resistensbestämning enligt eucast...

Resistensbestämning

enligt EUCAST

lappdiffusionsmetod

Version 5.0

Februari 2015

EUCAST 2015 Version 5.0 2

Innehåll

• Media

• Inokulatberedning

• Inokulering av plattor

• Antibiotikalappar

• Inkubering

• Avläsning

• Tolkning

• Kvalitetskontroll

• Felsökning

Ändringar i bildspelet om EUCAST lappdiffusionsmetod

Version Ändringar

Version 5.0

Februari 2015

• Information om förlängd inkubering för glykopeptider och enterokocker

tillagt på bild 20.

• E. coli ATCC 35218 flyttad till rutinmässig kvalitetskontroll. Tryckfel för

DSM-nummer korrigerat på bild 31.

• Kommentar om att H. influenzae NCTC 8468 ska utgå, tillagt på bild 32.

• H. influenzae ATCC 49766 tillagd som kvalitetskontrollstam på bild 32.

• Tryckfel för ATCC-nummer för E. faecalis ATCC 51299 korrigerat på bild

33.

Version 4.0

Augusti 2014

• Corynebacterium spp. tillagt på bild 7 och 20.

• Förtydligande angående förvaring och hantering av agarplattor på bild 10.

Version 3.0

Maj 2013

• Förtydligande angående defibrinerat hästblod och β-NAD på bild 5.

• Pasteurella multocida, Campylobacter jejuni och coli tillagt på bild 6 och

19.

• Förtydligande angående selektion av kolonier för lappdiffusion på bild 11

och 12.

• Förtydligande angående agarplattor på bild 13.

• Ändring av glykopeptider till vankomycin för Enterococcus spp. på bild 26.

• Ändring av Staphylococcus spp. till S. aureus för bensylpenicillin på bild

27.

• Tillägg av länk för kvalitetskontrollstammar med specifika

resistensmekanismer på bild 29.

• Campylobacter jejuni ATCC 33560 tillagd på bild 30.

• DSM- och CCUG-nummer tillagt för E. faecalis ATCC 51299 på bild 31.


Ändringar i bildspelet om EUCAST lappdiffusionsmetod

Version Ändringar

Version 2.1

Januari 2012

• Ny terminologi (Streptokocker viridansgruppen) och tillägg av Listeria

monocytogenes på bild 6 och 19.

• Förtydligande angående agardjup på bild 7.

• Förtydligande angående avläsning av zoner på bild 23 och 25.

• Tillägg av undantag vid avläsning av zoner på bild 27.

• Tillägg av spanska stamkollektionsnummer på bild 30 och 31.

• Tillägg av K. pneumoniae ATCC 700603 och E. faecalis ATCC 51299 på

bild 31.

Version 1.0

December 2009

• Bildspelet om EUCAST lappdiffusionsmetod publiceras för första gången

på EUCAST hemsida i engelsk version.



Media


Media

• Använd endast Mueller Hintonagar (MH)

• För krävande organismer används MH-F (Mueller Hinton-

Fastidious), dvs MH med tillsats av 5% hästblod

(mekaniskt defibrinerat) och 20 mg/L β-NAD.

• Använd β-NAD (Nikotinamid Adenin Dinukleotid) med en

renhet på ≥ 98%.


Media för olika organismer Organismer Medium

Enterobacteriaceae

Pseudomonas spp.

Stenotrophomonas maltophilia

Acinetobacter spp.

Staphylococcus spp.

Enterococcus spp.

Mueller Hintonagar

Streptococcus pneumoniae

Streptokocker grupp A, B, C och G

Streptokocker viridansgruppen

Haemophilus spp.

Moraxella catarrhalis

Listeria monocytogenes

Pasteurella multocida

Campylobacter jejuni och coli

Corynebacterium spp.

Mueller Hintonagar + 5% defibrinerat

hästblod + 20 mg/L β-NAD (MH-F)

Övriga krävande organismer Ej klart


Egen tillverkning av agarplattor

• Tillverka MH-plattor enligt tillverkarens instruktioner.

• Låt agarn svalna till 42-45°C innan blod eller β-NAD tillsätts, blanda väl och dispensera plattorna omedelbart.

• Dispensera plattorna på en plan yta för att få ett jämnt djup på 4.0 ± 0.5 mm. Om upprepade mätningar ger ett agardjup över eller under 4 mm, justera volymen även om agardjupet är inom 3.5-4.5 mm.

Vanligt förekommande storlekar på Petriskålar är 90 mm (~25 ml), 100 mm (~31 ml), 150 mm (~71 ml) och kvadratiska 100 mm (~40

ml).

9

Kvalitetskontroll av Mueller

Hintonagar

Kontrollera att alla batcher av Mueller Hinton hamnar inom QC-gränserna för alla relevanta kombinationer av bakterier och antibiotika.

Observera:

– P. aeruginosa ATCC 27853 och aminoglykosider:

Zoner utanför QC-intervallet indikerar för höga eller låga koncentrationer av divalenta katjoner i agarn.

– E. faecalis ATCC 29212 och trimetoprim/trim-sulfa:

För små zoner eller växt in till lappen indikerar för höga halter av tymin och tymidin i agarn.

EUCAST 2015 Version 5.0


Torkning och förvaring av agarplattor

• Agarplattor ska förvaras vid 4-10°C.

• Torkning, förvaring och hållbarhet hos egentillverkade agarplattor

kan variera beroende på lokala förhållanden (temperatur, fukthalt

mm).

• Köpta agarplattor ska förvaras enligt tillverkarens rekommendationer

och användas innan utgångsdatum.

• MH-F plattor som förvaras i plastpåse eller annan försluten

förpackning kan behöva torkas före användning. På detta sätt

undviks fukt som annars kan ge problem med otydliga zonkanter

och/eller dimma i zon.

• Agarplattorna ska vara rumstempererade vid inokulering. Det ska

inte finnas vattendroppar på agarytan, men plattorna ska inte heller

vara för torra.


Inokulat

• Inokulatet ska motsvara

grumligheten hos en

McFarland 0.5-standard*.

* Motsvarar ungefär

1-2 x 108 CFU/mL för E. coli.


Plocka isolerade kolonier från en övernatts-

kultur på icke selektivt medium


Inokulatberedning

• Plocka om möjligt flera morfologiskt lika kolonier för att undvika att välja en atypisk variant.

• Slamma kolonierna i 0.85% NaCl till en homogen lösning som motsvarar en McFarland 0.5-standard.

– Undantag: Streptococcus pneumoniae slammas till

McFarland 0.5 från en blodplatta, men till McFarland

1.0 från en chokladplatta.

• Justera grumligheten genom att tillsätta mer bakterier

eller NaCl till slamningen. Mät gärna till McFarland 0.5

med en densitometer.


Inokulering av plattor • Använd helst inokulatet inom 15 minuter från slamning och

alltid inom 60 minuter.

• Doppa en bomullspinne i slamningen och tryck bort överflödig vätska mot insidan av röret.

• Se till att agarplattorna är rumstempererade.

• Sprid inokulatet jämnt över hela agarytan, antingen för hand i tre riktningar eller med hjälp av en rotator.


Undvik överinokulering

• Det är viktigt att inte överinokulera plattorna så att växten

blir för tjockt.

• Kontrollera att zonerna för kontrollstammarna hamnar

inom rekommenderade QC-intervall. För tjockt inokulat

kan resultera i för små zoner.

• Tryck bort överflödig vätska genom att försiktigt pressa

bomullspinnen mot insidan av röret innan inokulatet

sprids ut (undvik dock en alltför torr bommullspinne för

grampositiva organismer).


Förvaring av antibiotikalappar

• Förvara lager av antibiotikalappar enligt tillverkarens rekommendationer.

• Lappar som är i bruk förvaras mörkt vid 4-8°C i förslutna behållare med torkmedel.

• Låt behållarna nå rumstemperatur innan de öppnas för att undvika kondensation på lapparna. Det är bättre att förvara antibiotikalapparna i rumstemperatur under dagen än att flytta dem in och ut ur kylen upprepade gånger.

• Använd inte antibiotikalappar som har passerat utgångsdatum (se förpackningen).


Applicering av antibiotikalappar

• Antibiotikalapparna ska appliceras

inom 15 minuter från att plattorna

inokulerats.

• Lapparna ska ligga plant på ytan

av mediet.

• Lapparna ska vara fördelade så att

zonerna inte överlappar varandra.

Överlappande zoner försvårar

avläsningen och kan ge

interaktioner mellan olika

antibiotika.


Sammanfattning Inokulering

• Slamma isolerade kolonier plockade från en icke-selektiv agarplatta som är inkuberad över natten.

• Justera till McFarland 0.5, gärna med en densitometer. Använd helst inokulatet inom 15 minuter.

• Doppa en steril bommullspinne i slamningen och tryck bort överflödig vätska mot insidan av röret.

• Sprid ut inokulatet jämnt över hela agarytan.

• Applicera antibiotikalappar inom 15 minuter från inokulering och påbörja inkubering av plattorna inom ytterligare 15 minuter.

19

Inkubering

• Vänd plattorna upp-och-ned och påbörja inkubering

inom 15 minuter från att antibiotikalapparna har

applicerats. Detta förhindrar prediffusion, vilket annars

kan resultera i för stora zoner.

• Inkubera plattorna i så små staplar som möjligt för att

undvika ojämn uppvärmning, vilket kan påverka

zonstorlekarna (beroende på inkubatorns effektivitet).

• MH inkuberas i luft och MH-F i luft med 4-6% CO2.



Inkubering Organism Inkubering

Enterobacteriaceae 35±1 ºC i luft 16-20 h

Pseudomonas spp. 35±1 ºC i luft 16-20 h

Stenotrophomonas maltophilia 35±1 ºC i luft 16-20 h

Acinetobacter spp. 35±1 ºC i luft 16-20 h

Staphylococcus spp. 35±1 ºC i luft 16-20 h

Enterococcus spp. 35±1 ºC i luft 16-20 h (24 h för glykopeptider)

Streptokocker grupp A, B, C och G 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h

Streptokocker viridansgruppen 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h

Streptococcus pneumoniae 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h

Haemophilus spp. 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h

Moraxella catarrhalis 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h

Listeria monocytogenes 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h

Pasteurella multocida 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h

Campylobacter jejuni och coli 41±1 ºC i mikroaerob miljö 24 h (40-48h)

Corynebacterium spp. 35±1 ºC i luft med 4-6% CO2 16-20 h (40-48h)

Övriga krävande organismer Ej klart

Observera:

• Använd helst inokulatet inom 15 minuter från slamning

och alltid inom 60 minuter.

• Applicera antibiotikalappar inom 15 minuter från att

plattorna inokulerats.

• Påbörja inkubering inom 15 minuter från att

antibiotikalapparna applicerats.


15-15-15 minutersregeln


Undersökning av plattor efter

inkubering

• Växten ska vara konfluerande.

• Det är viktigt att växten är jämn för att få fina zonkanter

(se exempel på nästa bild).

• Om enskilda kolonier syns är inokulatet för tunt och

resistensbestämningen måste göras om.


Växten ska vara jämn och konfluerande

…så här! ...men inte så här!

• Håll plattan på ca 30 cm avstånd, ta hänsyn till all växt

som syns med blotta ögat och läs zonerna där växten

slutar.


Avläsning

E. coli

Ciprofloxacin

S. aureus

Erytromycin

S. pneumoniae

Rifampicin

Exempel:

KNS

Trimetoprim


Avläsning

• MH

– Mät zoner från

baksidan mot en mörk

bakgrund med

belysning mot plattan

• MH-F

– Mät zoner från

ovansidan utan lock

med belysning mot

plattan


Avläsning

• Håll inte upp plattan mot ljuset och använd inte

förstoringsglas (se undantag nedan).

• Mät zonerna med skjutmått, linjal eller med en

automatisk zonavläsare.

• Om enskilda kolonier växer in i zonen, kontrollera om det

är en kontamination och upprepa resistensbestämningen

vid behov.


Avläsning – undantag (1)

Organism Antibiotika Avläsning

Proteus spp. Alla Bortse från svärmning.

Streptococcus spp. Alla Läs där växten slutar och inte där

hemolysen slutar.

Alla Trimetoprim

Trimetoprim-sulfametoxazol

Bortse från en tunn hinna av växt

in till lappen i en i övrigt tydlig

zon.

Staphylococcus spp. Linezolid Håll upp plattan mot ljuset och

undersök zonen.

Enterococcus spp. Vankomycin Håll upp plattan mot ljuset och

undersök zonen.

Enterobacteriaceae Ampicillin Bortse från tunn inväxt i form av

en inre zon som kan uppstå med

viss Mueller Hintonagar.


Avläsning – undantag (2)

Organism Antibiotika Avläsning

E. coli Mecillinam Bortse från isolerade kolonier i

zonen.

S. aureus Bensylpenicillin Håll upp plattan mot ljuset och

undersök zonkanten noggrant.

Staphylococcus spp. Cefoxitin Undersök zonen noggrant för att

detektera ev. kolonier i zonen.


Tolkning

• Kontrollera att zonerna för kontrollstammarna hamnar

inom angivna QC-intervall innan resultaten tolkas.

• Uppmätta zondiametrar (avrundade till närmsta

millimeter) tolkas till S, I och R enligt publicerade

brytpunktstabeller (www.eucast.org eller

www.nordicast.org). Alternativt kan mallar med EUCAST

brytpunkter användas.

http://www.eucast.org/

http://www.nordicast.org/


Kvalitetskontroll

• Använd rekommenderade kvalitetskontrollstammar i laboratoriets rutinmässiga arbete (se EUCAST QC Tables).

• Kvalitetskontrollstammar med definierade resistensmekanismer kan användas för att detektera specifika resistensmekanismer (se EUCAST QC Tables).

• Kvalitetskontrollstammar kan köpas från stamkollektioner eller vissa leverantörer av material för resistens-bestämning.

http://www.eucast.org/ast_of_bacteria/qc_tables/





EUCAST kvalitetskontrollstammar

31

Organism Stamkollektionsnummer Egenskaper

E. coli ATCC 25922; NCTC 12241

CIP 7624; DSM 1103

CCUG 17620; CECT 434

Känslig, vildtyp

E. coli

ATCC 35218; NCTC 11954

CIP 102181; DSM 5923


TEM-1 β-laktamas-

producerande

P. aeruginosa ATCC 27853; NCTC 12903

CIP 76110; DSM 1117


Känslig, vildtyp

S. aureus ATCC 29213; NCTC 12973

CIP 103429; DSM 2569


Svagt β-laktamas-

producerande

E. faecalis ATCC 29212; NCTC 12697

CIP 103214; DSM 2570

CCUG 9997; CECT 795

Känslig, vildtyp


EUCAST kvalitetskontrollstammar

32


S. pneumoniae ATCC 49619; NCTC 12977

CIP 104340; DSM 11967

CCUG 33638

Nedsatt känslighet för

bensylpenicillin

H. influenzae NCTC 8468*; CIP5494

CCUG 23946

Känslig, vildtyp

H. influenzae ATCC 49766; NCTC 12975

CIP 103570; DSM 11970

CCUG 29539

Känslig, vildtyp

Campylobacter

jejuni

ATCC 33560; NCTC 11351;

CIP 702; DSM 4688

CCUG 11284

Känslig, vildtyp

* H. influenzae NCTC 8468 har en ovanlig morfologi och kommer att utgå

2016.


Kontrollstammar för detektion av specifika

resistensmekanismer


K. pneumoniae ATCC 700603; NCTC 13368

CCUG 45421; CECT 7787

ESBL-producerande

(SHV-18)

S. aureus NCTC 12493 Oxacillin-heteroresistent,

mecA-positiv

E. faecalis

ATCC 51299; NCTC 13379

CIP 104676; DSM 12956

CCUG 34289

Höggradigt aminoglykosid-

resistent (HLAR) och

vankomycinresistent

(vanB positiv)

H. influenzae

ATCC 49247; NCTC 12699

CIP 104604; DSM 9999

CCUG 26214

β-laktamasnegativ,

ampicillin-resistent

(BLNAR)

Stamkollektioner

ATCC: American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD

20852, USA.

NCTC: National Collection of Type Cultures, Health Protection Agency Centre

for Infections, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, Storbritannien.

CIP: Collection de Institut Pasteur, 25–28 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris

Cedex 15, Frankrike.

DSMZ: Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen,

Mascheroder Weg 16, D-38124 Braunschweig, Tyskland.

CCUG: The Culture Collection University of Gothenburg, Sverige.

CECT: Colección Española de Cultivos Tipo, Universidad de Valencia, 46100

Burjassot, Valencia, Spanien.



Rutinmässig kvalitetskontroll

• Kvalitetskontroll bör utföras dagligen, särskilt för antibiotika som används rutinmässigt.

• Kvalitetskontrollen skall alltid läsas och bedömas innan de kliniska isolaten läses.

• Bedömningen görs på resultaten från de senaste 20 konsekutiva mätningarna.

• Var uppmärksam på trender och på zoner som upprepade gånger hamnar över eller under målvärdet.

• Om två eller fler av 20 mätningar ligger utanför intervallet krävs felsökning.


Övervakning av QC-resultat

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Dag

Zo

nd

iam

ete

r (

mm

)

Målvärde

Övre gränsvärde

Nedre gränsvärde

Enstaka mätningar

utanför QC-intervallet

Alla mätningar inom

intervallet men på

samma sida om

målvärdet.

Konsekutiva

mätningar utanför

intervallet på samma

sida om målvärdet.


Åtgärder vid avvikande QC-resultat

• Om två ickekonsekutiva mätningar av 20 hamnar utanför QC-

intervallet – rapportera resultaten från resistensbestämningen, men

gör felsökning.

• Om två konsekutiva mätningar av 20 hamnar utanför QC- intervallet

– gör felsökning innan resultaten rapporteras.

Resistensbestämningen kan behöva göras om.

• Om flera antibiotikalappar (>2) ligger utanför respektive QC-intervall

samma dag – gör felsökning innan resultaten rapporteras.

Resistensbestämningen kan behöva göras om.

• Om en kontrollstam med specifika resistensmekanismer inte

uppvisar resistens – svara inte ut resultaten, undersök och gör om

resistensbestämningen.


Hantering av kontrollstammar

• Förvara kontrollstammarna vid -70 °C på keramiska pärlor/kulor i små portioner. Se till att ha minst ett ”arkivrör” och flera ”bruksrör” i frysen. Alternativ förvaring är frystorkat material eller kommersiellt tillgängliga produkter.

• Från ett bruksrör görs varje vecka en ”veckoplatta” på icke-selektivt medium.

• Från ”veckoplattan” stryks varje dag en färsk platta som används till morgondagens kvalitetskontroll.

• Endast för krävande organismer får man använda seriell omstrykning av den dagliga färska plattan.


Potentiella felkällor (1)

Medium

Förvaring av plattor

Ej följt instruktioner vid tillverkning av plattor

Variation mellan batcher eller byte av leverantör

Tillsatser (variation mellan batcher, fel mängd eller

passerat utgångsdatum)

pH

Agardjup/Agarvolym

Passerat utgångsdatum

Test-

förhållanden

Ej följt “15-15-15”-minutersregeln (använd slamning inom

15 min, applicera lappar inom 15 min, inkubera inom 15

min)

Inkubering (temperatur, miljö och tid)

Felaktig inokulering (för tjockt, tunt eller ojämnt inokulat)

Avläsning med fel belysning eller bakgrund

Avläsning av zoner

Potentiella felkällor (2)

Antibiotika-

lappar

Fel antibiotikalapp (fel antibiotika eller fel lappstyrka)

Antibiotikainnehåll (felaktig förvaring, känsliga antibiotika,

passerat utgångsdatum)

Lapparna inte rumstempererade när behållaren öppnats

För många lappar på plattan (interaktion mellan lappar)

Kontroll-

stammar

Fel kvalitetskontrollstam

Mutation

Kontamination

För gammal kultur



EUCAST hemsida

• Följ regelbundet uppdateringar i metodologi, QC-tabeller och brytpunktstabeller på EUCAST hemsida

www.eucast.org

• Vid eventuella frågor kontakta [email protected] eller EUCAST sekretariat (se hemsida).

http://www.eucast.org/

mailto:[email protected]

resistensbestämning enligt eucast...

Documents