izbirni predmet, april/maj 2013 struktura in funkcija

IZBIRNI PREDMET, APRIL/MAJ 2013

STRUKTURA IN FUNKCIJA PROTEINOV

Matjaž Zorko

1. predavanje:

Od aminokislin do primarne strukture proteinov

DOSEGLJIVO: http://ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/izbir1.htm

E-mail: zorko@mf.uni-lj.si

POZOR: 20 standardnih in več100 nestandardnih AA

I. Lastnosti aminokislin

- klasifikacija

- velikost

- naboj

- polarnost

- hidrofobnost

- aromatične AK

- optična aktivnost

a C-atom

Klasifikacija (R!):

1. polarne:

2. hidrofobne

3. ‘posebne’

• bazične

• kisle

• nenabiti R

AROMATIC AA

1.

2.

3.

Velikost AK ostankov:

100-130 Da (110 Da),

z nekaj izjemami!

dodaj 18 (H2O) za maso AK!

odštej 56 za maso stranske verige

AK

ostanek

Pri zamenjavi ene AK za drugo lahko že samo zaradi razlike

v velikosti pride do velikih sprememb v molekuli protiena!

VELIKOST JE POMEMBNA PRI ZAMENJAVAH AMINOKISLIN (MUTACIJE)

Zamenjava Gly za Ala (-H za –CH3) v kolagenu močno oslabi trdnost vlakna.

NABOJ:

Določajo ga pKa vrednosti (25°C) in pH

Amino acid a-COOH group a-NH3+ group Side chain (R)

Alanine 2.3 9.9

Glycine 2.4 9.8

Phenylalanine 1.8 9.1

Serine 2.1 9.2

Valine 2.3 9.6

Aspartic acid 2.0 10.0 3.9

Glutamic acid 2.2 9.7 4.3

Histidine 1.8 9.2 6.0

Cysteine 1.8 10.8 8.3

Tyrosine 2.2 9.1 10.9

Lysine 2.2 9.2 10.8

Arginine 1.8 9.0 12.5

Pomembni so samo

Rs, N- in C- terminala

!

Naboj in polarnost/hidrofobnost določata značaj AK, njeno

interakcijo z vodo in navadno tudi njeno lokacijo v proteinu!

H

2.2

Paulingova elektronegativnost določa polarnost

(Cs = 0,7 ; F = 4,0)

Li

1

Be

1.5

B

2.0

C

2.5

N

3.0

O

3.5

F

4.0

Na

0.9

Mg

1.2

Al

1.5

Si

1.8

P

2.1

S

2.5

Cl

3.1

K

0.8

Ca

1.0

Ga

1.7

Ge

1.8

As

2.1

Se

2.4

Br

3.0

Rb

0.8

Sr

1.0

Ba

0.9

Sn

1.9

Sb

2

Te

2.1

I

2.6

Cs

0.7

Pb

2.3

Bi

2

Po

2

At

2.2

+

+

O H

HN H

HH

lone pair electrons

NH3 H2O

Za polarnost je pomembna razlika v elektronegativosti

CO2

O

H H

d-

d+ d+

H2O

d+

d+

d+

d+

d+

d+

d- d- d-

Polarnost kvantificiramo z dipolnim momentom: rz

d-

ne-polarno

polarno

nabito

O::C::O

Polarne skupine AK:

-OH, =C=O, -NH2, -SH

Hidrofobnost in hidrofilnost AK radikalov

a:

water

vapor

DX

XK

][

][

(a)

b: ecyclohexan

waterD

X

XK

][

][

(b)

voda : cikloheksan

voda : para

pola

rni

nepola

rni

Lys

H2O

C6H12

Aromatske AK (Phe, Tyr, Trp)

• velike

• resonanca: -OH v Tyr

disociira (pKa = 10,9)

• polarnost obroča:

specifične interakcije

• absorbirajo UV svetlobo,

pomembno za

identifikacijo proteinov

S,R-system

D,L-system

rotacija linearno

polarizirane svetlobe

(a = [a].l.c)

POMEN PRI

PREPOZNAVANJU:

E-S, R-H, Ag-Ab, itd

STANDARD! posebne funkcije!

D-AK ščitijo pred proteolitsko

razgradnjo

Funkcionalna superoksidna dismutaza: 153 D-aminokislin!

Neesencialne Esencialne

Alanine Histidine

Arginine Isoleucine

Asparagine Leucine

Aspartate Lysine

Cysteine Methionine

Glutamate Phenylalanine

Glutamine Threonine

Glycine Tryptophan

Proline Valine

Serine

Tyrosine

Bliskovit pregled sinteze proteinov

• DNA → primarni transkript (pre-mRNA)

• pre-mRNA se procesira

• mRNA je informacija za I. str. proteinov

• nastanek peptidnih vezi → polipeptidna veriga

• nekatere AK se modificirajo

• 1D → 3D struktura

• kontrola funkcionalne kvalitete

64 kodonov, vsi so v uporabi:

Nekateri proteini so inducibilni, drugi konstitutivni.

Indukcija b-galaktozidaze v E. coli.

Operonski sistem nadzoruje transkripcijo

+ :

- :

Regulacija izražanja genov pri prokariotih

Pri evkariotih je regulacija

ekspresije veliko kompleksnejša.

Sodeluje veliko regulatornih

proteinov.

Proteini, ki so potrebni za acilacijo

histonov in remodeliranje kromatina,

niso prikazani.

Transkripcija treh zaporednih genov v oocitih močerada Pleurodeles waltl

Sinteza pre-mRNA

Hitrost sinteze pre-mRNA in ‘natančnost’

• E. coli: 20 - 50 nukleotidov / sekundo

• več RNAP ‘dela’ simultano

• 1 napaka / ~104 nukleotidov (DNA replikacija: 1 napaka / ~107 nukleotidov

• zakaj to ni fatalno:

večina genov se velikokrat (stalno) prepisuje

degeneracija genetskega koda

niso vse zamenjave AK škodljive

velik del mRNA se izreže

Protismiselna veriga DNA (modro) in ustrezna mRNA (rdeče) za ovalbumin

½

AK

tRNA je adapter, ki

prevaja jezik nukleotidov

v jezik aminokislin. tRNA

mRNA (jezik nukleinskih kislin = zaporedje nukleotidov)

(jezik proteinov = zaporedje aminokislin)

Aktivacija AK –

vezava na tRNA.

Zelo specifična!

Aminoacil-tRNA-sintaza

‘Ribosomska sinteza’ proteinov: koncert za zelo velik orkester

polipeptidna veriga

Polipeptidna veriga raste na C-terminalni strani

katalizira rRNA!

Elongacija - veliko sodelujočih igralcev!

Energetsko potraten proces! Tvorba peptidne vezi je edergonska

reakcija, energija je potrebna za premik ravnotežja k produktom.

1 ATP za pripojitev AK na tRNA!

REZULTAT:

Polipeptidna veriga: PRIMARNA STRUKTURA PROTEINOV,

ki se po-translacijsko modificira in se zvije v 3D strukturo.

Peptidi se večinoma tudi sintetizirajo tako – končno

obliko dobimo po razcepljenju s proteazami. Nekateri se

sintetizirajo ne-ribosomsko (encimi).

MSH: melanocyte stimulating hormone

ACTH: adenocorticotropical hormone

Ne-ribosomska sinteza glutationa

-OOC-CH-CH2-CH2-C-N-CH-C-N-CH2-COO-

CH2

SH

H H

O O +NH3

g-Glu Cys Gly

Glu + Cys g-Glu Cys + Gly g-Glu Cys Gly

g-glutamil cysteine synthetase + ATP glutathione synthetase + ATP

ADP ADP

Po-translacijske modifikacije: dodatek novih funkcionalnih

skupin v AK (in drugi razlogi). Več kot 80 znanih.

Glavne modifikacije:

• proteolitično procesiranje

• spremenjeni konci

• glikozilacija

• dodatek lipida

• sulfacija

• g-karboksi-glutamat

• hidroksilacija

• fosforilacija

• ADP-ribozilacija

• -S-S- mostički

Proteolitično zorenje insulina

- 23 AA - 33 AA

Proteolitično procesiranje: ‘aktivacija’ encimov

Namen: biti aktiven na pravem mestu!

Glikozilacija: topnost, prepoznavanje, signaliziranje!

• Vezava na

• Asn: N-glikozil-

• Ser, Thr, Tyr, OH-Lys:

O-glikozil

• Dobimo "glikoprotein"

• Pogosto pri izvenceličnih

proteinih

Lipidacija: interakcija z membrano, 3D struktura

prenil

‘Lipidacija’, lipidni rafti in prenos signala

Modified Ras vezava v rafte

(neactiven, GDP) ali izven njih

(aktiven, GTP).

Majhne funkcionalne skupine

• fosforilacija

• g-karboksi-glutamate

• metilacija

• sulfacija

• hidroksilacija

Disulfidni mostički: stabilizacija 3D-strukture

ADP-ribozilacija.

CH2

HHOH OH

H HOOP

O

HHOH OH

H HO

CH2

N

N

N

NH2

OP

O

O

NO

(CH2)3

NH

C NH2+

protein

NH

O

H

CNH2

O

CH2

H

N

HOH OH

H HOOP

O

HHOH OH

H HO

CH2

N

N

N

NH2

OP

O

O

O

NO

H

CNH2

O

NH

+

+

(CH2)3

NH

C NH2+

protein

NH2

NAD+

nicotinamideArg

residue

ADP-ribosylated

protein

(nicotinamide

adenine

dinucleotide)

ADP-ribozilacijan Ga s PTX in CTX

GDP GTP

PTX CTX

X

hidroliza GTP

X

Gs Gi X

Gs Gi

Kompleksno procesiranje kolagena

Organizacija kolagena v različnih tkivih.

Kljub zelo podobni sekvenci pride do razlik v interakcijah med deli

kolagena, ker so po-translacijske modifikacije različne v različnih tkivih.

Po-translacijske modifikacije dokončno oblikujejo polipeptidno verigo. Nekatere

modifikacije prištejemo k primarni strukturi, nekatere pa ne – terminologija tu ni

dorečena. Pri kolagenu npr. hidroksi-Pro in hidroksi-Lys upoštevamo,

glikozilacije pa ne. K primarni strukturi nekateri štejejo tudi mesta (Cys), kjer se

vzpostavijo-SS- mostički.

Aminokislinsko sekvenco lahko določimo

Postopna identifikacija AK od N-konca proti C-koncu.

Zanesljivo se da to narediti le za peptide do cca 40 AK.

Ala – Phe - Arg Tyr - Lys Glu - Ser

tripsin

Ala - Phe - Arg - Tyr - Lys - Glu - Ser

kimotripsin

Ala – Phe Arg - Tyr Lys - Glu - Ser

Zato sekvenco razsekajo na peptide na dva

različna načina, določijo sekvenco vseh peptidov

in s poravnavo dobijo sekvenco proteina.

Sekvenco lahko določimo tudi

s sekvenciranjem gena ali z

masno spektrometrijo

Sekvence analiziramo in lahko dobimo pomembne podatke

EF-Tu protein (fragmenti)

• sorodnosti (molekularna evolucija)

• strukturi (napoved 3D strukture)

• lokaciji (intra/ekstra-celularnost, vgraditev v membrano)

• funkciji (sekvenčna sorodnost funkcijska sorodnost)

• napakah v delovanju (mutacije)

Analiza sekvence nam lahko da podatke o:

Evolucijsko drevo bakterij na osnovi sekvence GroEL (šaperon)

Napoved transmembranskih regij

Galparan/Transportan: napovedana

sekundarna struktura, amfipatičnost

in ‘3D-model’

TP-1: secondary structure prediction

Amino acid (number)

relia

bili

ty in

dex

(0

- 9)

0 5 10 15 20 25 30

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

Helix

Ext. (beta)

Loop

TP-1: predicted solvent accessibility

Amino acid (number)

rela

tive

solv

ent a

cces

sibi

lity

(0 -

9)

0 5 10 15 20 25 30

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

Soomets U., Hällbrink M., Zorko M., and Langel Ü. (1997) Curr. Top. Pept. Prot. Res. 2, 83-113

= TP

K