resistensbestämning enligt eucast...
Post on 14-Aug-2020
6 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Resistensbestämning
enligt EUCAST
lappdiffusionsmetod
Version 5.0
Februari 2015
EUCAST 2015 Version 5.0 2
Innehåll
• Media
• Inokulatberedning
• Inokulering av plattor
• Antibiotikalappar
• Inkubering
• Avläsning
• Tolkning
• Kvalitetskontroll
• Felsökning
Ändringar i bildspelet om EUCAST lappdiffusionsmetod
Version Ändringar
Version 5.0
Februari 2015
• Information om förlängd inkubering för glykopeptider och enterokocker
tillagt på bild 20.
• E. coli ATCC 35218 flyttad till rutinmässig kvalitetskontroll. Tryckfel för
DSM-nummer korrigerat på bild 31.
• Kommentar om att H. influenzae NCTC 8468 ska utgå, tillagt på bild 32.
• H. influenzae ATCC 49766 tillagd som kvalitetskontrollstam på bild 32.
• Tryckfel för ATCC-nummer för E. faecalis ATCC 51299 korrigerat på bild
33.
Version 4.0
Augusti 2014
• Corynebacterium spp. tillagt på bild 7 och 20.
• Förtydligande angående förvaring och hantering av agarplattor på bild 10.
Version 3.0
Maj 2013
• Förtydligande angående defibrinerat hästblod och β-NAD på bild 5.
• Pasteurella multocida, Campylobacter jejuni och coli tillagt på bild 6 och
19.
• Förtydligande angående selektion av kolonier för lappdiffusion på bild 11
och 12.
• Förtydligande angående agarplattor på bild 13.
• Ändring av glykopeptider till vankomycin för Enterococcus spp. på bild 26.
• Ändring av Staphylococcus spp. till S. aureus för bensylpenicillin på bild
27.
• Tillägg av länk för kvalitetskontrollstammar med specifika
resistensmekanismer på bild 29.
• Campylobacter jejuni ATCC 33560 tillagd på bild 30.
• DSM- och CCUG-nummer tillagt för E. faecalis ATCC 51299 på bild 31.
EUCAST 2015 Version 5.0 3
Ändringar i bildspelet om EUCAST lappdiffusionsmetod
Version Ändringar
Version 2.1
Januari 2012
• Ny terminologi (Streptokocker viridansgruppen) och tillägg av Listeria
monocytogenes på bild 6 och 19.
• Förtydligande angående agardjup på bild 7.
• Förtydligande angående avläsning av zoner på bild 23 och 25.
• Tillägg av undantag vid avläsning av zoner på bild 27.
• Tillägg av spanska stamkollektionsnummer på bild 30 och 31.
• Tillägg av K. pneumoniae ATCC 700603 och E. faecalis ATCC 51299 på
bild 31.
Version 1.0
December 2009
• Bildspelet om EUCAST lappdiffusionsmetod publiceras för första gången
på EUCAST hemsida i engelsk version.
EUCAST 2015 Version 5.0 4
EUCAST 2015 Version 5.0 5
Media
EUCAST 2015 Version 5.0 6
Media
• Använd endast Mueller Hintonagar (MH)
• För krävande organismer används MH-F (Mueller Hinton-
Fastidious), dvs MH med tillsats av 5% hästblod
(mekaniskt defibrinerat) och 20 mg/L β-NAD.
• Använd β-NAD (Nikotinamid Adenin Dinukleotid) med en
renhet på ≥ 98%.
EUCAST 2015 Version 5.0 7
Media för olika organismer Organismer Medium
Enterobacteriaceae
Pseudomonas spp.
Stenotrophomonas maltophilia
Acinetobacter spp.
Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.
Mueller Hintonagar
Streptococcus pneumoniae
Streptokocker grupp A, B, C och G
Streptokocker viridansgruppen
Haemophilus spp.
Moraxella catarrhalis
Listeria monocytogenes
Pasteurella multocida
Campylobacter jejuni och coli
Corynebacterium spp.
Mueller Hintonagar + 5% defibrinerat
hästblod + 20 mg/L β-NAD (MH-F)
Övriga krävande organismer Ej klart
EUCAST 2015 Version 5.0 8
Egen tillverkning av agarplattor
• Tillverka MH-plattor enligt tillverkarens instruktioner.
• Låt agarn svalna till 42-45°C innan blod eller β-NAD tillsätts, blanda väl och dispensera plattorna omedelbart.
• Dispensera plattorna på en plan yta för att få ett jämnt djup på 4.0 ± 0.5 mm. Om upprepade mätningar ger ett agardjup över eller under 4 mm, justera volymen även om agardjupet är inom 3.5-4.5 mm.
Vanligt förekommande storlekar på Petriskålar är 90 mm (~25 ml), 100 mm (~31 ml), 150 mm (~71 ml) och kvadratiska 100 mm (~40
ml).
9
Kvalitetskontroll av Mueller
Hintonagar
Kontrollera att alla batcher av Mueller Hinton hamnar inom QC-gränserna för alla relevanta kombinationer av bakterier och antibiotika.
Observera:
– P. aeruginosa ATCC 27853 och aminoglykosider:
Zoner utanför QC-intervallet indikerar för höga eller låga koncentrationer av divalenta katjoner i agarn.
– E. faecalis ATCC 29212 och trimetoprim/trim-sulfa:
För små zoner eller växt in till lappen indikerar för höga halter av tymin och tymidin i agarn.
EUCAST 2015 Version 5.0
EUCAST 2015 Version 5.0 10
Torkning och förvaring av agarplattor
• Agarplattor ska förvaras vid 4-10°C.
• Torkning, förvaring och hållbarhet hos egentillverkade agarplattor
kan variera beroende på lokala förhållanden (temperatur, fukthalt
mm).
• Köpta agarplattor ska förvaras enligt tillverkarens rekommendationer
och användas innan utgångsdatum.
• MH-F plattor som förvaras i plastpåse eller annan försluten
förpackning kan behöva torkas före användning. På detta sätt
undviks fukt som annars kan ge problem med otydliga zonkanter
och/eller dimma i zon.
• Agarplattorna ska vara rumstempererade vid inokulering. Det ska
inte finnas vattendroppar på agarytan, men plattorna ska inte heller
vara för torra.
EUCAST 2015 Version 5.0 11
Inokulat
• Inokulatet ska motsvara
grumligheten hos en
McFarland 0.5-standard*.
* Motsvarar ungefär
1-2 x 108 CFU/mL för E. coli.
EUCAST 2015 Version 5.0 12
Plocka isolerade kolonier från en övernatts-
kultur på icke selektivt medium
EUCAST 2015 Version 5.0 13
Inokulatberedning
• Plocka om möjligt flera morfologiskt lika kolonier för att undvika att välja en atypisk variant.
• Slamma kolonierna i 0.85% NaCl till en homogen lösning som motsvarar en McFarland 0.5-standard.
– Undantag: Streptococcus pneumoniae slammas till
McFarland 0.5 från en blodplatta, men till McFarland
1.0 från en chokladplatta.
• Justera grumligheten genom att tillsätta mer bakterier
eller NaCl till slamningen. Mät gärna till McFarland 0.5
med en densitometer.
EUCAST 2015 Version 5.0 14
Inokulering av plattor • Använd helst inokulatet inom 15 minuter från slamning och
alltid inom 60 minuter.
• Doppa en bomullspinne i slamningen och tryck bort överflödig vätska mot insidan av röret.
• Se till att agarplattorna är rumstempererade.
• Sprid inokulatet jämnt över hela agarytan, antingen för hand i tre riktningar eller med hjälp av en rotator.
EUCAST 2015 Version 5.0 15
Undvik överinokulering
• Det är viktigt att inte överinokulera plattorna så att växten
blir för tjockt.
• Kontrollera att zonerna för kontrollstammarna hamnar
inom rekommenderade QC-intervall. För tjockt inokulat
kan resultera i för små zoner.
• Tryck bort överflödig vätska genom att försiktigt pressa
bomullspinnen mot insidan av röret innan inokulatet
sprids ut (undvik dock en alltför torr bommullspinne för
grampositiva organismer).
EUCAST 2015 Version 5.0 16
Förvaring av antibiotikalappar
• Förvara lager av antibiotikalappar enligt tillverkarens rekommendationer.
• Lappar som är i bruk förvaras mörkt vid 4-8°C i förslutna behållare med torkmedel.
• Låt behållarna nå rumstemperatur innan de öppnas för att undvika kondensation på lapparna. Det är bättre att förvara antibiotikalapparna i rumstemperatur under dagen än att flytta dem in och ut ur kylen upprepade gånger.
• Använd inte antibiotikalappar som har passerat utgångsdatum (se förpackningen).
EUCAST 2015 Version 5.0 17
Applicering av antibiotikalappar
• Antibiotikalapparna ska appliceras
inom 15 minuter från att plattorna
inokulerats.
• Lapparna ska ligga plant på ytan
av mediet.
• Lapparna ska vara fördelade så att
zonerna inte överlappar varandra.
Överlappande zoner försvårar
avläsningen och kan ge
interaktioner mellan olika
antibiotika.
EUCAST 2015 Version 5.0 18
Sammanfattning Inokulering
• Slamma isolerade kolonier plockade från en icke-selektiv agarplatta som är inkuberad över natten.
• Justera till McFarland 0.5, gärna med en densitometer. Använd helst inokulatet inom 15 minuter.
• Doppa en steril bommullspinne i slamningen och tryck bort överflödig vätska mot insidan av röret.
• Sprid ut inokulatet jämnt över hela agarytan.
• Applicera antibiotikalappar inom 15 minuter från inokulering och påbörja inkubering av plattorna inom ytterligare 15 minuter.
19
Inkubering
• Vänd plattorna upp-och-ned och påbörja inkubering
inom 15 minuter från att antibiotikalapparna har
applicerats. Detta förhindrar prediffusion, vilket annars
kan resultera i för stora zoner.
• Inkubera plattorna i så små staplar som möjligt för att
undvika ojämn uppvärmning, vilket kan påverka
zonstorlekarna (beroende på inkubatorns effektivitet).
• MH inkuberas i luft och MH-F i luft med 4-6% CO2.
EUCAST 2015 Version 5.0
EUCAST 2015 Version 5.0 20
Inkubering Organism Inkubering
Enterobacteriaceae 35±1 ºC i luft 16-20 h
Pseudomonas spp. 35±1 ºC i luft 16-20 h
Stenotrophomonas maltophilia 35±1 ºC i luft 16-20 h
Acinetobacter spp. 35±1 ºC i luft 16-20 h
Staphylococcus spp. 35±1 ºC i luft 16-20 h
Enterococcus spp. 35±1 ºC i luft 16-20 h (24 h för glykopeptider)
Streptokocker grupp A, B, C och G 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h
Streptokocker viridansgruppen 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h
Streptococcus pneumoniae 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h
Haemophilus spp. 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h
Moraxella catarrhalis 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h
Listeria monocytogenes 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h
Pasteurella multocida 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h
Campylobacter jejuni och coli 41±1 ºC i mikroaerob miljö 24 h (40-48h)
Corynebacterium spp. 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h (40-48h)
Övriga krävande organismer Ej klart
Observera:
• Använd helst inokulatet inom 15 minuter från slamning
och alltid inom 60 minuter.
• Applicera antibiotikalappar inom 15 minuter från att
plattorna inokulerats.
• Påbörja inkubering inom 15 minuter från att
antibiotikalapparna applicerats.
EUCAST 2015 Version 5.0 21
15-15-15 minutersregeln
EUCAST 2015 Version 5.0 22
Undersökning av plattor efter
inkubering
• Växten ska vara konfluerande.
• Det är viktigt att växten är jämn för att få fina zonkanter
(se exempel på nästa bild).
• Om enskilda kolonier syns är inokulatet för tunt och
resistensbestämningen måste göras om.
EUCAST 2015 Version 5.0 23
Växten ska vara jämn och konfluerande
…så här! ...men inte så här!
• Håll plattan på ca 30 cm avstånd, ta hänsyn till all växt
som syns med blotta ögat och läs zonerna där växten
slutar.
EUCAST 2015 Version 5.0 24
Avläsning
E. coli
Ciprofloxacin
S. aureus
Erytromycin
S. pneumoniae
Rifampicin
Exempel:
KNS
Trimetoprim
EUCAST 2015 Version 5.0 25
Avläsning
• MH
– Mät zoner från
baksidan mot en mörk
bakgrund med
belysning mot plattan
• MH-F
– Mät zoner från
ovansidan utan lock
med belysning mot
plattan
EUCAST 2015 Version 5.0 26
Avläsning
• Håll inte upp plattan mot ljuset och använd inte
förstoringsglas (se undantag nedan).
• Mät zonerna med skjutmått, linjal eller med en
automatisk zonavläsare.
• Om enskilda kolonier växer in i zonen, kontrollera om det
är en kontamination och upprepa resistensbestämningen
vid behov.
EUCAST 2015 Version 5.0 27
Avläsning – undantag (1)
Organism Antibiotika Avläsning
Proteus spp. Alla Bortse från svärmning.
Streptococcus spp. Alla Läs där växten slutar och inte där
hemolysen slutar.
Alla Trimetoprim
Trimetoprim-sulfametoxazol
Bortse från en tunn hinna av växt
in till lappen i en i övrigt tydlig
zon.
Staphylococcus spp. Linezolid Håll upp plattan mot ljuset och
undersök zonen.
Enterococcus spp. Vankomycin Håll upp plattan mot ljuset och
undersök zonen.
Enterobacteriaceae Ampicillin Bortse från tunn inväxt i form av
en inre zon som kan uppstå med
viss Mueller Hintonagar.
EUCAST 2015 Version 5.0 28
Avläsning – undantag (2)
Organism Antibiotika Avläsning
E. coli Mecillinam Bortse från isolerade kolonier i
zonen.
S. aureus Bensylpenicillin Håll upp plattan mot ljuset och
undersök zonkanten noggrant.
Staphylococcus spp. Cefoxitin Undersök zonen noggrant för att
detektera ev. kolonier i zonen.
EUCAST 2015 Version 5.0 29
Tolkning
• Kontrollera att zonerna för kontrollstammarna hamnar
inom angivna QC-intervall innan resultaten tolkas.
• Uppmätta zondiametrar (avrundade till närmsta
millimeter) tolkas till S, I och R enligt publicerade
brytpunktstabeller (www.eucast.org eller
www.nordicast.org). Alternativt kan mallar med EUCAST
brytpunkter användas.
EUCAST 2015 Version 5.0 30
Kvalitetskontroll
• Använd rekommenderade kvalitetskontrollstammar i laboratoriets rutinmässiga arbete (se EUCAST QC Tables).
• Kvalitetskontrollstammar med definierade resistensmekanismer kan användas för att detektera specifika resistensmekanismer (se EUCAST QC Tables).
• Kvalitetskontrollstammar kan köpas från stamkollektioner eller vissa leverantörer av material för resistens-bestämning.
EUCAST 2015 Version 5.0
EUCAST kvalitetskontrollstammar
31
Organism Stamkollektionsnummer Egenskaper
E. coli ATCC 25922; NCTC 12241
CIP 7624; DSM 1103
CCUG 17620; CECT 434
Känslig, vildtyp
E. coli
ATCC 35218; NCTC 11954
CIP 102181; DSM 5923
CCUG 30600; CECT 943
TEM-1 β-laktamas-
producerande
P. aeruginosa ATCC 27853; NCTC 12903
CIP 76110; DSM 1117
CCUG 17619; CECT 108
Känslig, vildtyp
S. aureus ATCC 29213; NCTC 12973
CIP 103429; DSM 2569
CCUG 15915; CECT 794
Svagt β-laktamas-
producerande
E. faecalis ATCC 29212; NCTC 12697
CIP 103214; DSM 2570
CCUG 9997; CECT 795
Känslig, vildtyp
EUCAST 2015 Version 5.0
EUCAST kvalitetskontrollstammar
32
Organism Stamkollektionsnummer Egenskaper
S. pneumoniae ATCC 49619; NCTC 12977
CIP 104340; DSM 11967
CCUG 33638
Nedsatt känslighet för
bensylpenicillin
H. influenzae NCTC 8468*; CIP5494
CCUG 23946
Känslig, vildtyp
H. influenzae ATCC 49766; NCTC 12975
CIP 103570; DSM 11970
CCUG 29539
Känslig, vildtyp
Campylobacter
jejuni
ATCC 33560; NCTC 11351;
CIP 702; DSM 4688
CCUG 11284
Känslig, vildtyp
* H. influenzae NCTC 8468 har en ovanlig morfologi och kommer att utgå
2016.
EUCAST 2015 Version 5.0 33
Kontrollstammar för detektion av specifika
resistensmekanismer
Organism Stamkollektionsnummer Egenskaper
K. pneumoniae ATCC 700603; NCTC 13368
CCUG 45421; CECT 7787
ESBL-producerande
(SHV-18)
S. aureus NCTC 12493 Oxacillin-heteroresistent,
mecA-positiv
E. faecalis
ATCC 51299; NCTC 13379
CIP 104676; DSM 12956
CCUG 34289
Höggradigt aminoglykosid-
resistent (HLAR) och
vankomycinresistent
(vanB positiv)
H. influenzae
ATCC 49247; NCTC 12699
CIP 104604; DSM 9999
CCUG 26214
β-laktamasnegativ,
ampicillin-resistent
(BLNAR)
Stamkollektioner
ATCC: American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD
20852, USA.
NCTC: National Collection of Type Cultures, Health Protection Agency Centre
for Infections, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, Storbritannien.
CIP: Collection de Institut Pasteur, 25–28 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris
Cedex 15, Frankrike.
DSMZ: Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen,
Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Tyskland.
CCUG: The Culture Collection University of Gothenburg, Sverige.
CECT: Colección Española de Cultivos Tipo, Universidad de Valencia, 46100
Burjassot, Valencia, Spanien.
EUCAST 2015 Version 5.0 34
EUCAST 2015 Version 5.0 35
Rutinmässig kvalitetskontroll
• Kvalitetskontroll bör utföras dagligen, särskilt för antibiotika som används rutinmässigt.
• Kvalitetskontrollen skall alltid läsas och bedömas innan de kliniska isolaten läses.
• Bedömningen görs på resultaten från de senaste 20 konsekutiva mätningarna.
• Var uppmärksam på trender och på zoner som upprepade gånger hamnar över eller under målvärdet.
• Om två eller fler av 20 mätningar ligger utanför intervallet krävs felsökning.
EUCAST 2015 Version 5.0 36
Övervakning av QC-resultat
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Dag
Zo
nd
iam
ete
r (
mm
)
Målvärde
Övre gränsvärde
Nedre gränsvärde
Enstaka mätningar
utanför QC-intervallet
Alla mätningar inom
intervallet men på
samma sida om
målvärdet.
Konsekutiva
mätningar utanför
intervallet på samma
sida om målvärdet.
EUCAST 2015 Version 5.0 37
Åtgärder vid avvikande QC-resultat
• Om två ickekonsekutiva mätningar av 20 hamnar utanför QC-
intervallet – rapportera resultaten från resistensbestämningen, men
gör felsökning.
• Om två konsekutiva mätningar av 20 hamnar utanför QC- intervallet
– gör felsökning innan resultaten rapporteras.
Resistensbestämningen kan behöva göras om.
• Om flera antibiotikalappar (>2) ligger utanför respektive QC-intervall
samma dag – gör felsökning innan resultaten rapporteras.
Resistensbestämningen kan behöva göras om.
• Om en kontrollstam med specifika resistensmekanismer inte
uppvisar resistens – svara inte ut resultaten, undersök och gör om
resistensbestämningen.
EUCAST 2015 Version 5.0 38
Hantering av kontrollstammar
• Förvara kontrollstammarna vid -70 °C på keramiska pärlor/kulor i små portioner. Se till att ha minst ett ”arkivrör” och flera ”bruksrör” i frysen. Alternativ förvaring är frystorkat material eller kommersiellt tillgängliga produkter.
• Från ett bruksrör görs varje vecka en ”veckoplatta” på icke-selektivt medium.
• Från ”veckoplattan” stryks varje dag en färsk platta som används till morgondagens kvalitetskontroll.
• Endast för krävande organismer får man använda seriell omstrykning av den dagliga färska plattan.
EUCAST 2015 Version 5.0 39
Potentiella felkällor (1)
Medium
Förvaring av plattor
Ej följt instruktioner vid tillverkning av plattor
Variation mellan batcher eller byte av leverantör
Tillsatser (variation mellan batcher, fel mängd eller
passerat utgångsdatum)
pH
Agardjup/Agarvolym
Passerat utgångsdatum
Test-
förhållanden
Ej följt “15-15-15”-minutersregeln (använd slamning inom
15 min, applicera lappar inom 15 min, inkubera inom 15
min)
Inkubering (temperatur, miljö och tid)
Felaktig inokulering (för tjockt, tunt eller ojämnt inokulat)
Avläsning med fel belysning eller bakgrund
Avläsning av zoner
Potentiella felkällor (2)
Antibiotika-
lappar
Fel antibiotikalapp (fel antibiotika eller fel lappstyrka)
Antibiotikainnehåll (felaktig förvaring, känsliga antibiotika,
passerat utgångsdatum)
Lapparna inte rumstempererade när behållaren öppnats
För många lappar på plattan (interaktion mellan lappar)
Kontroll-
stammar
Fel kvalitetskontrollstam
Mutation
Kontamination
För gammal kultur
EUCAST 2015 Version 5.0 40
EUCAST 2015 Version 5.0 41
EUCAST hemsida
• Följ regelbundet uppdateringar i metodologi, QC-tabeller och brytpunktstabeller på EUCAST hemsida
www.eucast.org
• Vid eventuella frågor kontakta erika.matuschek@escmid.org eller EUCAST sekretariat (se hemsida).
top related