plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - usd … · glikosida jantung kalus daun kamboja jepang...

PROFIL PERTUMBUHAN DAN ANALISIS KUALITATIF

GLIKOSIDA JANTUNG KALUS DAUN KAMBOJA JEPANG

(Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.)

DALAM MEDIA GAMBORG DENGAN VARIASI KONSENTRASI

2,4 DIKLOROFENOKSI ASETAT DAN 6-FURFURIL AMINO PURIN

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh : Vicky Ariestya Chandra

NIM : 028114031

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2007

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

iv

Karena cinta dan kasih-Ku, Aku telah

memberimu dukungan kekal dan harapan yang baik. Aku mendukung hatimu dan menguatkanmu di setiap usaha dan perkaramu. Kuncinya adalah menemukan kegembiraan di dalam harapan, kesabaran di tengah rasa frustasi dan masa-masa sulit, serta ketekunan di dalam doa. Pasti tidak akan ada yang terlalu sulit untuk-Ku jika kamu selalu mengandalkan-Ku. Karena Aku sumber segala pengharapan...

from Your faithfull friend, Jesus

2 Tesalonika 2:16-17


vi

INTISARI

Penelitian ini dilatarbelakangi maraknya penggunaan kultur jaringan untuk

menghasilkan metabolit sekunder dari tanaman secara cepat dan optimal. Tujuannya yaitu membuktikan bahwa jaringan dapat menggantikan tanaman asal secara fungsional, termasuk menghasilkan metabolit sekunder. Dalam penelitian ini, metabolit sekunder yang diteliti yaitu glikosida jantung dari kalus daun kamboja Jepang (Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.). Eksplan untuk menghasilkan kalus didapat dari jaringan daun kamboja jepang yang ditanam secara in vitro pada media Gamborg dengan penambahan zat pengatur tumbuh asam 2,4-diklorofenoksi asetat (analog auksin) dan 6-furfurilaminopurin. Kalus kemudian direfluks dengan menggunakan campuran kloroform - metanol (1 : 10 v/v).

Analisis dilakukan dengan membandingkan waktu inisiasi kalus, profil pertumbuhan kalus, dan susut pengeringan kalus yang dikembangkan dalam media dengan dua macam perbandingan konsentrasi asam 2,4-diklorofenoksiasetat dan 6-furfurilaminopurin. Analisis kandungan glikosida jantung kalus dilakukan dengan cara KLT yaitu dengan membandingkan harga Rf bercak hasil pengembangan ekstrak kalus dengan ekstrak daun kamboja jepang dalam fase diam silika GF254, fase gerak etil asetat – methanol – air (81 : 11 : 8 v/v) dengan jarak pengembangan 8 cm. Deteksi yang digunakan yaitu sinar UV 254 dan 365 nm, pereaksi Vanilin Asam Fosfat dan Kedde berdasarkan acuan (Wagner, 1984). Pembanding yang digunakan yaitu standard digitoksin.

Dari hasil penelitian, diketahui bahwa waktu inisiasi tercepat terjadi pada kalus dalam media dengan perbandingan 2,4-D dan FAP yaitu 4 : 4 dibanding konsentrasi 2,4-D 4 ppm. Fase pertumbuhan media Ga. II, fase lag terjadi pada hari 0-18, fase eksponensial terjadi pada hari 18-36, dan fase stasioner terjadi pada hari 36-42. Media Ga. III mengalami fase lag pada hari 0-15, fase eksponensial pada hari 15-36, dan fase stasioner pada hari 36-42. Waktu pencapaian fase stasioner keduanya dicapai setelah hari ke-36 dan laju peningkatan susut pengeringan antara kedua perbandingan konsentrasi tidak nampak perbedaan yang berarti. Harga Rf ekstrak kalus dari analisis profil KLT mirip dengan Rf bercak hasil pengembangan ekstrak daun kamboja Jepang dan standar digitoksin sehingga diduga kalus pada penelitian ini mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya. Kata kunci : kamboja jepang,2,4-D, FAP, Adenium obesum, kalus


vii

ABSTRACT

This experiment is held because recently, tissue culture technologies are

often used in producing secondary metabolite from plant, quick and optimal. The purpose of this experiment is to prove that the tissue can act as a complete plant system to produce secondary metabolie. The secondary metabolite that is researched is cardiac glycoside from leaves callus of kamboja jepang (Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.). The explant that produce callus is got from kamboja jepang leaves tissue which is planted in vitro in Gamborg medium with addition of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (an auxin anologue) and 6-furfurylaminopurine (kinetin). Then, the dry callus is refluxed with chloroform-methanol mixed (1:10 v/v). The analysis done by comparing initiation time, callus growth profile, and drying decrease in callus which is planted in two kind of comination concentration.of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 6-furfurylaminopurine. The analysis of the contain of cardiac glycoside in callus is done with KLT by comparing Rf value between KLT spots of callus extract and the mother plant leaves. This experiment use silica GF254 as static phase and the etil acetic : methanol : water mixed (81 : 11 : 8 v/v) as mobile phase. The detection include UV 254 dan 365 light, VPA (Vanillin Phosphoric Acid), and Kedde reagent according to Wagner (1984). Standard of Digitoxin is used as a comparated. From the result of experiment, it is known that the most rapid initiation time is happened in callus which is planted in 4 : 4 concentration of FAP and 2,4-D. Growth phase of Ga. II medium, lag phase at 0-18th days, eksponensial phase at 18th-36th days, and stationary phase at 36th-42th days. Ga. III medium, lag phase at 0-15th days, eksponensial phase at 15th-36th days, and stationary phase at 36th- 42th days. Stationary phase reaching time, both are reached after 36 days from the inoculation and the increase rate of water contain between those are similar. The Rf value of callus extract’s KLT profile approach the Rf of mother plant leaves and digitoxin standard. The conclusion of this experiment is callus does contains some cardiac glycoside like the mother plant. Keywords : kamboja jepang, 2,4-D, FAP, Adenium obesum, callus


viii

PRAKATA

Puji syukur saya haturkan kepada Bapa yang Maha Besar atas berkat dan

pendampingan yang telah diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi

yang berjudul “Profil Pertumbuhan dan Analisis Kualitatif Glikosida Jantung

Kalus Daun Kamboja Jepang (Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.)

dalam Media Gamborg dengan Variasi Konsentrasi 2,4-Diklorofenoksi

Asetat dan Furfuril Amino Purin” sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

gelar Sarjana Farmasi.

Penelitian sampai dengan penulisan skripsi ini tidak akan selesai, tanpa

bantuan serta doa dari beberapa pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan

terima kasih kepada :

1. Keluarga terutama Papi Mami atas doa, dukungan, dan nasehatnya yang

menguatkan dan mendorong saya untuk segera menyelesaikan skripsi ini.

Verdy, ooh saya, terima kasih atas pinjaman printernya.

2. Bapak Ignatius Yulius Kristio Budiasmoro, M.Si., selaku Dosen

Pembimbing Skripsi yang telah menawarkan proyek ini sehingga penulis

tidak kesulitan dalam mencari usulan penelitian untuk skripsi. Beliau juga

banyak memberikan masukan, ilmu, waktu, dan kesabaran dalam

membimbing selama penelitian dan penulisan skripsi ini.

3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji Skripsi yang

telah bersedia menguji dan memberikan saran demi kesempurnaan skripsi

ini.


ix

4. Ibu Erna Tri Wulandari, M.Si, Apt., selaku Dosen Penguji Skripsi yang

telah bersedia menguji serta memberikan masukan demi kesempurnaan

skripsi ini.

5. Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi atas ilmu dan

bimbingannya selama lima tahun ini.

6. Seluruh laboran Fakultas Farmasi, terutama laboran Laboratorium Biologi

(Mas Sigit, Mas Andri, Mas Wagiran, dan Mas Sarwanto) atas segala

dukungan dan bantuannya selama ini serta Pak Iswandi atas

kebersamaannya selama di lab. KJT.

7. Meymey ku tersayang, atas dukungan dan kesabarannya selama ini, dan

terutama atas cintanya.

8. Teman-teman yang telah berjuang dan belajar bersama di Laboratorium

Kultur Jaringan (Pak eko, Donny, dan Mellisa).

9. Teman-teman satu angkatan, terutama kelompok praktikum B atas

kebersamaannya selama empat tahun ini (Ferry, Kobo, Beben, Kate, Dinta,

Dewi_Ali).

10. Teman-teman kos Ksatria atas kebersamaannya selama 1 tahun ini. Terima

kasih kalian sudah membuat saya menjadi lebih ceria, lebih semangat,

lebih kuat dalam menghadapi hidup. Anak-anak atas Santo, Abe (cepat

lulus ya !!), anak-anak bawah Onot (orang yang paling baik, tidak pernah

marah, rendah hati dan tidak sombong, serta selalu kelihatan tidak pernah

punya masalah dengan tampang culunnya), Ucup dan Ade (terima kasih


x

sudah mau dengerin curhatku), Budi tao dan Robby (terima kasih sudah

menjadi penasehat spiritual ku)

11. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah

mendukung dan mendoakan penulis.

Semoga Bapa membalas semua kebaikan, kasih, dan ketulusan yang

selama ini dirasakan oleh penulis.

Dalam penelitian dan penulisan skripsi ini, masih banyak kekurangan yang

masih harus diperbaiki. Oleh karena itu, penulis menerima segala saran maupun

kritik yang dapat membantu dan mendukung skripsi ini sehingga dapat lebih

bermanfaat bagi masyarakat luas terutama di bidang kefarmasian.

Yogyakarta, 1 Agustus 2007


xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL………………………………………………………….. i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING……………………………… ii

HALAMAN PENGESAHAN........................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN …………………………………………...… iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……………………………………… v

INTISARI…………………………………………………………………….. vi

ABSTRACT………………………………………………………...…………. vii

PRAKATA…………………………………………………………………… viii

DAFTAR ISI…………………………………………………………………. xi

DAFTAR TABEL……………………………………………………………. xiv

DAFTAR GAMBAR………………………………………………………… xv

DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………………. xvi

BAB I. PENGANTAR……………………………………………………….. 1

A. Latar Belakang……………………………………………………….... 1

B.Permasalahan…………………………………………………………... 4

C.Keaslian Penelitian……………………………………………………... 5

D.Manfaat Penelitian……………….…..……………………………….... 5

E.Tujuan Penelitian……………………………………………………..... 5

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA………………………………………... 6

A. Kamboja Jepang ………………………………………………………. 6

1. Uraian tanaman………………………………………………………. 6

2. Khasiat / kegunaan…………………………………………………… 7

3. Kandungan kimia…………………………………………………….. 7

4. Keterangan botani……………………………………………………. 7

B. Glikosida jantung……………………………………………………… 7

1. Glikosida jantung…………………………………………………….. 7

2. Digitoksin…………………………………………………………….. 8

3. Identifikasi……………………………………………………………. 9

C. Kromatografi lapis tipis………………………………………………… 9


xii

1. Silika gel……………………………………………………………… 10

2. Alumina………………………………………………………………. 11

3. Kieselguhr…………………………………………………………….. 11

4. Selulosa……………………………………………………………….. 11

D. Kultur jaringan…………………………………………………………. 13

1. Pendahuluan…………………………………………………………. 13

2. Penanaman eksplan…………………………………..……………… 15

3. Sub kultur……………………………………………………………. 15

4. Faktor penentu kultur jaringan………………………………………. 16

5. Pola pertumbuhan kalus……………………………………………... 26

E. Sterilisasi……………………………………………………………….. 27

F. Keterangan empiris……………………………………………………... 29

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN……………………………………... 31

A. Jenis dan Rancangan Penelitian……………………………………….... 31

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional………………………..… 31

1. Variabel utama…………………………………………………..….. 31

2. Variabel pengacau terkendali…………………………………..….... 31

3. Variabel pengacau tidak terkendali…………………………..……... 31

4. Definisi Operasional………………………………………..……….. 32

C. Bahan dan Alat Penelitian……………………………………..………... 33

1. Bahan……………………………………………………..…………. 33

2. Alat……………………………………………………..…………… 35

D. Tata Cara Penelitian……………………………………..……………… 36

1. Determinasi tanaman………………………………….…………….. 37

2. Pembuatan stok……………………………………………………... 37

3. Pembuatan media…………………………………………………… 39

4. Sterilisasi alat dan ruangan …………………………………………. 40

5. Sterilisasi dan penanaman eksplan…………………………………... 40

6. Pengamatan waktu inisiasi kalus……………………………………..41

7. Sub kultur……………………………………………………………. 41


xiii

8. Pemanenan…………………………………………………………...42

9. Analisis pertumbuhan kalus…………………………………………43

10. Pengeringan dan pembuatan serbuk daun kamboja jepang…………43

12. Pembuatan ekstrak kalus…………………………………………....44

13. Pembuatan ekstrak daun kamboja jepang…………………………...44

14. Pembuatan standar digitoksin……………………………………… 45

15. Uji KLT ekstrak kalus, ekstrak daun kamboja jepang

dan standard digitoksin……………………………………..……….45

E. Analisis hasil……………………………………………………………..45

BAB 1V. HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………………48

A. Determinasi tanaman…………………………………………………….48

B. Pembuatan media, pemilihan eksplan, sterilisasi, dan penanaman….….. 48

C. Waktu inisiasi…………………………………………………………… 51

D. Subkultur dan panen……………………………………………………. 53

E. Profil pertumbuhan kalus……………………………………………….. 55

F. Susut pengeringan kalus………………………………………………… 57

G. Analisis kandungan kimia kalus………………………………………... 59

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN………………………………………. 65

A. Kesimpulan……………………………………………………………... 65

B. Saran……………………………………………………………………. 65

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………….… 67

LAMPIRAN…………………………………………………………………... 71

BIOGRAFI PENULIS………………………………………………………… 81


xiv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Waktu inisiasi kalus pada Ga. II……………………………….52

Tabel II. Waktu inisiasi kalus pada Ga. III………………………………52

Tabel III. Hasil pengamatan KLT dengan fase diam

Silika gel GF254 dan fase gerak etil asetat :

metanol : air (81 : 11 : 8 v/v)……………………………………61

Tabel IV. Pertumbuhan kalus pada media Ga. II………………………….76

Tabel V. Pertumbuhan kalus pada media Ga. III…………………………77

Tabel VI. Susut pengeringan kalus pada media Ga. II…………………….78

Tabel VII Susut pengeringan kalus pada media Ga. III……………………79


xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1a. Struktur oleandrigenin………………………………………… 6

Gambar 1b. Struktur digitoksin…………………………………………….. 9

Gambar 2. Eksplan dalam bentuk irisan melintang…………………….… 51

Gambar 3. Inisiasi kalus…………………………………………………...53

Gambar 4. Kurva pertumbuhan kalus pada media Ga. II………………….55

Gambar 5. Kurva pertumbuhan kalus pada media Ga. III ………………...56

Gambar 6. Perbandingan kurva susut pengeringan kalus

pada kedua media………………………………………………58

Gambar 7 Penomoran struktur inti steroid………………………………...59

Gambar 8. Kromatogram glikosida jantung kalus daun

Kamboja Jepang, ekstrak daun kamboja Jepang

Tanaman asal dan standar digitoksin setelah

disemprot dengan pereaksi Vanilin Asam Fosfat………………62

Gambar 9. Kromatogram glikosida jantung kalus daun

Kamboja Jepang, ekstrak daun kamboja Jepang

Tanaman asal dan standar digitoksin setelah

disemprot dengan pereaksi Kedde……………………………..63

Gambar 10. Foto tanaman kamboja Jepang…………………………………72

Gambar 11. Foto kalus siap subkultur………………………………………72

Gambar 12. Foto kalus siap panen…………………………………………..73

Gambar 13. Foto hasil KLT secara visual…………………………………..73

Gambar 14. Foto hasil KLT dilihat di bawah sinar UV254…………………..74

Gambar 15. Foto hasil KLT dilihat di bawah sinar UV365…………………..74

Gambar 16. Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi VAP,

pemanasan 100˚C 10 menit……………………………………..75

Gambar 17. Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi Kedde…………………75


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tanaman………………………….71

Lampiran 2. Foto-foto hasil penelitian………………………………………..72

Lampiran 3. Data-data penelitian……………………………………………..76

Lampiran 4. Komposisi media Gamborg……………………………………..80


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Adenium obesum dikenal sebagai mawar gurun, termasuk suku

Apocynaceae, dan merupakan tumbuhan asli Afrika. Batangya bergetah dan dapat

membesar seperti bonggol yang berfungsi untuk menyimpan air, karena adenium

berasal dari gurun pasir yang kering dan panas (Beikram dan Andoko, 2003).

Pada penelitian terdahulu dilaporkan bahwa kamboja jepang mengadung bahan

aktif yang menyerupai glikosida digitalis (glikosida jantung). Selain itu juga

mengadung ekugin, honghelosida A, 16-asetilstrospesida, honghelin,

Oleandrigenin beta-gentiobiosil-beta-D-thevetosida, Neridienone A dan 16,17 -

dihydroneridienone, dihydroifflaionic acid, flavonol, 3-O-methylkaempferol,

flavonol 3,3′ - bis(O-methyl) quercetin (Anonim, 2005).

Menurut Nakamura dkk. (2000), Adenium obesum digunakan untuk

pengobatan gonorrhoea di Afrika timur. Ekstrak dari tanaman ini juga disebutkan

memiliki efek sitotoksik dengan cara mematikan sel-sel kanker leukimia. Efek

yang ditimbulkan oleh ekstrak tanaman ini lebih baik dibanding vincristine dan

adryamicin di mana sel-sel kanker leukimia bersifat resisten dengan keduanya.

(Nakamura, 2000). Ekstrak kulit batang Adenium obesum berpotensi sebagai

acaricidal (Mgbojikwe dan Okoye, 2001). Ekstrak akar dan kulit batang juga

berpotensi sebagai trypanocidal (Atawodi, et al., 2004; Freiburghaus,et al., 1996).


2

Senyawa yang memiliki efek sitotoksik tersebut memiliki ciri yang utama

yaitu adanya inti kardenolida. Inti kardenolida juga dimiliki oleh glikosida jantung

di samping adanya cincin lakton dan gula deoksi. Salah satu contoh golongan

glikosida jantung yang cukup dikenal adalah digitoksin. Dalam penelitian ini

digunakan digitoksin sebagai standar pembanding karena memiliki kemiripan

struktur dengan senyawa yang memiliki efek sitotoksik seperti yang disebutkan di

atas.

Kultur jaringan tanaman merupakan teknik untuk menumbuhkan organ,

jaringan dan sel tanaman yang dipelihara dalam suatu medium dan dikerjakan

seluruhnya dalam kondisi aseptik. Organ, jaringan dan sel tanaman yang

ditumbuhkan tersebut disebut eksplan. Eksplan yang telah ditumbuhkan dalam

media dapat membentuk kalus yaitu massa amorf yang tersusun atas sel-sel

parenkim berdinding sel tipis yang berkembang dari hasil proliferasi sel-sel

jaringan induk. Ide memperbanyak tanaman dengan jalan mengkulturkan bagian

kecil organ, jaringan atau sel tersebut dilakukan berdasarkan teori totipotensi sel

yaitu : setiap sel tanaman hidup mempunyai informasi genetik dan perangkat

fisiologis yang lengkap untuk dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman

yang utuh, jika kondisinya sesuai.

Untuk memacu pertumbuhan dalam kultivasi secara invitro, di dalam

media perlu ditambahkan zat pengatur tumbuh. Golongan zat pengatur tumbuh

yang sering dipakai dalam KJT adalah auksin dan sitokinin. Penambahan ZPT

dengan konsentrasi yang berbeda akan menghasilkan bentuk pertumbuhan yang


3

berbeda-beda. Penambahan ZPT akan memberikan dampak yang sangat luas

secara sitologis dalam pertumbuhannya (George, 1993; Taiz dan Zieyer, 1998).

Penelitian ini bertujuan untuk mengkulturkan bagian daun tanaman

kamboja jepang serta mengidentifikasi metabolit sekunder glikosida jantung yang

dihasilkan oleh kalus yang dibentuk dari hasil budidaya in vitro. Media yang

digunakan dalam penelitian ini adalah media Gamborg karena cocok untuk

tanaman bergetah (berkayu) (Katuk, 1989).

B. Permasalahan

Permasalahan yang dapat dirumuskan dalam penelitian ini, yaitu :

1. Apakah eksplan yang berasal dari daun kamboja jepang dapat menghasilkan

kalus jika dikembangkan secara in vitro dalam media Gamborg?

2. Bagaimana pola pertumbuhan kalus daun kamboja jepang yang dikulturkan?

3. Apakah kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in vitro dapat

menghasilkan glikosida jantung seperti tanaman asalnya ?

C. Keaslian Penelitian

Sejauh penelusuran pustaka yang dilakukan peneliti, belum ada penelitian

serupa mengenai budidaya in vitro dengan eksplan dari daun kamboja jepang

dengan media tumbuh Gamborg. Penelitian tentang kamboja jepang yang pernah

dilakukan antara lain :

1. Profil Pertumbuhan dan Analisis Kualitatif Glikosida Jantung Kalus Daun

Kamboja Jepang (Adenium obesum) dalam Media MS dengan Konsentrasi

2,4 Diklorofenoksi Asetat sebesar 4 ppm, diteliti oleh Mellisa W. (2007)


4

2. Profil Pertumbuhan dan Analisis Kualitatif Glikosida Jantung Kalus Daun

Kamboja Jepang (Adenium obesum) dalam Media WPM dengan Variasi

Konsentrasi asam 2,4-Diklorofenoksi Asetat dan 6-Furfurylaminopurine,

diteliti oleh Lukas Eko W. (2007)

D. Manfaat penelitian

Manfaat teoritis penelitian ini yaitu dapat mengembangkan bidang ilmu

kefarmasian, khususnya dalam mengeksplorasi kandungan glikosida jantung dari

tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) yang

ditumbuhkan secara in vitro, selain itu dapat menentukan konsentrasi dan media

yang cocok untuk pertumbuhan eksplan dari daun kamboja jepang. Manfaat

praktis penelitian ini diharapkan produksi metabolit sekunder berupa glikosida

jantung dapat dilakukan dalam skala industri sehingga bisa menjadi alternatif

pengobatan dalam masyarakat.

E. Tujuan Penelitian

1. Menumbuhkan kalus dari eksplan daun kamboja jepang.

2. Mengetahui pola pertumbuhan kalus daun kamboja jepang.

3. Membuktikan bahwa ekstrak kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in

vitro dapat menghasilkan glikosida jantung seperti tanaman asalnya.


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kamboja Jepang

1. Uraian tanaman

Kamboja jepang merupakan kelompok tanaman C3. Tanaman ini butuh

sinar matahari lansung dengan intensitas 80 %. Namun demikian untuk tanaman

dewasa, sinar matahari selama 8-12 jam sehari sangat baik untuk pertumbuhan

dan pembungaan (Wie, 2006).

Kamboja jepang sering disebut sebagai mawar gurun dan merupakan

tumbuhan asli Afrika (Ranger, 1996). Di gurun Afrika yang panas dan tandus,

tanaman ini bisa tumbuh liar mencapai 3 meter atau lebih. Bonggol dan batangnya

menggembung sebagai tempat cadangan air dengan ukuran ranting dan dedaunan

yang tidak seimbang. Daun bentuknya bermacam-macam, ada yang langsing

memanjang atau berbentuk lanset dan berujung lancip, ada pula yang oval dan

membulat di bagian ujungnya. Daunnya kebanyakan tipis dan ada pula yang tebal

seperti daun cocor bebek. Warnanya ada yang hijau tua, hijau pupus, kemerahan,

kuning dan variegeta (mengalami mutasi warna, biasanya hijau dengan belang-

belang kuning pucat atau putih). Permukaan daun umumnya halus, tetapi pada

beberapa jenis ada yang berbulu. Bunga berbentuk terompet, mahkota bunga

bervariasi dari bentuk bintang, ujung mahkota terpotong atau membulat, sampai

yang bergerigi. Corak bunga ada yang polos dengan satu warna, strip di bagian

dalamnya dan bergaris di bagian ujung mahkotanya. (Beikram dan Andoko,

2003).


6

2. Khasiat / kegunaan

Di Afrika timur digunakan untuk pengobatan gonorrhoea, penduduk asli

juga menggunakannya sebagai racun ikan dan anak panah (Nakamura dkk., 2000;

Ranger, 1996). Pada umumnya semua bagian tanaman ini bersifat racun jika

masuk dalam saluran cerna (Anonim, 2006). Menurut Nakamura dkk. (2000),

ekstrak tanaman ini dapat digunakan untuk mencegah sitotoksisitas. Ekstrak dari

kulit batang berpotensi sebagai acaricidal (Mgbojikwe dan Okoye, 2001). Ekstrak

dari akar dan kulit batang juga berpotensi sebagai trypanocidal (Atawodi, et al.,

2004; Freiburghaus, et al., 1996).

3. Kandungan kimia

Kamboja jepang mengandung bahan aktif menyerupai glikosida digitalis

(glikosida jantung). Selain itu juga mengandung ekugin, honghelosida A, 16-

asetylstrospeside, honghelin, Oleandrigenin beta-gentiobiosyl-beta-D-thevetoside,

Neridienone A dan 16,17 - dihydroneridienone, dihydroifflaionic acid, flavonol,

3-O-methylkaempferol, flavonol 3,3′ - bis(O-methyl) quercetin (Anonim, 2005).

4. Keterangan botani

Kamboja jepang memiliki nama ilmiah Adenium obesum (Forssk.) Roem.

& Schult. Tanaman ini termasuk dalam suku Apocynaceae (Anonim, 2006).

O

CH3

HOH

CH3

OH

O

H

O

H3C

O

Gambar 1a. Struktur oleandrigenin


7

B. Glikosida Jantung

1. Glikosida jantung

Senyawa ini mengandung glikosida steroid dengan efek spesifik, yaitu

mempengaruhi irama pergerakan jantung. Steroid ini strukturnya merupakan

turunan sistem cincin tetrasiklik, yaitu 10,13-dimethil-cyclopentano-

perhydrophenanthrene. Glikosida steroid ini mempunyai cincin γ-lakton

(kardenolida) atau cincin δ-lakton (bufadienolida) yang menyerang di posisi β

pada atom C17. Residu gula merupakan turunan dari deoksi dan atau C-3-0

methylated sugar, dan terhubung secara glikosidik melalui C-3-OH groups dari

aglikon steroid (Wagner, 1984)

Glikosida jantung ditemukan dalam beberapa keluarga tumbuhan yang

sama sekali tidak berkaitan satu sama lain seperti Apocynaceae, Liliaceae,

Moraceae, dan Ranunculaceae (Robinson, 1995), juga banyak ditemukan pada

anggota suku Scrophulariaceae, Digitalis, Nerium, Asclepiadaceae, dan Asclepis

(Harborne, 1987). Tumbuhan yang mengandung senyawa ini telah digunakan

sejak zaman prasejarah sebagai racun panah dan siksaan. Keberadaan senyawa ini

dalam tumbuhan mungkin memberi perlindungan kepada tumbuhan dari

gangguan beberapa serangga tertentu (Robinson, 1995).

2. Digitoksin

Digitoksin merupakan glikosida jantung dari Digitalis purpurea

dengan rumus molekul C41H64O13 dan berat molekul 764,92. Oleh asam

terhidrolisis menghasilkan 1 molekul digitoksigenin dan 3 molekul

digitoksosa. Digitoksin tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik


8

seperti kloroform, alkohol, etil asetat, juga larut dalam aseton amil alkohol dan

piridin (Mursyidi, 1990). Digitoksin merupakan glikosida sekunder bersama

dengan digoksin dan gitoksin. Glikosida primer dapat berupa glikosida

purpurea (dalam Digitalis purpurea) dan lanatosida (dalam Digitalis lanata).

Dalam Digitalis purpurea, glikosida primer kurang stabil dibanding yang

terdapat dalam Digitalis lanata, buktinya terbentuk zona yang jelas dari

digitoksin dan gitoksin (Wagner, 1984).

OH

O

C18H31O9

OO

Gambar 1b. Struktur digitoksin

3. Identifikasi

Identifikasi glikosida jantung dapat dilakukan dengan menggunakan

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) secara kualitatif. Reaksi identifikasi terhadap

glikosida jantung dapat dilakukan menggunakan uji dengan pereaksi Baljet (2,4,6-

trinitrophenol), uji dengan pereaksi Kedde (3,5-dinitrobenzoic acid), uji dengan

pereaksi Raymond (m-dinitrobenzene), uji dengan pereaksi Legal (sodium

nitroprusside) di mana pereaksi tersebut akan bereaksi dengan grup methylene

aktif yang ditemukan dalam cincin C17-unsaturated lactone. Pereaksi ini akan


9

memberikan warna oranye, ungu, biru, dan violet, yang menunjukkan adanya

glikosida jantung (Farnsworth, 1966).

Di dalam skrining fitokimia untuk glikosida jantung, uji pendahuluan yang

positif pada ekstrak tanaman dengan menggunakan salah satu pereaksi yang

dikonfirmasikan dengan pereaksi yang spesifik untuk tambahan 2 sisi reaktif (vide

supra). Sebagai contoh, sebuah uji pendahuluan yang positif dengan pereaksi

Keller menunjukkan adanya gula deoksi. Ini harus diikuti dengan uji yang ke dua

yaitu uji dengan pereaksi Liebermann, hasil positif, menunjukkan adanya inti

steroid (Shoppee, 1964).

C. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan metode pemisahan

fisikokimia. Lapisan pemisah berupa bahan-bahan berbutir yang ditempatkan pada

penyangga berupa gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan

dipisahkan berupa larutan yang ditotolkan sebagai bercak. Setelah itu, pelat

dimasukkan ke dalam suatu bejana tertutup yang telah jenuh dengan fase gerak.

Pemisahan berbagai komponen dalam campuran akan terjadi selama

pengembangan (perambatan kapiler). Selanjutnya, senyawa yang tidak berwarna

harus ditampakkan dan dideteksi (Stahl,1973).

Beberapa bahan penyerap yang digunakan dalam KLT antara lain:

1. Silika gel

Silika gel merupakan fase diam yang paling sering digunakan untuk KLT.

Untuk penggunaan dalam suatu tipe pemisahan perbedaannya tidak hanya

pada struktur, tetapi juga pori-pori dan struktur lubangnya, di samping


10

pemilihan fase gerak. Dalam perdagangan, ada beberapa macam silika gel

yang beredar yaitu :

a. silika gel dengan pengikat. Umumnya sebagai pengikat adalah CaSO4

(5 – 15%). Jenis ini dinamakan silika gel G. Selain itu, yang digunakan

sebagai pengikat yaitu pati dan dinamai silica gel S. Namun,

penggunaan pati mempunyai kelemahan jika penentuan lokasi bercak

dengan asam sulfat.

b. silika gel dengan pengikat dan indikator fluoresensi. Jenis silika gel ini

biasanya berfluoresensi kehijauan jika dilihat pada sinar ultra violet

dengan panjang gelombang pendek. Sebagai indicator biasanya

digunakan timah kadmiumsulfat atau mangan-timah silikat aktif. Jenis

ini dikenal dengan nama silika gel GF atau GF 254.

c. silika gel tanpa pengikat. Lapisan ini dibandingkan dengan yang

mengandung CaSO4 menunjukkan hasil yang lebih stabil. Beberapa

produk dinamakan silika gel H atau silika gel N.

d. silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indikator fluoresensi.

e. silika gel untuk keperluan pemisahan preparatif, dapat digunakan

silika gel PF254 atau PF366 (Sudjadi,1988).

2. Alumina

Alumina termasuk kelompok fase diam dengan aktivitas tinggi. Penyerap ini

tidak banyak digunakan dalam kromatografi karena bereaksi dengan asam

netral dan basa sehingga perlu penanganan khusus. Saat ini, alumina paling

banyak digunakan untuk pemisahan senyawa kurang polar. Alumina netral


11

mempunyai kemampuan untuk memisahkan senyawa seperti terpena, alkaloid,

steroid, dan senyawa aromatik (Sudjadi,1988; Sastrohamidjojo,1985).

3. Kieselguhr

Penyerap ini merupakan adsorben yang lebih lemah dari silika dan alumina.

Oleh karena itu, penyerap ini tidak cocok digunakan untuk memisahkan

senyawa polar. Kieselguhr tidak banyak digunakan dalam KLT, penggunaan

utamanya sebagai pendukung diam dalam kromatografi partisi (Adnan,1997).

4. Selulosa

Selulosa merupakan penyerap berupa butiran-butiran halus dan

homogen, dapat dengan atau tanpa bahan pengikat. Lapisan tipis dari selulosa

mempunyai ruang lebih kecil, sehingga difusi aliran dari pelarut lebih cepat

daripada kromatografi kertas. Selulosa untuk KLT terdapat dalam dua bentuk

yaitu selulosa serat asli, misalnya MN 300 dan selulosa mikrokristal, misalnya

avicel. Pada KLT, selulosa digunakan untuk pemisahan senyawa hidrofil

(Adnan,1997; Sudjadi,1988).

Fase gerak adalah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa

pelarut. Fase ini bergerak dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Fase gerak

yang digunakan adalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan sistem

pelarut multi-komponen harus berupa campuran sesederhana mungkin terdiri atas

maksimum tiga komponen (Stahl, 1969). Pemilihan fase gerak untuk glikosida

jantung ada beberapa macam alternatif, yaitu: etil asetat-metanol-air (100:13,5:10

v/v); etil asetat-metanol-etanol-air (81:11:4:8 v/v); metiletil keton-toluena-air-asam


12

asetat glasial (40:5:3:2,5:1 v/v); kloroform-metanol-air (65:35:10 v/v) (Wagner,

1984).

Identifikasi dari senyawa yang terpisah (bercak / noda) pada lapisan tipis

dapat dilakukan dengan tanpa pereaksi kimia dan disemprot dengan reagen.

Identifikasi senyawa glikosida jantung dapat dilakukan dengan tanpa pereaksi

kimia yaitu dengan menggunakan sinar ultraviolet 254 dan 365 nm, sedangkan

reagen penyemprot yang digunakan untuk identifikasi senyawa glikosida jantung

adalah reagen Kedde, Legal, Baljet, Raymond, antimony (III) chloride,

chloramine-trichloroacetic acid / CTA, sulphuric acid (Wagner, 1984) dan

vanillin-phosporic acid (Jork, et al., 1990).

Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan

dengan angka Rf atau hRf. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan jarak

antara senyawa dari titik awal dengan jarak tepi muka pelarut dari awal.

Rf = anpengembangjarak

anpengembangawaldaribercakjarak

Harga Rf yang diperoleh pada KLT tidak tetap jika dibandingkan dengan

kromatografi kertas. Oleh karena itu, pada lempeng yang sama di samping

kromatogram zat yang akan diuji perlu dibuat kromatogram zat pembanding

kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda. Perkiraan identifikasi

diperoleh dengan pengamatan dua bercak dengan harga Rf dan ukuran yang

hampir sama. Angka Rf berkisar antara 0,01 – 1,00 dan hanya dapat ditentukan

dengan dua desimal. hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan

nilai berkisar antara 0 – 100 (Stahl, 1969).


13

D. Kultur Jaringan

1. Pendahuluan

Kultur jaringan merupakan teknik budidaya sel, jaringan, dan organ tanaman

dalam suatu lingkungan yang terkendali dan bebas mikroorganisme (aseptik),

mengandung dua prinsip dasar yang jelas, yaitu:

a. Bahan tanam yang bersifat totipoten yaitu tanaman yang masih juvenil,

muda dan banyak terdapat pada daerah meristem tanaman.

b. Budidaya yang terkendali, mencakup keadaan media tumbuh, lingkungan

yang mempengaruhi (kelembaban, temperatur, cahaya) serta keharusan

sterilitas (Katuuk, 1989).

Menurut Helgeson dan Deveral (1983), ada beberapa keuntungan dan kerugian

menggunakan kultur jaringan.

Keuntungan kultur jaringan tanaman :

1. dimungkinkan untuk mengontrol lingkungan di mana interaksi eksplan dan

jamur terjadi karena media dapat ditentukan dan bervariasi; temperatur dapat

dikontrol; komponen gas dapat dimodifikasi.

2. kultur tidak terikat oleh organisme (bebas kontak dengan jamur dan material

jamur).

Adapun kerugiannya :

1. mekanisme pertahanan seperti kutikula atau inhibitor tidak ada dalam sistem

kultur jaringan.


14

2. kejadian yang terjadi pada tanaman tidak terjadi pada kultur, begitu juga

sebaliknya.

3. perubahan genetik dapat terjadi pada kultur.

Kultur kalus tanaman adalah teknik budidaya kalus tanaman dalam suatu

lingkungan yang terkendali dan dalam keadaan aseptik atau bebas

mikroorganisme. Kultur kalus banyak digunakan dalam usaha produksi metabolit

sekunder (Santoso dan Nursandi, 2002).

Produksi metabolit sekunder dipengaruhi oleh jumlah sukrosa, penambahan ZPT

dari luar, sumber nitrogen dan jumlahnya yang relatif, cahaya, dan suhu.

Komponen kimia ini juga mempengaruhi pertumbuhan dan total biomassa dari

kultur in vitro (Rhodes, et al., 1994).

2. Penanaman eksplan

Penanaman eksplan dilakukan di dalam laminar air flow (LAF) dengan kondisi

aseptic. Sebelum bekerja di dalam LAF, semua perhiasan tangan seperti cincin,

jam, dan sebagainya harus dilepas dan tangan dibasuh dahulu dengan alkohol

70%. Dalam menginokulasikan eksplan, pekerja harus menggunakan masker

penutup mulut dan hidung (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Penanaman eksplan dilakukan secara aseptik pada media padat dan ditekan pelan-

pelan agar terjadi persinggungan yang baik antara eksplan dan media (Dixon,

1985). Pemilihan macam eksplan mempengaruhi kecepatan membentuk kalus.

Eksplan daun mempunyai kemampuan tumbuh lebih cepat dibandingkan eksplan

batang utama, cabang batang, atau tangkai bunga (Santoso dan Nursandi, 2002).


15

Peneliti menggunakan eksplan daun dengan maksud pertumbuhan kalus bisa lebih

cepat. Selanjutnya wadah ditutup dengan aluminium foil atau parafilm untuk

mencegah penguapan dan kontaminasi. Inkubasi dilakukan di tempat gelap

dengan penyinaran pada suhu 25 ± 3°C (Dixon, 1985).

Eksplan yang berupa kepingan atau irisan tipis dapat diletakkan sedemikian rupa

sehingga bagian permukaan yang luas melekat erat pada media (Soegihardjo,

1990).

3. Sub kultur

Sub kultur adalah usaha mengganti media tanam kultur jaringan dengan media

yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kalus atau protokormus

dapat terpenuhi. Subkultur pada media padat mudah dilakukan dengan cara

meletakkan kalus yang sudah terbentuk di atas cawan petri, kemudian membelah-

belahnya menjadi bagian-bagian kecil lagi. Setelah menjadi potongan kecil, kalus

dimasukkan kembali dalam media yang memiliki komposisi sama dengan media

lama. Proses ini juga dilakukan dalam suasana steril (Hendaryono dan Wijayani,

1994).

Frekuensi pengulangan dari subkultur bervariasi untuk tiap spesies dan kondisi

pertumbuhan. Beerapa macam kultur umumnya dapat disubkultur tiap 4–8

minggu. Hampir tidak ada kepustakaan yang menyebutkan jumlah pengulangan

subkultur untuk propagasi (Wetherel, 1982).

4. Faktor penentu kultur jaringan

4.1 Eksplan


16

Eksplan adalah bagian kecil jaringan atau organ yang dikeluarkan atau

dipisahkan dari tanaman induk kemudian dikulturkan. Berhasil tidaknya

pengkulturan eksplan tergantung pada faktor yang dimiliki oleh eksplan itu

sendiri. Faktor-faktor itu meliputi:

a. Ukuran eksplan

Ukuran eksplan sangat menentukan proses pengkulturan. Bagian

tanaman yang dikerat masih mengandung suplai makanan serta hormon

untuk potongan itu sendiri, sehingga makin besar keratan, makin besar

kemampuan keratan ini untuk dirangsang tumbuh dan beregenerasi. Namun

dibalik itu harus dipikirkan pula bahwa makin besar eksplan, makin besar

kemungkinan mendapatkan jaringan yang terkontaminasi. Ukuran eksplan

yang paling baik adalah 0,5 sampai 1,0 cm, namun ukuran ini dapat

bervariasi, tergantung pada material tanaman yang dipakai serta jenis

tanaman ( Katuuk, 1989).

b.Umur eksplan

Umur eksplan sangat mempengaruhi tipe serta daya morfogenesis.

Jaringan yang masih muda serta belum banyak berdiferensiasi terdapat pada

bagian meristematik. Dari semua jenis tanaman bagian inilah yang paling

banyak berhasil. Sel atau jaringan yang masih muda yang dinamakan

juvenile akan tetap muda dalam pengkulturan sehingga daya untuk

beregenerasi tetap ada, sedangkan sel-sel tua, kesanggupan untuk

beregenarasi sudah berkurang. Selain dari kandungan jaringan meristematik


17

yang berkurang, jaringan yang sudah tua ada kemungkinan sudah

mengandung banyak patogen ( Katuuk, 1989 ).

c. Sumber eksplan

Tanaman yang dijadikan sumber eksplan hendaknya dari tanaman

yang sehat, yang bertumbuh baik / normal. Pengaruh perubahan suhu,

cahaya, musim serta kelembaban terhadap tanaman induk sangat

mempengaruhi perkembangan eksplan. Tanaman induk dituntut untuk

berkecukupan zat hara, lama penyinaran, intensitas cahaya serta hormon

tumbuh. Pendek kata pertumbuhannya harus optimum ( Katuuk, 1989 ).

d.Genotip eksplan.

Genotip adalah faktor endogen yang paling utama mempengaruhi

perkembangan jaringan eksplan, dibandingkan faktor-faktor lain. Perbedaan

kemampuan untuk beregenerasi disebabkan oleh genotip jelas dapat dilihat

pada tanaman monokotil, dikotil dan gymnospermae. Dari ketiga kelompok

ini, kemampuan untuk beregenerasi yang paling rendah adalah tanaman

gymnospermae, kemudian diikuti oleh tanaman monokotil, dan terakhir oleh

tanaman dikotil. Selanjutnya dikatakan bahwa apabila satu jenis tanaman

dengan mudah beregenerasi in vivo maka sifat ini berlaku juga pada in vitro

(Katuuk, 1989 ).

4.2 Media

Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perbanyakan

tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah

diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman


18

yang dikulturkan (Yusnita, 2003). Media yang digunakan dalam penelitian ini

adalah media Gamborg. Komposisi media Gamborg mirip dengan media MS.

Perbedaannya, jumlah nitrogen dalam bentuk ion ammonium yang terdapat dalam

media Gamborg jauh lebih sedikit dibanding yang terdapat dalam media MS

(Santoso dan Nursandi, 2002).

Nitrogen pada umumnya tersedia dalam bentuk campuran ion nitrat (dari

KNO3) dan ion ammonium (dari NH4NO3). Secara teoritis, ada keuntungan dalam

penyediaan nitrogen dalam bentuk ion ammonium, nitrogen harus dalam bentuk

tereduksi supaya dapat menyerap ke dalam makromolekul. Oleh karena itu, ion

nitrat juga harus direduksi terlebih dahulu. Perlu diketahui, pada konsentrasi

tinggi, ion ammonium dapat menyebabkan toksik pada kultur sel tanaman dan

adanya ion ammonium dari dalam media menyebabkan asidifikasi pada medium.

Konsentrasi tinggi ion ammonium juga dapat menyebabkan masalah pada kultur

dengan meningkatkan frekuensi vitrifikasi (kultur menjadi pucat dan mudah

hancur dan biasanya tidak layak untuk kultur lebih lanjut). Penggunaan campuran

ion ammonium dan ion nitrat mempunyai keuntungan yaitu proses buffer yang

tidak perlu terlalu kuat karena adanya ion nitrat menyebabkan ion OH- dilepaskan

(Ramage dan Williams, 2002).

Komponen media kultur yang digunakan dalam kultur jaringan adalah sebagai

berikut :

a. Air

Air memegang peranan penting dalam proses kultur jaringan karena 95% dari

media kultur terdiri dari air. Air yang digunakan dalam media serta dalam seluruh


19

proses kultur jaringan adalah air suling. Hal ini karena di dalam air ledeng atau air

sumur terlarut sejumlah kontaminan yang dapat merusak proses perkembangan

kultur eksplan. Kontaminan yang dimaksud adalah substansi atau mikroorganisme

yang mengganggu kultur. Air suling disimpan dalam kondisi steril dengan tidak

memberi peluang pada bakteri untuk hidup dan berkembang (Katuuk, 1991).

b. Garam anorganik

Unsur yang dibutuhkan dalam jumlah besar yang disebut unsur makro,

sedangkan unsur yang dibutuhkan dalam jumlah sedikit disebut unsur mikro.

Beberapa jenis unsur yang termasuk unsur makro adalah nitrogen (N), fosfor (P),

dan kalium (K) adalah unsur yang mutlak dibutuhkan oleh tanaman, yang berarti

harus selalu tersedia. Unsur sulfur (S), kalsium (Ca), dan magnesium (Mg) boleh

ada serta boleh tidak ada, tetapi karena fungsinya sangat mendukung pertumbuhan

jaringan maka akan lebih baik apabila unsur-unsur tersebut juga selalu disediakan

(Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Unsur mikro dalam media dapat menyebabkan kelainan pertumbuhan.

Unsur mikro yang dibutuhkan dalam tanaman yaitu: unsur besi (Fe), unsur boron

(B), unsur seng (Zn), unsur kobalt (Co), unsur tembaga (Cu), unsur molybdenum

(Mo), dan unsur yodium (I) (George dan Sherrington, 1984).

c. Sumber karbon dan energi

Media kultur jaringan memerlukan bahan sebagai sumber tenaga. Biasanya

yang merupakan sumber tenaga adalah bahan kimia organik yang mengandung

karbon. Karbohidrat adalah kimia karbon yang meliputi gula, pati, dan selulosa.

Karbohidrat memiliki 2 fungsi utama yaitu sebagai sumber energi untuk jaringan


20

dan untuk menjaga keseimbangan tekanan osmotik potensial minimum dalam

media. Ada banyak jenis karbohidrat yang dipakai dalam kultur jaringan namun

yang paling banyak digunakan adalah sukrosa atau D-glukosa ( Katuuk, 1989).

d. Myo-inositol, vitamin, dan asam amino

Penambahan myo-inositol pada media bertujuan untuk membantu

diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan. Bila myo-inositol diberikan

bersama dengan auksin, kinetin dan vitamin, maka dapat mendorong pertumbuhan

jaringan kalus ( Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam media kultur jaringan

antara lain adalah Tiamin (vitamin B1), Piridoksin (vitamin B6), dan asam

nikotinat. Tiamin adalah vitamin yang esensial untuk hampir semua kultur

jaringan tumbuhan. Fungsi tiamin adalah untuk mempercepat pembelahan sel

pada meristem akar, juga berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang

menghasilkan energi dari karbohidrat. Asam nikotinat juga penting dalam reaksi-

reaksi enzimatik, di samping berperan sebagai prekursor dari beberapa alkaloid.

Pemberian vitamin C biasanya bertujuan untuk mencegah terjadinya pencoklatan

pada permukaan irisan jaringan (Hendaryono dan Wijayani, 1994). Sedangkan

fungsi dari vitamin B6 adalah sebagai ko-enzim yang membantu reaksi kimia

dalam proses metabolisme (Katuuk, 1989).

Asam-asam amino berperanan penting untuk pertumbuhan dan

diferensiasi kalus. Kebutuhan asam amino untuk setiap tanaman berbeda-beda.

Asparagin dan Glutamin berperan dalam metabolisme asam amino, karena dapat


21

menjadi pembawa dan sumber amonia untuk sintesis asam-asam amino baru

dalam jaringan (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

e. Hormon dan zat pengatur tumbuh

Keberadaan hormon dan zat pengatur tumbuh dalam kegiatan kultur

jaringan adalah mutlak karena budidaya kultur jaringan adalah budidaya

terkendali. Proses tumbuh dan berkembangnya eksplan dapat disesuaikan dengan

harapan, menjadi kalus saja, organogenesis ataupun embriogenesis. Pengaturan ini

dapat dilakukan dengan mengatur macam dan konsentrasi zat pengatur tumbuh

sehingga menghasilkan kombinasi yang tepat sesuai dengan harapan. Macam

hormon dan zat pengatur tumbuh yang sudah dikenal hingga saat ini adalah

sebagai berikut :

1. Auksin

Auksin pertama kali ditemukan oleh Went, dan diketahui sebagai asam

indolasetat (IAA). Selanjutnya, nama auksin digunakan untuk nama kelompok

hormon dan zat pengatur tumbuh yang menimbulkan respons khas IAA.

Tumbuhan mengandung tiga senyawa lain yang mirip dengan IAA baik

struktur maupun respon yang diakibatkannya, yaitu : asam 4-kloroindolasetat

(4kloroIAA), asam fenilasetat (PAA), dan asam indolbutirat (IBA) ( Santoso

dan Nursandi, 2001 ).

Hormon sintetik atau zat pengatur tumbuh yang digolongkan sebagai auksin

yaitu : asam a-naftalenasetat (NAA), asam 2,4-diklorofenoksiasetat (2,4-D),

asam 2-metil 4-klorofenoksiasetat (MCPA), asam 2-naftalosiasetat (4-CPA),

asam p-klorofenoksiasetat (PCPA), asam 2,4,5-triklorofenoksiasetat (2,4,5-T),


22

asam 3,6-dikloroanisik (dikamba), asam 4-amino 3,5,6-trikloropikolinik

(pikloram) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).

Dalam aktivitas kultur jaringan, auksin berperan menginduksi terjadinya

kalus, menghambat kerja sitokinin membentuk klorofil dalam kalus,

mendorong proses morfogenesis kalus membentuk akar atau tunas,

mendorong proses embryogenesis, dan mempengaruhi kestabilan genetis

tanaman ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).

2. Sitokinin

Sitokinin merupakan nama kelompok hormon tumbuhan yang sangat

penting sebagai pemacu pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur jaringan.

Seperti auksin, selain sitokinin alami juga terdapat sintesisnya yang tergolong

dalam zat pengatur tumbuh. Sitokinin sintetik yang umum digunakan dalam

kegiatan kultur jaringan adalah FAP (6-furfurilaminopurin), BAP

(Benzylaminopurin), Thidiazuron (N-phenil-N-1,2,3-thiadiazol-5-penylurea) (

Santoso dan Nursandi, 2001 ).

Dalam kegiatan kultur jaringan sitokinin berperan di dalam menstimulasi

terjadinya pembelahan sel, proliferasi kalus, pembentukan tunas, menghambat

pembentukan akar, mendorong pembentukan klorofil pada kalus ( Santoso dan

Nursandi, 2001 ).

3. Gibberilin (GA)

Gibberilin merupakan kelompok lain dari ZPT atau hormon yang dapat

mempengaruhi pemanjangan batang atau ruas batang, mendorong

pembungaan, induksi buah, dan tumbuhnya mata tunas yang dorman. Secara


23

umum dalam kegiatan kultur jaringan tanaman tanpa penambahan GA,

sesungguhnya kegiatan telah dapat berjalan dan proses induksi serta

diferensiasi dapat dilakukan, meski demikian tidak menutup kemungkinan

bahwa GA endogen dalam eksplan walaupun dalam kadar yang relatif kecil

diduga tetap merupakan komponen yang essensial, contoh GA sintetik adalah

gibberillic acid (Santoso dan Nursandi, 2001).

4. ABA (Abcisic acid)

ABA merupakan hormon tanaman yang secara alamiah disintesis tanaman bila

tanaman berada dalam keadaan stress. ABA tergolong dalam zat penghambat

tanaman atau inhibitor karena kerjanya berlawanan dengan hormon pendorong

seperti auksin, sitokinin, dan giberelin. Dalam kultur jaringan, ABA dapat

menghambat proses inisiasi dan pertumbuhan sel (Santoso dan Nursandi,

2001).

f. Bahan pemadat media

Media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh eksplan.

Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media cair berarti

campuran komponen-komponen zat kimia dengan air suling, sedangkan media

padat adalah media cair tersebut dengan ditambah zat pemadat ( Hendaryono dan

Wijayani, 1994 ).

Zat pemadat yang digunakan untuk membuat media padat adalah berupa agar-

agar. Agar adalah campuran berbagai polisakarida dari galaktosa yang diekstrak

dari ganggang laut, terutama Gellidium amansii dan ganggang lain dari golongan

Rhodophyta. Umumnya agar dapat membentuk gel pada suhu 40-45°C dengan


24

titik cair 80-90°C. Kemampuan agar dalam memadatkan media tergantung pada

cara pengekstrakannya dari ganggang dan pH larutan media sebelum diautoklaf.

Dalam larutan media dengan pH rendah (kurang dari 4,5), gel yang terbentuk oleh

agar sangat encer, sedangkan larutan dengan pH tinggi (lebih dari atau sama

dengan 5,5) akan berbentuk padat ( Yusnita, 2003 ).

4.3 Lingkungan

Faktor lingkungan utama yang harus dipenuhi adalah :

a. Cahaya

Cahaya berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan yang disebut

fotomorfogenenesis. Jenis cahaya yang paling sering digunakan dalam

kultur jaringan adalah cahaya dari lampu neon. Hal ini disebabkan oleh

kemampuannya yang dapat menyebarkan cahaya yang lebih luas dan merata,

serta lebih hemat pemakaian listrik (Katuuk, 1989)

b. Suhu

Pada umumnya kultur jaringan memerlukan suhu sebesar 25-30°C.

Namun untuk pertumbuhan optimum hal ini akan berbeda-beda pada setiap

spesies, serta jenis eksperimen (Katuuk, 1989).

c. pH

Pada umumnya nilai pH yang paling disukai untuk pertumbuhan sel

antara 5-6. Walaupun pH media akan berubah selama pengkulturan, pH

harus diatur lebih dulu sebelum diautoklaf, yaitu apabila semua komponen

media sudah dicampurkan. Manfaat pH dalam media adalah untuk menjaga

kestabilan membran sel, mengatur garam-garam agar tetap dalam bentuk


25

terlarut, membantu penyerapan hara dan mengatur sifat gel agar (dalam

media padat) (Katuuk,1989).

d. Kelembaban

Faktor kelembaban relative humidity (RH) tidak banyak dibahas dalam

kultur jaringan. Hal ini disebabkan oleh kondisi dalam botol kultur yang

selalu lembab karena media. Namun demikian kelembaban di luar botol

kultur juga perlu diperhatikan. Kondisi iklim dalam hal ini sangat

berpengaruh terhadap kelembaban kultur. Untuk itu disarankan agar RH

dalam ruang kultur berkisar 70% ( Katuuk,1989 ).

e. Wadah / botol kultur

Ukuran wadah kultur biasanya juga mempengaruhi pertumbuhan serta

morfogenesis in vitro. Hal ini mungkin disebabkan oleh perbedaan

konsentrasi CO2 yang tersedia, etilen serta gas lain yang berada dalam ruang

wadah. Besar kecilnya wadah tergantung pada jenis serta ukuran eksplan

yang digunakan, dan fase perkembangan eksplan sehingga pemindahan

eksplan ke botol yang lebih besar sangat diperlukan. Biasanya untuk eksplan

yang berukuran kecil, pada permulaan pengkulturan dapat menggunakan

tabung kultur yang berdiameter 1,5 cm, kemudian untuk pertumbuhan akar

maka diameter tabung kultur dapat diganti menjadi 2,5 cm. Wadah kultur

jaringan tidak hanya tergantung pada botol kultur buatan pabrik. Banyak

macam wadah yang boleh dijadikan tempat kultur, antara lain: botol-botol

bekas obat-obatan, jam, atau bekas bahan makanan lainnya. Biasanya


26

wadah terbuat dari gelas adalah yang paling baik, karena dapat dengan

mudah dicuci untuk digunakan lagi.

5. Pola pertumbuhan kalus

Pertumbuhan kalus dapat dinyatakan sebagai fungsi kurva matematika

sederhana. Kurva yang menggambarkan pertumbuhan kalus adalah kurva

sigmoid. Kurva ini menyerupai bentuk huruf S. Fase-fase pertumbuhan yang

dapat dilihat pada kurva pertumbuhan yaitu :

a. Fase lag

Fase lag ditunjukkan dengan pertumbuhan yang lambat, tetapi kemudian

meningkat terus. Fase ini juga dapat disebut sebagai fase penyesuaian

organisme terhadap media.

b. Fase eksponensial

Pada fase ini sel tanaman sudah dapat menyesuaikan diri dengan

lingkungannya dan mulai membelah lebih cepat. Fase ini akan ditandai dengan

bentuk kurva yang cenderung curam.

c. Fase Stasioner

Pada fase ini tanaman telah mencapai pertumbuhan maksimum.

Berkurangnya nutrisi dalam media, akumulasi produk beracun, dan

kekurangan oksigen akan menyebabkan penurunan kecepatan pertumbuhan

organisme (Campbell, et al., 2003)


27

E. Sterilisasi

Media tumbuh yang digunakan untuk kultur jaringan sangat menguntungkan

bagi pertumbuhan cendawan dan bakteri. Oleh sebab itu, perlu dilakukan

sterilisasi untuk mencegah kontaminasi mikroorganisme (Wetherel, 1982).

Beberapa teknik sterilisasi yang lazim digunakan dalam kultur jaringan

tanaman :

a. Sterilisasi panas kering

Alat yang digunakan adalah oven dengan temperatur 1600C selama

4 jam. Oven digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang tidak mudah

terbakar, antara lain peralatan yang terbuat dari bahan gelas, atau logam

(Dodds dan Roberts, 1982).

b. Pemanasan basah

Metode ini menggunakan autoklaf dengan uap air dan tekanan.

Autoklaf digunakan untuk mensterilkan media, serta bahan yang

digunakan selama proses pengkulturan. Hampir semua mikroba mati

sesudah diberi uap air dengan suhu 121 0C selama 10-15 menit. Untuk

sterilisasi cairan sampai volume 1 liter diperlukan suhu 121 0C selama 20

menit (Dodds dan Roberts, 1982).

c. Sterilisasi dengan memakai nyala

Alat / instrument yang sudah disterilkan dari oven, dikeluarkan dari

bungkusnya, dicelupkan dalam etanol 70% dan dilewatkan pada nyala

lampu spiritus. Setiap beberapa saat instrument harus dicelupkan ke dalam


28

etanol kemudian dibakar. Perlakuan ini berjalan terus selama kegiatan

inokulasi yang berlangsung di dalam kotak transfer (LAF) ( Katuuk,1989).

d. Sterilisasi dengan bahan kimia

Sterilisasi dengan bahan kimia merupakan pembasmian mikroba

dengan jalan memakai bahan kimia. Biasanya bahan kimia dipakai untuk

mensterilkan permukaan saja, yang meliputi: material tanaman dapat

disterilkan dengan menggunakan natrium hipoklorit, perak nitrat atau air

brom, sedangkan instrumen, tangan pekerja, serta ruang atau kotak transfer

dapat disterilkan dengan menggunakan alkohol 70% ( Katuuk, 1989 ).

Banyak jenis bahan pencuci yang boleh digunakan untuk sterilisasi

material tanaman. Jenis serta lamanya sterilisasi tergantung pada kepekaan

material tanaman. Banyak kali terjadi bila terlalu lama dan dengan

konsentrasi bahan pencuci yang tinggi, berakibat bukannya mematikan

mikroba tetapi bahkan merusak jaringan tanaman yang disterilkan. Di

samping itu bahan pencuci hendaknya bersifat lebih mudah larut. Bila

tidak demikian, sisa zat pencuci ini akan tetap pada material tanaman,

yang dapat mengganggu pertumbuhan eksplan ( Katuuk, 1989 ).

e. Sterilisasi dengan cahaya

Ruang dan kotak transfer sukar untuk disterilkan hanya dengan

menggosok dengan alkohol atau bahan kimia pada permukaan. Untuk itu

digunakan lampu germisidal dengan sinar ultraviolet. Ada laboratorium

yang sudah memasangnya di langit-langit atau pada tempat lain dengan

maksud agar semua bagian terkena cahaya. Kelemahan menggunakan


29

sinar ultraviolet adalah pada tempat-tempat yang tidak terkena cahaya,

proses sterilisasi tidak terjadi. Selain itu, sinar ultraviolet hanya mampu

mematikan bentuk fertilisasi bakteri dan jamur, bukan bentuk spora

(Katuuk, 1989 ).

F. Keterangan Empiris

Di dalam pencarian metode produksi kandungan obat dari tumbuhan,

pendekatan kultur jaringan, potensial sebagai alternatif di dalam produksi

metabolit-metabolit bioaktif tumbuhan untuk skala industri. Ide memperbanyak

tanaman dengan jalan mengkulturkan bagian kecil jaringan atau organ

berdasarkan teori ”totipotency”.

Berdasarkan teori “totipotency”, diharapkan penelitian ini dapat

menghasilkan ekstrak kalus daun kamboja jepang yang memiliki kandungan

glikosida jantung yang sama dengan ekstrak daun kamboja jepang tanaman asal

dan standard digitoksin. Kultur kalus yang dihasilkan oleh teknik kultur jaringan

ini diharapkan memiliki profil pertumbuhan sigmoidal, di mana pada fase

stasionernya menghasilkan kandungan glikosida jantung yang optimum.

Berdasar kan keterangan empiris di atas diharapkan :

1. Daun tanaman kamboja jepang dapat membentuk kalus dengan penambahan

zat pengatur tumbuh asam 2,4 Diklorofenoksiasetat dan 6-furfurilaminopurin

pada media Gamborg.

2. Kultur kalus yang dihasilkan melalui teknik kultur jaringan ini memiliki profil

pertumbuhan sigmoidal, di mana pada fase stasionernya menghasilkan

kandungan glikosida jantung yang optimum.


30

3. Ekstrak kalus daun tanaman kamboja jepang memiliki kandungan glikosida

jantung yang sama dengan ekstrak daun kamboja jepang tanaman asal dan

standard digitalis.


31

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk dalam jenis penelitian non eksperimental dengan

rancangan penelitian deskriptif.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel utama

a. Variabel bebas : konsentrasi 2,4-D dan FAP, umur kalus, dan waktu

panen.

b. Variabel tergantung : profil pertumbuhan dan susut pengeringan kalus.

2. Variabel pengacau terkendali

a. Subjek uji : daun yang digunakan sebagai eksplan adalah daun yang tidak

terlalu muda, segar, dan sehat terletak no 3-5 dari ujung batang atau

cabang dengan ukuran eksplan 0,5 - 1,0 cm.

b. Bahan uji dan cara kerja :

i. Media agar jenis Gamborg.

ii.Sterilitas, suhu, kelembaban dan intesitas cahaya dalam ruang

inkubator.

3. Variabel pengacau tidak terkendali

a. Adanya parasit endogen berupa bakteri endofit.


32

b. Kandungan senyawa kimia lain yang terkandung dalam tanaman kamboja

jepang yang muncul pada kromatogram.

4. Definisi Operasional

a. Konsentrasi zat pengatur tumbuh 2,4-D dan FAP adalah sejumlah ppm

2,4-D dan FAP yang terkandung dalam satu liter media Gamborg.

b. Waktu inisiasi adalah waktu yang diperlukan oleh eksplan untuk

membentuk kalus dihitung dari awal penanaman hingga hari pertama kalus

mulai terbentuk.

c. Subkultur adalah suatu kegiatan pemeliharaan kalus dengan memindahkan

kalus ke dalam media baru sehingga kalus tidak kekurangan nutrisi.

d. Bobot kalus awal adalah bobot kalus pada saat penanaman pada subkultur

ke-1.

e. Bobot kalus akhir adalah bobot kalus pada saat pemanenan pada subkultur

ke-1.

f. Bobot kalus kering adalah bobot kalus hasil pemanenan yang telah

mengalami proses pengeringan sampai diperoleh bobot konstan.

g. Bobot konstan adalah bobot yang didapat apabila dalam 2 kali

penimbangan dan di antara kedua waktu penimbangan itu dilakukan

pengeringan dalam waktu sekurang-kurangnya 1 jam, selisih bobot dalam

kedua penimbangan tidak lebih dari 0,5 mg.

h. Laju pertumbuhan kalus adalah pertambahan berat kalus tiap satuan waktu

yang diperoleh dari data penimbangan hasil pemanenan kalus setiap 6 hari

sekali sebanyak 3 botol selama 42 hari.


33

i. Profil pertumbuhan kalus adalah rasio antara pertumbuhan kalus (bobot

kalus akhir- bobot kalus awal) dengan waktu pemanenan serta rasio antara

bobot kalus kering dengan waktu pemanenan..

j. Susut pengeringan adalah rerata bobot kalus basah dikurangi dengan rerata

bobot kalus kering lalu dibagi dengan rerata bobot kalus basah dikali

dengan 100%.

C. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan

a. Bahan utama

Bahan utama yang digunakan adalah tanaman kamboja jepang (Adenium

obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) yang ditanam di Maguwohardjo, Kabupaten

Sleman. Bagian tanaman yang digunakan adalah daun segar dan sehat terletak

no. 3-5 dari ujung batang atau cabang.

b. Bahan kimia

Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini yaitu :

1) Agar, disuplai oleh Mkr Chemicals

2) Garam anorganik (makronutrien) yang terdiri dari :

a) amonium sulfat, Merck , Germany,

b) magnesium sulfat-heptahidrat, Merck, Germany,

c) kalsiumklorida-dihidrat, Merck, Germany,

d) kalium nitrat, Merck, Germany,

e) natrium dihidrogen fosfat-monohidrat, Merck, Germany.


34

3) Garam anorganik mikronutrien yang terdiri dari :

a) mangan (II) sulfat monohidrat, BDH Limited Poole, England,

b) sengsulfat-heptahidrat, Merck, Germany, 108883

c) tembaga (II) sulfat pentahidrat, disuplai oleh Brataco Chemica,

Bandung, Indonesia.

d) kobalt (II) klorida-heksahidrat, BDH Limited Poole, England, 10082.

e) kalium iodide, Merck, Germany, 105043.

f) asam borat, Merck, Germany, 100165.

g) natriummolibdat-dihidrat, Riedel de Haen, Germany, 31439.

4) Sumber besi yang terdiri dari :

besi (II) sulfat-heptahidrat dalam bentuk larutan stok dengan natrium

etilen diamin tetra asetat (Merck, Germany).

5) Vitamin

a) mio-inositol, Merck, Germany,

b) asam nikotinat, Calbiochem, US dan Canada,

c) piridoksin (B6), disuplai oleh Bratako Chemika, Bandung, Indonesia.

d) tiamin (B1), disuplai oleh Bratako Chemika, Bandung, Indonesia.

6) Sumber karbon : sukrosa, Merck, Germany

7) Zat pengatur tumbuh yang terdiri dari :

a) auksin (asam 2,4-diklorofenoksiasetat), Sigma, Germany,

b) sitokinin (6-furfurilamino-purin), Merck, Germany,

8) Desinfektan

a) natrium hipoklorida, Bayclin, Johnson


35

b) alkohol 70 % derajat kemurnian teknis.

c) Tween-80, Merck-Sohuchardt

9) Akuades

c. Bahan untuk penyarian : Metanol (J.T. Baker, Germany) dan Kloroform

(J.T. Baker, Germany)

d. Bahan untuk Kromatografi Lapis Tipis :

1. Metanol, J.T. Baker, Germany

2. Etil asetat, J.T. Baker, Germany.

3. Kedde reagent, Merck, Germany.

4. Asam sulfat, Merck, Germany.

5. Silica-Gel GF 254, Merck, Germany.

2. Alat

a. Alat yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman :

1) Alat-alat gelas, Pyrex

1) Autoklaf, YX 400Z Shanghai Sanshen, Medical Inst, Co, LTD.

2) Oven, Marius Instrument, German.

3) Pemanas listrik, Ika Combimag, RCT, German.

4) Timbangan analitik, Scaltec.

5) Glassfirn.

6) Magnetic stirrer.

7) Pinset.

8) Skapel.

9) Kertas pH indikator.


36

10) Kertas saring.

11) Laminar air flow.

12) Lampu UV.

13) Inkubator, Heraeus Tamson, Holland.

14) Botol kultur.

15) Aluminium foil,Heavy-Duty, Diamond-Wrap.

16) Refrigerator, Sharp.

17) Sprayer.

18) Mortir & stamper.

b. Alat untuk penyarian : alat gelas (pyrex), kertas saring, dan waterbath

c. Alat untuk Kromatografi Lapis Tipis:

1) Bejana gelas.

2) Lempeng kaca.

3) Lemari asam.

4) Pipa kapiler.

5) Sprayer.

6) Lampu TL 20 watt.

7) Lampu UV 254 dan 365 nm.

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman Adenium obesum dilakukan di Laboratorium

Biologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dengan

menggunakan jurnal acuan (Anonim, 2006).


37

2. Pembuatan stok

a. Pembuatan larutan stok hara mikro

Disiapkan gelas piala dengan volume 500 ml yang telah diisi akuades

300 ml. Mangan (II) sulfat tetrahidrat sebanyak 1,00 g, seng sulfat heptahidrat

sebanyak 0,2 g, asam borat sebanyak 0,3 g, kalium iodida sebanyak 0,075 g,

natrium molibdat dihidrat sebanyak 0,025 g, tembaga (II) sulfat pentahidrat

0,0025 g, kobalt (II) klorida heksahidrat sebanyak 0,0025 g dimasukkan satu

per satu ke dalam gelas piala tersebut, sambil diaduk dengan menggunakan

magnetic stirer hingga jernih. Kemudian ditambahkan aquades hingga volume

500 ml. Perlu diperhatikan bahwa tiap 1 liter media membutuhkan 1 ml stok

hara mikro.

b. Pembuatan larutan stok besi

Stok untuk bahan ini terpisah dari unsur hara mikro lainnya, karena

komponen natrium etilen diamin tetra asetat dan besi (II) sulfat heptahidrat

sukar larut dalam akuades, maka perlu ditambahkan beberapa tetes HCl,

kemudian dipanaskan. Disiapkan gelas piala dengan volume 500 ml yang telah

diisi akuades 300 ml. Besi (II) sulfat heptahidrat sebanyak 0,278 g dan

natrium etilen diamin tetra asetat dihidrat sebanyak 0,373 g dimasukkan ke

dalam gelas piala tersebut, lalu ditambahkan beberapa tetes HCl sambil diaduk

dengan menggunakan magnetis stirer hingga larut dan agar cepat larut dibantu

dengan pemanasan. Kemudian ditambahkan akuades hingga volume 500 ml.

Perlu diperhatikan bahwa satu liter media dibutuhkan 5 ml larutan stok besi.

c. Pembuatan larutan stok vitamin


38

Dua ratus milliliter aquades dimasukkan ke dalam gelas piala dengan

volume 500 ml, kemudian asam nikotinat sebanyak 0,1 g, piridoksin

hidroklorida sebanyak 0, 1 g, tiamin hidroklorida sebanyak 0,01 g dimasukkan

satu per satu ke dalam gelas piala tersebut, sambil diaduk dengan

menggunakan magnetic stirer hingga jernih. Kemudian ditambahkan aquades

hingga volume 500 ml. Perlu diperhatikan bahwa satu liter media dibutuhkan

5 ml larutan stok vitamin dan asam amino.

d. Pembuatan larutan stok myoinositol

Untuk membuat larutan myoinositol, diperlukan 10 g myoinositol yang

dilarutkan dalam 500 ml aquades dalam gelas piala sampai larut kemudian

akuades ditambahkan sampai volume 1 liter. Dalam membuat satu liter media

dibutuhkan larutan stok myoinositol sebanyak 10 ml.

e. Pembuatan larutan stok ZPT

ZPT yang digunakan adalah asam 2,4-Diklorofenoksiasetat. Untuk

membuat larutan stok 2,4-D (4 ppm), larutkan 2,4-D sebanyak 100 mg ke

dalam 2-5 ml etanol, panaskan sebentar lalu tambahkan 100 ml akuades.

Dalam membuat satu liter media dengan konsentrasi 2,4D sebesar 4 ppm

dibutuhkan larutan stok sebanyak 4 ml.

3. Pembuatan media

Media yang digunakan adalah media Gamborg. Pembuatannya adalah

sebagai berikut : mula-mula 500 ml akuades dipanaskan di dalam gelas piala

1000 ml. Sambil terus diaduk, dimasukkan bahan-bahan anorganik makro

sesuai dengan komposisi yang ada (daftar terlampir). Setelah semua hara


39

makro larut, dimasukkan berturut-turut 1 ml larutan stok hara mikro, 5 ml

larutan stok besi-EDTA, 1 ml stok vitamin dan 10 ml stok myoinositol.

Sedikit demi sedikit dimasukkan campuran sukrosa 27 g dan agar 10 g sambil

diaduk hingga larut. Sementara itu, ditambahkan juga akuades sedikit demi

sedikit untuk membantu kelarutan hingga volume mencapai 1000 ml.

Campuran tersebut dipanaskan hingga mendidih dan berwarna jernih. Setelah

jernih, suhu pemanas diturunkan dan stok zat pengatur tumbuh dimasukkan

sesuai konsentrasi yang diinginkan. Setelah itu, dilakukan pengaturan pH

media 5,2 – 5,6. jika terlalu basa ditambahkan HCl encer dan jika terlalu asam

ditambahkan larutan KOH encer. Penyusutan air karena pemanasan diatasi

dengan penambahan akuades hingga 1000 ml kemudian media dipindahkan ke

dalam botol kultur dengan ketebalan kurang lebih 1 cm. Botol yang berisi

media kemudian ditutup menggunakan alumunium foil dan disterilisasi

dengan autoklaf pada suhu 1210 C selama 15 menit. Media yang aman

digunakan adalah media yang telah disimpan dalam inkubator selama kurang

lebih 1 minggu dan tidak tampak adanya pertumbuhan mikroorganisme

kontaminan seperti : jamur dan bakteri.

4. Sterilisasi alat dan ruangan

a. Sterilisasi alat

Erlenmeyer yang berisi akuades dan gelas piala kosong ditutup dengan

alumunium foil. Cawan petri diisi kertas saring, skalpel, pinset yang

dibungkus dengan kertas payung semuanya dimasukkan dalam autoklaf dan

disterilkan pada temperatur 121 °C selama 20 menit.


40

b. Sterilisasi ruangan

Dinding- dinding ruangan penanaman eksplan dan Laminar Air Flow

(LAF) disterilkan dengan menggunakan alkohol 70% atau spiritus.

Selanjutnya lampu UV baik yang ada di ruangan maupun di LAF dinyalakan

selama ± 2 jam.

5. Sterilisasi dan penanaman eksplan

a. Sterilisasi eksplan

Sebelum dimasukkan ke dalam LAF, eksplan berupa daun yang

diambil dari tanaman induk dicuci di bawah air keran yang mengalir dengan

diberi sedikit detergen untuk membersihkan kotoran yang melekat di

permukaan terluar eksplan Eksplan direndam-dikocok dalam larutan hipoklorit

5 – 10 menit kemudian dibilas dengan akuades sebanyak 3 kali. Di dalam LAF

eksplan juga disterilkan dengan direndam-dikocok dalam larutan hipoklorit

dengan ditambah Tween-80 sebanyak 2-3 tetes selama 5 menit. Eksplan

dibilas 3 kali dengan air steril (air yang sudah disterilisasi dengan autoklaf).

Eksplan yang sudah dibilas dengan air steril ini sudah siap untuk ditanam.

b. Penanaman eksplan

Potongan eksplan yang akan ditanam yang sudah disterilkan

sebelumnya dimasukkan ke dalam media dengan sedikit ditekan untuk

memperbesar sudut kontak eksplan dengan permukaan media klutur. Media

yang telah ditanami, diinkubasikan dalam ruang inkubator dengan suhu

ruangan 18 °C serta disinari dengan lampu TL 20 watt dengan ketinggian 40

cm.


41

6. Pengamatan waktu inisiasi kalus

Waktu inisiasi kalus dihitung dari saat kalus mulai terbentuk. Karena

pertambahan bobot pertumbuhan kalus tidak dapat diamati, penentuan waktu

inisiasi kalus dilakukan secara visual yaitu mulai terlihatnya bintik putih pada

bagian pelukaan eksplan.

7. Subkultur

Subkultur dilakukan 36 hari setelah penanaman di mana tanaman telah

menampakkan gejala kurang nutrisi (berwarna kecoklatan) atau bobotnya

tidak bertambah. Pada proses subkultur, kalus dipecah menjadi bagian yang

lebih kecil kemudian ditanam lagi ke dalam media baru. Proses subkultur ini

dilakukan sebagai berikut, semua perlengkapan yang digunakan yaitu pinset,

skapel, bunsen, alat-alat gelas, botol berisi alkohol 70% dan botol-botol yang

berisi media yang telah diketahui beratnya dimasukkan kedalam laminar air

flow dan disterilkan selama ± 2 jam dengan lampu UV.

Media yang berisi kalus kemudian disemprot dengan alkohol 70%

kemudian dimasukkan ke dalam laminar air flow. Ketika botol akan dibuka

dan ditutup, maka dilakukan proses flambir. Kemudian ambil kalus dengan

pinset dan letakkan di atas cawan petri. Bersihkan kalus dari sisa-sisa eksplan

hingga bersih kemudian belah bagian kalus tersebut dan potong-potong

dengan menggunakan skapel dan pinset dengan ukuran kalus 3 – 5 mm lalu

ditanam dalam media yang baru secara aseptis. Kalus yang telah ditanam tadi

kemudian diinkubasikan di dalam ruang inkubator dengan suhu ruangan 180C

serta disinari dengan lampu TL 20 watt dengan ketinggian 40 cm. Sub-kultur


42

ini dibuat sebanyak 42 botol. Untuk mengetahui bobot kalus maka dilakukan

penimbangan pada media baru yang berisi kalus, selanjutnya bobot yang

diperoleh dikurangkan dengan bobot media awal sebelum ditanami kalus.

8. Pemanenan

Setelah dilakukan subkultur, tiap 6 (enam) hari sekali dilakukan

pemanenan sebanyak 3 (tiga) buah botol yang berisi kalus lalu dibersihkan

dari sisa-sisa agar yang masih melekat. Setelah kalus bersih kemudian

dilakukan penimbangan dan akan mendapatkan bobot kalus basah. Kalus yang

telah dipanen kemudian dikeringkan pada suhu 40-500C hingga didapatkan

perbedaan bobot tidak lebih dari 0,5 mg bobot kalus dari 2 penimbangan

berurutan berselang 1 jam (MMI jilid IV) atau dengan kata lain setelah

didapatkan berat kalus kering yang konstan. Catat bobot kering kalus hasil

setiap pemanenan. Kalus kering yang diperoleh kemudian digerus dengan

menggunakan mortir dan stamper. Selanjutnya serbuk kalus yang diperoleh,

disimpan di dalam flakon dan dikumpulkan sebanyak ± 2 gram untuk dibuat

ekstrak sehingga dapat diketahui metabolit sekunder dalam kalus.

9. Analisis pertumbuhan kalus

Analisis pertumbuhan kalus dalam penelitian ini menggunakan dua cara,

yaitu :

a. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data penimbangan

bobot kalus basah dengan umur kalus.

Perhitungan bobot kalus basah tiap-tiap waktu tertentu yakni setiap 6

(enam) hari sekali. Pertambahan bobot kalus basah pada tiap-tiap waktu


43

pemanenan didapatkan dari penjumlahan dari tiap-tiap botol yang dipanen

pada hari yang sama. Analisis pertumbuhan kalus dilakukan dengan

menggunakan kurva sigmoid yang menyatakan hubungan antara umur kalus

dengan pertambahan bobot kalus basah (pertumbuhan kalus) sehingga

diperoleh gambaran fase-fase pertumbuhan kalus.

b. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data biomassanya

Kalus basah yang diperoleh dari setiap pemanenan kemudian

dikeringkan hingga bobotnya konstan dan ditimbang. Pertumbuhan kalus

dihitung berdasarkan persentase pertambahan bobot biomassa kalus.

Kemudian dibuatkan grafik pola pertumbuhan kalus, dengan menghubungkan

antara pertambahan bobot kalus kering dan umur kalus.

10. Pengeringan dan pembuatan serbuk daun kamboja jepang

Daun kamboja jepang dikeringkan di dalam oven pada suhu 40-500C.

Kemudian daun yang telah dikeringkan tersebut, digerus dengan

menggunakan mortir dan stamper. Serbuk daun yang diperoleh, disimpan di

dalam flakon.

11. Pembuatan ekstrak kalus

Satu gram serbuk kalus daun kamboja jepang direfluks menggunakan 10

ml campuran kloroform-metanol (1:10 v/v), selama 10 menit. Larutan

didinginkan dan disaring, filtratnya diuapkan sampai kering. Residu yang

diperoleh dilarutkan dalam 2 ml kloroform-metanol (1:1 v/v) (Dwiatmaka dan

Wulandari, 2005). Ekstrak yang ditotolkan pada plat KLT sebanyak 30-50μl

(Wagner, et al., 1984).


44

12. Pembuatan ekstrak daun kamboja jepang

Satu gram serbuk kering daun kamboja jepang direfluks menggunakan

10 ml campuran kloroform-metanol (1:10 v/v), selama 10 menit. Larutan

didinginkan dan disaring, filtratnya diuapkan sampai kering. Residu yang

diperoleh dilarutkan dalam 2 ml kloroform-metanol (1:1 v/v) (Dwiatmaka dan

Wulandari, 2005). Sebelumnya perlu dilakukan uji tabung untuk memastikan

ada tidaknya aglikon kardenolida sebagai salah satu cincin lakton yang

menyerang C17 pada glikosida steroid. Uji dengan pereaksi Baljet, ambil sari

kloroform secukupnya, encerkan dengan metanol 3-5 kali lipat volume asal,

tambahkan pereaksi Baljet. Terbentuknya warna jingga menunjukkan adanya

aglikon kardenolida. Uji dengan pereaksi Raymond, dengan cara kerja yang

sama maka terbentuknya warna ungu menunjukkan adanya aglikon

kardenolida. Ekstrak yang ditotolkan pada plat KLT sebanyak 30-50μl

(Wagner, et al., 1984)

13. Pembuatan standar digitoksin

Sepuluh mg serbuk digitoksin dilarutkan dalam sepuluh ml metanol P

(Anonim, 1995).

14. Uji KLT ekstrak kalus, ekstrak daun kamboja jepang dan standar

digitoksin

Ekstrak kalus, ekstrak daun kamboja jepang dan standar digitoksin

ditotolkan pada lempeng KLT dengan menggunakan fase diam silika gel

GF254 dan fase gerak berupa etil asetat – metanol - air (81 : 11 : 8 v/v) dengan

jarak pengembangan 8 cm. Deteksinya menggunakan sinar UV 254 dan 365


45

nm, serta disemprot dengan dua macam pereaksi yaitu Kedde (bercak diamati

di bawah sinar tampak) dan Vanilin Asam Fosfat (lempeng dipanaskan pada

suhu 1000C selama 10 menit, amati bercak di bawah sinar tampak) (Wagner,

et al., 1984).

E. Analisis Hasil

Analisis waktu inisiasi kalus dilakukan secara visual sebagai munculnya

titik-titik tumbuh kalus yang berwarna putih kekuningan untuk yang pertama

kalinya pada eksplan dengan menggunakan rata-rata waktu inisiasi kalus.

Pertumbuhan kalus diperoleh berdasarkan pertambahan bobot kalus

basah yakni dengan cara mengurangkan bobot kalus basah akhir dengan bobot

kalus basah awal. Bobot kalus basah awal didapat dari bobot kalus hasil subkultur

pertama. Bobot kalus basah akhir didapat dari bobot kalus basah yang telah

ditumbuhkan dalam media selama enam hari (bobot kalus setelah pemanenan).

Pertumbuhan kalus (p) = bobot kalus basah akhir – bobot kalus basah awal

Data penimbangan bobot kalus basah yang diperoleh dari setiap

pemanenan kemudian dikeringkan hingga bobotnya konstan dan ditimbang.

Pertumbuhan kalus juga dapat dihitung dihitung berdasarkan persentase

pertambahan bobot biomassa kalus. Kemudian dibuatkan grafik profil

pertumbuhan kalus, dengan menghubungkan antara persen susut pengeringan

dengan umur kalus. Data profil pertumbuhan kalus berdasarkan biomassa kalus


46

tersebut digunakan sebagai data pendukung bagi profil pertumbuhan kalus

berdasarkan pertambahan bobot kalus basah.

Untuk mengetahui apakah dengan adanya penambahan zat pengatur

tumbuh (2,4-D) selama dilakukannya proses kultur, berpengaruh terhadap bobot

biomassa kalus maka diperlukan perhitungan susut pengeringan. Persen susut

pengeringan kalus dihitung dengan mengurangkan rerata bobot kalus basah akhir

dengan rerata bobot kalus kering dibagi dengan rerata bobot basah akhir dikali

100%.

% susut pengeringan :

(rerata bobot kalus basah akhir – rerata bobot kalus kering) x 100% rerata bobot kalus basah akhir

Analisis kandungan kimia kalus, dalam hal ini glikosida jantung dilakukan

uji KLT dengan membandingkan bercak kalus kamboja jepang dengan bercak

daun tanaman asal dan bercak standar digitoksin.


47

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman kamboja jepang dilakukan dengan mencocokkan

tanaman kamboja jepang yang digunakan dalam penelitian dengan ciri-ciri

morfologi tanaman kamboja jepang berdasarkan jurnal acuan (Anonim, 2006).

Berdasarkan hasil determinasi, diperoleh keterangan bahwa tanaman yang

digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman kamboja jepang (Adenium obesum

(Forssk.) Roem. & Schult.).

B. Pembuatan Media, Pemilihan Eksplan, Sterilisasi, dan Penanaman

Media yang digunakan adalah media Gamborg. Pembuatan media pada

prinsipnya dilakukan dengan melarutkan semua komponen media dalam air,

sesuai dengan konsentrasinya. Modifikasi komponen media baku juga biasa

dilakukan untuk mendapatkan pertumbuhan kultur yang lebih sesuai yang

diinginkan.

Media Gamborg dibuat dengan cara melarutkan bahan-bahan yang ada ke

dalam Beaker glass secara berurutan, bahan organik makro dan mikro, vitamin,

myoinositol, sukrosa dan agar, serta hormon pengatur tumbuh. Unsur mikro perlu

dibuat dalam larutan stok untuk memudahkan dalam pembuatan media karena

jumlahnya yang cukup kecil (kurang dari 100 mg/L), sedangkan unsur makro

tidak perlu. Begitu juga dengan vitamin, Fe(Na)EDTA, dan Myoinositol perlu

dibuat dalam larutan stok. Selanjutnya ditambahkan campuran sukrosa dan agar

yang sebelumnya sudah digerus halus. Penambahan dilakukan sedikit demi sedikit


48

sambil dipanaskan agar campuran sukrosa dan agar tidak menggumpal dan

sekaligus memudahkan pelarutan. Campuran bahan kemudian dididihkan.

Selanjutnya ditambahkan hormon pengatur tumbuh 2,4-D dan FAP dan diatur PH

5,2-5,6. Jika terlalu asam media akan sukar memadat sehingga perlu ditambah

KOH (basa) encer. Jika terlalu basa media akan cepat memadat sehingga akan

sulit dituang ke dalam botol-botol media, diatasi dengan penambahan HCl (asam)

encer. Selanjutnya media dipindahkan ke dalam botol-botol kultur dan ditutup

dengan alumunium foil untuk kemudian disterilisasi dengan autoklaf 121˚C

selama 15 menit. Media yang sudah disterilisasi kemudian disimpan dalam

inkubator selama 1 minggu dan siap untuk ditanami jika tidak terjadi kontaminasi

seperti jamur dan bakteri.

Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian daun tanaman

Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. yang terletak nomor 3-5 dari ujung

batang atau cabang karena pada bagian tersebut masih banyak dijumpai jaringan

meristem dan parenkim muda yang mempunyai sifat totipotensi sehingga dapat

tumbuh dan berkembang menjadi kalus. Sel atau jaringan yang masih muda yang

dinamakan juvenile akan tetap muda dalam pengkulturan sehingga daya untuk

beregenerasi tetap ada. Daun yang terletak di bagian ujung batang atau cabang

memiliki jaringan yang sudah tua sehingga kesanggupan untuk beregenerasi sudah

berkurang, selain itu jaringan yang sudah tua mengandung banyak bakteri endofit

sehingga harus dihindari. Pemilihan daun sebagai eksplan, selain mudah didapat

daun juga memiliki kemampuan tumbuh lebih cepat dibandingkan eksplan bagian

lain seperti batang utama, cabang batang, atau tangkai bunga. Proses sterilisasi


49

yang diperlukan juga mudah dan lebih cepat. Menurut Santoso dan Nursandi

(2002), munculnya kalus rata-rata terjadi pada hari 12,2 HSI (Hari Setelah

Inokulasi) dengan perlakuan asam 2,4-D. Daun yang diinokulasikan akan

mengalami dediferensiasi (kebalikan diferensiasi) yaitu berubahnya sel-sel

eksplan yang tadinya sudah terspesialisasi menjadi tidak terspesialisasi dan

kembali ke kondisi meristematik. Proses ini terjadi pada sel-sel eksplan yang

sebelumnya sudah terdeferensiasi). Ukuran eksplan yang akan ditanam

berdasarkan orientasi adalah 0,5 – 1,0 cm. Ukuran eksplan tidak begitu

menentukan, namun hendaklah diketahui bahwa pembelahan sel akan seringkali

gagal apabila eksplan terlalu kecil. Namun eksplan yang terlalu besar juga

memiliki resiko kontaminasi yang lebih besar dan penyerapan nutrisi yang kurang

sempurna karena tidak semua bagian eksplan menempel pada media sehingga

kalus yang terbentuk hanya pada sebagian eksplan saja selebihnya eksplan mulai

menguning, menjadi coklat dan akhirnya mati. Peneliti sudah mencoba dengan

ukuran eksplan yang besar dan yang kecil. Hasilnya, eksplan yang kecil

membentuk kalus lebih sempurna karena nutrisi yang diserap juga lebih banyak

karena permukaan eksplan menempel seluruhnya pada media.

Bagian tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun karena

pada penelitian yang dilakukan oleh Nakamura dkk. (2000) dilaporkan bahwa

ekstrak dari daun tanaman Adenium obesum mengandung glikosida jantung yang

memiliki efek mengatasi sitotoksik sehingga berpotensi sebagai antikanker. Oleh

karena itu, diharapkan dengan metode kultur jaringan ini dihasilkan kalus dari


50

daun kamboja jepang yang mengandung glikosida jantung yang sama dengan

tanaman asalnya.

Media tumbuh yang digunakan dalam kultur jaringan juga merupakan

tempat tumbuh yang menguntungkan bagi pertumbuhan jamur dan bakteri, untuk

itu perlu dilakukan sterilisasi guna mencegah kontaminasi. Sterilisasi dilakukan

pada peralatan, media, eksplan, maupun ruang transfer. Sterilisasi pada peralatan

dan media menggunakan metode uap panas bertekanan yaitu menggunakan

autoklaf denga suhu 121 °C selama 15 menit. Ruang transfer disterilisasi dengan

disemprot alkohol 70% dan radiasi sinar UV selama ± 2 jam. Sinar UV ini

memiliki panjang gelombang yang pendek (10-8 – 10-6 nm) sehingga energi yang

dimiliki sinar UV sangat besar karena panjang gelombang berbanding terbalik

dengan energi yang dipancarkan sehingga energi radiasi dari sinar UV ini dapat

digunakan untuk mensterilisasi ruang transfer. Sinar UV ini beda dengan yang

digunakan untuk menyinari uang karena memiliki watt yang lebih besar (2 x 30

watt) sehingga radiasi yang ditimbulkan juga cukup besar untuk mematikan

mikroorganisme di dalam ruang transfer. Sterilisasi eksplan terdiri dari 3 tahap,

yaitu pencucian, sterilisasi di luar dan sterilisasi di dalam ruang transfer.

Pencucian dilakukan dengan tujuan menghilangkan kotoran (kontaminan) dari

permukaan daun dengan menggunakan detergen dan dibilas dengan akuades,

biasa disebut disinfeksi. Sterilisasi di luar dan di dalam ruang transfer dilakukan

secara kimiawi yaitu dengan campuran hipoklorit 10% dan Tween 80 dan dibilas

menggunakan akuades steril. Tween 80 digunakan sebagai agen pembasah untuk

meningkatkan efektivitas serilisasi karena lapisan terluar daun biasanya


51

berlapiskan lilin, sehingga akan mencegah terbentuknya gelembung-gelembung

udara yang dapat menutupi permukaan jaringan yang dapat menghambat

penyerapan nutrisi media.

Eksplan ditanam dalam bentuk irisan melintang daun. Melalui bentuk

irisan ini diharapkan permukaan eksplan yang dapat kontak dengan media

semakin luas sehingga nutrisi dapat diserap dengan lebih baik oleh eksplan. Pada

saat pengirisan dan pemindahan eksplan ke dalam botol kultur, digunakan pisau

dan pinset yang telah disterilkan dan didinginkan untuk meminimalkan resiko

kematian eksplan karena panas.

Gambar 2. Eksplan dalam bentuk irisan melintang daun

C. Waktu Inisiasi Kalus

Waktu inisiasi kalus adalah waktu yang diperlukan sejak penanaman

hingga saat kalus mulai terbentuk. Idealnya, waktu inisiasi kalus ditandai dengan

pertambahan bobot eksplan yang telah ditanam dari bobot awalnya. Namun,

pengamatan bobot media dan eksplan dari hari ke hari menunjukkan terjadinya

penurunan bobot eksplan dan media berbanding lurus dengan umur penanaman.

Penurunan bobot tersebut terjadi karena laju pertumbuhan kalus lebih lambat

daripada laju pengurangan kadar air media akibat penguapan dan penyerapan air


52

oleh eksplan. Oleh karena itu, penentuan waktu inisiasi kalus tidak dapat diamati

dengan cara tersebut.

Pada penelitian ini, inisiasi kalus diamati dengan munculnya titik-titik

tumbuh kalus yang berwarna putih kekuningan untuk yang pertama kalinya pada

eksplan. Waktu inisiasi kalus berdasarkan konsentrasi 2,4-D dan FAP terlihat

pada tabel berikut.

Tabel I. Waktu inisiasi kalus pada Ga. II Perbandingan

konsentrasi ZPT (ppm) Jumlah botol

Waktu inisiasi kalus

(hari)

2 9

4 10

4 14

2,4-D : FAP

4 : 4

Rata-rata 11

Tabel II. Waktu inisiasi kalus pada Ga. III Perbandingan

konsentrasi ZPT(ppm) Jumlah botol

Waktu inisiasi kalus

(hari)

3 14

4 10

2 14

2,4-D : FAP

4 : 0

Rata-rata 12,7


53

Tabel tersebut menunjukkan bahwa waktu inisiasi Ga. II lebih cepat

dibandingkan Ga. III.

Waktu inisiasi kalus ini tidak dapat menggambarkan pertumbuhan kalus.

Karena selama proses orientasi yang dilakukan oleh peneliti menunjukkan bahwa

walaupun eksplan tanaman yang dipilih diperlakukan pada kondisi percobaan

yang sama, namun eksplan tanaman yang satu dan yang lainnya memiliki

kepotensialan yang berbeda untuk tumbuhnya kalus.

Gambar 3. Inisiasi kalus D. Subkultur dan Panen

Subkultur dilakukan setelah kalus berumur 36 hari. Hal tersebut dilakukan

untuk menjaga konsistensi pasokan nutrisi. Apabila subkultur terlambat

dilakukan, massa kalus akan mati kehabisan nutrisi. Tanda-tanda kalus kehabisan

nutrisi dan harus segera dipindah adalah warna kalus menjadi coklat, media retak,

dan selanjutnya sedikit demi sedikit kalus akan mengering. Waktu 36 hari yang

digunakan dalam penelitian ini didapat dari hasil orientasi, di mana pada umur 36

hari kalus telah mulai menunjukkan tanda kekurangan nutrisi.

Pada penelitian ini, kalus cukup disubkultur 1 kali sebelum dilakukan

pemanenan. Kalus yang dipanen adalah hasil dari subkultur pertama. Hal ini


54

dilakukan karena pada subkultur yang pertama eksplan sudah membentuk kalus

seluruhnya.

Bagian kalus yang disubkultur adalah bagian yang masih memiliki titik

tumbuh yaitu di bagian kalus terluar dan belum mengalami browning. Kalus yang

telah mengalam browning apabila ditanam tidak dapat tumbuh dan berkembang

membentuk kalus baru. Kalus bagian luar merupakan kalus yang masih tersusun

oleh sel-sel meristem sehingga dapat tumbuh dan berkembang membentuk kalus

baru. Dengan pemilihan ini, diharapkan kalus akan cepat berkembang setelah

dipindah ke media baru. Dari hasil orientasi, ditemukan bahwa kalus bagian dalam

terdiri dari sel-sel tua yang dalam keadaan dorman sebelum mulai pertumbuhan

apabila dipindahkan ke media baru. Tidak jarang, kalus tua ini justru mati setelah

dipindah karena tidak mampu menyerap nutrisi dari media.

Bobot kalus awal sebelum subkultur tidak dapat ditimbang karena resiko

kontaminasi. Oleh karena itu, jumlah kalus awal dikendalikan dengan

menyamakan ukuran kalus awal, yaitu ± 3 – 5 mm. Ukuran ini ditetapkan dengan

cara orientasi. Ukuran kalus awal yang lebih kecil menghasilkan pertumbuhan

yang lebih pesat karena penyerapan nutrisi lebih optimal.

Pemanenan dilakukan pada setiap 6 hari sekali selama 42 hari. Tujuan

pemanenan adalah untuk mengetahui profil pertumbuhan kalus dan untuk

mendapatkan kalus kering untuk dianalisis kandungan kimianya. Pemanenan pada

hari ke-30 sampai hari ke-36 dilakukan 2 hari sekali agar perubahan fase

eksponensial menuju fase stasioner terlihat lebih jelas. Pemanenan dilakukan

sampai hari ke-42, karena pada hari ke-36 hingga hari ke-42 kalus menunjukan


55

fase stasioner, di mana pada fase tersebut diharapkan kalus memiliki kandungan

metabolit sekunder berupa glikosida jantung yang optimum.

E. Profil Pertumbuhan Kalus

Pertumbuhan kalus tidak dapat diamati dengan penimbangan kalus

setiap periode waktu tertentu karena adanya pengurangan bobot media akibat

penguapan yang akan mengacaukan data. Kadang-kadang, bobot kalus terlihat

berkurang semu karena laju penguapan media lebih besar daripada laju

pertumbuhan kalus.

Pada penelitian, dilakukan panen setiap 6 hari sekali sehingga

didapatkan data bobot kalus awal dan akhir pada hari ke 6, 12, 18, dan seterusnya.

Pertumbuhan dihitung sebagai selisih bobot kalus basah akhir (n hari setelah

penanaman) dengan bobot kalus basah awal (bobot kalus pada saat ditanam). Pola

pertumbuhan kalus mengikuti persamaan kuva sigmoid dengan adanya fase lag,

fase eksponensial, dan fase stasioner. Pada analisis profil pertumbuhan ini media

yang digunakan disebut sebagai media Ga. II dan Ga. III. Media Ga. II adalah

media Gamborg dengan perbandingan konsentrasi FAP dan 2,4-D (4 : 4). Media

Ga. III adalah media Gamborg dengan konsentrasi 2,4-D 4 ppm.


56

Gambar 4. Kurva pertumbuhan kalus pada media Ga. II

Fase-fase pertumbuhan kalus dapat dilihat pada kurva pertumbuhan

kalus hasil pengamatan, yaitu : fase lag, merupakan fase penyesuaian di mana laju

pertumbuhan kalus sangat kecil. Pada penelitian ini, fase lag terjadi pada hari ke-0

hingga hari ke-18. Pada fase lag, terjadi penyesuaian diri daun kamboja jepang

dengan lingkungan sehingga laju pertumbuhan sangat kecil. Pada fase ini, kalus

mulai tumbuh yang ditandai dengan adanya bintik berwarna putih kekuningan

pada bagian pelukaan daun. Pada hari ke-18 sampai hari ke-36 kalus mengalami

fase eksponensial yang ditandai dengan pertumbuhan kalus yang sangat pesat

karena kalus sudah dapat menyesuaikan diri dengan media dan dapat

mengabsorpsi nutrisi dengan baik. Setelah hari ke-36, kalus mengalami fase

stasioner di mana laju pertumbuhan kalus setara dengan laju kematian sehingga

bobot kalus relafif tetap. Pada fase stasioner inilah metabolit aktif berupa

glikosida jantung dihasilkan. Oleh karena itu, pemanenan kalus dapat dilakukan

mulai hari ke-36 untuk mendapatkan metabolit dalam jumlah optimum.


57

Gambar 5. Kurva pertumbuhan kalus pada media Ga. III

Fase-fase pertumbuhan kalus dapat dilihat pada kurva pertumbuhan kalus

hasil pengamatan, yaitu : fase lag, merupakan fase penyesuaian di mana laju

pertumbuhan kalus sangat kecil. Pada penelitian ini, fase lag terjadi pada hari ke-0

hingga hari ke-15. Pada umur tersebut, kalus masih dalam tahap penyesuaian diri

dengan media setelah proses subkultur sehingga absorpsi nutrisi dari media

berjalan lambat. Pertumbuhan kalus masih lambat karena belum banyak asupan

nutrisi yang diperlukan sebagai sumber energi bagi pembelahan dan pembesaran

sel. Pada hari ke-15 sampai hari ke-36, pertumbuhan kalus menjadi cepat. Fase ini

disebut fase eksponensial. Pada fase ini, nutrisi dapat diserap dengan baik

sehingga pertumbuhan sel menjadi optimal. Setelah hari ke-36, pertumbuhan

kalus menjadi tetap karena sel mulai menua dan nutrisi pada media mulai

menipis. Pemanenan dapat dilakukan pada fase ini karena metabolit sekunder

terbentuk dengan optimal.

Kurva sigmoid yang menggambarkan hubungan antara umur kalus dengan

pertambahan bobot kalus basah didukung oleh kurva pertumbuhan kalus daun


58

kamboja jepang berdasarkan pertambahan bobot biomassa kalus. Data profil

pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan pertambahan bobot

biomassa kalus ditunjukkan pada lampiran 3.

F. Susut Pengeringan Kalus

Bobot basah kalus tidak dapat menggambarkan produktivitas kalus.

Produktivitas kalus dapat dilihat dari nilai biomassa (massa sel kalus) atau bobot

kering kalus. Biomassa kalus akan terbentuk seiring dengan pertumbuhan umur

kalus. Sel-sel kalus akan terus tumbuh dan akan mencapai pertumbuhan yang

maksimal pada fase stasioner sehingga pada fase ini metabolit sekunder yang

dihasilkan akan maksimal, Menurut Salisbury dan Ross (1992), auksin dapat

meningkatkan bobot basah kalus dengan cara meningkatkan permeabilitas dinding

sel terhadap air sehingga air dari media banyak terabsorpsi ke dalam kalus. Untuk

melihat pengaruh variasi konsentrasi terhadap kandungan air kalus, dilakukan

perbandingan susut pengeringan dari kalus pada kedua media.

Gambar 6. Perbandingan kurva susut pengeringan kalus pada kedua media


59

Persen susut pengeringan adalah nilai persen dari pengurangan rerata bobot

kalus basah dengan rerata bobot kalus kering dibagi dengan rerata bobot kalus

basah. Persen susut pengeringan kalus yang diperoleh dari hasil penelitian

ditunjukkan pada gambar 6. Persen susut pengeringan kalus meningkat secara

drastis pada hari ke-0 hingga hari ke-6. Hal tersebut menunjukkan bahwa

kalus menyerap lebih banyak air pada fase awal pertumbuhan kalus yaitu pada

fase lag akibat adanya penambahan ZPT (2,4-D) ke dalam media yang mana

menurut Hendaryono dan Wijayani (1994) 2,4-D dapat menaikkan tekanan

osmotik, meningkatkan sintesa protein, meningkatkan permeabilitas sel

terhadap air, dan melunakkan dinding sel yang diikuti menurunnya tekanan

dinding sel sehingga air dapat masuk ke dalam sel yang disertai dengan

kenaikan volume sel, sehingga persen susut pengeringanpun mengalami

kenaikan. Selanjutnya persen kadar air kalus mulai konstan pada hari ke-6

hingga hari ke-42. Hal tersebut menunjukkan bahwa kalus menyerap sedikit

air akan tetapi kalus lebih banyak melakukan aktivitas pembelahan sel.

Data persen susut pengeringan sangat penting dalam hal pemilihan jenis media

tanam yang akan digunakan. Apabila tipe kalus yang ditumbuh kembangkan

banyak mengalami penyusutan setelah dikeringkan maka media yang cocok

digunakan yakni media cair. Melalui pemilihan media yang tepat maka dapat

diketahui pula waktu yang tepat untuk dilakukan pemanenan sehingga

metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kalus dalam keadaan optimum.

Pada gambar 6 ditunjukkan bahwa kalus daun kamboja jepang banyak

mengkonsumsi air di dalam pertumbuhannya sehingga pembudidayaan pada


60

media cair diduga akan menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang

optimal karena media yang digunakan optimum di dalam pertumbuhan. Dalam

hal ini, media Ga. II lebih baik dibanding Ga. III karena waktu inisiasi yang

diperlukan lebih singkat selain itu.

G. Analisis Kandungan Kimia Kalus

Analisis kandungan kimia kalus secara KLT dan uji tabung dilakukan

untuk membuktikan bahwa secara kualitatif kalus mampu memproduksi glikosida

jantung seperti tanaman asalnya sehingga diharapkan dapat dikembangkan

sebagai penghasil metabolit sekunder.

Pada penelitian ini, terlebih dahulu dilakukan uji identifikasi fitokimia

kalus dengan menggunakan 2 macam pereaksi, yaitu uji dengan pereaksi Baljet

dan uji dengan pereaksi Raymond, di mana jika hasil uji ini positif memberikan

warna jingga dan ungu yang menunjukkan adanya aglikon kardenolida sebagai

salah satu cincin lakton yang menyerang C17 pada glikosida steroid.

Gambar 7. Penomoran struktur inti steroid

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1011

12

13

14

15

16

17

CH3

18

CH3

19 R20


61

Dari hasil penelitian diperoleh hasil yang positif dengan kedua pereaksi

tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak kalus mengandung aglikon

kardenolida.

Secara spesifik, menurut Farnsworth (1966), ada 2 macam gugus yang

menunjukkan adanya kandungan glikosida jantung, yaitu cincin lakton tidak jenuh

dan inti steroid. Masing-masing gugus tersebut dapat diidentifikasi menggunakan

beberapa macam reagen dan menghasilkan warna yang spesifik. Cincin lakton

tidak jenuh dapat diidentifikasi menggunakan beberapa macam reagen, salah

satunya reagen Kedde (3,5 Dinitrobenzoic acid-alkali). Reagen semprot ini

menghasilkan intensitas warna yang lebih tinggi pada bercak hasil pengembangan.

Inti steroid dapat diidentifikasi menggunakan reagen vanillin asam fosfat dan akan

menghasilkan bercak berwarna warna kuning kehijauan. Kedua reagen tersebut

dalam penelitian ini digunakan untuk mengidentifikasi adanya cincin lakton tidak

jenuh dan inti steroid yang merupakan penyusun glikosida jantung.

Selanjutnya analisis kandungan kimia kalus dalam penelitian ini

dilakukan dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Fase diam yang

digunakan pada penelititan ini yaitu silika gel GF254 Fase diam ini digunakan

karena glikosida jantung hanya memiliki sedikit gugus kromofor yang apabila

dideteksi di bawah UV 254 nm pada silika gel tanpa indikator fluoresensi

memberikan bercak dengan intensitas warna yang lemah. Oleh karena itu

digunakan silika gel GF254 yang mengandung bahan yang dapat berfluoresensi.


62

Standar pembanding yang digunakan adalah digitoksin karena termasuk

glikosida jantung. Selain itu kamboja jepang juga mengandung bahan aktif yang

menyerupai glikosida digitalis berupa glikosida jantung.

Fase gerak yang digunakan dalam analisis ini adalah campuran etil asetat

: metanol : air dengan perbandingan 81 : 11 : 8 v/v . Karena fase diam lebih polar

daripada fase gerak, maka kromatografi ini merupakan kromatografi fase normal.

Pereaksi semprot yang digunakan dalam penelitian ini adalah pereaksi vanilin

asam fosfat dan peraksi Kedde (Wagner et al., 1984).

Glikosida jantung bersifat polar karena memiliki gugus gula (glikon).

Namun kepolaran fase diam yang digunakan dalam penelitian lebih tinggi

dibandingkan dengan glikosida jantung. Berdasarkan sifat fase gerak, fase diam,

dan analit, bercak dapat bergerak mengikuti fase gerak (tabel III).


63

Tabel III. Hasil pengamatan KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak etil asetat : metanol : air ( 81 : 11 : 8 v/v )

Keterangan :

Ga II → media Gamborg dengan konsentrasi FAP : 2,4-D (4 : 4)

Ga. III → media Gamborg dengan konsentrasi FAP : 2,4-D (0 : 4)

A1 s/d A 3 → bercak standar digitoksin no. 1 – 3

B1 s/d B6 → bercak ekstrak daun no. 1 – 6

C1 s/d C4 → bercak ekstrak kalus Ga. II no. 1 – 4

D1 s/d D4 → bercak ekstrak kalus Ga. III no. 1 – 4

Sinar UV 254 nm 365 nm

Pereaksi Vanilin Asam Fosfat

Pereaksi Kedde Totolan Ekstrak

No. Ber-cak Rf Warna Rf Warna Rf Warna Rf Warna

A1 0.56 Ungu - - 0,56 Kuning oranye

0,56 Ungu

A2 0,69 Ungu - - 0,69 Kuning oranye

0,69 Ungu

Standar Digitoksin

A3 0,79 Ungu - - 0,79 Kuning oranye

0,79 Ungu

B1 0.08 Coklat 0,08 Ungu 0,08 Jingga 0,08 Kuning B2 0,29 Ungu 0,29 Ungu 0,29 Jingga - - B3 0,56 Hijau 0,56 Ungu 0,56 Hijau 0,56 Hijau B4 0,65 Hijau 0,65 Ungu 0,65 Hijau 0,65 Hijau B5 0,75 Ungu - - 0,75 Kuning - -

Daun Kamboja Jepang

B6 0,81 Hijau tua 0,81 Ungu 0,81 Hijau 0,81 Hijau C1 0,05 Coklat 0,05 Hijau 0,05 Jingga 0,05 Kuning C2 0,16 Coklat 0,16 Ungu 0,16 Jingga 0,16 Kuning

C3 0,66 Ungu - - 0,66 Jingga 0,66 -

Kalus Kamboja Jepang Ga. II

C4 0,81 Hijau 0,81 Ungu 0,81 Hijau 0,81 Hijau

D1 0,09 Coklat 0,09 Hijau 0,09 Jingga 0,09 Kuning

D2 0,18 Coklat 0,18 Ungu 0,18 Jingga 0,18 Kuning

D3 0,68 Ungu - - 0,68 Jingga - -

Kalus Kamboja Jepang Ga. III

D4 0,84 Hijau - - 0,84 Hijau 0,84 Hijau


64

3 6 4 4 2 5 4 3 1 3

2

2 2 1 1 1

A B C D

Keterangan gambar :

Fase diam : silika gel GF254

Fase gerak: etil asetat : metanol :air

(81 : 11 : 8 v/v)

A : Standar Digitoksin

B : Ekstrak daun kamboja jepang

C : Ekstrak kalus daun kamboja

jepang Ga. II

D : Ekstrak kalus daun kamboja

jepang Ga. III

Deteksi :vanilin asam fosfat

pemanasan 1000C selama

10 menit

Jarak pengembangan : 8 cm

Gambar 8. Kromatogram glikosida jantung kalus daun kamboja jepang, ekstrak daun

kamboja jepang tanaman asal dan standar digitoksin setelah disemprot dengan pereaksi vanilin asam fosfat

Dari hasil penelitian di atas, ekstrak kalus daun kamboja jepang

menghasilkan 4 bercak untuk masing-masing konsentrasi, sedangkan ekstrak

daun kamboja jepang menghasilkan 6 bercak,dan standar digitoksin menghasilkan

3 bercak setelah lempeng disemprot dengan pereaksi vanilin asam fosfat.


65

Keterangan gambar :

Fase diam : silika gel GF254

Fase gerak: etil asetat : metanol :air

(81 : 11 : 8 v/v)

A : Standar digitoksin.

B : Ekstrak daun kamboja jepang

C : Ekstrak kalus daun kamboja

jepang Ga. II

D : Ekstrak kalus daun kamboja

jepang Ga. III

Deteksi : pereaksi Kedde

Jarak pengembangan : 8 cm

Gambar 9. Kromatogram glikosida jantung kalus daun kamboja jepang, ekstrak daun kamboja jepang tanaman asal dan standar digitoksin

setelah disemprot dengan pereaksi Kedde

Dari hasil penelitian di atas, masing-masing ekstrak kalus daun kamboja

jepang menghasilkan 3 bercak, sedangkan ekstrak daun kamboja jepang

menghasilkan 4 bercak, dan standar digitoksin menghasilkan 3 bercak setelah

lempeng disemprot dengan pereaksi Kedde.

Dari pengamatan bercak hasil KLT, terdapat 3 bercak masing-masing

ekstrak kalus daun kamboja jepang yaitu bercak no. 1,3, dan 4 yang memiliki

harga Rf yang mirip dengan harga Rf bercak ekstrak daun kamboja jepang yaitu

bercak no. 1,4, dan 6 dan Rf standar digitoksin yaitu bercak no. 2 dan 3. Apabila

dilihat dari warnanya, masing-masing bercak ekstrak kalus daun kamboja jepang

3 6 4 4 2 4 1 3

2 2 1 1 1

A B C D


66

no. 4 dan bercak standar digitoksin no. 3 memiliki warna hijau muda sedangkan

bercak ekstrak daun kamboja jepang no. 6 memiliki warna hijau tua. Hal tersebut

dikarenakan konsentrasi kandungan glikosida pada ektrak kalus daun kamboja

jepang dan standar digitoksin hasil preparasi lebih kecil daripada ekstrak daun

kamboja jepang.

Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa dengan sistem KLT yang digunakan

pada penelitian ini, diperoleh 1 senyawa pada ekstrak kalus daun kamboja jepang

yang mirip dengan senyawa yang terkandung di dalam ekstrak daun kamboja

jepang dan standar digitoksin yang diduga sebagai glikosida jantung. Hal ini

membuktikan bahwa kamboja jepang memiliki peluang untuk dikembangkan

secara kultur jaringan untuk menghasilkan kalus yang dapat berperan secara

fungsional menghasilkan senyawa golongan glikosida jantung yang mirip dengan

tanaman asalnya.


67

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. KESIMPULAN

Dari hasil penelitian pertumbuhan kalus daun tanaman kamboja jepang

dengan teknik kultur jaringan dapat diambil beberapa kesimpulan, yaitu :

1. Daun tanaman kamboja jepang dapat membentuk kalus dengan teknik

kultur jaringan menggunakan media Gamborg yang mengandung variasi

zat pengatur tumbuh 2,4-D dan FAP.

2. Profil pertumbuhan kalus daun tanaman kamboja jepang mengikuti kurva

sigmoid. Media Ga. II mengalami fase lag pada hari 0-18, fase

eksponensial pada hari 18-36, dan fase stasioner pada hari 36-42. Media

Ga. II mengalami fase lag pada hari 0-15, fase eksponensial pada hari 15-

36, dan fase stasioner pada hari 36-42.

3. Kalus daun tanaman kamboja jepang memiliki profil kromatografi lapis

tipis yang mirip dengan daun tanaman induknya.

B. SARAN

Dari penelitian ini, perlu dilakukan penelitian lanjutan tentang :

1. Perlu diadakan percobaan lanjutan tentang pengaruh variasi 2,4-D

terhadap kandungan glikosida jantung kalus daun kamboja Jepang secara

kuantitatif.

2. Perlu dilakukan percobaan lanjutan penanaman kamboja Jepang secara in

vitro sampai ke kultur suspensi sel.


68

3. Perlu dilakukan pemastian terhadap jenis metabolit glikosida steroid yang

dihasilkan.


69

DAFTAR PUSTAKA

Adnan, M., 1997, Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan, Ed. I, Penerbit Andi, Yogyakarta, hal 1-19.

Anonim, 1980, Materia Medika Indonesia , jilid IV, Depkes RI, XVI. Anonim, 2006, Adenium, http://en.wikipedia.org/wiki/Adenium, diakses pada

tanggal 27 November 2006. Anonim, 2006, Desert Rose Adenium obesum, http://davesgarden.com/pf, diakses

pada tanggal 22 November 2006. Atawodi, S.E., Bulus T.I.S., Ameh D.A., Nok Aj., Mamman M., Galadima M.,

2003, In vitro trypanocidal effect of methanolic extract of some Nigerian savannah plants, Afr.J.Biotechnol. 2(9): 317-321.

Beikram dan Andoko A., 2003, Mempercantik Penampilan Adenium, Agromedia

Pustaka, Solo, hal 2, 12, 13. Bruneton, J., 1999, Pharmacognosy Phytochemistry Madicinal Plant, 2nd edition,

terj. Caroline K. Hatton, Intercept Ltd., New York, p. 721-734. Dicosmo, F. and M. Misawa, 1995, Plant cell and tissue culture: Alternatives for

metabolit production, Biotechnol, Adv.13(3): 425-453. Dixon, R.A., 1985, Plant Cell Culture, A practical Approach, IRL Press, Oxford,

Washington DC, p.3-11 Doods, J.H. dan Roberts, L.W., 1985, Experiments in Plant Tissue Culture,

Cambridge University Press, Cambridge. Dwiatmaka, Y. dan Wulandari, E., 2005, Modul Praktikum Farmakognosi

Fitokimia, USD, Yogyakarta.

Farnsworth, N.R., 1966, Biological and Phytochemical Screening of Plants,

Journal Of Pharmaceutical Sciencis, Vol.55, No. 3., p.260-262. Freiburghaus F., Kaminsky R., Nkuna M.H.N., Brun R., 1996, Evaluation of

African medicinal for their in vitro trypanocidal activity, J.Ethnopharmacol. 55: 1-11.

George, E.F., and Sherrington, P.D.., 1984, Plant Propagation by Tissue Culture,

Eastern Press, Reading, p. 301-310.


70

Harborne, J.B., 1996, Metode Fitokimia : Penuntun cara modern menganalisis tumbuhan, terbitan kedua, ITB, Bandung, hal. 14-15, 147-156.

Helgeson and Deveral, 1983, Use of Tissue Culture and Protoplast in Plant

Pathology, Academic Press, Tokyo, p. 10-11. Hendaryono, D.P.S. dan Wijayani A., 1994, Teknik Kultur Jaringan, Kanisius,

Yogyakarta, hal. 18, 26-29, 59, 89-94. Jork,H., W. Funk, W. Fischer and H. Wimmer, 1990, Thin-Layer

Chromatography : Reagent and Detection Methods, Vol. 1a., Trans: Frank & Jennifer A. Hampson, VCH Publishers, New York, p. 430-433.

Katuuk, J.R.P., 1989, Teknik Kultur Jaringan Dalam Mikropropagasi Tanaman,

Depdikbud Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Jakarta, hal. 2-4, 90-94, 109.

Mgbojikwe, L.O. and Z.S.C. Okoye, 2001, Acaricidal Efficacy of the Aqueous

Stem Bark Extract of Adenium obesum on the Various Life Stages of Cattle Ticks, Nig.J.Exptl.Appl.Biol. Vol. 2, No. 1, pp. 39-43.

Misawa, M., 1994, Plant Tissue Culture; An Alternative for Production of Useful

Metabolite, Food and Agriculture Organization, Rome, p. 1-78.

Mulja, H.M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya, hal. 223-227.

Mursyidi, A., 1990, Analisis Metabolisme Sekunder, PAU Bioteknologi UGM,

Yogyakarta, hal 196-197. Nakamura, M., M. Ishibashi, E. Okuyama, T. Koyano, T. Kowithayakorn, M.

Hayashi and K. Komiyama, 2000, Cytotoxic Pregnanes from Leaves of Adenium obesum, Natural Medicines 54(3): 158-159.

Nugroho, A. dan Heru S., 2002, Pedoman Pelaksanaan Teknik Kultur Jaringan,

Penebar Swadaya, Jakarta, hal. 1, 15. Puspitasari, A. dan Soegihardjo, C.J., 2002, Optimasi Media Penumbuh Kalus

Sebagai Langkah Awal Upaya Budidaya In vitro Tanaman Vitex trifolia L., Majalah Farmasi Indonesia, hal. 21-25.

Ramachandra Rao, S. and G.A. Ravishankar, 2002, Plant cell cultures: Chemical

factories of secondary metabolites, Biotechnol, Adv 20:101-153.


71

Ramage, C. M. and Williams, R. R., 2002, Mineral nutrition and plant morphogenesis. In vitro Cellular and Developmental Biology—Plant, 38, 116–24.

Ranger, E., 1996, Herbal Gram, The Jurnal of The American Botanical Council,

http://www.herbalgram.org/youngliving/herbalgram/articleview.asp?a=64&p=Y, I. 36; p. 34 diakses pada tanggal 4 Oktober 2005.

Rhodes MCJ, Parr AJ, Ceielutt A, Aird ELH., 1994, Influence of exogenous

hormone on the growth and secondary metabolite formation in transformed root cultures. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 38 : 143-51

Robinson, Trevor, 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, terjemahan

Kosasih Padmawinata, edisi 6, ITB Press, Bandung, hal. 191-193. Salisbury, F.B. dan Cleon W.R., 1995, Fisiologi Tumbuhan, jilid 3, diterjemahkan

oleh Diah R., Lukman, dan Sumaryono, ITB, Bandung, hal. 15, 151-152. Samuelsson, G., 1999, Drugs of Natural Origin, 4th Ed., Swedish Pharmaceutical

Press, Sweden, p. 326. Santoso, U. dan Fatimah N., 2002, Kultur Jaringan Tanaman, cetakan pertama,

edisi pertama, Iniversitas Muhammadiyah, Malang, hal. 1-2, 9, 115-120. Sastrohamidjojo, H., 2001, Kromatografi, Laboratorium Analisis Kimia Fisika

Pusat UGM, Yogyakarta, hal. 26-36. Sastrohamidjojo, H., 2002, Kromatografi, Liberty, Yogyakarta, hal. 26-33. Stahl, E., 1969, Thin-Layer Chromatography-A Laboratory Handbook, Springer

International Student Edition, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, p. 33-34.

Stahl, E., 1973, Drug Analysis by Chromatography, diterjemahkan oleh

Padmawinata, K. dan Soediro, I., ITB-Press, Bandung, hal. 119-123. Stahl, E., 1985, Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, Penerbit

ITB, Bandung, hal. 114-117. Sudjadi, 1988, Metode Pemisahan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta Suryowinoto, M., 1992, Budidaya In vitro : Terobosan dalam Teknologi,

Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman, Fakultas Biologi UGM.


72

Taiz dan Zieyer, 1998, Taiz, L., and E. Zieger, !998, Plant Physiology, 2nd Edt., Sinauer Associates, Maschacusetts.

Thorpe, T.A., 1981, Requirements for a Tissue Culture Facility, Academic Press,

Tokyo. Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E.M., 1984, Plant Drug Analysis: A Thin Layer

Chromatography Atlas, (Transl: Scoot, Th.A.), Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York-Tokyo, p.195-223.

Wetherell, D.F., 1982, Pengantar Propagasi Tanaman Secara In Vitro,

diterjemahkan oleh dra. Koensoemardiyah S. Su., Apt., Avery Publishing Group Inc., USA, hal. 39-44.

Wie, T., 2006, Bibit, Media, Cuaca, dan Sinar Matahari pada Adenium,

http://www.kebonkembang.com/kebonkembang., diakses pada tanggal 22 November 2006.

Wijaya, M., 2007, Profil Pertumbuhan dan Analisis Kualitatif Glikosida Jantung

Kalus Daun Kamboja Jepang (Adenium obesum) Dalam Media MS Dengan Konsentrasi 2,4-Diklorofenoksiasetat Sebesar 4 ppm, Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta.

Yamauchi T. and Abe F., 1990, Cardiac glycosides and pregnanes from Adenium

obesum (studies on constituents of Adenium. I)., Chem Pharm Bull, 38 (3):669-72.

Yusnita, 2003, Kultur Jaringan : Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien,

cet. 1, Agromedia Pustaka, Jakarta, hal. 1-2, 14.


73

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul Profil Pertumbuhan dan Analisis Kualitatif

Glikosida Jantung Kalus Daun Kamboja Jepang (Adenium obesum) dalam

Media Gamborg dengan Variasi Konsentrasi 2,4 Diklorofenoksi Asetat dan

Furfuryl Amino Purine bernama Vicky Ariestya Chandra, dilahirkan di Kutoarjo

pada tanggal 11 April 1984. Penulis merupakan putra kedua dari pasangan

Chandra Heryadi dan Lucia Arinia Sutisna.

Penulis pernah menempuh pendidikan di TK Pius Bakti Utama Kutoarjo (1988-

1990), kemudian melanjutkan pendidikan di SD Pius Bakti Utama Kutoarjo

(1990-1996),

SMP Pius Bakti Utama (1996-1999), SMA Kolese De Britto Yogyakarta (1999-

2002), dan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta tahun 2002.

Selama studi di Fakultas Farmasi penulis pernah menjadi Koordinator Seksi

Perlengkapan pada Panitia Titrasi 2004, Koordinator Seksi Humas pada Panitia

Pharmacy Event Cup 2003, penulis juga aktif sebagai anggota UKF basket

Farmasi (2002-2006).


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - usd … · glikosida jantung kalus daun kamboja jepang...

Documents