seente geneetika ii - botany.ut.ee · pärmi mitokondriaalne genoom ehk ρ faktor. metsiktüüpi...
Post on 17-Oct-2020
1 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Seente geneetika II
Heidi Tamm6. märts 2007
Suguline paljunemineSeened mudelorganismidenaTetraadide analüüsKomplementatsiooni testS. cerevisiae genoomProteoomika
Suguline paljunemineEt saada maksimaalset kasu, peaksid ühinevate rakkude tuumad olema nii erinevad kui võimalikTsütoplasmad peaksid olema nii sarnased kui võimalik (et vältida geneetilist saastust)Vegetatiivne vs. seksuaalne kokkusobivus
Isane või emane?
ei ole võimalik eristada
seened on hermafrodiitsed
Vegetatiivne kokkusobivusHeterokaarüonid tekivad vaid samasse vegetatiivse kokkusobivuse gruppi kuuluvate hüüfide vahelKui hüüfid ei ole kokkusobivad, siis vahetult kontakteeruvad rakud surevad
Vegetatiivne kokkusobivus/sobimatus
Liitumise kokkusobimatus (fusionincompatibility) - kokkusobivussüsteem määrab ära rakkude võime liituda. (hallitusseentel)Liitumisejärgne kokkusobimatus (post-fusion…) – määrab ära, kas koos tsütoplasmaga saavad migreeruda ka tuumad jm. organellid
RistumissüsteemidOn määratud tuuma geenide poolt, mis takistavad kahe geneetiliselt identse mütseeli ristumist
Heterotallism – süsteem, kus on takistatud ristumine kahe identse gameedi vahel
Homotallism – kui miski ei takista identsete gameetide ristumist
Heterotallismanastomoos on võimalik ainult kahe erineva talluse vahel
90% kandseentest
Homotallismsuguline paljunemine saab toimuda ilma interaktsioonita kahe talluse vaheliseviljastumine
primaarne vs. sekundaarne homotallism
Primaarne homotallismidaneb ühetuumaline eos, moodustub kahetuumaline mütseel
tuumad on ühesugused
moodustuvad viljakehad
Sekundaarne homotallismkui peale meioosi satub ühte eosesse 2 tuuma
Ristumissüsteemid: unifaktoriaalneunifaktoriaalne ehk bipolaarneristumist kontrollib üks geen kahe alleeligaalleelide lahknemine meioosis tagab, et ühes eoses on vaid üks alleel.
Edukalt ristuvad vaid rakud, millel on ristumistüübi lookuses erinevad alleelid.erinevad alleelid.
Ristumissüsteemid: unifaktoriaalne
kui ühe viljakeha eostest kasvanud mütseele ristata omavahel, toimub dikaarüonide moodustumine 50% juhtudest
N. crassa, S. cerevisiae, Puccinia graminis35% kandseentest
Ristumissüsteemid: bifaktoriaalne
Kaks omaette ristumistüübi lookust (A ja B).Bifaktoriaalne
Edukaks ristumiseks on vaja erinevaidalleele mõlemas lookuses
Ristumissüsteemid: bifaktoriaalnePopulatsioonis võib olla palju erinevaid alleele kummagi lookuse kohta
55% kandseentel
AB Ab aB abAB
aBAb
ab
Kui ühe viljakeha eostest kasvanud mütseele ristata omavahel, toimub dikaarüonide moodustumine 25% juhtudest
Ristumisfaktorid: bifaktoriaalne“A” geen kodeerib homeodomääni valke (transkriptsioonifaktoreid)“B” geen kodeerib feromone ja nende retseptoreidkummalgi geenil on alamlookused
AB Ab aB abAB
aBAb
ab
Coprinus cinereus
Schizophyllum commune
S. cerevisiae ristumistüübi faktorid
2 ristumistüüpi: a ja αRistumistüüp määratud:
peptiidhormoonide (feromonide) poolt (α- ja a-faktorid)feromonispetsiifiliste retseptorite poolt
Kuidas ristumistüübi faktoridtoimivad?
Feromon seostub vastastüüpi raku pinnaloleva retseptoriga. Selle sündmusetagajärjed:
rakus algab aglutiniini tootmine, nii kleepuvadrakud kokkumõlema raku kasv peatub G1 faasismuutub rakuseina struktuur ja raku kuju
a-tüüpi rakkudes produtseeritakse:a-feromoniα-feromoni retseptorit
ja vastupidi
MAT lookusLookuses on 2 geeni (a1 ja a2 või α1 ja α2)MATa1 represseerib a-feromoni retseptorija α-feromoni sünteesiMATa2 funktsioon teadmataMATα1 aktiveerib a-feromoni retseptori jaα-feromoni sünteesiMATα2 represseerib α-feromoni retseptorija a-feromoni sünteesi
Kui tuumad on ühinenud:Diploidid on alati MAT lookuse suhtesheterosügootseda1 ja α2 valgud moodustavadheterodimeeri, mis aktiveerib meioosi jasporulatsiooni ja represseerib haploidsedfunktsioonid
Et asi oleks tõeliselt segane...Pärmi haploidsed rakud saavad omaristumistüüpi muutaKontrollib geen HO (endonukleaas)Dominantse alleeli korral toimub see pealeigat raku jagunemist
HML MAT HMR
(kott)seened mudelorganismidenaSaccharomyces cerevisiae Aspergillus nidulansSchizosaccharomyces pombeNeurospora crassa
Saccharomyces cerevisiae kuimudelorganism
EukarüootLihtne kasvatadaVäike genoom kergestimanipuleeritavKasvab kiirestiMutantide isoleerimiselihtsusHästidefineeritudgeneetiline süsteemRekombinatsioon kõrge sagedusega
Saccharomyces cerevisiae kuimudelorganism
Mitmekülgne DNA transformatsiooni süsteemNii haploidne kui ka diploidne faas stabiilneMittepatogeenneMetaboolsed jaregulatoorsedmehhanismid kõrgeltkonserveerunudInimeste haigustegaseotud geenide ortoloogid...
Pärm: milliseid protsesseuuritakse?
Geeniregulatsioonraku koostisosade biosünteesmRNA translatsioonvalkude post-translatsiooniline modifitseeriminevalkude sekreteerimine
mitokondri biogeneesvõõrgeenide ekspressioon
Pärm: mida uuritakse?Rakutsükli regulatsioonSignaaliülekande mehhanismidKromosoomi struktuurDNA replikatsioonGenoomika
Neurospora ja AspergillusHaploidne vegetatiivne faas ja haploidsed
koniidid -
seeneniidistiku fenotüübi järgi saame tehajäreldused genotüübi kohta
Neurospora
Aspergillus
Neurospora ja AspergillusIga eoskott sisaldab 8 eost
peale meioosi toimub mitoos2n tuuma iga üksik DNA ahel läheb üheeose tuuma
võimaldab algse DNA detailset analüüsiisegi heterodupleksi erinevused tulevad välja
(osaline erinevus kaksikheeliksi ahelates)
Magnaporthe griseaRiisi närbumistõve tekitaja (rice blast fungus)Genoomi suurus 40.3 Mb7 kromosoomi10% genoomist kordusjärjestused (> 200 bp)retrotransposoonidsagedane rekombinatsioon
Magnaporthe grisea
Magnaporthe grisearekombinatsioonide tõttu genoom muutliklooduses paljuneb mittesuguliseltgenoomi muutlikkus on seenele kasulik:
peremehespetsiifilisuse muutumine
kui kaotsi lähvad geenid, mis põhjustavad potentsiaalses peremehes kaitsereaktsioone
Seente transformatsioonKatsetatud paljudel seentelHead protokollid olemas üksikute jaoks:
SaccharomycesAspergillusNeurosporaUstilago
Mida on vaja transformatsiooni läbiviimiseks?
Vektor, milles meid huvitaval geenil on sobiv promootor ja terminaatorSeenerakud peavad olema kompetentsedSelektsioonisüsteem(Protoplastidest tuleb regenereerida mütseel)
Võimalused transformatsiooniksProtoplastTerve raku töötlemine Ca2+ ja Li+ ioonidegaElektroporatsioonGeenipüss (gene gun, particlebombardment)
YAC
N. crassa – tetraadide analüüsEoskotid kuikorrastatud tetraadid -alleelide kombinatsiooneostes vastab meioosi I ja II jagunemisele
meioos I - kahe(homoloogilise) kromosoomi lahkneminemeioos II - kahetütarkromatiidilahknemine
Tetraadide analüüsSaab jälgida rekombinatsiooni toimumist jakindlaks teha aheldatuse gruppeKottseened sobivad geenide meiootilisekskaardistamiseks Pärmil on eoskotis 4 eost, mis on ühemeioosi tulemusMitme alleeliga geenide aheldusLookuse asukoht tsentromeeri suhtes
Tetraadide analüüs tänapäevalEt kindlaks teha mutatsiooni, mis vastabkonkreetse lookuse muutmiseleEt konstrueerida uusi tüvesidEt kindlaks teha geenide interaktsioone
Erinevad tetraaditüübid. Ristati AB × ab
Eri tüüpide osakaal näitab, kas A ja B on aheldunud
AuksotroofidNeurospora crassa
Auksotroofsed mutandid, kes pole ühegeeni muteerumise tõttu võimelisedkasvama teatud söötmelKasv taastus, kui söötmele lisati ükskomponent
Esineb spetsiifiline sõltuvus konkreetse geeniprodukti ja metaboolse sammu vahel.
““ÜksÜks geengeen -- üksüks valkvalk” ” hüpoteeshüpotees
Auksotroofne organism sisaldab mutatsiooni, mis muudab organismi toitumisvajadusiPrototroof – metsiktüüpi organism muutmata toitumisvajadustega
Pärmi auksotroofsed markeridAminohapped
LeuHisTrp
NukleotiididUratsiilAdeniin
Mis on komplementatsioon?Kahe auksotroofi ristamisel saadud diploid on prototroof, kui defektid on erinevates lookustesAlleel, mis ühes haploidis on mutantne (retsessiivne), on teises haploidis funktsionaalne (dominantne)Mõlema haploidi wt alleelid kompenseerivad teise haploidi defektse alleeli
Mis on komplementatsioon?Kui defektid on samades lookustes, siis kahe auksotroofi ristamisel tekkiv diploid on auksotroof
Retsessiivne homosügootKa eri liikidelt pärit geenid võivad üksteist täiendada
Komplementatsiooni test
Haploidsete auksotroofide genotüüpide kindlakstegemiseksTundmatu genotüübiga haploid ristatakse teadaolevate genotüüpidega haploididega
peavad olema erineva ristumistüübiga
KomplementatsioonigrupidKui defektsete tüvede ristamisel ei toimu komplementatsiooni, kuuluvad nad samasse gruppiIga grupp esindab ühte ensüümi biokeemilises rajasSuuremahulised projektid võimaldavad identifitseerida kõik kompl. grupid => kõik geenid metaboolses rajas
Alati pole kõik nii ilus…Kahe lookuse suhtes heterosügootne diploid võib fenotüübilt olla ikkagi defektneAlleelne ehk geenisisene komplementatsioon – mutatsioonid on mõlemas tüves samas lookuses
Geenisisene komplementatsioonKui ensüüm koosneb kahest või rohkemast identsest subühikust
Kaks erinevalt defektset valku kompenseerivad teineteise vead
Kui ensüüm koosneb erinevatest domäänidest, mis täidavad erinevaid katalüütilisi funktsioonePärmis on tavaline
Kas siis ikkagi 1 või 2 lookust?Tetraadide analüüsRekombinatsiooni sagedus
väga madal => mutatsioonid samas lookuseskuni 25% => mutatsioonid erinevates lookustes
S. cerevisiae genoom sekveneeriti 1996Goffeau et al. 1996. Science 274: 546esimene täielikult sekveneeritud eukarüootnegenoom
Sekveneeritud seenedAscomycota
Saccharomyces cerevisiaestrain S288C 12
Saccharomyces cerevisiaestrain RM11-1a 12
Saccharomyces pastorianus 26Candida guilliermondii 12Candida lusitaniae 16Candida tropicalis 30Candida glabrata 12Ashbya gossypii 9Debaryomyces hansenii 10Kluyveromyces lactis 11Pichia stipitis 15Yarrowia lipolytica 21Schizosaccharomyces pombe 14Aspergillus nidulans 31Aspergillus fumigatus 32Aspergillus oryzae 37Aspergillus niger 37Chaetomium globosum 36Coccidioides immitis 29Nectria haematococca 52Fusarium graminearum 40Fusarium verticillioides 46
Mbp Magnaporthe grisea 40Neurospora crassa 43Stagonospora nodorum 37Trichoderma reesei 33Epichloë festucae 35
BasidiomycotaCoprinus cinereus 38Cryptococcus neoformans 20Ustilago maydis 20Phanerochaete chrysosporium 35
ZygomycotaRhizopus oryzae 40
MicrosporidiaEncephalitozoon cuniculi 2.5
Dictyosteliomycota (Protozoa)Dictyostelium discoideum 34
Oomycota (Chromista)Phytophthora ramorum 65Phytophthora sojae 95
S. cerevisiae genoom12 Mb (~200 korda väiksem inimesegenoomist, ~ 4 korda suurem E. coli genoomist)16 kromosoomiKromosoomide suurused 250-2500 kb~ 6000 ORF-iValke kodeerivad alad moodustavad 70% genoomist
S. cerevisiae genoom3.8% ORF-e sisaldab introneidJärjestikku ~ 120 rRNA geenide komplektikordust (XII kromosoomis)275 tRNA geeni51 Ty elementide koopiat(retrotransposoonid)
Schizosaccharomyces pombeGenoomi suurus 13.8 Mb3 kromosoomiPooldub, mitte ei punguKasutatakse raku kasvamise ja jagunemise uurimiseks
Genome Inventory (as of Apr 12, 2005)
Nuclear genome
Mitochondrial genome (Q)
Total ORFs 6591 6563 28Verified ORFs 4292 4275 17
Uncharacterized ORFs 1481 1479 2Dubious ORFs 818 809 9
Long_terminal_repeat 382 382 0tRNA 299 275 24
Transposable_element_genes 89 89 0ARS 82 82 0
snoRNA 68 68 0Retrotransposon 50 50 0
Telomere 32 32 0X_element_core_sequence 32 32 0
Telomeric_repeat 31 31 0X_element_combinatorial_repea 28 28 0
rRNA 27 25 2Pseudogenes 21 21 0
Y'_element 19 19 0Centromere 16 16 0
ncRNA 10 9 1snRNA 6 6 0Total 7783 7728 55
Sequence length (bp) 12,156,590 12,070,811 85,779
Feature Type Total
Genome Inventory (as of Apr 09, 2006)
Feature Type Total Nuclear genome
Mitochondrial genome (Q)
Total ORFs 6603 6575 28 Verified ORFs 4385 4368 17 Uncharacterized ORFs 1396 1394 2 Dubious ORFs 822 813 9 Long_terminal_repeat 382 382 0 tRNA 299 275 24 Transposable_element_genes 89 89 0 ARS 85 85 0 snoRNA 75 75 0 Retrotransposon 50 50 0 Telomere 32 32 0 X_element_core_sequence 32 32 0 Telomeric_repeat 31 31 0 X_element_combinatorial_repeats 28 28 0 rRNA 27 25 2 Pseudogenes 21 21 0 Y'_element 19 19 0 Centromere 16 16 0 ncRNA 9 8 1 snRNA 6 6 0 Total 7804 7749 55 Chromosome length (bp) 12,156,599 12,070,820 85,779
Genome Inventory as of Mar 05, 2007
Feature Type TotalNuclear genome
Mitochondrial genome(Q)
Total ORFs 6604 6576 28Verified ORFs 4534 4517 17Uncharacterized ORFs 1254 1252 2Dubious ORFs 816 807 9Long_terminal_repeat 382 382 0tRNA 299 275 24ARS 266 266 0Transposable_element_genes 89 89 0snoRNA 76 76 0Retrotransposon 50 50 0Telomere 32 32 0X_element_core_sequence 32 32 0Telomeric_repeat 31 31 0X_element_combinatorial_repea 28 28 0rRNA 27 25 2Pseudogenes 21 21 0Y'_element 19 19 0Centromere 16 16 0ncRNA 10 9 1snRNA 6 6 0Total 7988 7933 55Chromosome length (bp) 12,156,678 12,070,899 85,779
S. cerevisiae valke kodeerivad geenid
S. cerevisiaegeeniproduktide jaotus vastavalt bioloogilistele protsessidele
S. cerevisiae kromosomaalsete geenide nomenklatuur
Gene symbol DefinitionARG+ All wild-type alleles controlling arginine
requirementARG2 A locus or dominant allelearg2 A locus or recessive allele confering an arginine
requirementarg2– Any arg2 allele confering an arginine
requirementARG2+ The wild-type allelearg2-9 A specific allele or mutationArg+ A strain not requiring arginineArg– A strain requiring arginineArg2p The protein encoded by ARG2
S. cerevisiae mitokonderMitokondris leiab aset suur hulk biokeemilisi reaktsiooneOksüdatiivse fosforüleerimise teelprodutseeritakse ATP ja NAD+
Pärmid on fakultatiivsedfakultatiivsed anaeroobidanaeroobid, mistähendab, et nad saavad hakkama ka ilmamolekulaarse hapnikuta => võivadvõivad eladaeladailmailma funktsionaalsefunktsionaalse hingamisahelatahingamisahelata
Pärmi elu ilma hingamataEeldab sobivat süsinikuallikat (suhkrud)ATP süntees glükolüüsi ja kääritamisekäigusRakud kasvavad aeglaselt, kolooniad on väikesedKääritataval söötmel kasvab ka siis, kuimtDNA on mutantne või puudub üldse
Pärmi mitokondriaalne genoomSuurus ~ 80 kb (inimesel 16.5 kb)Lineaarne!Ühes haploidses pärmirakus ~ 50 mtDNAkoopiatKodeerib hingamisahela ensüümeÜlejäänud valgud kodeerib tuuma genoomTsütoplasmaatiline pärilikkus
Pärmi mitokondriaalne genoomehk ρ faktor
Metsiktüüpi pärmirakud (‘grande’), mis hingavadnormaalselt ja moodustavad suuri kolooniaid, on ρ+
‘Petite’ mutandid ei ole võimelised hingama janad moodustavad fermenteeritaval söötmel väikesikolooniaid
ρ0 rakkudel puudub mtDNA üldseρ- rakkudel esineb mtDNA, mis on moodustunud wt mitokondriaalse genoomi üksikutest fragmentidest, misesinevad paljude kordustena
‘petite’ - mutandidSaab eristada, ristates neid wt rakkudegaρ0 rakud annavad wt (‘grande’) järglased
keskmiselt supressiivsete ρ- rakkude järglasedon pooled ‘grande’ ja pooled ‘petite’
hüpersupressiivsete ρ- (HS) rakkude järglasedon peaaegu kõik ‘petite’
ρ- mtDNASisaldab wt mtDNA üksikuid fragmente, mis esinevad paljude kordustena
HS ρ- mutantidel on selliseks fragmendiksarvatavasti replikatsiooni alguskoht (ori)
Pärm ja genoomiuuringudDNA kiipide kasutamine transkriptoomiuurimiseksGeeni funktsioonide analüüs geenikatkestamise teelValkude lokalisatsiooni analüüs2D protein mapsEnsümaatilise aktiivsuse analüüsValk-valk interaktsioonide analüüs
Pärmid ja proteoomikaGeenijärjestuste analüüs vs. valkude analüüsValgud ei tegutse tavaliselt üksindaValgukomplekside analüüs
Pärmi proteoomi 2D-kaart
Kuidas analüüsida valk-valk interaktsioone?
Pärmi kaksikhübriidsüsteemmRNA sünekspressioonGeneetilised interaktsioonid ehk sünteetiline letaalsusIn silico meetodidValgukomplekside afiinsuspuhastamine + mass-spektromeetria
Pärmi kaksikhübriidsüsteemTranskriptsioonifaktor koosneb DNA-ga seonduvast domäänist ja aktivatsioonidomäänistDomäänid on eraldatud ja liidetud 2 uuritava ORF-igaPärmis ekspresseeruvad liitvalgud
Afiinsuspuhastamine ja mass-spektromeetria
Valkudele liidetakse peptiidne märgisAfiinsuskromatograafiaValk kui sööt terve kompleksi väljapuhastamiseksIdentifitseerimine mass-spektromeetria abil
TAP – tandem affinity purification
C-terminaalse TAP-märgise skeem. CBP – kalmoduliiniga seostuv peptiid, TEV – TEV proteaasilõikesait, ProtA - Staphylococcus aureus'e proteiin A
top related