kfc/stbi strukturní bioinformatika - fch.upol.czfch.upol.cz/skripta/stbi/02_stbi_struktura.pdf ·...

KFC/STBIStrukturní bioinformatika

02_struktury

Karel Berka

Jak získávat strukturu

• RTG– xyz souřadnice atomů– krystal, rozlišení, – interpretace mezimolekulové

interakce

• EM– elektronový obal– nízké rozlišení– velké komplexy

• NMR– torzní uhly a vzdálenosti– dynamická informace– zpracování pomocí MD

• MS– vzdálenosti– hmotnosti – dostupnost

rozpouštědla– neúplná informace

• a další…– FRET - vzdálenosti

Získávání struktury Xrayzačátek (krystalografického) experimentu

klonování

expreseproteinu

purifikaceproteinu

krystalizace

difrakceRTG zářením

fit modelu vyřešenístruktury

fázový problém

zisk mapyelektronovéhustoty

Rentgenová krystalografie

1. Růst proteinových krystalů

2. Difrakční experiment 3. Výpočet mapy elektronové hustoty.4. Stavba modelu do mapy el. hustoty

Proč X-RayElektromagnetické záření interaguje s objekty jejichžvelikost je srovnatelná s vlnovou délkou (λ).

Např. viditelné světlo má vlnovou délku přibližně od 400 do 700 nm.

Vzdálenosti mezi atomy: C-C = 1,54 Å,C=C = 1,23 Å

1 Å (Ångstrom) = 0.1 nm C-N = 1,45 Å1 Å = 10-10 m N-(H)…..O = 2,8 Å

V laboratoři se běžně používá CuKα - λ = 1,54 Å.Synchrotron – λ = 0,5 Å – 2,5 Å.

Krystaly• X-paprsky se rozptylují na elektronech.

• Tato interakce je však příliš slabá pro detekci rozptylu na jedné molekule.

• Proto používáme krystaly, které obsahují triliony molekul v identické orientaci. Složením rozptýlených vln pak vzniká m ěřitelný difrak ční sign ál.

KrystalizaceEnergetický diagram krystalizace

Airlie J McCoy, Protein Crystallography coursehttp://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/Course/Crystals/intro.html

Experimentální uspořádání

Krystalová mřížka• Krystal má translační symetrii z definice.

– Jestli je ρ(r) elektronová hustota krystalu v bodě r, potom existujívektory a, b, c pro které platí:

ρ(r) = ρ(r + u · a + v · b + w · c)kde u, v, w jsou celá čísla.

• Každá identická kopie se nazývá základní bu ňka.• a, b, c se nazývají vektory základní buňky.• Délka vektorů základní buňky je a = |a|, b = |b|, c = |c|.• α, β, γ označují úhly

mezi vektory základní buňky• Pravotočivý systém souřadnic

Operace symetrie

• Translace (opakování základní buňky)• E – identita (C1)• i - Inverze (symetrie přes bod) (S2)• Cn

m - Rotační symetrie (rotace kolem osy o 360°/ n m-krát)

• σ - Roviny zrcadlení (S1)• Sn

m – Kombinace rotace o 360°/n m -krát následovaná zrcadlením přes rovinu

• Kombinace s translací

Bodové grupy symetrie proteinových krystalů

Asymetrická jednotka a základní jednotka

Asymetrická jednotka = Nejmenší objem z něhož můžeme zrekonstruovat základní jednotku aplikací krystalografické symetrie.

Základní jednotka = Nejmenší objem jehož translací v 3D můžeme zrekonstruovat celý krystal.

asymetrická jednotka

základní jednotka

Krystalové kontakty• Krystaly proteinu

obsahují velké kanály naplněnérozpouštědlem

• Kontakty molekul v rámci krystalu nemají(většinou!!!) vliv na strukturu proteinu.

Spakování krystaluglykolátoxidasy(schematicky)

Difrakce X-paprsků

Rosalind Franklin & Raymond GoslingNature 171 (1953)

Princip difrakce

Braggův zákonn.λ= 2d.sinθ(W. H. Bragg & W. L. Bragg,

1912)

Difraktované záření - sety rovin, které nejsou navzájem rovnoběžné

Výpočet mapy elektronové hustotyCílem krystalografie je pomocí amplitud a fázítisíců Fhkl vypočítat mapu elektronové hustoty ρ(x,y,z)

Fázový problém

• Amplitudy a fáze Fhkl jsou zakódovány v paprscích záření,které rozptylujíatomy v krystaluAmplituda |Fh,k,l| je druháodmocnina intenzity rozptýleného záření, kteréměříme standardním difrakčním experimentem.

• Φhkl je fáze rozptýlené vlny. Ta nemůže být měřena přímo – Fázový problém.

Fázový problém názorně

Difrakčnídata s fázovou informací

Reálnádifrakčnídata

Rekonstrukce objektu

FT

snadné

FT

obtížné

Význam fáze

F1, Φ1 F2, Φ2

F1, Φ2 F2, Φ1

Metody řešení fázov ého problému

• Přímé metody– Založeny na systematických souvislostech mezi určitými reflexemi.– Nutné mít data s vysokým rozlišením a relativně malý systém.– Velmi populární při řešení struktur malých molekul.

• Molekulární nahrazení– Když existuje vyřešená struktura podobná té kterou chceme řešit,potom

ji můžeme použít k odhadu fází.– Je stále více populární s tím jak roste počet vyřešených struktur.

• Metody t ěžkých atom ů

– Do krystalu vneseme těžký atom, který silně rozptyluje (např. Hg, Fe, Pb, I,Se ..). Nebo nahradíme všechny Met v proteinu Se-Met.

– Použijeme vícečetné isomorfní nahrazení (Multiple IsomorphousReplacement).MIR

– Použijeme vícečetnou nebo jednoduchou anomální difrakci (Multiple nebo Single Anomolous Diffraction). MAD

there is an app for that… SOLVE, SHELL-X, Phaser…

První mapa• Jakmile známe experimentální fáze, můžeme provést Fourierovu

transformaci.• Když získáme dostatečně kvalitní mapu elektronové hustoty, potom

začneme budovat model.• Nejdříve řetězec Cα atomů pomocí poly-Ala modelu.• Poté identifikujeme elementy sekundární struktury.• Poté stavíme postraní řetězce s pomocí znalosti sekvence.

• Programy: CNS, O, COOT, ARPwARP

Rozlišení (R) • v jednotkách Å, (více reflexí-lepší zesílení signál-šum)

• schopnost rozlišit detaily na vzdálenost. Teoreticky rozlišitëlné detaily separované nejméně 0.7x rozlišení.

• Čím lepší rozlišení, tím lepší mapu dostaneme -snadnější stavba modelu!

3.5 Å mapa fotosystému II

2.3 Å mapa fotosyntetického reakčního centra

0.95 Å mapa elastasy

Nízké rozlišení

• Mapy s nízkým rozlišením ukazují pouze obecnévlastnosti jako je např. tvar molekuly a umístěníelementů sekundární struktury.

R = 7 Å, tropomyosin.

Klasické rozlišení proteinů• běžné rozlišení u proteinových struktur pod 2.5 Å• Při tomto rozlišení je snadné sledovat průběh

hlavního řetězce a řada postraních řetězců mátaké dobře definovanou hustotu. U proteinů je limit pro publikaci struktury rozlišení 3.0 Å.

R = 2.6 Å

Vysoké rozlišení

• Mapa elektronovéhustoty s velmi vysokým rozlišením jasněukazuje pozice jednotlivých atomů.

R = 1.2 ÅH-vazby (fialová) mezi N a O atomy.

Validace

• Rfree (Brünger, 1992)

– test set (~5-10%) of reflekcívynecháno z určovánístruktury

• StereochemieRamachandranův diagram

– WHATIF– MOLPROBITY

• Bad contacts– stérické problémy ve

struktuře

And now somethingcompletelydifferent…

Nukleární magnetická rezonanceNMR

• NMR spektroskopie využívá magnetických vlastnostíjader atomů.

• Absorpční(emisní) spektroskopie, podobně jako IČ neboUV. Detekuje absorbci radiofrekvenčního záření jádry atomů v molekule.

• Radiofrekvenční energie (∆E přechodů jaderného spinu):

λ = 1011 až 3 x 107 nmν = 106 až 1010 Hz

Nastavením frekvence elektromagnetického záření (ν, nebo ω) narezonanční podmínku dojde k indukci přechodů mezi hladinamijaderného spinu

(tzn. můžeme měřit NMR spektrum!).

• Externí magnetické pole => energetický rozdíl mezi spinovými stavy jaderných magnetických momentů (m)

• Rozdíl v populaci stavů je dán rozdílem energií

• např. ∆E=3.8x10-5 kcal/mol pro 1H při 400 MHz (Bo=9.5T) Nα/Nβ= 1.000064

• Rozdíly populací velmi malé

NMR

Pravidla pro určení spinu izotopu

Nukleon. č.(A) Proton. č.(Z) I Detekceliché sudé nebo liché 1/2, 3/2, 5/2 anosudé sudé 0 nesudé liché 1, 2, 3 ano

Možný počet spinových stavů = 2I + 1:Jádro Spin.kvant.č. Počet stavů Mag.spin.č.1H I = 1/2 2(1/2) + 1 = 2 m = ±1/214N I = 1 2(1) + 1 = 3 m = -1, 0, 1

NMR-aktivní jádra v proteinech

• Přirozená:1H, spin ½31P, spin ½

• Obohacená díky bakteriální expresi:2H, spin 113C, spin ½15N, spin ½

Orientace mag.spinů

• Bez externího magnetického pole– náhodné orientace– degenerace

• S magnetickým polem– Makroskopická

magnetizace (Mz)

Vliv magnetického pole

Energie µ v poli Bo

E = - µ·Bo

pro jednu hladinu:Em= -m·Bo·γ·ħ

Projekce je kvantována, takže E závisí na:1) typ jádra (γ)2) spinový stav (m)3) síla magnetu (Bo)

Rezonance

rezonanční podmínka: ∆E = hν = ħω = Boγħ

ωo = Boγ

∆E = ħωo

Excitace a podélná relaxace (Mz -> rovnováha)

• nárůst

• pokles

Chemický posun• Různá jádra mají různé rezonanční frekvence• Magnetické pole, ve kterém se jádro nachází není rovno

vnějšímu magnetickému poli.– Elektrony v okolí jádra (chemické okolí) stíní vnější pole –

výsledné efektivní magnetické pole Beff je tvořeno vnějším polem B0 a polem lokálním B loc .

Beff = B0 – B loc = B0(1-σ), kde σ je konstanta magnetického stínění

NMR – řešení struktury makromolekul

• Pozorujeme protony (1H)– (! x-ray difrakce, kde

elektronová hustota atomů s vyšším počtem elektronů (C, N, O)!)

• Protein je v roztoku.

NMR proteinů

• Přiřazení pozorovaných 1H rezonancí individuálním aminokyselinám.

• Protonové rezonance jsou často rozlišeny na základě rozdílů v chemickém posunu.

• Měříme intra-aminokyselinové a inter-AK proton-protonovévzdálenosti prostřednictvím dipolárních spřáhnutí.

• Měříme torzní úhlyprostřednictvím J- spřáhnutí.

• Získané vzdálenosti a torzníúhly použijeme k určenísekundární a terciární struktury.

NMR interakce1H mezi sebou, ale také se značenými 13C a 15N

Přenos magnetizace• Mezi 1H, 13C a 15N může dojít k

přenosu magnetizace, což můžeme použít k určení konektivity.

• Chemické posuny• J-spřáhnutí (skrze vazby)• Dipolární spřáhnutí (skrze prostor)

Obecný 2D experiment

FT

COSY (Correlated Spectroscopy)

NOESY (Nuclear OverhauserEnhancement Spectroscopy)

Intenzita cross-píků odpovídá inter-jaderné vzdálenosti

Určování struktury pomocí NMR

Určení struktury pomocí NMR

• Přiřazení sekvence (určenívedlejších řetězců)– COSY– NOESY– 3D-NMR experimenty

• Sekundární struktura– chemické posuny (backbone)– dipolární spřáhnutí => prostor– J-spřáhnutí => torzní úhly

• Terciární struktura (do modelu)– NOE intenzity (neodpovídající

COSY pro vedlejší řetězce)

Získané parametry z NMR• Raw

– Time-domain: 1D,2D,3D,4D spektrum

• Processed (FT)– frekvency domain

• NMR parametry– peak list– chemical shifts– 1H-1H NOE– J-couplings– residual dipolar couplings– NMR relaxation rates

• Derived data– NMR peak assignments– % expected in observed data– covalent structure– bond hybridizations

• Derived data– secondary structure– interatomic distances– torsion angles– hydrogen bonds– order parameters– solvent exposure– 3D structure– binding constant– pH titration parameters– hydrogen exchange rates– termodynamics and kinetics of

structural rearangements– disordered regions

Kvalita struktury NMR

• Výsledkem NMR experimentu

= Zisk celé sady struktur, kterésplňují podmínky

• Kvalita:– Stereochemie – Ramachandran– Ekvivalent Rfree – vynechá se část dat při určování struktury a pak se to přes ně kontroluje není standardizováno!

Elektronový mikroskop – EM

magnetickéčočky

rozlišení R = 0.61λ/nsin α– zelené světlo λ=400nm => R=150 nm– elektrony 200 kV~ λ=0.0025nm => R=0.02nm (teoretický limit)

R=1 nm (TEM), méně cryo-HRTEM

TEM

• transmisní elektronový mikroskop

• do tloušťky 100 nm

SEM

• skenovací elektronový mikroskop

• krystalografie– odražené e.– sekundární e.

– transmitované e.– Xray

Elektronová tomografie

• programy: Chimera, Modeller, IMP

Kryoelektronová tomografie200kDa – 400 MDa

Protein/RNA or DNA complexese.g.Ribosome, ~2 MDa

Asymmetric monomericproteinse.g.DNA-PKcs, 470 kDa

Icosahedral viruses60-fold symmetrye.g.Adenovirus, ~150 MDa

Detergent solubilized membrane proteins

e.g.Voltage-sensitive sodium channel~300 kDa, Sato et al., Nature 2001

e.g.Platelet integrin αIIbβ3~230 kDa, Adair & Yeager, PNAS 2002

How to… EM

Fluorescence• Jablonskiho diagram

Fluorescence

Zvýšení polarity rozpouštědla většinouzpůsobuje červený posun fluorescence.

Z Jablonskiho diagramu vyplývá, že energie emitovaného záření (fluorescence) je typicky nižší než energie absorbovaného záření. (G.G.Stokes,1852,U.of Cambridge)

Fluorescence (Förster) Resonance Energy Transfer (FRET)

• Vzdálenosti - r

• Když se tyto dva fluoroforydostanou blízko k sobě, tak po excitaci dojde k FRET

• R0 je vzdálenost mezi D a A při které je přenos energie 50% (polovina energie se přenese z D na A).

• R0 je typicky mezi 20-90Å

Typické hodnoty Ro

Donor Akceptor Ro (Å)Fluorescein Tetramethylrhodamine 55IAEDANS Fluorescein 46EDANS Dabcyl 33Fluorescein Fluorescein 44BODIPY FL BODIPY FL 57Fluorescein QSY 7,QSY 9 dyes 61

Take home message• X-ray:

– krystaly (kontakty), vnitřní elektrony – elektronová mapa– R do 2.5 A se dá, jinak jen obálky – velikost neomezená

• NMR– roztok, značené proteiny, jádra protonů – vzdálenosti a torzní úhly– korelační 2D, 3D-spektra, je výhodné pro homologní modelování– omezení na velikost

• EM– jednotlivé molekuly, vnitřní elektrony – elektronová mapa – nemá atomární rozlišení (R > 5 A) – použitelné pro struktury komplexů

jako obálka• Fluorescence (FRET), MS

– vzdálenosti

• kontrola: Ramachandran, Rfree (Xray, NMR), krystalovékontakty, stérické kontakty

Nobelovsk éporovnání jednotlivých metod

2009 Venkatraman Ramakrishnan, Thomas A. Steitz, and Ada E. Yonath (Chemistry) ribosome (1ffk, 1fjg, 1fka, 1gix, 1giy)

2006: Roger Kornberg (Chemistry) molecular basis of eukaryotictranscription (1i3q, 1i50, 1i6h)

2003: Peter Agre and Roderick MacKinnon (Chemistry) membrane channels (1bl8, 2f2b, 2evu)

2003: Paul C. Lauterbur, Peter Mansfield (Physiology or Medicine) magnetic resonance imaging (MRI)

1996: Paul D. Boyer, John E. Walker, and Jens C. Skou (Chemistry) F1-ATPase (1bmf, 1cow)

2002: Kurt Wüthrich (Chemistry) nuclear magnetic resonance (NMR)1988: Johann Deisenhofer, Robert Huber, and HartmutMichel (Chemistry) photosynthetic reaction centre (1PRC).

2002: John B. Fenn, Koichi Tanaka (Chemistry) soft ionization massspectrometry (MS)

1962: Max F. Perutz and John C. Kendrew (Chemistry) globularproteins – myoglobin, hemoglobin

1994: Bertram N. Brockhouse and Clifford G. Shull (Physics) neutron scattering

1962 Francis H.C. Crick, James D. Watson, Maurice H.F. Wilkins(Physiology or Medicine) – DNA

1991: Richard R. Ernst (Chemistry) high resolution nuclear magneticresonance (NMR) spectroscopy

1954: Linus Pauling (Chemistry) – chemical bond, peptide bond, andthe structures of the alpha helix and beta strand

1986: Ernst Ruska, Gerd Binnig, Heinrich Rohrer (Physics) TEM, STM 1985: Herbert A. Hauptman and Jerome Karle (Chemistry) phaseproblem

1982: Aaron Klug (Chemistry) crystallographic electron microscopy

(EM)

1964: Dorothy C. Hodgkin (Chemistry) structures of penicillin andvitamin B-12.

1952: Felix Bloch, Edward M. Purcell (Physics) nuclear magneticprecision measurements (NMR)

1915: William H. Bragg and William L. Bragg (Physics) – Bragg’sequation

1944: Isidor I. Rabi (Physics) resonance method for recording themagnetic properties of atomic nuclei (NMR)

1914: Max von Laue (Physics) diffraction of X-rays by crystals

1943: Otto Stern (Physics) magnetic moment of the proton (NMR)1901: Wilhelm C. Röntgen (Physics) – X-ray

OthersX-Ray

Validační metody – servery

www.doe-mbi.ucla.edu/Services/Verify 3DProteinBowie, Luthy andEisenberg, 1991

Verify3D

xray.bmc.uu.se/cgi-bin/gerard/Protein (Caplha)

Kleywegt, 1997MOLEMAN2

www-lbit.iro.umontreal.ca/mcannotateRNAGendron, Lemieux, and Major, 2001

MC-Annotate

www.doe-mbi.ucla.edu/Services/ERRATProteinColovos and Yeates, 1993

ERRAT

cmbi1.cmbi.kun.nl:1100/WIWWWI/oldqua.html

ProteinVriend and Sander, 1993

DACA

ebi.ac.ukProteinEU 3-D ValidationNetwork, 1998

PROCHECK,PROVE, WHAT IF

www.fundp.ac.be/sciences/biologie/bmsProteinMelo and Feytmans, 1998

ANOLEA

URLProtein/NA Reference Program

R.A. Laskowski – Structural quality assurance

Validační metody – programy

www.cmbi.kun.nl/whatifVriend, 1990 WHAT IF

www.cmbi.kun.nl/gv/whatcheckHooft et al.,

1996WHATCHECK

www.yorvic.york.ac.uk/∼oldfield/squidmain.htmlOldfield, 1992 SQUID

www.ucmb.ulb.ac.be/SCMBB/PROVEPontius,

Richelle, andWodak, 1996

PROVE

www.biochem.ucl.ac.uk/∼roman/procheck/procheck.html

Laskowski et al., 1993

PROCHECK

www.doe-mbi.ucla.edu/People/Yeates/Gallery/Errat.html

Colovos andYeates, 1993

ERRAT

pdb.rutgers.edu/softwarePDBADIT

URLReference Program

R.A. Laskowski – Structural quality assurance