
yang sesuai, dalam waktu 2 – 4 minggu, tergantung spesiesnya akan terbentuk
massa kalus yaitu suatu massa amorf yang tersusun atas sel-sel parenkim
berdinding sel tipis yang berkembang dari hasil proliferasi sel-sel jaringan
induk ( Yuwono, 2006 ).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Kalus terbentuk melalui 3 tahapan, yaitu : induksi, pembelahan sel dan
diferensiasi. Untuk memelihara kalus, maka perlu dilakukan subkultur secara
berkala, misalnya setiap 30 hari ( Yuwono, 2006 ).
Subkultur adalah usaha mengganti media tanam kultur jaringan dengan
media yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kalus atau
protokormus dapat terpenuhi. Subkultur pada media padat mudah dilakukan
dengan cara meletakkan kalus yang sudah terbentuk di atas cawan petri,
kemudian membelah-belahnya menjadi bagian-bagian kecil lagi. Setelah
menjadi potongan kecil, kalus dimasukkan kembali dalam media yang
memiliki komposisi sama dengan media lama. Proses ini juga dilakukan
dalam suasana steril ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).
Ada 3 tahapan perkembangan dan pertumbuhan kalus, mulai dari waktu
subkultur atau penaburan inokulum, yaitu: induksi pembelahan sel,
pembelahan sel aktif dan tahap pembelahan sel lambat atau sel berhenti
membelah. Laju pertumbuhan kalus umumnya ditetapkan secara kuantitatif
dengan parameter indeks pertumbuhan bobot kalus basah. Pertambahan bobot
kalus basah merupakan selisih antara bobot kalus basah pada periode tertentu
dikurangi bobot kalus mula-mula atau bobot inokulum. Selanjutnya dari kurva
pertumbuhan kalus yang menyatakan hubungan antara pertumbuhan bobot
kalus basah dengan umur dapat diketahui fase-fase pertumbuhan kalus antara
lain:
a. Fase lag, yaitu fase dimana belum terjadi pertumbuhan secara nyata,
keadaan ini terjadi selama beberapa waktu setelah kalus disubkultur, serta
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
merupakan waktu adaptasi kalus dengan media yang baru. Pada fase ini
pertambahan bobot kalus hanya sedikit dan terlihat hampir mendatar pada
kurva.
b. Fase eksponensial, yaitu fase dimana mulai terjadi pertumbuhan kalus.
Pertambahan bobot kalus mulai terlihat nyata dan diikuti fase linier
dimana pertumbuhan kalus terus menaik secara eksponensial seperti garis
lurus ke atas dan berhenti.
c. Fase stasioner, yaitu fase dimana pertumbuhan kalus sama dengan
kematian sel-sel kalus. Kalus tidak dapat bertahan hidup pada fase ini
dalam waktu yang lama. Sel-sel mulai mati, media pertumbuhan kelebihan
muatan dan nutrien telah habis digunakan, sehingga kematian sel menjadi
lebih cepat ( George dan Sherrington, 1984 ).
3. Lingkungan
Faktor lingkungan utama yang harus dipenuhi antara lain :
a. Cahaya.
Cahaya berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan yang disebut
fotomorfogenenesis. Jenis cahaya yang paling sering digunakan dalam
kultur jaringan adalah cahaya dari lampu neon. Hal ini disebabkan oleh
kemampuannya yang dapat menyebarkan cahaya yang lebih luas dan merata,
serta lebih hemat pemakaian listrik ( Katuuk, 1989 ).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
b. Suhu.
Pada umumnya kultur jaringan memerlukan suhu sebesar 25-30°C.
Namun untuk pertumbuhan optimum hal ini akan berbeda-beda pada setiap
spesies, serta jenis eksperimen ( Katuuk, 1989 ).
c. pH.
Pada umumnya nilai pH yang paling disukai untuk pertumbuhan sel
antara 5-6. Walaupun pH media akan berubah selama pengkulturan, pH
harus diatur lebih dulu sebelum diautoklaf, yaitu apabila semua komponen
media sudah dicampurkan. Manfaat pH dalam media adalah untuk menjaga
kestabilan membran sel, mengatur garam-garam agar tetap dalam bentuk
terlarut, membantu penyerapan hara dan mengatur sifat gel agar (dalam
media padat) ( Katuuk,1989 ).
d. Kelembaban.
Faktor kelembaban relative humidity (RH) tidak banyak dibahas dalam
kultur jaringan. Hal ini disebabkan oleh kondisi dalam botol kultur yang
selalu lembab karena media. Namun demikian kelembaban di luar botol
kultur juga perlu diperhatikan. Kondisi iklim dalam hal ini sangat
berpengaruh terhadap kelembaban kultur. Untuk itu disarankan agar RH
dalam ruang kultur berkisar 70% ( Katuuk,1989 ).
e. Wadah / botol kultur.
Ukuran wadah kultur biasanya juga mempengaruhi pertumbuhan serta
morfogenesis in vitro. Hal ini mungkin disebabkan oleh perbedaan
konsentrasi CO2 yang tersedia, etilen serta gas lain yang berada dalam ruang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
wadah. Besar kecilnya wadah tergantung pada jenis serta ukuran eksplan
yang digunakan, dan fase perkembangan eksplan sehingga pemindahan
eksplan ke botol yang lebih besar sangat diperlukan. Biasanya untuk eksplan
yang berukuran kecil, pada permulaan pengkulturan dapat menggunakan
tabung kultur yang berdiameter 1,5 cm, kemudian untuk pertumbuhan akar
maka diameter tabung kultur dapat diganti menjadi 2,5 cm. Wadah kultur
jaringan tidak hanya tergantung pada botol kultur buatan pabrik. Banyak
macam wadah yang boleh dijadikan tempat kultur, antara lain: botol-botol
bekas obat-obatan, jam, atau bekas bahan makanan lainnya. Biasanya
wadah terbuat dari gelas adalah yang paling baik, karena dapat dengan
mudah dicuci untuk digunakan lagi.
C. Glikosida Jantung
Glikosida jantung ditemukan dalam beberapa famili tumbuhan seperti
Apocynaceae, Liliaceae, Moraceae, dan Ranunculaceae. Sumber niaga utama
kardenolida ialah genus Digitalis dan Strophantus. Digitalis mempunyai efek
langsung pada jantung yaitu memberi kekuatan bila jantung melemah. Glikosida
jantung biasanya mempunyai sifat peluruh air seni (diuretik) yang berakibat
menurunkan tekanan darah dan mengobati bengkak. Keberadaan senyawa ini
dalam tumbuhan mungkin memberi perlindungan kepada tumbuhan tersebut dari
gangguan beberapa serangga ( Robinson, 1995 ).
Glikosida jantung merupakan suatu glikosida yang memiliki kepolaran
yang tinggi, oleh karena itu isolasi glikosida jantung murni dalam tanaman sulit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
dilakukan. Berdasarkan polaritasnya, glikosida jantung dapat diekstrak dengan
menggunakan pelarut yang polar antara lain: etanol, etil asetat, campuran etanol
dan air serta campuran etanol dan kloroform ( Samuelsson, 1999 ).
Glikosida jantung diklasifikasikan sebagai steroid (sterol), karena
memiliki inti cyclopentanoperhydrophenanthrene, sebuah cincin ∝-β-unsaturated
lactone(no. 5 atau 6) pada C17, sebuah β-oriented hydroxyl pada C14, sebuah cis
fusi dari cincin C dan D pada C13-C14 dan tambahan satu atau lebih gula pada C3,
biasanya deoxyhexomethyloses ( Farnsworth, 1966 ).
Gambar 1. Struktur glikosida jantung ( Moffat, 2004 )
Identifikasi glikosida jantung dapat dilakukan dengan menggunakan
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) secara kualitatif. Reaksi identifikasi terhadap
glikosida jantung dapat dilakukan menggunakan uji dengan pereaksi Baljet (2,4,6-
trinitrophenol), uji dengan pereaksi Kedde (3,5-dinitrobenzoic acid), uji dengan
pereaksi Raymond (m-dinitrobenzene), uji dengan pereaksi Legal (sodium
nitroprusside) dimana pereaksi tersebut akan bereaksi dengan grup methylene
aktif yang ditemukan dalam cincin C17-unsaturated lactone. Pereaksi ini akan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
memberikan warna oranye, ungu, biru, dan violet, yang menunjukkan adanya
glikosida jantung ( Farnsworth, 1966 ).
Di dalam skrining fitokimia untuk glikosida jantung, uji pendahuluan yang
positif pada ekstrak tanaman dengan menggunakan salah satu pereaksi yang
dikonfirmasikan dengan pereaksi yang spesifik untuk tambahan 2 sisi reaktif (vide
supra). Sebagai contoh , sebuah uji pendahuluan yang positif dengan pereaksi
Keller menunjukkan adanya gula deoksi. Ini harus diikuti dengan uji yang ke dua
yaitu uji dengan pereaksi Liebermann, hasil positif, menunjukkan adanya inti
steroid ( Shoppee, 1964 ).
D. Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi merupakan proses diferensiasi komponen-komponen
cuplikan yang ditahan secara selektif oleh fase diam. Pada dasarnya semua
kromatografi menggunakan dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Pemisahan-
pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari dua fase ini. Kromatografi dapat
digolongkan berdasarkan sifat-sifat fase diam, yang dapat berupa zat padat atau
zat cair. Apabila fase diam berupa zat padat maka cara tersebut dikenal sebagai
kromatografi serapan, sedangkan untuk fase diam yang berupa cairan dikenal
sebagai kromatografi partisi ( Sastrohamidjojo, 2001 ).
Kromatografi lapis tipis termasuk ke dalam kromatografi serapan. Prinsip
dari kromatografi serapan adalah kecepatan bergerak dari suatu komponen
tergantung pada berapa besarnya komponen tersebut tertahan oleh fase diam
(Sastrohamidjojo, 2001 ).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Fase diam yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis adalah bahan
penyerap atau adsorben ( Stahl, 1969 ). Zat penyerap merupakan lapisan tipis
serbuk halus yang dilapiskan pada lempeng kaca, plastik atau logam secara
merata, umumnya digunakan lempeng kaca. Dua sifat penting yang perlu
diperhatikan dalam pemilihan bahan penyerap adalah ukuran partikel dan
homogenitas partikel penyerap. Kedua sifat ini sangat berpengaruh pada gaya
adhesi. Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1-25 mikron. Fase diam yang
umum dan paling banyak digunakan adalah silika gel yang dicampur dengan
CaSO4 untuk menambah daya lengket partikel silika gel pada pendukung (pelat).
Adsorben lain yang juga biasa digunakan adalah alumina, kieselguhr, celite,
serbuk selulosa, serbuk poliamida, kanji dan sephadex ( Mulja dan Suharman,
1995 ). Fase diam yang digunakan untuk analisis secara kromatografi lapis tipis
untuk glikosida jantung adalah silika gel GF 254 ( Wagner, 1984 ).
Fase gerak adalah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa
pelarut. Fase ini bergerak dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Fase gerak
yang digunakan adalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan sistem
pelarut multi-komponen harus berupa campuran sesederhana mungkin terdiri atas
maksimum tiga komponen ( Stahl, 1969 ). Pemilihan fase gerak untuk glikosida
jantung ada beberapa macam alternatif, yaitu: etil asetat-metanol-air (100:13,5:10
v/v); etil asetat-metanol-etanol-air (81:11:4:8 v/v); metiletil keton-toluena-air-asam
asetat glasial (40:5:3:2,5:1 v/v); kloroform-metanol-air (65:35:10 v/v) ( Wagner,
1984 ).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Campuran yang dipisahkan berupa larutan yang ditotolkan berupa bercak.
Setelah itu pelat atau lapisan dimasukkan ke dalam bejana tertutup rapat yang
berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi selama
pengembangan. Selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus dideteksi ( Stahl,
1969 ).
Identifikasi dari senyawa yang terpisah (bercak / noda) pada lapisan tipis
dapat dilakukan dengan tanpa pereaksi kimia dan disemprot dengan reagen.
Identifikasi senyawa glikosida jantung dapat dilakukan dengan tanpa pereaksi
kimia yaitu dengan menggunakan sinar ultraviolet 254 dan 365 nm, sedangkan
reagen penyemprot yang digunakan untuk identifikasi senyawa glikosida jantung
adalah reagen Kedde, Legal, Baljet, Raymond, antimony (III) chloride,
chloramine-trichloroacetic acid / CTA, sulphuric acid ( Wagner, 1984 ) dan
vanillin-phosporic acid ( Jork, et al., 1990 ).
Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan
dengan angka Rf atau hRf. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan jarak
antara senyawa dari titik awal dengan jarak tepi muka pelarut dari awal.
Rf = anpengembangjarak
anpengembangawaldaribercakjarak
Harga Rf yang diperoleh pada KLT tidak tetap jika dibandingkan dengan
kromatografi kertas. Oleh karena itu, pada lempeng yang sama di samping
kromatogram zat yang akan diuji perlu dibuat kromatogram zat pembanding
kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda. Perkiraan identifikasi
diperoleh dengan pengamatan dua bercak dengan harga Rf dan ukuran yang
hampir sama. Angka Rf berkisar antara 0,01 – 1,00 dan hanya dapat ditentukan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
dengan dua desimal. hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan
nilai berkisar antara 0 – 100 ( Stahl, 1969 ).
E. Landasan Teori
Di dalam pencarian metode produksi kandungan obat dari tumbuhan,
pendekatan kultur jaringan, potensial sebagai alternatif di dalam produksi
metabolit-metabolit bioaktif tumbuhan untuk skala industri. Ide memperbanyak
tanaman dengan jalan mengkulturkan bagian kecil jaringan atau organ
berdasarkan teori totipotensi.
Pertumbuhan dan perkembangan tanaman dipengaruhi juga oleh zat
pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh yang digunakan dalam penelitian ini
adalah 2,4-D (auksin) dengan tujuan untuk merangsang pertumbuhan kalus. Selain
itu, 2,4-D juga berfungsi dalam perkembangan sel dengan menaikkan tekanan
osmotik dan menurunkan tekanan dinding sel sehingga air dapat masuk ke dalam
sel disertai kenaikkan volume sel.
Pada penelitian ini, kalus terbentuk dari daun kamboja jepang yang
mengalami pelukaan pada bagian tepi. Menurut Salisbury dan Ross (1995) bahwa
kurva pertumbuhan dihasilkan dengan memplotkan ukuran atau bobot organisme
terhadap waktu. Kurva tersebut dijelaskan dengan fungsi matematis sederhana,
misalnya garis lurus atau kurva berbentuk-S yang sederhana. Oleh karena itu,
pada penelitian ini diharapkan bahwa profil pertumbuhan kalus daun kamboja
jepang dapat dijelaskan dengan menggunakan kurva sigmoid dengan adanya fase
lag, fase eksponensial dan fase stasioner.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan bahwa daun kamboja jepang
dapat tumbuh secara in vitro untuk menghasilkan kalus yang mengandung
glikosida jantung yang sama dengan glikosida jantung pada daun tanaman
asalnya.
F. Hipotesis
1. Daun tanaman kamboja jepang dapat membentuk kalus dengan penambahan
zat pengatur tumbuh asam 2,4 Diklorofenoksiasetat pada media MS.
2. Kultur kalus yang dihasilkan melalui teknik kultur jaringan ini memiliki profil
pertumbuhan sigmoidal, dimana pada fase stasionernya menghasilkan
kandungan glikosida jantung yang optimum.
3. Ekstrak kalus daun tanaman kamboja jepang memiliki kandungan glikosida
jantung yang sama dengan ekstrak daun kamboja jepang tanaman asalnya.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian non eksperimental dengan
rancangan penelitian deskriptif yaitu tidak ada perlakuan atau manipulasi pada
subyek uji dan penelitian ini hanya bertujuan menunjukkan fakta yang ada.
B. Definisi Operasional
1. Daun yang digunakan sebagai eksplan dalam penelitian ini adalah daun
yang segar dan sehat, terletak pada nomor 3-5 dari ujung batang atau
cabang.
2. Waktu inisiasi adalah waktu yang dibutuhkan oleh eksplan untuk
membentuk kalus dihitung mulai dari saat penanaman eksplan sampai hari
pertama kalus mulai terbentuk berupa bintik putih dari tepi irisan daun
eksplan.
3. Subkultur adalah suatu kegiatan pemeliharaan kalus dengan memindahkan
kalus ke dalam media baru sehingga kalus tidak kekurangan nutrisi.
4. Bobot kalus basah awal adalah hasil pengurangan antara bobot botol +
media + kalus dengan bobot botol + media pada saat subkultur.
5. Bobot kalus basah akhir adalah bobot kalus yang ditimbang pada saat
pemanenan.
30
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
6. Bobot kalus kering adalah bobot kalus pada saat pemanenan dan sesudah
mengalami proses pengeringan dengan menggunakan oven pada suhu 40-
500C, sampai diperoleh kalus dengan bobot konstan yaitu antara
penimbangan yang pertama dan berikutnya selama 1 jam tidak berbeda 0,5
mg.
7. Laju pertumbuhan kalus adalah laju pertumbuhan kalus yang ditandai
adanya pertambahan berat kalus dari waktu ke waktu dengan memanen
setiap 6 hari sekali sebanyak 6 botol selama 42 hari.
8. Profil pertumbuhan kalus adalah rasio antara pertumbuhan kalus ( bobot
kalus basah akhir- bobot kalus basah awal) dengan waktu pemanenan serta
rasio antara bobot kalus kering dengan waktu pemanenan.
9. Persen kadar air adalah rerata bobot kalus basah dikurangi dengan rerata
bobot kalus kering lalu dibagi dengan rerata bobot kalus basah dikali dengan
100%.
10. Konsentrasi zat pengatur tumbuh yaitu asam 2,4-Diklorofenoksiasetat yang
digunakan adalah 4 ppm 2,4-D yang terkandung dalam satu liter media.
C. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat penelitian
a. Alat yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman:
1) Alat-alat gelas, Pyrex
2) Autoklaf, YX 400Z Shanghai Sanshen, Medical Inst, Co, LTD.
3) Oven, Marius Instrument, German.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
4) Pemanas listrik, Ika Combimag, RCT, German.
5) Timbangan analitik, Scaltec.
6) Glassfirn.
7) Magnetic stirrer.
8) Pinset.
9) Skapel.
10) Kertas pH indikator.
11) Kertas saring.
12) Laminar air flow.
13) Lampu UV.
14) Inkubator, Heraeus Tamson, Holland.
15) Botol kultur.
16) Aluminium foil,Heavy-Duty, Diamond-Wrap.
17) Referigerator, Sharp.
18) Sprayer.
19) Mortir & stamper.
b. Alat untuk penyarian : alat gelas (pyrex), kertas saring, dan waterbath
c. Alat untuk Kromatografi Lapis Tipis:
1) Bejana gelas.
2) Lempeng kaca.
3) Lemari asam.
4) Pipa kapiler.
5) Penyemprot bercak.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
6) Lampu TL Day Light” 20 watt.
7) Lampu UV 254 dan 365 nm.
2. Bahan Penelitian
a. Bahan eksplan : daun yang segar dan sehat terletak no. 3-5 dari ujung
batang atau cabang tanaman kamboja jepang diambil dari Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma, Dusun Paingan, Desa
Maguwohardjo, Kecamatan Depok, Kabupaten Sleman, Yogyakarta.
b. Bahan kimia
Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah :
1) Agar, Mkr Chemicals.
2) Garam anorganik (makronutrien) yang terdiri dari :
a) Kalium nitrat, Merck, Germany.
b) Ammonium nitrat, GPR, BDH.
c) Kalsium dikloro dihidrat, Merck, Germany
d) Magnesium sulfat heptahidrat, Merck, Germany
e) Kalium dihigrogen fosfat, Merck, Germany.
3) Garam anorganik mikronutrien yang terdiri dari :
a) Mangan sulfat tetrahidrat, BDH limited Poole, England.
b) Seng sulfat heptahidrat, Merck, Germany.
c) Asam borat, GPR, BDH, Merch, Germany
d) Kalium iodide netral, Merck, Germany
e) Tembaga (II) sulfat pentahidrat, Bratako chemika, Bandung.
f) Natrium molibdat dihidrat, Riedel dehaen, Germany.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
g) Kobalt (II) klorida heksahidrat, GPR, BDH.
h) Besi (II) sulfat heptahidrat, Merck, Germany
i) Natrium etilen diamin tetra asetat dihidrat, GPR,BDH, Merck,
Germany.
4) Vitamin dan asam amino yang terdiri dari:
a) Myo inositol, Biochemical, BDH, Merck, Germany.
b) Tiamin hidroklorida, Biochemical, BDH, Merck, Germany.
c) Asam nikotinat, BDH, Merck, Germany.
d) Piridoksin hidroklorida, Biochemical, BDH, Merck, Germany.
e) Glisin, Biochemical, BDH, Merck, Germany.
5) Sumber karbon : sukrosa, BDH, Merck, Germany.
6) Zat pengatur tumbuh : Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat, GPR, BDH.
7) Desinfektan
a) Natrium hipoklorida, Bayclin, Johnson.
b) Alkohol 70% derajat kemurnian teknis.
c) Tween 80, Merck-Sohuchardt.
8) Akuades
c. Bahan untuk penyarian: Metanol (J.T. Baker, Germany) dan Kloroform
(J.T. Baker, Germany)
d. Kromatografi Lapis Tipis :
a) Metanol, J.T. Baker, Germany
b) Etil asetat, J.T. Baker, Germany.
c) Kedde reagent, Merck, Germany.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
d) Asam sulfat, Merck, Germany.
e) Silica-Gel GF 254, Merck, Germany.
D. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman kamboja jepang dilakukan di laboratorium Biologi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma berdasarkan pustaka acuan
(Anonim, 2006).
2. Pembuatan stok
a. Pembuatan larutan stok hara mikro
Disiapkan gelas piala dengan volume 500 ml yang telah diisi akuades
300 ml. Mangan (II) sulfat tetrahidrat sebanyak 2,23 g, seng sulfat
heptahidrat sebanyak 0,86 g, asam borat sebanyak 0,62 g, kalium iodida
sebanyak 0,083 g, natrium molibdat dihidrat sebanyak 0,025 g, tembaga
(II) sulfat pentahidrat 0,0025 g, kobalt (II) klorida heksahidrat sebanyak
0,0025 g dimasukkan satu per satu ke dalam gelas piala tersebut, sambil
diaduk dengan menggunakan magnetic stirer hingga jernih. Kemudian
ditambahkan aquades hingga volume 500 ml. Perlu diperhatikan bahwa
tiap 1 liter media membutuhkan 5 ml stok hara mikro.
b. Pembuatan larutan stok besi
Stok untuk bahan ini terpisah dari unsur hara mikro lainnya, karena
komponen natrium etilen diamin tetra asetat dan besi (II) sulfat heptahidrat
sukar larut dalam akuades, maka perlu ditambahkan beberapa tetes HCl,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
kemudian dipanaskan. Disiapkan gelas piala dengan volume 500 ml yang
telah diisi akuades 300 ml. Besi (II) sulfat heptahidrat sebanyak 0,278 g
dan natrium etilen diamin tetra asetat dihidrat sebanyak 0,373 g
dimasukkan ke dalam gelas piala tersebut, lalu ditambahkan beberapa tetes
HCl sambil diaduk dengan menggunakan magnetis stirer hingga larut dan
agar cepat larut dibantu dengan pemanasan. Kemudian ditambahkan
akuades hingga volume 500 ml. Perlu diperhatikan bahwa satu liter media
dibutuhkan 5 ml larutan stok besi.
c. Pembuatan larutan stok vitamin dan asam amino
Dua ratus milliliter aquades dimasukkan ke dalam gelas piala dengan
volume 500 ml, kemudian asam nikotinat sebanyak 0,05 g, piridoksin
hidroklorida sebanyak 0,05 g, tiamin hidroklorida sebanyak 0,01 g dan
glisin sebanyak 0,2 g dimasukkan satu per satu ke dalam gelas piala
tersebut, sambil diaduk dengan menggunakan magnetic stirer hingga
jernih. Kemudian ditambahkan aquades hingga volume 500 ml. Perlu
diperhatikan bahwa satu liter media dibutuhkan 5 ml larutan stok vitamin
dan asam amino.
d. Pembuatan larutan stok myoinositol
Untuk membuat larutan myoinositol, diperlukan 10 g myoinositol yang
dilarutkan dalam 500 ml aquades dalam gelas piala sampai larut kemudian
akuades ditambahkan sampai volume 1 liter. Dalam membuat satu liter
media dibutuhkan larutan stok myoinositol sebanyak 10 ml.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
e. Pembuatan larutan stok ZPT
ZPT yang digunakan adalah asam 2,4 Diklorofenoksiasetat. Untuk
membuat larutan stok 2,4-D (4 ppm), larutkan 2,4-D sebanyak 100 mg ke
dalam 2-5 ml etanol, panaskan sebentar lalu tambahkan 100 ml akuades.
Dalam membuat satu liter media dengan konsentrasi 2,4D sebesar 4 ppm
dibutuhkan larutan stok sebanyak 4 ml.
3. Pembuatan media
Media yang digunakan adalah media Murashige-Skoog. Pembuatannya
adalah sebagai berikut : mula-mula 500 ml akuades dipanaskan di dalam gelas
piala 1000 ml. Sambil terus diaduk, dimasukkan bahan-bahan anorganik
makro sesuai dengan komposisi yang ada (daftar terlampir). Setelah semua
hara makro larut, dimasukkan berturut-turut 5 ml larutan stok hara mikro, 5 ml
larutan stok besi-EDTA, 5 ml stok vitamin dan asam amino dan 10 ml stok
myoinositol. Sedikit demi sedikit dimasukkan campuran sukrosa 30 g dan agar
11 g sambil diaduk hingga larut. Sementara itu, ditambahkan juga akuades
sedikit demi sedikit untuk membantu kelarutan hingga volume mencapai 1000
ml. Campuran tersebut dipanaskan hingga mendidih dan berwarna jernih.
Setelah jernih, suhu pemanas diturunkan dan stok zat pengatur tumbuh
dimasukkan sesuai konsentrasi yang diinginkan. Setelah itu, dilakukan
pengaturan pH media 5,2 – 5,6. jika terlalu basa ditambahkan HCl encer dan
jika terlalu asam ditambahkan larutan KOH encer. Penyusutan air karena
pemanasan diatasi dengan penambahan akuades hingga 1000 ml kemudian
media dipindahkan ke dalam botol kultur dengan ketebalan kurang lebih 1 cm.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
Botol yang berisi media kemudian ditutup menggunakan alumunium foil dan
disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210 C selama 15 menit. Media yang
aman digunakan adalah media yang telah disimpan dalam inkubator selama
kurang lebih 1 minggu dan tidak tampak adanya pertumbuhan
mikroorganisme kontaminan seperti : jamur, dan bakteri.
4. Sterilisasi alat dan ruangan
a. Sterilisasi alat
Erlenmeyer yang berisi akuades dan gelas piala kosong ditutup dengan
alumuniumfoil. Cawan petri diisi kertas saring, skalpel, pinset yang
dibungkus dengan kertas payung semuanya dimasukkan dalam autoklaf
dan disterilkan pada temperatur 120 °C selama 20 menit.
b. Sterilisasi ruangan
Dinding- dinding ruangan penanaman eksplan dan Laminar Air Flow
(LAF) disterilkan dengan menggunakan alkohol 70 % atau spiritus.
Selanjutnya lampu UV baik yang ada di ruangan maupun di LAF
dinyalakan selama ± 2 jam.
5. Sterilisasi dan penanaman eksplan
a. Sterilisasi eksplan
Sebelum dimasukkan ke dalam LAF, eksplan berupa daun yang
diambil dari tanaman induk dicuci di bawah air keran yang mengalir
dengan diberi sedikit detergen untuk membersihkan kotoran yang melekat
di permukaan terluar eksplan Eksplan direndam-dikocok dalam larutan
hipoklorit dan Tween-80 selama 5 – 10 menit kemudian dibilas dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
akuades. Di dalam LAF eksplan juga disterilkan dengan direndam-dikocok
dalam larutan hipoklorit-Tween-80 selama 5 menit. Eksplan dibilas 3 kali
dengan air steril (air yang sudah disterilisasi dengan autoklaf). Eksplan
yang sudah dibilas dengan air steril ini sudah siap untuk ditanam.
b. Penanaman eksplan
Potongan eksplan yang akan ditanam yang sudah disterilkan
sebelumnya dimasukkan ke dalam media dengan sedikit ditekan untuk
memperbesar sudut kontak eksplan dengan permukaan media klutur.
Media yang telah ditanami, diinkubasikan dalam ruang inkubator dengan
suhu ruangan 18 °C serta disinari dengan lampu TL ”Day Light” 20 watt
dengan ketinggian 40 cm.
6. Pengamatan waktu inisiasi kalus
Waktu inisiasi kalus dihitung dari saat kalus mulai terbentuk. Karena
pertambahan bobot pertumbuhan kalus tidak dapat diamati, penentuan waktu
inisiasi kalus dilakukan secara visual yaitu mulai terlihatnya bintik putih pada
bagian pelukaan eksplan.
7. Subkultur
Subkultur dilakukan 36 hari setelah penanaman dimana tanaman telah
menampakkan gejala kurang nutrisi (berwarna kecoklatan) atau bobotnya
tidak bertambah. Pada proses subkultur, kalus dipecah menjadi bagian yang
lebih kecil kemudian ditanam lagi ke dalam media baru. Proses subkultur ini
dilakukan sebagai berikut, semua perlengkapan yang digunakan yaitu pinset,
skapel, bunsen, alat-alat gelas, botol berisi alkohol 70% dan botol-botol yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
berisi media yang telah diketahui beratnya dimasukkan kedalam laminar air
flow dan disterilkan selama ± 2 jam dengan lampu UV.
Media yang berisi kalus kemudian disemprot dengan alkohol 70%
kemudian dimasukkan ke dalam laminar air flow. Ketika botol akan dibuka
dan ditutup, maka dilakukan proses flambir. Kemudian ambil kalus dengan
pinset dan letakkan di atas cawan petri. Bersihkan kalus dari sisa-sisa eksplan
hingga bersih kemudian belah bagian kalus tersebut dan potong-potong
dengan menggunakan pertolongan skapel dan pinset dengan ukuran kalus
awal, yaitu 3 – 5 mm lalu ditanam dalam media yang baru secara aseptis.
Kalus yang telah ditanam tadi kemudian diinkubasikan di dalam ruang
inkubator dengan suhu ruangan 180C serta disinari dengan lampu TL “Day
Light” 20 watt dengan ketinggian 40 cm. Sub-kultur ini dibuat sebanyak 42
botol. Untuk mengetahui bobot kalus maka dilakukan penimbangan pada
media baru yang berisi kalus, selanjutnya bobot yang diperoleh dikurangkan
dengan bobot media awal sebelum ditanami kalus.
8. Pemanenan
Setelah dilakukan subkultur, tiap 6 (enam) hari sekali dilakukan
pemanenan sebanyak 6 (enam) buah botol yang berisi kalus lalu dibersihkan
dari sisa-sisa agar yang masih melekat. Setelah kalus bersih kemudian
dilakukan penimbangan dan akan mendapatkan bobot kalus basah. Kalus yang
telah dipanen kemudian dikeringkan pada suhu 40-500C hingga didapatkan
perbedaan bobot sebesar 0,5 mg bobot zat dari 2 penimbangan berurutan
berselang 1 jam atau dengan kata lain setelah didapatkan berat kalus kering
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
yang konstan. Catat bobot kering kalus hasil setiap pemanenan. Kalus kering
yang diperoleh kemudian digerus dengan menggunakan mortir dan stamper .
Selanjutnya serbuk kalus yang diperoleh, disimpan di dalam flakon dan
dikumpulkan sebanyak ± 2 gram untuk dibuat ekstrak sehingga dapat
diketahui metabolit sekunder dalam kalus.
9. Analisis pertumbuhan kalus
Analisis pertumbuhan kalus dalam penelitian ini menggunakan dua cara,
yaitu :
a. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data penimbangan
bobot kalus basah dengan umur kalus.
Perhitungan bobot kalus basah tiap-tiap waktu tertentu yakni setiap 6
(enam) hari sekali. Pertambahan bobot kalus basah pada tiap-tiap waktu
pemanenan didapatkan dari penjumlahan dari tiap-tiap botol yang dipanen
pada hari yang sama. Analisis pertumbuhan kalus dilakukan dengan
menggunakan kurva sigmoid yang menyatakan hubungan antara umur
kalus dengan pertambahan bobot kalus basah ( pertumbuhan kalus )
sehingga diperoleh gambaran fase-fase pertumbuhan kalus. Rumus regresi
linier menurut Budiasmoro (2003) adalah sebagai berikut :
r = Δp/(Δh.p)
( )( ) ( )( )( )( ) ( )22
2
ppnp.rppr a
Σ−ΣΣΣ−ΣΣ
=
( ) ( )( )( )( ) ( )22 ppn
rpp.rn bΣ−Σ
ΣΣ−Σ=
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
Persamaan kurva sigmoid menurut Budiasmoro (2003) adalah sebagai
berikut :
bebNaaY xta N −+
= −+ )(.
1)/('
Y' = pertumbuhan sebagai fungsi umur kalus pada persamaan sigmoid
a = nilai intercept dari rumus regresi linier
b = nilai slope dari rumus regresi linier
N = data bukan nol yang terukur pertama kali
X = umur kalus
Untuk membuktikan bahwa kurva sigmoid yang dihasilkan dapat
mewakili profil pertumbuhan kalus dilakukan uji t terhadap nilai b dan
nilai pertumbuhan yang diperoleh dari persamaan kurva sigmoid.
Sy.x =2)'( 2
−−
nyy
Sb = ∑ 2xSyx
tb = Sbb
Syx = simpangan relatif data penimbangan dengan hasil perhitungan kurva
sigmoid
Y = nilai pertumbuhan yang didapat dari selisih bobot akhir dan bobot
awal kalus
Y' = nilai pertumbuhan yang didapat dari persamaan sigmoid
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
n = jumlah data
x = simpangan Y terhadap rerata Y
Sb = simpangan b
b = nilai slope persamaan sigmoid yang didapat dari hasil regresi linier
tb = nilai t hitung dari b yang akan dibandingkan dengan t tabel.
b. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data biomassanya
Kalus basah yang diperoleh dari setiap pemanenan kemudian
dikeringkan hingga bobotnya konstan dan ditimbang. Pertumbuhan kalus
dihitung berdasarkan persentase pertambahan bobot biomassa kalus.
Kemudian dibuatkan grafik pola pertumbuhan kalus, dengan
menghubungkan antara pertambahan bobot kalus kering dan umur kalus.
10. Pengeringan dan pembuatan serbuk daun kamboja jepang
Daun kamboja jepang dikeringkan di dalam oven pada suhu 40-500C.
Kemudian daun yang telah dikeringkan tersebut, digerus dengan
menggunakan mortir dan stamper. Serbuk daun yang diperoleh, disimpan di
dalam flakon.
11. Pembuatan ekstrak kalus daun kamboja jepang
Satu gram serbuk kalus daun kamboja jepang direfluks menggunakan 10
ml campuran kloroform-metanol (1:10 v/v), selama 10 menit. Larutan
didinginkan dan disaring, filtratnya diuapkan sampai kering. Residu yang
diperoleh dilarutkan dalam 2 ml kloroform-metanol (1:1 v/v) ( Dwiatmaka dan
Wulandari, 2005). Ekstrak yang ditotolkan pada plat KLT 30-50μl ( Wagner,
et al., 1984 ).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
12. Pembuatan ekstrak daun kamboja jepang
Satu gram serbuk daun kamboja jepang direfluks menggunakan 10 ml
campuran kloroform-metanol (1:10 v/v), selama 10 menit. Larutan didinginkan
dan disaring, filtratnya diuapkan sampai kering. Residu yang diperoleh
dilarutkan dalam 2 ml kloroform-metanol (1:1 v/v) ( Dwiatmaka dan
Wulandari, 2005) . Ekstrak yang ditotolkan pada plat KLT 30-50μl ( Wagner,
et al., 1984 ).
13. Uji KLT ekstrak kalus daun kamboja jepang dan ekstrak daun tanaman
asalnya.
Ekstrak kalus daun kamboja jepang dan ekstrak daun tanaman asalnya
ditotolkan pada lempeng KLT dengan menggunakan fase diam silica gel GF254
dan fase gerak berupa etil asetat – metanol - air (81 : 11 : 8 v/v) dengan jarak
pengembangan 10 cm. Deteksinya menggunakan sinar UV 254 dan 365 nm,
serta disemprot dengan dua macam pereaksi yaitu Kedde ( bercak diamati di
bawah sinar tampak) dan asam sulfat 97% ( lempeng dipanaskan pada suhu
1000C selama 3-5 menit, amati bercak di bawah sinar tampak) ( Wagner, et
al., 1984 ).
E. Analisis Hasil
Analisis waktu inisiasi kalus dilakukan secara visual sebagai munculnya
titik-titik tumbuh kalus yang berwarna putih kekuningan untuk yang pertama
kalinya pada eksplan dengan menggunakan rata-rata waktu inisiasi kalus.
Analisis pertumbuhan kalus di dalam penelitian ini menggunakan dua
cara, yaitu :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
1. Pembuatan grafik profil pertumbuhan kalus berdasarkan data
penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus.
Pertumbuhan kalus diperoleh berdasarkan pertambahan bobot kalus basah
yakni dengan cara mengurangkan bobot kalus basah akhir dengan bobot kalus
basah awal. Kemudian data yang diperoleh dimasukkan ke dalam rumus
regresi linier untuk memperoleh nilai a ( intercept ) dan b ( slope ). Setelah itu,
nilai a dan b yang diperoleh, dimasukkan ke dalam persamaan kurva sigmoid
dan dibuat grafik pertumbuhan kalus dengan memplotkan umur kalus dengan
pertumbuhan kalus. Untuk mengamati apakah data dapat digambarkan dengan
kurva sigmoid dilakukan uji t dengan membandingkan nilai t hitung dengan t
tabel ( Budiasmoro, 2003 ).
2. Pembuatan grafik profil pertumbuhan kalus berdasarkan data
biomassanya.
Data penimbangan bobot kalus basah yang diperoleh dari setiap
pemanenan kemudian dikeringkan hingga bobotnya konstan dan ditimbang.
Pertumbuhan kalus dihitung berdasarkan persentase pertambahan bobot
biomassa kalus. Kemudian dibuatkan grafik profil pertumbuhan kalus, dengan
menghubungkan antara pertambahan bobot kalus kering dan umur kalus. Data
profil pertumbuhan kalus berdasarkan biomassa kalus tersebut digunakan
sebagai data pendukung bagi profil pertumbuhan kalus berdasarkan
pertambahan bobot kalus basah.
Untuk mengetahui apakah dengan adanya penambahan zat pengatur
tumbuh ( 2,4-D ) selama dilakukannya proses kultur terhadap kadar air yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
terkandung di dalam kalus maka diperlukan perhitungan persen kadar air. Persen
kadar air kalus dihitung dengan mengurangkan rerata bobot kalus basah akhir
dengan rerata bobot kalus kering dibagi dengan rerata bobot basah akhir dikali
100%.
Analisis kandungan kimia kalus, dalam hal ini glikosida jantung
dilakukan uji KLT dengan membandingkan bercak kalus kamboja jepang dengan
bercak daun tanaman asalnya.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman kamboja jepang dilakukan dengan mencocokkan
tanaman kamboja jepang yang digunakan dalam penelitian dengan ciri-ciri
morfologi tanaman kamboja jepang berdasarkan pustaka acuan ( Anonim, 2006 ).
Berdasarkan hasil determinasi, diperoleh keterangan bahwa tanaman yang
digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman kamboja jepang ( Adenium
obesum ( Forssk.) Roem & Schult) . Kamboja jepang yang dipergunakan dalam
penelitian ini termasuk dalam familia Apocynaceae ( Anonim, 2006 ).
B. Pemilihan Eksplan, Sterilisasi, dan Penanaman
Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tanaman
kamboja jepang. Bagian tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah
daun karena daun lebih mudah didapat daripada bagian tanaman yang lain dan
daun memiliki jaringan parenkim yang akan berdediferensiasi yaitu proses
perkembangan terbalik dari bagian tanaman atau organ tanaman menjadi
sekelompok sel yang terus-menerus membelah berupa kalus dalam media tanam
yang digunakan. Selain itu, di dalam proses pengkulturan mudah untuk
disterilisasi.
Daun yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun yang segar dan
sehat, terletak nomor 3-5 dari ujung batang atau cabang karena pada bagian
47
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
tersebut masih banyak dijumpai jaringan meristem dan parenkim muda yang
mempunyai sifat totipotensi sehingga dapat tumbuh dan berkembang menjadi
kalus. Pada bagian ujung batang atau cabang, sel-sel daun masih terlalu muda dan
tidak tahan terhadap sterilisasi secara kimiawi dengan menggunakan larutan
hipoklorit-Tween 80. Campuran senyawa kimia tersebut menyebabkan kerusakan
banyak jaringan daun sehingga gagal terbentuk kalus bahkan eksplan dapat mati.
Sedangkan pada bagian pangkal batang atau cabang, sel-sel daun sudah tidak aktif
membelah karena pada daun hanya memiliki sedikit jaringan meristem sehingga
pembentukan kalus akan butuh waktu yang sangat lama.
Bagian tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun karena
pada penelitian terdahulu dilaporkan bahwa ekstrak dari daun tanaman Adenium
obesum mengandung glikosida jantung yang memiliki efek sitotoksik yang
berpotensi sebagai antikanker ( Nakamura et.al., 2000 ). Oleh karena itu, pada
penelitian ini diharapkan kalus daun kamboja jepang juga mempunyai kandungan
glikosida jantung yang sama dengan tanaman asalnya.
Media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh
eksplan. Media yang digunakan adalah Murashige-Skoog. Media tersebut
mengandung berbagai nutrisi sehingga dapat menimbulkan resiko kontaminasi.
Kontaminan yang paling sering dijumpai adalah jamur dan bakteri. Untuk
menghindari kontaminasi, dilakukan sterilisasi pada peralatan, media, eksplan
maupun ruang transfer. Sterilisasi peralatan dan media menggunakan metode uap
panas bertekanan yaitu menggunakan autoklaf dengan suhu 121 °C selama 15-20
menit. Sterilisasi eksplan berlangsung dalam 3 tahap, yaitu pencucian, sterilisasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
di luar dan sterilisasi di dalam ruang transfer. Pencucian dilakukan dengan tujuan
menghilangkan kotoran pada daun dengan menggunakan detergen kemudian
dibilas dengan akuades. Sterilisasi di luar dan di dalam ruang transfer dilakukan
secara kimiawi yaitu dengan campuran larutan hipoklorit-Tween 80 kemudian
dibilas menggunakan akuades steril. Ruang transfer disterilisasi dengan disemprot
alkohol 70% dan radiasi sinar UV selama ± 2 jam.
Ukuran eksplan sangat menentukan dalam proses pengkulturan. Bagian
tanaman yang dikerat, masih mengandung suplai makanan serta hormon untuk
potongan tanaman itu sendiri, sehingga makin besar keratan, makin besar
kemampuan keratan ini untuk dirangsang tumbuh dan beregenerasi. Namun
dibalik itu harus dipikirkan pula bahwa makin besar eksplan, makin besar
kemungkinan mendapatkan jaringan yang terkontaminasi (Katuuk,1989). Ukuran
daun yang digunakan adalah 0,5-1 cm. Ukuran tersebut diperoleh dari hasil
orientasi yaitu pada ukuran tersebut mempunyai daya regenerasi yang paling baik.
Gambar 2. Eksplan dalam bentuk irisan melintang daun
Eksplan ditanam dalam bentuk irisan melintang daun. Dengan bentuk
ini, diharapkan permukaan eksplan yang dapat kontak dengan media semakin luas
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
sehingga nutrisi dapat diserap dengan lebih baik oleh eksplan. Pada saat
pengirisan dan pemindahan eksplan ke dalam botol kultur, digunakan pisau dan
pinset yang telah disterilkan dan didinginkan untuk meminimalkan resiko
kematian eksplan karena panas.
C. Deskripsi Kalus dan Waktu Inisiasi Kalus
Kalus adalah suatu massa amorf yang tersusun atas sel-sel parenkim
berdinding sel tipis yang berkembang dari hasil proliferasi sel-sel jaringan induk
( Yuwono, 2006 ). Pada hasil penelitian, kalus dari daun kamboja jepang yang
diperoleh berwarna putih kekuningan dan bersifat “freeable” yaitu antara satu
kumpulan sel dengan sel yang lain mudah dipisahkan.
Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Murashige-
Skoog yang mengandung nutrisi yang cukup lengkap untuk mendukung
pertumbuhan kalus. Penambahan zat pengatur tumbuh auksin dalam media juga
merupakan salah satu faktor yang digunakan untuk menumbuhkan kalus. Dalam
aktivitas kultur jaringan tanaman, auksin terkenal dalam berperan sebagai hormon
yang mampu berperan menginduksi terjadinya kalus (George dan Sherrington,
1984). Pada penelitian digunakan ZPT berupa 2,4-D yang termasuk dalam
golongan auksin sehingga 2,4-D berfungsi dalam menginduksi terjadinya kalus.
Pada penelitian, konsentrasi 2,4-D yang ditambahkan ke dalam media adalah 4
ppm. Konsetrasi 2,4-D tersebut diperoleh dari hasil orientasi di mana pada
konsentrasi tersebut ZPT sudah dapat menginduksi terjadinya kalus.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
Waktu inisiasi kalus adalah waktu yang diperlukan oleh eksplan untuk
menumbuhkan kalus yang dihitung mulai saat penanaman eksplan hingga kalus
teramati pertama kali tumbuh berupa bintik putih pada tepi irisan eksplan atau
pada pelukaan eksplan ( Puspitasari dan Soegihardjo, 2002). Idealnya, waktu
inisiasi kalus ditandai dengan pertambahan bobot eksplan yang telah ditanam dari
bobot awalnya. Namun, pengamatan bobot media dan eksplan dari hari ke hari
menunjukkan terjadinya penurunan bobot eksplan dan media berbanding lurus
dengan umur penanaman. Penurunan bobot tersebut terjadi karena laju
pertumbuhan kalus lebih lambat daripada laju pengurangan kadar air media akibat
penguapan dan penyerapan air oleh eksplan. Oleh karena itu, penentuan waktu
inisiasi kalus tidak dapat diamati dengan cara tersebut.
Pada penelitian ini, inisiasi kalus diamati sebagai munculnya titik-titik
tumbuh kalus yang berwarna putih kekuningan untuk yang pertama kalinya pada
eksplan. Waktu inisiasi kalus rata-rata yang diperoleh dari hasil penelitian adalah
10,3 hari, dapat terlihat pada tabel I.
Tabel I. Waktu inisiasi kalus rata-rata daun kamboja jepang
Jumlah botol sumber inokulum Waktu inisiasi kalus ( hari )
6 9
3 12
1 13
Waktu inisiasi kalus rata – rata ( hari ) 10,3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
Waktu inisiasi kalus menunjukkan komposisi media yang sesuai untuk
menumbuhkan kalus. Dalam penelitian ini, waktu inisiasi digunakan juga sebagai
parameter waktu pemanenan kalus yang nantinya data pemanenan ini akan
digunakan untuk analisis pola pertumbuhan kalus.
Gambar 3. Inisiasi kalus daun kamboja jepang
Waktu inisiasi kalus ini tidak dapat menggambarkan pertumbuhan kalus.
Karena selama proses orientasi yang dilakukan oleh peneliti menunjukkan bahwa
walaupun eksplan tanaman yang dipilih diperlakukan pada kondisi percobaan
yang sama, namun eksplan tanaman yang satu dan yang lainnya memiliki
kepotensialan yang berbeda untuk tumbuhnya kalus. Maka dari itu diperlukan
analisis pertumbuhan kalus baik secara visual maupun penimbangan berat kalus
selama pemanenan.
D. Subkultur dan Panen
Subkultur dilakukan setelah kalus berumur 36 hari. Hal tersebut
dilakukan untuk menjaga konsistensi pasokan nutrisi. Apabila subkultur terlambat
dilakukan, massa kalus akan mati kehabisan nutrisi. Tanda-tanda kalus kehabisan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
nutrisi dan harus segera dipindah ke dalam media yang baru adalah warna kalus
menjadi coklat, media retak, dan selanjutnya sedikit demi sedikit kalus akan
mengering. Waktu 36 hari yang digunakan dalam penelitian ini didapat dari hasil
orientasi, di mana pada umur 36 hari kalus telah mulai menunjukkan tanda
kekurangan nutrisi.
Pada penelitian ini, kalus disubkultur cukup 1 kali sebelum dilakukan
pemanenan. Kalus yang dipanen adalah hasil dari subkultur pertama. Hal ini
dilakukan karena pada subkultur yang pertama eksplan sudah membentuk kalus
seluruhnya.
Bagian kalus yang disubkultur adalah bagian yang masih sehat yaitu
bagian kalus yang belum mengalami kecoklatan atau “browning” dan memiliki
titik tumbuh yang baik yaitu di bagian kalus terluar. Kalus yang telah
mengalami“browning” apabila ditanam tidak dapat tumbuh dan berkembang
membentuk kalus baru. Kalus bagian luar merupakan kalus yang masih tersusun
oleh sel-sel meristem sehingga dapat tumbuh dan berkembang membentuk kalus
baru. Dengan pemilihan ini, diharapkan kalus akan cepat berkembang setelah
dipindah ke media baru. Dari hasil orientasi, ditemukan bahwa kalus bagian dalam
terdiri dari sel-sel tua yang memiliki waktu dormansi sebelum mulai tumbuh
apabila dipindahkan ke media baru. Tidak jarang, kalus tua ini justru mati setelah
dipindah karena tidak mampu menyerap nutrisi dari media.
Bobot kalus awal sebelum subkultur tidak dapat ditimbang karena resiko
kontaminasi. Oleh karena itu, jumlah kalus awal dikendalikan dengan
menyamakan ukuran kalus awal, yaitu ± 3 – 5 mm. Ukuran ini ditetapkan dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
cara orientasi. Ukuran kalus awal yang lebih kecil menghasilkan pertumbuhan
yang lebih pesat karena penyerapan nutrisi lebih optimal.
Pemanenan dilakukan pada setiap 6 hari sekali selama 42 hari. Tujuan
pemanenan adalah untuk mengetahui profil pertumbuhan kalus dan untuk
mendapatkan kalus kering untuk dianalisis kandungan kimianya. Pemanenan
dilakukan sampai hari ke-42, karena pada hari ke-36 hingga hari ke-42 kalus
menunjukan fase stasioner, yang mana pada fase tersebut diharapkan kalus
memiliki kandungan metabolit sekunder berupa glikosida jantung yang optimum.
E. Profil Pertumbuhan Kalus
Pertumbuhan kalus tidak dapat diamati dengan penimbangan kalus
setiap periode waktu tertentu karena adanya pengurangan bobot media akibat
penguapan yang akan mengacaukan data. Kadang-kadang, bobot kalus terlihat
berkurang semu karena laju penguapan media lebih besar daripada laju
pertumbuhan kalus. Untuk mengatasi hal tersebut, analisis pertumbuhan kalus di
dalam penelitian ini menggunakan dua cara, yaitu:
1. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data
penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus.
Pada penelitian, dilakukan panen setiap 6 hari sekali sehingga
didapatkan data bobot kalus awal dan akhir pada hari ke 6, 12, 18, dan seterusnya.
Pertumbuhan dihitung sebagai selisih bobot kalus basah akhir ( n hari setelah
penanaman) dengan bobot kalus basah awal (bobot kalus pada saat ditanam). Pola
pertumbuhan kalus mengikuti persamaan kuva sigmoid dengan adanya fase lag,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
fase eksponensial, dan fase stasioner. Kurva sigmoid menggambarkan hubungan
antara umur kalus dengan pertambahan bobot kalus basah.
Profil pertumbuhan kalus yang akan digunakan untuk melihat fase-fase
pertumbuhan kalus dibuat dengan menghitung pertumbuhan sebagai fungsi pada
persamaan kurva sigmoid yaitu :
( ) bebNa
aYxta N −⎟
⎠⎞
⎜⎝⎛ +
=−+1
Y adalah pertumbuhan menurut fungsi sigmoid dan X adalah umur kalus. Nilai a
dan b diperoleh dari persamaan regresi linier pertumbuhan versus umur kalus
sebagai nilai intercept dan slope. Dengan memasukkan nilai a dan b ke dalam
persamaan maka diperoleh persamaan :
( ) 1494,01494,01730,01730,0
11730,0 +⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
=−+ xt Ne
N
Y
Hasil dari perhitungan tersebut akan membentuk kurva sigmoid yang
menggambarkan profil pertumbuhan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
Profil Pertumbuhan Kalus Berdasarkan Bobot Kalus Basah
00.20.40.60.8
11.21.4
0 6 12 18 24 30 36 42 48
Umur Kalus (hari)
Pert
amba
han
Bob
otK
alus
Bas
ah (Δg
)
Profil Pertumbuhan Kalus Hasil Penimbangan Profil Pertumbuhan Kalus Menurut Kurva Sigmoid
Gambar 4. Profil pertumbuhan kalus kamboja jepang berdasarkan bobot kalus basah
Berdasarkan hasil plot antara umur kalus dan nilai y’ yang diperoleh dari
persamaan kurva sigmoid, dilakukan uji t terhadap slope untuk menentukan
keterwakilan data dari kurva sigmoid tersebut mampu mewakili pertumbuhan
kalus yang diperoleh dari penimbangan dengan membandingkan antara t hitung
dengan t tabel ( sebagai H1 ).
Sy.x =2)'( 2
−−
nyy = 0,1501 Sb =
∑ 2xSyx = 0,1138 tb =
Sbb = -1,3128
t tabel = ± 1,943
Nilai t hitung yang diperoleh adalah -1,3128 , sedangkan nilai t tabel
adalah ± 1,943. Nilai t hitung lebih besar daripada t tabel pada rentang penerimaan
H0 sebelah kiri sehingga kurva sigmoid berada pada daerah penerimaan (H1
diterima ). Kurva sigmoid ini dapat mewakili pertumbuhan kalus yang diperoleh
dari penimbangan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
Berdasarkan hasil plot antara kurva sigmoid dan grafik pertumbuhan
kalus yang diperoleh dari penimbangan dapat menggambarkan profil
pertumbuhan kalus. Fase-fase pertumbuhan kalus daun kamboja jepang dapat
dilihat dari kurva sigmoid tersebut, yaitu:
a. Fase lag. Fase lag yaitu fase penyesuaian dimana laju pertumbuhan kalus
sangat kecil. Pada penelitian ini, fase lag terjadi pada hari ke-0 hingga hari
ke-18. Pada fase lag, terjadi penyesuaian diri daun kamboja jepang dengan
lingkungan sehingga laju pertumbuhan sangat kecil. Pada fase ini, kalus
mulai tumbuh yang ditandai dengan adanya bintik berwarna putih
kekuningan pada bagian pelukaan daun.
b. Fase eksponensial. Fase eksponensial yaitu fase dimana laju pertumbuhan
kalus sangat besar. Pada fase ini kalus dapat menyerap nutrisi dengan baik
yang diperlukan untuk pembelahan sel. Fase eksponensial terjadi setelah
hari ke-18 hingga hari ke-36 .
c. Fase stasioner. Fase stasioner yaitu fase dimana laju pertumbuhan kalus
mulai konstan. Pada fase ini nutrisi dalam media mulai berkurang
sehingga penyerapan nutrisi juga berkurang dan laju pertumbuhan kalus
sebanding dengan laju kematian. Pada penelitian ini fase stasioner dimulai
pada hari ke-36 hingga hari ke-42. Metabolit sekunder diproduksi pada
fase stasioner sehingga untuk memperoleh metabolit sekunder yang
optimum panen perlu dilakukan mulai hari ke-36 hingga hari ke-42.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
2. Biomassa kalus selama masa pertumbuhan 42 hari.
Kurva sigmoid yang menggambarkan hubungan antara umur kalus dengan
pertambahan bobot kalus basah didukung oleh kurva pertumbuhan kalus daun
kamboja jepang berdasarkan pertambahan bobot biomassa kalus. Data profil
pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan pertambahan bobot
biomassa kalus ditunjukkan pada lampiran 6.
F. Persen Kadar Air Kalus
Persen kadar air adalah nilai persen dari pengurangan rerata bobot kalus
basah dengan rerata bobot kalus kering dibagi dengan rerata bobot kalus basah.
Persen kadar air kalus meningkat secara drastis pada hari ke-0 hingga hari ke-6.
Hal tersebut menunjukkan bahwa kalus menyerap lebih banyak air pada fase awal
pertumbuhan kalus yaitu pada fase lag akibat adanya penambahan ZPT (2,4-D) ke
dalam media yang mana 2,4-D dapat menurunkan tekanan dinding sel sehingga
air dapat masuk ke dalam disertai dengan kenaikan volume sel, sehingga kalus
membesar dan persen susut pengeringanpun mengalami kenaikan. Selanjutnya
persen kadar air kalus mulai konstan pada hari ke-6 hingga hari ke-42. Hal
tersebut menunjukkan bahwa kalus menyerap sedikit air akan tetapi kalus lebih
banyak melakukan aktivitas pembelahan sel. Persen kadar air kalus yang
diperoleh dari hasil penelitian ditunjukkan pada gambar 5.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
% Kadar Air Kalus Pada Pertumbuhan Kalus Selama 42 Hari Pemanenan
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 5
Umur Kalus (hari)
Pert
amba
han
Kad
ar A
i
0
rK
alus
( %
)
% Kadar Air Kalus
Gambar 5. Persen kadar air kalus daun kamboja jepang
Kaitan antara data persen kadar air dengan data profil pertumbuhan
adalah sebagai berikut:
a. Fase lag ( hari ke 0 - 18 ) . Pada fase lag, kalus memiliki sel yang besar dan
mengandung banyak air.
b. Fase eksponensial ( hari ke 18 – 36 ). Pada fase eksponensial, sel kalus mulai
membelah dengan ukuran sel yang kecil serta memiliki kandungan air yang
banyak.
c. Fase stasioner ( hari ke 36 – 42 ). Pada fase stasioner, kalus memiliki massa
sel yang besar dan kandungan air yang banyak. Pada fase stasioner, apabila
dilakukan pembudidayaan dalam media cair, diduga kalus daun kamboja
jepang akan menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang optimal karena
media yang digunakan optimum dalam pertumbuhan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
G. Kromatografi Lapis Tipis
Analisis kandungan kimia kalus dilakukan untuk membuktikan bahwa
kalus mampu memproduksi glikosida jantung seperti tanaman asalnya. Dengan
demikian, kalus daun kamboja jepang dapat dikembangkan sebagai penghasil
metabolit sekunder.
Analisis kandungan kimia kalus dalam penelitian ini dilakukan dengan
metode kromatografi lapis tipis (KLT) berdasarkan pada pustaka Wagner (1984).
Fase diam yang digunakan pada penelititan sistem KLT ini yaitu silika gel GF254.
Fase gerak yang digunakan dalam analisis ini adalah campuran etil asetat :
metanol : air dengan perbandingan 81 : 11 : 8 v/v . Karena fase diam lebih polar
daripada fase gerak, maka kromatografi ini merupakan kromatografi fase normal.
Pereaksi semprot yang digunakan dalam penelitian ini adalah pereaksi asam sulfat
97 % dan peraksi Kedde (Wagner et al., 1984).
Glikosida jantung bersifat polar karena memiliki gugus gula (glikon).
Namun kepolaran fase diam yang digunakan dalam penelitian lebih tinggi
dibandingkan dengan glikosida jantung. Berdasarkan sifat fase gerak, fase diam,
dan analit, diperkirakan bercak akan dapat bergerak mengikuti fase gerak. Dari
pengamatan bercak hasil KLT, didapatkan data yang tercantum dalam tabel II.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
Tabel II. Hasil pengamatan KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak etil asetat : metanol : air ( 81 : 11 : 8 v/v )
Pereaksi Asam Sulfat (97%) Perekasi Kedde Totolan Ekstrak
No. Bercak
Rf Warna Rf Warna A1 0,09 Kuning-coklat 0,09 Kuning A2 0,40 Hijau muda 0,40 Kuning A3 0,50 Hijau tua 0,50 Kuning A4 - - 0,65 Merah muda A5 0,75 Coklat 0,71 Merah muda A6 0,80 Hijau tua 0,80 Kuning
Daun Kamboja Jepang
A7 0,90 Hijau tua 0,90 Hijau tua B
B1 0,12 Kuning-coklat 0,12 Kuning Kalus Kamboja Jepang
BB2 0,90 Hijau muda 0,90 Hijau muda
Keterangan gambar :
Fase diam : silika gel GF254
Fase gerak: etil asetat : metanol :air
(81 : 11 : 8 v/v)
A : Ekstrak daun kamboja jepang
B : Ekstrak kalus daun kamboja
jepang
Deteksi :asam sulfat 97 %,
pemanasan selama 1000C
selama 3-5 menit
Jarak pengembangan : 10 cm
Gambar 6. Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi asam sulfat ( 97 % )
Diketahui bahwa larutan penyemprot asam sulfat 97% mempunyai sifat
positif terhadap steroid, glikosida jantung, alkaloid, gibberellin, dan lain-lain (Jork
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
et all, 1990). Wagner (1984) menyatakan bahwa reaksi warna yang terjadi pada
identifikasi senyawa glikosida jantung positif bila timbul gradasi warna dari
merah atau coklat sampai hijau.
Dari hasil penelitian di atas, ekstrak kalus daun kamboja jepang
menghasilkan 2 bercak yaitu B1 dan B2 dengan warna kuning-coklat dan hijau
muda. Kedua bercak tersebut mirip dengan bercak ekstrak daun kamboja jepang
tanaman asalnya yaitu A1 dan A8 dengan warna kuning-coklat dan hijau tua.
Namun bercak-bercak yang diperoleh memiliki warna yang berbeda dari pustaka
acuan. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa tidak dibuktikan ekstrak kalus
daun kamboja jepang mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya.
Keterangan gambar :
Fase diam : silika gel GF254
Fase gerak: etil asetat : metanol :air
(81 : 11 : 8 v/v)
A : Ekstrak daun kamboja jepang
B : Ekstrak kalus daun kamboja
jepang
Deteksi : pereaksi Kedde
Jarak pengembangan : 10 cm
Gambar 7. Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi Kedde
Diketahui juga bahwa pereaksi semprot Kedde mempunyai sifat positif
terhadap glikosida jantung (Anonim, 1978). Wagner (1984) menyatakan bahwa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
reaksi warna yang terjadi pada identifikasi senyawa glikosida jantung positif bila
timbul warna dari biru sampai merah.
Dari hasil KLT dengan pereaksi semprot Kedde, ekstrak kalus daun
kamboja jepang menghasilkan 2 bercak yaitu B1 dan B2 dengan warna kuning dan
hijau muda. Kedua bercak tersebut mirip dengan bercak ekstrak daun kamboja
jepang tanaman asalnya yaitu A1 dan A8 dengan warna kuning dan hijau tua.
Namun bercak-bercak yang diperoleh memiliki warna yang berbeda dari pustaka
acuan. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa tidak dibuktikan ekstrak kalus
daun kamboja jepang mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya.
Secara morfologi pertumbuhan kalus daun kamboja jepang pada media
Murashige – Skoog menunjukkan hasil yang baik, hal ini ditunjukkan dengan
pertumbuhan kalus mengikuti kurva sigmoid. Namun secara fisiologis kalus yang
dihasilkan pada media MS tidak dapat memproduksi metabolit sekunder berupa
glikosida jantung, hal ini ditunjukkan pada hasil uji KLT. Dengan demikian dapat
disimpulkan bahwa pemilihan media tanam dalam penelitian ini tidak sesuai di
dalam menghasilkan metabolit sekunder berupa glikosida jantung.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. KESIMPULAN
Berdasarkan data yang dikumpulkan dalam penelitian ini, maka dapat
ditarik kesimpulan :
1. Penanaman eksplan daun kamboja jepang dapat membentuk kalus yang
dapat tumbuh dengan baik dalam media tumbuh Murashige-Skoog dengan
penambahan ZPT berupa 2,4-Diklorofenoksiasetat (2,4-D) dan waktu
inisiasi kalus rata-rata yang diperoleh dari hasil penelitian adalah 10,3 hari.
2. Pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan penimbangan bobot
kalus basah dan kering mengikuti pola pertumbuhan kurva sigmoid : fase
lag, fase eksponensial dan fase stasioner.
3. Hasil KLT dengan menggunakan pereaksi semprot asam sulfat 97% dan
pereaksi semprot Kedde menunjukkan bahwa ekstrak kalus daun kamboja
jepang tidak mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya.
B. Saran
Dari penelitian ini, perlu dilakukan lanjutan penelitian tentang :
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pemilihan media yang
tepat untuk budidaya secara in vitro daun kamboja jepang sehingga dapat
dihasilkan metabolit sekunder berupa glikosida jantung .
64
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1978, Dyeing Reagents for Thin Layer and Paper Chromatography, no.112 dan 305, E. Merck, Darmstadt, Federal Republic of Germany.
Anonim, 2006, Adenium, http://en.wikipedia.org/wiki/Adenium, diakses pada
tanggal 27 November 2006. Atawodi, S.E., Bulus T.I.S., Ameh D.A., Nok Aj., Mamman M., Galadima M.,
2003, In vitro trypanocidal effect of methanolic extract of some Nigerian savannah plants, Afr.J.Biotechnol. 2(9): 317-321.
Backer, C.A. and R.C.Bakhuizen, 1965, Flora of Java (Spermatophytes Only),
Vol.II, 218-221,225, N.V.P.Noordhoff-Groningen-The Netherlands. Dicosmo, F. and M. Misawa, 1995, Plant cell and tissue culture: Alternatives for
metabolit production, Biotechnol, Adv.13(3): 425-453. Dixon, R.A., 1985, Plant Cell Culture, A practical Approach, 3-11, IRL Press,
Oxford, Washington DC. Doods, J.H. dan Roberts, L.W., 1985, Experiments in Plant Tissue Culture,
Cambridge University Press, Cambridge. Farnsworth, N.R., 1966, Biological and Phytochemical Screening of Plants,
Journal Of Pharmaceutical Sciencis, Vol.55, No. 3., p.260-262. Freiburghaus F., Kaminsky R., Nkuna M.H.N., Brun R., 1996, Evaluation of
African medicinal for their in vitro trypanocidal activity, J.Ethnopharmacol. 55: 1-11.
George, E.F., and Sherrington, P.D.., 1984, Plant Propagation by Tissue Culture,
p.301-310, Eastern Press, Reading. Hendaryono, D.P. Sriyanti dan A. Wijayani, 1994, Teknik Kultur Jaringan, 59-
67,69, 89-94, Kanisius, Yogyakarta. Jork,H., W. Funk, W. Fischer and H. Wimmer, 1990, Thin-Layer
Chromatography : Reagent and Detection Methods, Vol. 1a., p.410-415, Trans: Frank & Jennifer A. Hampson, VCH Publishers, New York.
Katuuk, J.R.P., 1989, Tehnik Kultur Jaringan Dalam Mikropropagasi Tanaman,
Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Proyek Pengembangan Lembaga Pendidikan Tenaga Kependidikan, Jakarta, Hlm:3,37-62,90-109.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
Mgbojikwe, L.O. and Z.S.C. Okoye, 2001, Acaricidal Efficacy of the Aqueous Stem Bark Extract of Adenium obesum on the Various Life Stages of Cattle Ticks, Nig.J.Exptl.Appl.Biol. Vol. 2, No. 1, pp. 39-43.
Moffat, A.C., 2004, Clarke's Analysis of Drugs and Poisons, http://www.medicinescomplete.com/mc/clarke/current/images/clk0536c001.gif, diakses pada tanggal 12 Februari 2007.
Mulja, H.M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 223-227, Airlangga
University Press, Surabaya. Nakamura, M., M. Ishibashi, E. Okuyama, T. Koyano, T. Kowithayakorn, M.
Hayashi and K. Komiyama, 2000, Cytotoxic Pregnanes from Leaves of Adenium obesum, Natural Medicines 54(3): 158-159.
Puspitasari, A. dan Soegihardjo, C.J., 2002, Optimasi Media Penumbuh Kalus
Sebagai Langkah Awal Upaya Budidaya In vitro Tanaman Vitex trifolia L., Majalah Farmasi Indonesia, 21-25.
Ramachandra Rao, S. and G.A. Ravishankar, 2002, Plant cell cultures: Chemical
factories of secondary metabolites, Biotechnol, Adv 20:101-153. Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, 152-158, ITB Press,
Bandung. Sajc, L., D. Grubisic, and G. Vunjak-Novakovic, 2000, Bioreactors for plant
engineering: an outlook for further research, Biochem. Eng. J. 4: 89-99 Salisbury, F.B., and Ross, C.W., 1995, Fisiologi Tumbuhan : Perkembangan
Tumbuhan dan Fisiologi Lingkungan, Jilid III, Edisi IV, hal 14-16, ITB, Bandung.
Samuelsson, G., 1999, Drugs of Natural Origin, 4th Ed., 326, Swedish
Pharmaceutical Press, Sweden. Santoso,U. dan Nursandi,F., 2001, Kultur Jaringan Tanaman, Ed. I, 15 – 139,
UMM Press, Malang. Sastrohamidjojo, H., 2001, Kromatografi, 26-36, Laboratorium Analisis Kimia
Fisika Pusat UGM, Yogyakarta. Shoppee, C.W., 1964, in “ Symposium on Phytochemistry,” Athur, H.R., ed.,
p.86, Hongkong University Press, Hongkong,. Soenanto, H., 2005, Pesona Adenium, 3,10-13, Kanisius, Yogyakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
Stahl, E. (Ed), 1969, Thin Layer Chromatography : A Laboratory Handbook, 2nd Ed., 6, 341-346 , diterjemahkan oleh M.R.F. Ashworth, Springer-Verlag, New York.
Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E.M., 1984, Plant Drug Analysis: A Thin Layer
Chromatography Atlas, p.195-223, (Transl: Scoot, Th.A.), Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York-Tokyo.
Wetherell, D.F., 1982, Pengantar Propagasi Tanaman Secara In Vitro,
diterjemahkan oleh dra. Koensoemardiyah S. Su., Apt., 39-44, Avery Publishing Group Inc., USA.
Yamauchi T. and Abe F., 1990, Cardiac glycosides and pregnanes from Adenium
obesum (studies on constituents of Adenium. I)., Chem Pharm Bull, 38 (3):669-72.
Yusnita, 2003, Kultur Jaringan: Cara Memperbanyak Tanaman secara Efisien,
5,56-62, PT Agromedia Pustaka: Jakarta. Yuwono, T., 2006, Bioteknologi Pertanian, 169, Gadjah Mada University Press,
Yogyakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
Lampiran 1. Surat Determinasi Tumbuhan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
Lampiran 2. Foto-foto Hasil Penelitian
Gambar 8. Foto tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.)
Gambar 9. Foto daun kamboja jepang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
Gambar 10. Foto kalus siap subkultur Gambar 11. Foto kalus siap panen
Gambar 12. Foto kalus basah Gambar 13. Foto kalus kering
Gambar 14. Foto serbuk kalus
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
Gambar 15. Foto hasil KLT secara visual
Keterangan gambar:
A. Ekstrak daun kamboja jepang.
B. Ekstrak kalus daun kamboja jepang.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
Gambar 16. Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi asam sulfat ( 97% )
Keterangan gambar:
A. Ekstrak daun kamboja jepang.
B. Ekstrak kalus daun kamboja jepang.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
Gambar 17. Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi Kedde.
Keterangan gambar:
A. Ekstrak daun kamboja jepang.
B. Ekstrak kalus daun kamboja jepang.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
Lampiran 3. Komposisi media tumbuh Murashige-Skoog ( MS ).
Makronutien mg / L
Kalium nitrat ( KNO3 )
Ammonium nitrat ( NH4NO3 )
Kalsium dikloro dihidrat ( CaCl2.2H2O )
Magnesium sulfat heptahidrat ( MgSO4.7H2O )
Kalium dihigrogen fosfat ( KH2PO4 )
1900
1650
440
370
170
Mikronutien mg / L
Mangan sulfat tetrahidrat ( MnSO4.4H2O )
Seng sulfat heptahidrat ( ZnSO4.7H2O )
Asam borat ( H3BO3 )
Kalium iodide ( KI )
Tembaga (II) sulfat pentahidrat (CuSO4.5H2O )
Natrium molibdat dihidrat ( NaMoO4.2H2O )
Kobalt (II) klorida heksahidrat (CoCl2.6H2O )
Besi (II) sulfat heptahidrat ( FeSO4.7H2O )
Natrium etilen diamin tetra asetat dihidrat ( NaEDTA.2H2O )
22,3
8,6
6,2
0,83
0,025
0,25
0,025
27,8
37,3
Vitamin dan asam amino mg / L
Myo-inositol
Thiamin HCl
Asam nikotinat
Piridoksin HCl
Glisin
100
0,1
0,5
0,5
2
Sumber karbon mg / L
Sukrosa 30000
Zat pengatur tumbuh mg / L
Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat 4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
Zat pemadat dan pelarut mg / L
Agar
Akuades
11000
ad 1 L
pH 5,2 – 5,6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
Lampiran 4. Data penimbangan bobot kalus basah dan bobot kalus kering dalam media tumbuh MS.
Umur kalus (hari)
No. Botol
Bobot kalus
basah awal (g)
Rata-rata bobot kalus basah awal
(g)
Bobot kalus
basah akhir (g)
Rata-rata bobot kalus basah akhir
(g)
Bobot kalus kering
(g)
Rata-rata bobot kalus
kering (g)
Pertumbuhan (g)
1 0,2275 0,2594 0,0226 7 0,2585 0,3163 0,0277
6 13 0,2459 0,2448 0,3041 0,2959 0,0276 0,0251 0,0511 19 0,1989 0,2832 0,0254 25 0,2565 0,2946 0,0222 31 0,2815 0,3176 0,0248 2 0,1645 0,2648 0,0173 8 0,2649 0,3444 0,0290
12 14 0,3307 0,2598 0,3504 0,3093 0,0292 0,0239 0,0496 20 0,2743 0,3369 0,0256 26 0,2699 0,3024 0,0230 32 0,2543 0,2571 0,0195 3 0,2139 0,2769 0,0211 9 0,3497 0,3702 0,0299
18 15 0,2909 0,2707 0,4903 0,3671 0,0385 0,0295 0,0964 21 0,2269 0,279 0,0197 27 0,2501 0,462 0,0393 33 0,2925 0,3242 0,0284 4 0,2481 0,9372 0,0698 10 0,4097 0,7350 0,0532
24 16 0,3091 0,2992 0,5389 0,6734 0,0437 0,0522 0,3742 22 0,2522 0,5608 0,0469 28 0,3047 0,6888 0,0514 34 0,2715 0,5797 0,0479 5 0,4108 1,4450 0,0892 11 0,3809 1,0869 0,0728
30 17 0,3221 0,3227 0,9751 1,1007 0,0717 0,0735 0,7780 23 0,3279 0,9851 0,0641 29 0,2097 0,9654 0,0694 35 0,2850 1,1467 0,0735 6 0,2332 1,8759 0,1007 12 0,3325 1,4615 0,0901
36 18 0,4520 0,3341 1,5795 1,5965 0,0957 0,0968 1,2624 24 0,3918 1,8697 0,1026 30 0,3345 1,3046 0,0913 36 0,2603 1,4878 0,1007 37 0,3719 1,2136 0,0782 38 0,3296 1,0095 0,0710
42 39 0,3516 0,3094 1,4478 1,3257 0,1049 0,0905 1,0162 40 0,3413 1,7060 0,1059 41 0,2289 1,1165 0,0807 42 0,2334 1,4607 0,1022
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
Lampiran 5. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus basah.
Hari Pemanenan p p2 Δp Rs = Δp/(Δh.p) p.Rs Y’
0 0,0000 0,0000 0,0157 0,0511 0,0000 0,0000 6 0,0511 0,0026 0,0433 -0,0015 -0,0049 -0,0003
12 0,0496 0,0025 0,1144 0,0469 0,1576 0,0078
18 0,0964 0,0093 0,2736 0,2778 0,4800 0,0463
24 0,3742 0,1400 0,5399 0,4038 0,1799 0,0673
30 0,7780 0,6052 0,8239 0,4845 0,1038 0,0807
36 1,2625 1,5938 1,0126 -0,2462 -0,0325 -0,0410
42 1,0162 1,0327 1,1020
a = 0,1730 ( nilai intercept dari rumus regresi linier )
b = -0,1494 ( nilai slope dari rumus regresi linier )
( ) 1494,01494,01730,01730,0
11730,0 +⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
=−+ xt Ne
N
Y
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
Data Uji t profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus basah. No X Y Y’ ( Y-Y’ ) ( Y-Y’ )² X=Y-Yrata-rata X² 1 0 0,0000 0,0157 -0,0157 0,0002465 -0,4535 0,2057 2 6 0,0511 0,0433 0,0078 6,094E-05 -0,4024 0,1619 3 12 0,0496 0,1144 -0,0648 0,0041984 -0,4039 0,1632 4 18 0,0964 0,2736 -0,1772 0,0313913 -0,3571 0,1275 5 24 0,3742 0,5399 -0,1657 0,027466 -0,0793 0,0063 6 30 0,7780 0,8239 -0,0460 0,0021129 0,3245 0,1053 7 36 1,2625 1,0126 0,2499 0,0624293 0,8090 0,6544 8 42 1,0162 1,1020 -0,0857 0,0073482 0,5627 0,3167
Sy.x =2)'( 2
−−
nyy = 0,1501
Sb = ∑ 2xSyx = 0,1138
tb = Sbb = -1,3128
t tabel = ± 1,943
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
79
Lampiran 6. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus kering.
Hari Pemanenan p p2 Δp Rs = Δp/(Δh.p) p.Rs Y’
0 0,0000 0,0000 0,0193 0,0251 0,0000 0,0000 6 0,0251 0,0006 0,0242 -0,0011 -0,0074 -0,0002
12 0,0239 0,0006 0,0299 0,0056 0,0386 0,0009
18 0,0295 0,0009 0,0363 0,0227 0,1281 0,0038
24 0,0522 0,0027 0,0434 0,0213 0,0681 0,0036
30 0,0735 0,0054 0,0510 0,0234 0,0531 0,0039
36 0,0969 0,0094 0,0587 -0,0064 -0,0110 -0,0011
42 0,0905 0,0082 0,0662
a = 0,0467 ( nilai intercept dari rumus regresi linier )
b = -0,4239 ( nilai slope dari rumus regresi linier )
( ) 04239,04239,00467,00467,0
10467,0 +⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
=−+ xtNe
N
Y
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
80
Data Uji t profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus kering.
No X Y Y’ ( Y-Y’ ) ( Y-Y’ )² X=Y-Yrata-rata X² 1 0 0.0000 0.0193 -0.0193 0.0003721 -0.0489 0.00242 6 0.0251 0.0242 0.0009 7.954E-07 -0.0239 0.00063 12 0.0239 0.0299 -0.0059 3.501E-05 -0.0250 0.00064 18 0.0295 0.0363 -0.0068 4.67E-05 -0.0194 0.00045 24 0.0522 0.0434 0.0087 7.608E-05 0.0032 0.00006 30 0.0735 0.0510 0.0225 0.0005054 0.0245 0.00067 36 0.0969 0.0587 0.0382 0.0014580 0.0479 0.00238 42 0.0905 0.0662 0.0243 0.0005884 0.0416 0.0017
Sy.x =2)'( 2
−−
nyy = 0,0227
Sb = ∑ 2xSyx = 0,2444
tb = Sbb = -1,7344
t tabel = ± 1,943
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
81
Lampiran 7.Data persen kadar air kalus kamboja jepang
Persen kadar air kalus dihitung dengan rumus:
% Kadar air = rerata bobot kalus basah – rerata bobot kalus kering x 100% rerata bobot kalus basah Hari pemanenan
Rerata bobot kalus
basah (g) Rerata bobot kalus
kering (g) Kadar air
(%) 0 0 0 0 6 0,2959 0,0251 91,5333 12 0,2998 0,0239 92,0178 18 0,3671 0,0295 91,9686 24 0,6734 0,0522 92,2557 30 1,1007 0,0735 93,3270 36 1,5965 0,0969 93,9336 42 1,3257 0,0905 93,1746
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
82
BIOGRAFI PENULIS
Nama lengkap penulis adalah Melissa Wijaya, dilahirkan
di Cirebon pada tanggal 13 Oktober 1985, anak kedua
dari dua bersaudara pasangan Kusnadi Widjaja dan Tuti
Setiawati. Penulis menyelesaikan pendidikan TK Kristen
BPK Penabur Jamblang tahun 1989-1991, pendidikan
SD Kristen BPK Penabur Jamblang tahun 1991-1997,
kemudian pendidikan SLTP Kristen BPK Penabur
Cirebon tahun 1997-2000, dilanjutkan SMU Kristen BPK Penabur Cirebon tahun
2000-2003, selepas SMU penulis masuk ke perguruan tinggi Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma penulis pernah aktif sebagai asisten praktikum, antara
lain adalah praktikum farmakologi dasar dan toksikologi dasar pada tahun
2006/2007. Pada tahun 2005/2006 penulis mengerjakan Program Kreativitas
Mahasiswa Penelitian dengan judul Optimasi Komposisi 2,4 Diklorofenoksi
Asetat dan Furfuryl Amino Purine dalam Penghasilan Glikosida Jantung secara In
Vitro dari Kalus Kamboja Jepang ( Adenium Obesum ). Penulis telah
menyelesaikan skripsi dengan judul “Kandungan Glikosida Jantung dan Profil
Pertumbuhan Kalus Daun Kamboja Jepang ( Adenium obesum (Frossk.) Roem. &
Schult. ) Dalam Media Tumbuh Murashige-Skoog”.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
top related