identifikasi gen sitokrom p450 2a6 alel*4 pada ...enzim sitokrom p450 2a6 (cyp2a6) terdapat di hati...
Post on 05-Dec-2020
15 Views
Preview:
TRANSCRIPT
i
IDENTIFIKASI GEN SITOKROM P450 2A6 ALEL*4 PADA SUBJEK UJI
NONPEROKOK SUKU TIONGHOA INDONESIA DENGAN METODE
POLYMERASE CHAIN REACTION
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Vink Dellin
NIM : 168114024
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
IDENTIFIKASI GEN SITOKROM P450 2A6 ALEL*4 PADA SUBJEK UJI
NONPEROKOK SUKU TIONGHOA INDONESIA DENGAN METODE
POLYMERASE CHAIN REACTION
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Vink Dellin
NIM : 168114024
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
HALAMAN PERSEMBAHAN
Karya ini kupersembahkan kepada, Tuhan Yesus yang menjadi sumber kekuatan dan jawaban dalam setiap
tantangan yang saya hadapi, Bapa yang menyertai dalam setiap rancangan yang disediakannya kepada aku.
Mama, Papa, dan Vion yang terus-menerus mendukungku dan
menyemangatiku.
Sahabat-sahabat dan teman-teman yang selalu menyemangatiku dan mememaniku melalui setiap proses selama ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas
berkat, tuntunan, serta rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi
dengan berjudu “Identifikasi Gen Sitokrom P450 2A6 Alel*4 pada Subjek Uji
Nonperokok Suku Tionghoa Indonesia dengan Metode Polymerase Chain
Reaction”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Farmasi (S. Farm) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
Penyelesaian skripsi ini tidak terlepas dari dukungan, bimbingan dan bantuan
berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan
terima kasih kepada:
1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartani, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt. Selaku Dosen Pembimbing Skripsi atas
bimbingan, dukungan, pelajaran, nasihat, serta setia mendampingi penulis
dengan sabar hingga penyusunan skripsi ini.
3. Bapak Maywan Hariono, Ph. D., Apt. selaku Dosen Penguji yang telah
memberikan kritik dan saran kepada penulis.
4. Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc., selaku Dosen Penguji yang telah
memberi kritik dan saran kepada penulis sekaligus sebagai Kepala Penanggung
Jawab Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan izin untuk
penggunaan semua fasilitas laboratorium selama penelitian.
5. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang
atas bimbingannya selama perkuliahan dari awal hingga akhir.
6. Pak Kayatno selaku laboran biokimia yang sudah setia membantu penulis
dalam penelitian.
7. Pak Heru, Pak Wagiran, dan Mas Bimo yang telah membantu selama proses
penelitian di laboratorium.
8. Papa, Mama, dan Vion yang sudah memberikan doa, semangat, dan dukungan
kepada penulis hingga terselesaikannya skripsi ini.
9. Rekan seperjuangan penelitian ini yaitu Evelyn, Handani, Lodvi, Tasya dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR ISI
COVER .............................................................................................................. i
HALAMAN JUDUL ......................................................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. iii
HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN........................................................................ v
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................ vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ......................................................... vii
PRAKATA ..................................................................................................... viii
DAFTAR ISI ..................................................................................................... x
DAFTAR TABEL ............................................................................................ xi
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xiii
ABSTRAK ..................................................................................................... xiv
ABSTRACT ...................................................................................................... xv
PENDAHULUAN............................................................................................. 1
METODE PENELITIAN .................................................................................. 3
HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................... 7
KESIMPULAN ............................................................................................... 16
SARAN ........................................................................................................... 16
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 17
LAMPIRAN .................................................................................................... 20
BIOGRAFI PENULIS .................................................................................... 41
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR TABEL
Tabel I. Frekuensi Alel CYP2A6 *1 dan alel CYP2A6 *4 pada suku Tionghoa
………………………………………………………………………...15
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan Teknik
elektroforesis…………………………. …………………………10
Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen urutan basa potongan gen
CYP2A6 *1…………………………. …………………………..12
Gambar 3. Urutan nukleotida potongan urutan basa CYP2A6 *1 dan CYP2A6
*4 ………………………………………………………………...13
Gambar 4. Elektroforegram produk PCR dari berbagai hasil pita …………..14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Ethical Clearence Penelitian ........................................................... 21
Lampiran 2. Go TaqGreen Master Mix Certification of Analysis ........................ 22
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix ........................... 23
Lampiran 4. Product Datasheet of Primer Forward and Reverse CYP2A6*4 .... 24
Lampiran 5. Product Datasheet of DNA Ladder and Markers ............................ 25
Lampiran 6. Product Datasheet of FluorovueTM Nucleid Acid Gel Stain ............ 26
Lampiran 7. Product Datasheet of FavorPrepTM Blood Genomic Mini DNA
Extraction Kit ......................................................................................................... 27
Lampiran 8. Elektroforegram Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA .................. 28
Lampiran 9. Elektroforegram Hasil PCR CYP2A6 *4 ....................................... 29
Lampiran 10. Data Subyek ................................................................................... 31
Lampiran 11. Frekuensi Alel ................................................................................ 32
Lampiran 12. Inform Consent .............................................................................. 33
Lampiran 13. Hasil kuisioner subyek uji dan inform consent .............................. 38
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
ABSTRAK
Asap rokok mengandung banyak senyawa prokarsinogen, salah satunya
adalah Tobacco-specific nitrosamines (TSNA). Enzim CYP2A6 dapat
mengaktifkan TSNA melalui reaksi α-hidroksilasi menjadi zat intermediet yang
dapat berikatan dengan DNA dan menyebabkan miscoding. Polimorfisme pada gen
dapat memberikan efek yang bervariasi, di antaranya dapat menurunkan,
menghilangkan atau meningkatkan aktivitas enzim. Alel CYP2A6*4 merupakan
salah satu bentuk polimorfi yang mengalami whole gene deletion yang
mengakibatkan penurunan aktivasi senyawa nitrosamin sehingga dapat mengurangi
risiko kanker yang disebabkan oleh senyawa TSNA dalam asap rokok. Alel ini
banyak ditemukan pada orang Asia, khususnya pada suku Tionghoa. Tujuan
penelitian ini, yaitu untuk mengetahui keberadaan alel CYP2A6 *4 serta
menentukan frekuensi alel CYP2A6 *4 yang terdapat pada isolat DNA non perokok
suku Tionghoa di Indonesia. Hasil produk PCR dianalisis menggunakan
elektroforesis. Hasil penelitian menunjukkan frekuensi alel CYP2A6 *4 pada suku
Tionghoa Indonesia sebesar 30%. Berdasarkan hasil penelitian ini, maka dapat
disimpulkan bahwa adanya bentuk polimorfi CYP2A6 *4 pada subjek uji suku
Tionghoa Indonesia yang diketahui merupakan slow metabolizer dan dapat
mengakibatkan penurunan aktivasi TSNA sehingga memiliki kecenderungan
menurunkan risiko kanker paru.
Kata kunci: Nitrosamin, CYP2A6*4, Polimorfisme, Polymerase Chain Reaction
(PCR)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
ABSTRACT
Cigarette smoke contains many procarcinogenic compounds and one of
them is Tobacco-specific nitrosamines (TSNA). Enzyme CYP2A6 could activate
TSNA by α-hydroxylation into intermediets which bind to DNA and cause
miscoding . Polymorphisms in genes could provide a varied effect, either decrease,
eliminate or increase the activity of enzymes. Allele CYP2A6 * 4 is an example of
the polymorphy that undergoes whole gene deletion thus resulting in a decreased
activation of nitrosamine compounds. Therefore, this can reduce the risk of cancer
caused by TSNA compounds in cigarette smoke. This allele is mostly found in
many Asians, especially Chinese ethnic. The purpose of this research is to identify
the presence of CYP2A6 * 4 and determine the frequency of the Allele CYP2A6 *
4 contained in the Chinese non-smokers’ DNA extract in Indonesia. The PCR
product is analyzed using PCR, which results an allele CYP2A6 * 4 in Indonesian
Chinese with a frequency of 30%. Based on the results collected, it could be
concluded that the presence of CYP2A6*4 polymorphic allele in among Chinese
Indonesian population sample study were slow metabolizer, which may decrease
the activation of TSNA thus having the tendency to lower the risk of lung cancer.
Keywords : Nitrosamine, CYP2A6*4, Polimorphism, Polymerase Chain Reaction
(PCR)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PENDAHULUAN
Merokok merupakan salah satu faktor pemicu terjadinya penyakit jantung,
osteoporosis, kanker paru, kelainan reproduktif, diabetes dan penyakit lambung
(Gupta, 2001). Bahaya asap rokok tidak hanya merugikan bagi perokok aktif,
namun juga akan berdampak buruk terhadap perokok pasif. Kemungkinan perokok
pasif mengalami gangguan kesehatan akibat asap rokok yang dihirup mencapai
sekitar 30% (Barber, 2008). Menurut hasil survei Global Adults Tobacco Survey
(GATS) tahun 2011, Indonesia menempati urutan pertama untuk persentase jumlah
perokok pasif yaitu sebesar 78,4% (Plianbangchang, 2011). Orang yang terpapar
asap rokok akan mengalami peningkatan risiko penyakit jantung sebesar 25-30%
dan kanker paru sebesar 20-30% (Surgeon General, 2006; WHO, 2004).
Asap rokok dari produk tembakau mengandung sejumlah senyawa
prokarsinogen. Salah satu senyawa prokarsinogen yang terdapat pada asap rokok
adalah Tobacco-specific nitrosamines (TSNA) (Hoffman dan Hoffman, 1997).
TSNA memainkan peran penting dalam induksi beberapa jenis kanker, dan salah
satunya adalah kanker paru. Beberapa jenis TSNA yang telah ditemukan adalah N’-
nitrosonornikotin (NNN), 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanon (NNK),
4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanol (NNAL), Nitrosoanatabin (NAT),
Nitrosoanasabin (NAB), 4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)-1-butanol (iso-NNAL),
dan 4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)-1-asam butirat (iso-NNAC). TSNA dan
nitrosamin lainnya diaktivasi oleh enzim CYP2A (Rossini et al., 2008).
Enzim sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) terdapat di hati dan merupakan
enzim monooksigenase yang dapat memetabolisme senyawa xenobiotik dan
mengaktivasi toksin seperti nitrosamin (Mcdonagh et al., 2012; Tanner dan Tyndale,
2017). NNK, NNN, dan NNAL merupakan senyawa nitrosamin dalam asap rokok
yang berpotensi menimbulkan kanker (Xue et al., 2014). NNAL, merupakan sebuah
produk genotoksik hasil reduksi karbonil NNK. NNK akan mengalami reaksi α-
hidroksilasi menghasilkan beberapa metabolit genotoksik tambahan (Brown et al.,
2003). NNN dapat dimetabolisme melalui α-hidroksilasi lewat dua jalur yaitu
karbon 2’ dan karbon 5’ sehingga menghasilkan DNA adduct (Rossini et al., 2008).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
Gen yang mengkode enzim CYP2A6 memiliki polimorfisme yang tinggi (Tanner
dan Tyndale, 2017).
Polimorfisme gen sitokrom P450 (CYP2A6) bervariasi dan diantaranya
dapat menurunkan, menghilangkan atau bahkan meningkatkan aktivitas enzim
(https://www.pharmvar.org/gene/CYP2A6). Polimorfisme gen CYP2A6 dapat
mengubah kecepatan aktivasi NNN dan NNK, dan meningkatkan risiko kanker
berhubungan dengan konsumsi tembakau (Rossini et al., 2008). Mayoritas dari
polimorfisme CYP2A6 adalah polimorfisme non-synonymous single nucleotide
(SNPs) yang terdapat pada ekson. CYP2A6 alel *1 merupakan wild type atau alel
normal pada gen CYP2A6 (Yoshida et al., 2002). Sedangkan salah satu varian dari
polimorfisme gen CYP2A6 yang dapat menyebabkan metabolisme enzim CYP2A6
menjadi lebih lambat (slow metabolizer) yang mengarah pada penurunan aktivasi
TSNA dan penurunan risiko kanker paru dibandingkan dengan normal metabolizer
adalah alel CYP2A6*4 (Malaiyandi et al., 2006; McDonagh et al., 2012; Tanner
dan Tyndale, 2017).
Bentuk polimorfi gen CYP2A6 banyak ditemukan pada orang-orang Asia,
dengan frekuensi alel nonaktif yang tinggi. Bentuk alel non aktif CYP2A6 yang
dapat dijumpai pada populasi Asia adalah CYP2A6 *4 dengan presentase sebesar
11-20% (Nakajima dan Yokoi, 2005). Alel CYP2A6*4 merupakan whole gene
deletion yang dapat berdampak fungsional pada tidak diekspresikannya mRNA dan
protein. Berkurangnya kemampuan ekspresi mRNA dari gen CYP2A6 akan
berkaitan dengan penurunan aktivitas metabolik total dari TSNA (Tanner dan
Tyndale, 2017). Hal ini diperkuat dengan hasil penelitian Mcdonagh (2012) yang
menyatakan bahwa frekuensi alel CYP2A6*4 berkisar antara 5-15% pada orang
Cina.
Indonesia adalah negara yang terkenal dengan keberagaman suku, dan
tercatat sedikitnya ada 300 suku di Indonesia. Salah satu suku yang terdapat di
Indonesia adalah suku Tionghoa dengan jumlah penduduk sekitar 2.832.510 jiwa
(Badan Pusat Statistik, 2010). Suku Tionghoa di Indonesia berasal dari dataran
Tiongkok/Cina yang kemudian menetap di Indonesia dan menikah dengan sesama
suku Tionghoa (Christian, 2017). Penelitian ini menggunakan subyek uji berupa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
suku Tionghoa nonperokok di Indonesia untuk mengidentifikasi adanya
polimorfisme gen CYP2A6 alel *4 pada populasi tersebut.
Penelitian ini difokuskan untuk mengidentifikasi adanya polimorfisme
terkait gen CYP2A6 khususnya alel *4 pada isolat DNA nonperokok suku
Tionghoa di Indonesia dan mengetahui frekuensinya. Metode Polymerase Chain
Reaction (PCR) adalah metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi alel
CYP2A6 *1 (wild type) dan CYP2A6 *4 (CYP2A6 deletion) (Shimizu et al., 2015;
Patramurti, 2017). PCR merupakan metode pengujian enzimatis yang digunakan
untuk mengamplifikasi suatu primer yang merupakan fragmen DNA pendek
dengan sekuen yang melengkapi target DNA (Garibyan and Avashia, 2013). Hasil
produk PCR akan dibaca dengan menggunakan metode elektroforesis.
METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini berupa sampel darah non
perokok suku Tionghua Indonesia. Primer forward :5’-CCT CAT CAC ACA CAA
CTT CCT C-3’ dan primer reverse : 5’- CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT
AG-3’ (Stella, 2017), blue tip, yellow tip, white tip, Promega Go Taq Green Master
Mix (berisi taq DNA polymerase, dNTP, MgC12, dan buffer), kit DNA isolasi
(FavorPrep Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) yang terdiri-dari FABG
buffer; etanol; W1 buffer; wash buffer, dan elution buffer, Nuclease Free Water
(Promega), FluoroVueTM Nucleid Acid Gel Stain (Smobio), Tris-Borate-EDTA
Buffer (TBE) pH 8,3 (10x) (Vivantis), Agarose Molecular Biology Grade
(Genedirex), DM3100 ExcelBandTM 1 KB (0.25-10 kb) DNA Ladder (Smobio),
DNA loading dye (bromophenol blue 25 mg; gliserol 3,3 mL; aqua pro injection
6,7 mL), etanol absolut (Sigma Chemical Co, St. Louis), aqua pro injection
(Ikapharmindo) dan es batu.
Alat Penelitian
Alat yang digunakan pada penelitian ini berupa Thermal cycler (Perkin
Elemer 2400), satu set elektroforensis horizontal (Sigma Aldrich), UV
Transilluminator (Fisher Scientific), Centrifuge (Fisher Scientific), disposable
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
gloves, ice box, microtubes 1,5 mL (Fisher Scientific), spuit injeksi 3 mL (Terumo),
mikropipet ukuran 1-10 µl (Socorex Acura 825), mikropipet ukuran 100-1000 µl
(Socorex Acura 825), timbangan analitik (Mettler AE 260), FABG column,
collection tube 2 mL, elution tube, hot plate (CimarecTM Thermo Scientific),
waterbath, vortex, oven, vacutainer K2 yang mengandung EDTA (4,5 mg), PCR ®
Tubes (Axygen), kamera mirrorless Fujifilm XA3 dan alat-alat gelas.
Tata Cara Penelitian
Penentuan Kriteria Subyek Uji Penelitian
Subyek uji pada penelitian ini berjumlah 30 orang yang memenuhi kriteria
inklusi. Subyek uji berjenis kelamin perempuan/laki-laki dewasa yang tidak
merokok atau pernah terpapar asap rokok. Subyek uji merupakan suku Tionghoa
asli minimal third degree relatives (kakek dan nenek orang Tionghoa asli) yang
tinggal di Yogyakarta (diketahui dari hasil wawancara). Subyek uji tidak sedang
mengkonsumsi obat rutin; tidak menderita penyakit hepar seperti hepatitis, sirosis
hati, hepatoma, dan penyakit lain yang dapat disebabkan oleh virus dan bakteri.
Pemilihan subyek uji dilakukan melalui wawancara langsung serta
pengisian kuisioner. Subyek uji dengan sadar bersedia menandatangani inform
consent. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang memenuhi kode etik yang telah
disetujui oleh Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Duta Wacana.
Pengambilan Sampel Darah pada Subyek Uji
Sampel darah dari 30 subyek uji diambil oleh petugas profesional perawat.
Sampel darah diambil dari pembuluh vena subyek uji dan ditampung dalam
vacutainer K2 yang mengandung EDTA (5,4 mg). Darah segar yang diperoleh dari
subyek uji disimpan pada suhu ±20°C sebelum dianalisis untuk identifikasi alel
CYP2A6*4.
Isolasi DNA
Isolasi DNA dari sampel darah 30 subyek uji yang berbeda dilakukan
dengan menggunakan reagen Favorprep ™ Blood Genomic DNA Extraction Mini
Kit. Sampel darah subyek uji sebanyak 200 µl disiapkan dan dipindahkan ke
microsentrifuge tube 1,5 ml lalu ditambahkan 20 µl Proteinase K dan 200 µl FABG
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
buffer ke dalam sampel. Proteinase K jangan dicampur ke dalam FABG buffer lalu
divortex sebentar. Sampel diinkubasi pada 60 °C selama 15 sambil divortex setiap
3 menit untuk dilisiskan. Sampel dilakukan 2 kali vortex selama 30 detik masing-
masing. Sampel dilanjutkan dengan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm
selama 30 detik dan supernatan dihilangkan dari tube. Sebanyak 200 µl etanol
absolut ditambahkan ke dalam sampel dan divortex selama 30 detik lalu dilanjutkan
dengan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 30 detik. Pada saat itu
juga, W1 Buffer dan wash buffer ditambahkan etanol pada saat pertama kali dibuka.
Selanjutnya, FABG column dipasangkan pada 2 mL collection tube. Sentrifugasi
selama 1 menit pada kecepatan maksimal (13000 rpm) lalu dibuang cairan dalam 2
ml collection tube tersebut dan dipindahkan ke dalam 2 mL collection tube baru.
Kemudian FABG column dicuci dengan 500 µl W1 buffer dan disentrifugasi pada
kecepatan maksimal (13000 rpm) selama 1,5 menit. Cairan yang ada pada 2 mL
collection tube dibuang. FABG column kemudian dicuci dengan 750 µl wash buffer
yang sudah ditambahkan etanol dan diulangi langkah seperti diatas. FABG column
diletakkan kembali pada collection tube dan disentrifugasi dengan kecepatan
maksimal (13000 rpm) selama 1,5 menit lalu dibuang sisa cairan dalam collection
tube. FABG column disentrifugasi pada kecepatan maksimal (13000 rpm) selama 4
menit untuk mengeringkan kolom. FABG column yang sudah kering dipasangkan
ke 1,5 ml elution tube lalu ditambahkan 200 µl elution buffer yang sudah
dipanaskan ke tengah membran FABG column lalu didiamkan dengan posisi tegak
selama 3 menit agar elution buffer dapat terserap pada membran FABG column lalu
disentrifugasi pada kecepatan maksimal (13000 rpm) selama 3 menit untuk
mengelusi DNA. Hasil isolasi DNA dari subyek uji disimpan pada suhu -70°C.
Penyiapan Gel Agarose
Elektroforesis menggunakan gel agarose 1% dibuat dengan menimbang
250 mg agarose untuk dilakukan dalam 25 mL larutan 1x TBE kemudian
dipanaskan di atas hot plate sampai mendidih sambil diaduk dengan menggunakan
magnetic stirrer hingga gel agarose larut, lalu ditambahkan 2,5 µl larutan nucleic
acid gel stain dan diaduk hingga homogen. Larutan dituang sebanyak 25 ml ke
dalam cetakan gel yang telah diberi sisiran pada tepi gel dan gel dibiarkan mengeras.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
Sisir dicabut setelah gel mengeras sehingga terbentuk sumur-sumur. Untuk
mengidentifikasi kemurnian isolat DNA digunakan konsentrasi agarose 1%, dan
digunakan konsentrasi agarose 1,5% untuk mengidentifikasi hasil PCR.
Analisis Kualitatif Isolat DNA
Isolat DNA sebanyak 4 µl ditambahkan aquabidest sebanyak 1 µl, lalu
ditambahkan loading dye sebanyak 1,0 µl. Kemudian campuran tersebut diambil
sejumlah 6 µl dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel menggunakan mikropipet.
Satu sumur gel diisi dengan 100 bp DNA ladder sebanyak 4 µl sebagai marker. Gel
agarosa ditempatkan di dalam gel tray elektroforesis berisi larutan buffer 1x TBE
dengan tegangan 100 volt selama 30 menit. Molekul DNA pada gel tray pada pH
netral akan bergerak ke kutub positif dari kutub negatif. Hasil elektroforesis berupa
gel agarosa dideteksi di bawah lampu UV Transilluminator kemudian
didokumentasikan dengan kamera DSLR. Panjang pita DNA dapat diketahui
dengan cara menarik garis lurus masing-masing pita DNA sampel dengan pita DNA
ladder.
Amplifikasi Alel CYP2A6 *4
Dilakukan amplifikasi untuk mendapatkan fragmen DNA dari alel
CYP2A6*4 dengan menggunakan primer forward: :5’-CCT CAT CAC ACA CAA
CTT CCT C-3’ dan primer reverse : 5’- CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT
AG-3’ (Stella, 2017). Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan Promega Go
Taq Green Marker Mix (berisi taq DNA polymerase, dNTP, MgC12, dan buffer)
dengan volume akhir campuran 25 µl, reagen 12,5 µl, primer forward 1,25 µl,
primer reverse 1,25µl, isolat DNA 5 µl, dan Nuclease-free water 5 µl. Amplifikasi
dilakukan dengan mesin PCR Thermal cycler (Perkin Elmer 2400). Kondisi PCR
yang digunakan yaitu sebagai berikut: initial denaturasi pada suhu 95°C (5’);
dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 98°C (20’’); annealing pada suhu 64 °C
(15’’) dan ekstensi pada suhu 72°C (30’’). Siklus amplifikasi dilakukan sebanyak
35 siklus kemudian diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C (5’) (Patramurti
et al., 2015).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
Analisis produk PCR Menggunakan Teknik Elektroforesis
Analisis hasil amplifikasi produk PCR dilakukan elektroforesis dengan
menggunakan gel agarose 1,5% yang telah ditambahkan nucleic acid gel stain.
Hasil produk PCR sebanyak 5 µl ditambahkan loading dye sebesar 1 µl lalu dari
campuran diambil sebanyak 6 µl dengan mikropipet lalu dimasukkan ke sumur-
sumur gel agarose. Salah satu sumur diisi dengan DNA ladder sebanyak 3,0 µl
sebagai marker. Gel agarose ditempatkan dalam gel tray elektroforesis berisi buffer
TBE 1x hingga permukaan gel terendam dan dilakukan running elektroforesis
dengan tegangan sebesar 110 volt selama 30 menit. Gel agarosa kemudian dideteksi
di bawah lampu sinar UV Transilluminator kemudian DNA yang terekspresi
didokumentasikan dengan kamera mirrorless Fujifilm XA3. Produk PCR yang
terbentuk pada yaitu panjang pita 350 bp merupakan wild type (CYP2A6*1)
sedangkan apabila pada panjang 350 bp tidak terbentuk pita maka subyek uji
dikatakan memiliki bentuk polimorfi CYP2A6 alel *4.
Analisis Hasil
Hasil elektroforesis dengan panjang pita 350 bp dapat mendeteksi adanya
alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 pada sampel. Terbentuknya hasil produk berupa
pita dengan panjang 350 bp menunjukkan bahwa isolat DNA yang dianalisis
memiliki alel CYP2A6*1. Jika tidak ditemukan hasil produk, dapat dinyatakan
bahwa isolat DNA yang dianalisis memiliki CYP2A6*4. Frekuensi alel CYP2A6*1
dan CYP2A6*4 dihitung dengan rumus berikut:
Frekuensi alel CYP2A6 ∗ 1 = Jumlah alel CYP2A6 ∗ 1 yang diperoleh
Jumlah seluruh subyek uji (30 orang)x 100 %
Frekuensi alel CYP2A6 ∗ 4 = Jumlah alel CYP2A6 ∗ 4 yang diperoleh
Jumlah seluruh subyek uji (30 orang)x 100 %
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian polimorfisme gen CYP2A6 ini dilakukan lima tahapan
utama, yaitu pemilihan subyek uji, isolasi DNA, analisis kualitatif isolat DNA,
amplifikasi alel CYP2A6 *4, dan analisis produk PCR (Polymerase Chain Reaction)
dengan metode elektroforesis. Pada penelitian ini digunakan PCR sebagai suatu
teknik sintesis untuk amplifikasi DNA secara in vitro sehingga dapat mengetahui
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
ada tidaknya polimorfisme berupa CYP2A6 *4 pada isolat DNA nonperokok suku
Tionghoa di Indonesia. Bentuk alel CYP2A6 *4 merupakan bentuk alel yang tidak
aktif, sedangkan alel CYP2A6 *7 dan alel CYP2A6 *9 merupakan alel yang akan
menyebabkan penurunan aktivitas enzim sehingga dapat menurunkan risiko kanker
paru-paru (Patramurti, 2017). Pemilihan alel CYP2A6 *4 dikarenakan bentuk
polimorfi enzim CYP2A6 banyak ditemukan pada orang Asia dengan frekuensi alel
non aktif yang tinggi. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi terkait
variasi alel pada populasi nonperokok suku Tionghoa di Indonesia. Penelitian ini
juga dapat dijadikan dasar edukasi di bidang Farmasi sebagai usaha preventif
merokok dan ketergantungan terhadap rokok dengan informasi terkait CYP2A6 *4.
Pemilihan Subyek Uji
Penelitian ini menggunakan subyek uji berjumlah 30 orang yaitu 17 orang
berjenis kelamin perempuan dan 13 orang berjenis kelamin laki-laki dewasa (17-25
tahun), keturunan suku Tionghoa asli minimal third degree relatives (kakek dan
nenek orang Tionghoa asli) yang tinggal di Yogyakarta. Dewasa yang dimaksud
dalam kriteria merupakan individu yang memiliki pertanggung jawaban penuh
terhadap diri sendiri, memahami norma-norma susila dan nilai-nilai etis, serta dapat
mengerti isi dari inform consent. Subyek uji yang digunakan tidak sedang
mengkonsumsi obat rutin; menderita penyakit hepar seperti hepatitis, sirosis hati,
hepatoma. Metode PCR dapat mendeteksi DNA baik manusia maupun DNA virus
dan bakteri, sehingga subjek uji yang mengalami penyakit akibat virus dan bakteri
di eksklusi. Subyek uji dipilih sejumlah 30 orang karena jumlah tersebut sudah
dapat digunakan untuk mendeteksi dua alel pada penelitian ini yaitu CYP2A6 *1
(wild type)/ alel utama dan CYP2A6 *4 (alel minor) dengan probabilitas tinggi (B-
Rao, 2001). Jumlah sampel minimal yang dibutuhkan untuk melihat polimorfisme
pada alel yang langka dapat dihitung dengan persamaan dibawah ini:
Nmin ≥ log (1-π )/2 log (1-fmin)
Dengan keterangan Nmin menunjukkan jumlah sampel minimal, π (phi)
menunjukkan probabilitas alel utama (0,95) dan fmin menunjukkan Frekuensi Alel
Minor (0,05). Berdasarkan hasil yang didapatkan maka dapat disimpulkan jumlah
sampel minimal untuk penelitian ini adalah lebih dari 29 orang (B-rao, 2001).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Isolasi DNA
Isolasi DNA dari sampel darah dilakukan dengan menggunakan
Favorprep™ Blood Genomic DNA Extraction Mini Kit. Tujuan isolasi DNA adalah
untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah berupa penghancuran (lisis) membran
dan dinding sel yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel dengan menambahkan
FABG buffer dan ditambahkan Proteinase K (Hidayati et al., 2016). Selain untuk
melisiskan sel, Proteinase K juga berfungsi untuk menghilangkan kontaminan
berupa protein dengan cara mendegradasi protein atau menghancurkan protein
sehingga membran sel rusak dan seluruh isi sel keluar (Fitriya et al., 2012;
Kameliah, 2017). Dalam proses ini digunakan vortex untuk membantu proses lisis
sel dengan prinsip menggunakan bantuan listrik (Utami, et al,, 2013). Sampel yang
sudah divortex akan diinkubasi pada 60 °C selama 15 menit dan perlu dibolak-balik
dengan tujuan agar larutan buffer dapat melisiskan sel dengan sempurna (Mulyani
et al., 2011). Sampel disentrifugasi agar terjadi pemisahan DNA dari bahan padat
seperti protein. Setelah tahapan pemisahan DNA, sampel ditambahkan dengan
etanol absolut dengan tujuan untuk mempresipitasi DNA agar DNA dapat
menggumpal dan membentuk struktur fiber dan pellet DNA yang berupa endapan
kering setelah disentrifugasi (Hidayati et al., 2016). Presipitasi juga berfungsi untuk
menghilangkan residu-residu yang berasal dari tahapan ekstraksi/pemisahan DNA.
Selanjutnya dilakukan tahapan pencucian DNA dengan ditambahkan W1 Buffer dan
wash buffer untuk memisahkan senyawa lain dan menghilangkan residu etanol dan
sisa garam yang ikut mengendap bersama endapan DNA untuk memurnikan DNA
dan berfungsi sebagai langkah awal protokol elusi (Mulyani et al., 2011; Utami et
al., 2013; Kamaliah, 2017). Setelah itu, FABG column diletakkan kembali pada
collection tube dan disentrifugasi dengan kecepatan maksimal (13000 rpm) selama
4 menit untuk mengeringkan kolom. FABG column yang sudah kering ditambahkan
elution buffer untuk mengelusi DNA sehingga dihasilkan DNA yang murni
sebelum sentrifugasi pada tahap terakhir (Utami et al., 2013). Tahap purifikasi
bertujuan untuk memurnikan DNA dari makromolekul sel lainnya setelah sel
dihancurkan. Terakhir, ekstrak DNA yang telah diperoleh dan terlarut dalam buffer
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
disimpan di dalam freezer yang bersuhu -20 °C agar DNA hasil isolasi tidak rusak
(Marwayana, 2019). Kemurnian dari isolat DNA yang diisolasi dapat ditentukan
dari ada tidaknya kontaminan seperti protein dan RNA dengan menggunakan
teknik elektroforesis (Hidayati et al., 2016).
Analisis Kualitatif Isolat DNA
Hasil isolasi DNA diuji secara kualitatif dengan teknik elektroforesis
menggunakan gel agarose 1% (Hidayati et al., 2016). Isolat DNA yang telah
dijalankan (running) dengan teknik elektroforesis kemudian diamati dan hasilnya
akan berupa pita-pita DNA yang tervisualisasi dibawah UV transilluminator.
Kemurnian isolat DNA dapat diketahui dengan adanya pita tunggal DNA jika
diamati dibawah UV transilluminator. Bila sampel DNA menunjukkan hasil berupa
pita tunggal yang terang dan tebal maka disimpulkan sampel DNA memiliki
konsentrasi dan tingkat kemurnian yang tinggi. Namun apabila pita yang
didapatkan menunjukkan hasil yang tipis, maka hal tersebut mengindikasikan
bahwa konsentrasi DNA yang dihasilkan kecil (Mulyani et al., 2011; Hidayati et
al., 2016). Hasil elektroforesis menunjukkan terbentuknya pita tunggal yang terang
dan tebal dengan ukuran lebih dari 10000 bp (Gambar 1).
Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA
menggunakan teknik elektroforesis
Keterangan:
M : 1KB (0,25-10 kb) DNA ladder sebagai marker
1-5 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tebal
Kondisi elektroforesis : Fase diam agarose 1,0%; fase gerak larutan TBE 1X, volume injeksi 6 µl;
kecepatan 100 V/cm selama 30 menit
M 1 2 3 4 5
10000 bp Isolat
DNA
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
Bila terdapat smear berarti sampel isolat DNA yang diteliti tidak murni,
tercemar atau terdapat kontaminan bahkan terdegradasi. Smear merupakan sisa dari
larutan-larutan yang masih terbawa selama proses isolasi atau DNA yang
terdegradasi pada proses isolasi (Mulyani et al., 2011). Hasil uji kualitas isolat DNA
yang dilakukan menunjukkan sampel isolat DNA bersifat murni dan dapat
digunakan sebagai template untuk identifikasi polimorfisme CYP2A6 *4
(Patramurti et al., 2017).
Amplifikasi Alel CYP2A6 *4
Polimorfisme gen CYP2A6 dapat mengubah kecepatan aktivasi NNN dan
NNK sehingga dapat menurunkan risiko terjadinya kanker paru yang berhubungan
dengan produk tembakau (Rossini et al., 2008). Alel CYP2A6 *1 merupakan
bentuk aktif CYP2A6, dan merupakan alel normal (wild type) sedangkan CYP2A6
*4 merupakan bentuk tidak aktif. Subyek dengan alel CYP2A6 *1/*4 termasuk
dalam golongan slow metabolizer dan dapat mengalami penurunan aktivitas enzim
sebesar 50%. Aktivasi senyawa prokarsinogen dapat meningkatkan resiko
terjadinya kanker paru yang disebabkan oleh asap rokok (Akrodou, 2015; Tanner
dan Tyndale, 2017). Alel CYP2A6*4 terdiri dari crossover homolog yang tidak
sama dengan CYP2A7 pada beberapa posisi (CYP2A6 *4A-F) yang mengarah
terjadinya delesi pada keseluruhan gen secara homogen sehingga berdampak
fungsional pada tidak diekspresikannya mRNA dan protein atau hilangnya aktivitas
enzimatik (Ito et al., 2015; Lopez-Flores et al., 2016).
Amplifikasi alel CYP2A6*4 pada penelitian ini dilakukan dengan
menggunakan metode PCR. Komponen-komponen yang diperlukan dalam proses
amplifikasi dengan metode PCR adalah berupa template DNA; sepasang primer,
yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang
komplementer dengan urutan nukleotida DNA template; dNTPs (Deoxynucleotide
triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim DNA
polimerase (Handoyo dan Rudiretna, 2001). Pada penelitian ini, kondisi PCR
optimum yang digunakan yaitu initial denaturasi pada suhu 95°C (5’); dilanjutkan
dengan denaturasi pada suhu 98 °C (20’’); annealing pada suhu 64°C (15’’) dan
ekstensi pada suhu 72°C (30’’). Siklus amplifikasi dilakukan sebanyak 35 siklus
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
kemudian diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C (5’) (Patramurti et al.,
2015). Proses pemilihan primer juga sangat penting dilakukan karena pemilihan
primer berkaitan dengan keberhasilan proses amplifikasi DNA target (Surahman et
al., 2007). Jika primer yang digunakan tidak spesifik dan tidak sesuai dengan
sekuens nukleotida target maka proses penggandaan oleh enzim taq-polymerase
tidak akan terjadi sehingga amplifikasi tidak dapat berlangsung. Optimasi suhu
annealing juga penting untuk dilakukan karena berkaitan dengan spesifisitas
produk PCR dan keberhasilan amplifikasi produk PCR. Jika suhu annealing terlalu
rendah, maka penempelan primer pada DNA template tidak spesifik dan akan
menyebabkan multiple band pada hasil elektroforesis sehingga menghasilkan
produk PCR yang tidak spesifik (unspecific band), bila suhu annealing yang terlalu
tinggi maka penempelan primer pada DNA template akan lepas sehingga hasilnya
dapat menjadi kurang jelas (Hidayati et al., 2016; Yuenleni et al., 2019). Untuk
mengamplifikasi fragmen DNA dari alel CYP2A6 *4, digunakan primer spesifik
yang akan menempel pada CYP2A6 *1. Primer yang digunakan berupa primer
forward: 5’-CCT CAT CAC ACA CAA CTT CCT C-3’ dan primer reverse: 5’-
CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG-3’. Situs penempelan primer pada
sekuen urutan basa potongan gen CYP2A6 *1 diilustrasikan pada Gambar 2.
Alel CYP2A6 *1
Primer forward
5’ 3’
CCT CATCACACACAACTTCCT C CTACCAAGCACCCAGTACCTGCG
GGAGTAGTGTGTGTTGAAGGAG GATGGTTCGTGGGTCATGGACGC
5’ 3’
Primer reverse
Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen urutan basa potongan gen
CYP2A6*1
Keterangan:
: arah penempelan primer reverse
: arah penempelan primer forward
Identifikasi ada tidaknya CYP2A6*4 menggunakan primer forward dan
reverse spesifik untuk mengamplifikasi CYP2A6*1. Amplifikasi dengan
menggunakan primer spesifik tersebut dapat menghasilkan produk PCR berukuran
350-bp yang merupakan alel normal (CYP2A6 *1). Isolat DNA dari subyek uji
yang memiliki alel CYP2A6 *4 tidak akan membentuk pita pada saat diamati
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
dibawah UV Transilluminator karena alel *4 memiliki perbedaan basa G (guanin)
menjadi A (adenin) pada sisi penempelan primer reverse dengan alel *1 pada basa
ke -10993.
Adanya perbedaan basa antara CYP2A6 *1 dan CYP2A6 *4 dapat dilihat
dari gambar 3 sebagai berikut:
A : CCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGGCACCGAAGTGTTCCC
B : CCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGGCACCGAAGTGTTCCC
A : TATGCTGGGCTCTGTGCTGAGAGACCCCAGTTTCTTCTCCAACCCCCAGG
B : TATGCTGGGCTCCGTGCTGAGAGACCCCAGCTTCTTCTCCAACCCTCAGG
A : ACTTCAATCCCCAGCACTTCCTGAATGAGAAGGGGCAGTTTAAGAAGAGT
B : ACTTCAATCCCCAGCATTTCCTGAATGAGAAGGGGCAGTTTAAGAAGAGT
A : GATGCTTTTGTGCCCTTTTCCATCGGTAAGAGACCACTGTTTGCTGCCAG
B : GATGCTTTTGTGCCCTTTTCCATCGGTAAGAGACCACTGTTTGCTGCCAG
A : GCCACGGCTCACACCAGCAGGGGCCTCCCTCACCCTCCTCCCCTCTCTGC
B : GCCACGGCTCACACCAGCAGGCGCCTCCCTCACCCTCCTCCCCTCTCTGC
A : GGTGTAGCCTGGTATTTCTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGAATCTACCC
B : GGTGTAGCCTGGTATTTCTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGAATCTACCC
A : TTGAGCCAGCAGCTGATACTTCCTTAACTACCAAGCACCCAGTACCTGCG
B : TTGAGCCAGCAGCTGATACTTCCTTAACTACCAAGCACCCAGTACCTGCA
Gambar 3. Urutan nukleotida potongan urutan basa CYP2A6 *1 dan *4
Keterangan :
A : potongan urutan basa CYP2A6 *1
B : potongan urutan basa CYP2A6 *4
Analisis Produk PCR dengan Teknik elektroforesis
Pada penelitian yang dilakukan oleh Antona et al (2009) dijelaskan proses
polimorfisme genetik yang terjadi dan gen dapat mempengaruhi peningkatan risiko
kanker yang disebabkan oleh paparan asap rokok. Berdasarkan pengelompokkan
genotip dari CYP2A6, maka aktivitas enzim CYP2A6 dapat dibagi menjadi tiga
kelompok, yaitu normal metabolizers (genotipe CYP2A6*1/*1), slow metabolizers
(genotipe CYP2A6*1/*4; CYP2A6*1/*9, CYP2A6*1/*9/*4, CYP2A6*9/*9)
aktivitas metabolismenya 50% lebih lambat dibandingkan dengan normal
metabolizers) dan poor metabolizers (genotipe CYP2A6*4/*4, CYP2A6*4/*9);
aktivitas metabolismenya 25% lebih lambat dibandingkan dengan normal
metabolizers) (Mwenifumbo et al., 2010).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
Hasil produk PCR dapat diidentifikasi dengan menggunakan teknik
elektroforesis. Urutan basa potongan alel CYP2A6 *1 dan CYP2A6 *4 memiliki
perbedaan pada basa -10993 sehingga menyebabkan tidak terjadinya amplifikasi
dan tidak terbentuknya pita gel agarosa. Gambar 4 Menunjukkan hasil
elektroforesis produk PCR yang diamati dengan UV transilluminator dan
didokumentasikan dengan kamera DSLR mirrorless Fujifilm XA3. Dari gambar
tersebut dapat dilihat bahwa lima dari tujuh isolat DNA yang diamplifikasi
menghasilkan produk PCR dengan panjang pita 350-bp. Terbentuknya hasil produk
berupa pita dengan panjang 350-bp menunjukkan bahwa isolat DNA yang
dianalisis memiliki alel normal CYP2A6*1 (wild type). Apabila hasil menunjukan
bahwa tidak terbentuk pita pada panjang 350-bp maka dapat dinyatakan bahwa
isolat DNA yang dianalisis memiliki CYP2A6*4 karena tidak terjadi amplifikasi.
Hasil produk PCR yang tidak dapat diamplifikasi dan tidak membentuk pita
menunjukkan bahwa subyek uji mengalami polimorfisme sehingga tidak dapat
diamplifikasi menggunakan primer yang digunakan.
Gambar 4. Elektroforegram produk PCR dari berbagai hasil pita
Keterangan:
M : 1KB (0,25-10 Kb) DNA ladder sebagai marker
2&6 : tidak terbentuk pita pada produk PCR
1,3-5,7 : produk PCR dengan pita tebal dan tunggal
Kondisi elektroforesis : Fase diam agarose 1,5%; fase gerak larutan TBE 1X, volume injeksi
6 µl; kecepatan 110 V/cm selama 30 menit
Dari 30 sampel yang diamplifikasi dan dianalisa dengan menggunakan
teknik elektroforesis, didapatkan bahwa 9 sampel tidak menghasilkan pita dan 21
sampel menghasilkan pita. Sehingga dengan demikian, pada penelitian ini
M 1 2 3 4 5 6 7
Produk PCR
350-bp
10000 bp
500 bp
200 bp Produk PCR
350-bp
dengan pita
tunggal dan
terang
Produk PCR
tidak
terbentuk
ekspresi pita
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
teridentifikasi sebanyak 21 orang (70%) dari subyek yang diuji memiliki alel aktif
(CYP2A6*1) dan 9 orang (30%) memiliki bentuk alel tidak aktif (CYP2A6*4) dan
data tersebut disajikan dalam tabel 1. Subjek yang memiliki alel CYP2A6*4 tidak
dapat mengaktivasi nitrosamin seperti NNK dan NNN yang terkandung dalam asap
tembakau sebagai karsinogen hasil nikotin, sehingga hal ini akan berakibat pada
berkurangnya risiko kanker yang diinduksi oleh asap rokok dari tembakau (Liu et
al., 2013).
Tabel I. Frekuensi Alel CYP2A6 *1 dan alel CYP2A6 *4 pada suku Tionghoa
Alel Jumlah Subyek Frekuensi Alel
CYP2A6 *1 21 70%
CYP2A6 *4 9 30%
Hasil penelitian menunjukkan bahwa 9 dari subyek uji nonperokok
termasuk dalam kategori slow metabolizer. Keberadaan alel CYP2A6 *4
menandakan subyek uji dapat mengalami penurunan aktivasi prokarsinogen
sehingga hal tersebut dapat berdampak pada penurunan risiko kanker paru yang
disebabkan oleh asap rokok (Tanner dan Tyndale, 2017). Namun, hal tersebut tidak
menutup kemungkinan bahwa individu dengan polimorfisme alel CYP2A6 *4 tidak
akan mengalami kanker paru karena faktor penyebab kanker paru juga mencakupi
antara lain: makanan, hormon, alcohol, paparan sinar matahari (Blackadar, 2016).
Polimorfisme gen CYP2A6 *4 juga dapat mempengaruhi metabolisme
beberapa obat, seperti: obat prodrug Tegafur yang dimetabolisme menjadi
5’hydroxytegafur dan dapat dipecah menjadi 5-fluorouracil (5 FU) yang kemudian
menjadi metabolit aktif untuk terapi antikanker. Gen delesi alel CYP2A6*4 dapat
menurunkan kadar mRNA dan protein pada sampel hati manusia secara signifikan
sehingga berkorelasi dengan penurunan metabolisme Tegafur secara in vitro dan in
vivo. Dengan adanya genotipe CYP2A6 poor-metabolizer menyebabkan penurunan
metabolisme Tegafur menjadi 5-FU sehingga menurunkan efikasi anti-tumor.
Selain itu, individu yang memiliki gen delesi alel *4 juga dapat meningkatkan kadar
plasma obat asam valproat yang digunakan sebagai terapi anti-epilepsi sehingga
menurunkan aktivitas metabolit enzim CYP2A6 yang kemudian menginduksi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
peningkatan paparan terhadap obat yang berakibat hepatotoksisitas pada manusia
(Mcdonagh et al., 2012). Sehingga penelitian terkait polimorfisme enzim ini
penting untuk dilakukan lebih lanjut agar dapat mendeteksi tingkat risiko suatu
penyakit dalam suatu populasi dan dapat meningkatkan pemahaman suatu
mekanisme penyebab/etiologi penyakit (Kelada et al., 2003).
KESIMPULAN
Hasil amplifikasi isolat DNA pada subyek uji suku Tionghoa di Indonesia
yang dianalisis dengan teknik elektroforesis menunjukan bahwa terdapat 9 individu
yang teridentifikasi mengalami polimorfisme dan memiliki alel CYP2A6 *4
sehingga didapatkan frekuensi alel tersebut yaitu sebesar 30%.
SARAN
Peneliti menyarakan perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai
identifikasi gen sitokrom CYP2A6 di Indonesia dengan jumlah subyek uji lebih
besar dan terdistribusi merata di Indonesia.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
DAFTAR PUSTAKA
Antona, C. R., Gomez, A., Karlgren, M., Sim, S. C., dan Ingelman-Sundberg, M.,
2009. Molecular Genetics and Epigenetics of the Cytochrome P450 Gene
Family and Its Relevance for Cancer Risk and Treatment. Human
Genetics, 127, 1-17.
Barber, S., Adioetomo, S. M., Ahsan, A., dan Setyonaluri, D., 2008. Tembakau di
Indonesia. Jakarta: Lembaga Demografi Fakultas Ekonomi Universitas
Indonesia.
Blackadar, C. B., 2016. Historical review of the causes of cancer. World Journal of
Clinical Oncology, 7(1), 54.
B-rao, C., 2001. Sample size considerations in genetic polymorphism studies.
Human heredity, 52, 191-200.
Brown, B. G., Borschke, A. J., & Doolittle, D. J., 2003. An Analysis of the Role of
Tobacco-Specific Nitrosamines in the Carcinogenicity of Tobacco
Smoke. Nonlinearity in Biology, Toxicology, Medicine, 1(2),
154014203914343.
Christian, S. A., 2017. Identitas Budaya Orang Tionghoa Indonesia. Jurnal
Cakrawala Mandarin, 1(1), 11-22.
Fitriya, R. T., Ibrahim, M., dan Lisdiana, L., 2015. Keefektifan Metode Isolasi DNA
Kit dan CTAB/NaCl yang Dimodifikasi pada Staphylococcus aureus dan
Shigella dysentriae, LenteraBio, 4(1), 87-92.
Flores, L., Rubio, P., dan Valencia, F., 2017. Distribution of Polymorphic Variants
of CYP2A6 And Their Involvement in Nicotine Addiction. Experimental
and Clinical Science Journal, 16, 174-196.
Garibyan, L., dan Avashia, N., 2013. Polymerase Chain Reaction. Journal of
Investigative Dermatology, 133(3), 1–4.
Gupta, C., 2001. The Public Health Impact Tobacco. Current Sciences, 81(5).
Handoyo, D., dan Rudiretna, A., 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase
Chain Reaction (PCR). Unitas, 9(1), 17-29.
Hidayati, Saleh. E., dan Aulawi, T., 2016. Identifikasi Keragaman Gen Bmpr-1b
(Bone Morphogenetic Protein Receptor Ib) Pada Ayam Arab,Ayam
Kampung Dan Ayam Ras Petelur Menggunakan PCR-RFLP. Jurnal
Peternakan, 13(1), 1-12.
Hoffman, D., dan Hoffman, I., 1997. The Changing Cigarette, 1950-1995. Journal
of Toxicology and Enviromental Health, 50(4), 307-364.
Ito, T., Tsuji, M., Mori, Y., Kanda, H., Hidaka, T., Kakamu, T., Fukushima, And
T., 2015. Effect Of Cyp2a6*4 Genetic Polymorphisms On Smoking
Behaviors And Nicotine Dependence In A General Population Of
Japanese Men. Fukushima Journal Of Medical Science, 61(2), 125–130.
Kamaliah, 2017. Perbandingan Metode Ekstraksi DNA Phenol-Chloroform dan Kit
Extraction Pada Sapi Aceh Dan Sapi Madura, Jurnal Biotik, 5(1), 60-65.
Kelada, S. N., Eaton, D. L., Wang, S. S., Rothman, N. R., & Khoury, M. J., 2003.
The Role of Genetic Polymorphisms in Environmental Health.
Environmental Health Perspectives, 111(8), 1055–1064.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Liu, Y., Xu, Y., Li, F., Chen, H., & Guo, S., 2013. CYP2A6 deletion polymorphism
is associated with decreased susceptibility of lung cancer in Asian
smokers: a meta-analysis. Tumor Biology, 34(5), 2651–2657.
Malaiyandi, V., Lerman, C., Benowitz, NL., Jepson, C., Patterson, F., dan Tyndale,
R. F., 2006. Impact of CYP2A6 Genotype On Pretreatment Smoking
Behaviour and Nicotine Levels from and Usage of Nicotine Replacement
Therapy. Molecular Psychiatry, 11, 400-409.
Marwayana, O., 2015. Ekstraksi Asam Deoksiribonukleat (DNA) Dari Sampel
Jaringan Otot. Oseana, 9(2), 1-9.
McDonagh, E. M., Wassenaar, C., David, S. P., Tyndale, R. F., Altman, R. B.,
Carrillo-Whirl, M., dan Klein, T. E., 2012. PharmGKB Summary: Very
Important Pharmacogene Information For Cytochrome P-450, family 2,
subfamily A, polypeptide 6. Pharmacogenetics and Genomics, 22, 695-
708.
Mulyani, Y., Purwanto, A., dan Nurruhwati, I., 2011. Perbandingan Beberapa
Metode Isolasi DNA untuk Deteksi Dini KOI Herpes Virus (KHV) pada
Ikan Mas (Cyripnus caprio L.). Jurnal Akuatika, 2(1), 2-15.
Mwenifumbo, J. C., Zhou, Q., Benowitz, N. L., Sellers, E. M., & Tyndale, R. F.,
2010. New CYP2A6gene deletion and conversion variants in a population
of Black African descent. Pharmacogenomics, 11(2), 189–198.
Nakajima, M., & Yokoi, T., 2005. Interindividual Variability in Nicotine
Metabolism: C-Oxidation and Glucuronidation. Drug Metabolism and
Pharmacokinetics, 20(4), 227–235.
Patramurti, C., dan Fenty, 2017. Studi Genotipe Sitokrom P450 2A6 Alel
CYP2A6*4 dan CYP2A6*9 pada Subyek Uji Perokok Suku Jawa
Indonesia. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 15(1), 50-56.
Plianbangchang, S., 2011. Global Adult Tobacco Survey: Indonesia.
Raunio, H., Rautio, A., Gullsten, H., dan Pelkonen, O., 2001. Polymorphisms of
CYP2A6 and Its Practical Consequences. Journal of Clinical
Pharmacology, 52, 357-363.
Rossini, A., Simao, T. A., Albano, R. M., Pinto, L. F. R., 2008. CYP2A6
Polymorphisms and Risk for Tobacco-Related Cancers.
Pharmacogenomics, 9 (11), 1737-1752.
Shimizu, M., Koyama, T., dan Kishimoto, I., 2015. Dataset for Genotyping
Validation of Cytochrome P450 2A6 Whole-gene Deletion (CYP2A6 *4)
By Real-Time Polymerase Chain Reaction Platforms, Elsevier, 642-645.
Tanner, J. A., dan Tyndale, R. F., 2017. Variation in CYP2A6 Activity and
Personalized Medicine. Journal of Personalized Medicine, 7(18), 1-29.
Utami, S. T., Kusharyati, D. F., dan Pramono, H., 2013. Pemeriksaan Bakteri
Leptospirapada Sampel Darah Manusia Suspect Leptospirosis
Menggunakan Metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Balaba, 9(2),
74-81.
WHO, 2019. Second Hand Tobacco Smoke (Online).
https://www.who.int/tobacco/research/secondhand_smoke/en/ diakses
pada tanggal 20 April 2019, pukul 19.20
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
Xue, J., Yang, S., dan Seng, S., 2014. Mechanisms of Cancer Induction by Tobacco-
Specific NNK and NNN. Cancers (Basel), 6(2), 1138-1156.
Yoshida, R., Nakajima, M., Watanabe, Y., Kwon, J.-T., & Yokoi, T., 2002. Genetic
polymorphisms in human CYP2A6 gene causing impaired nicotine
metabolism. British Journal of Clinical Pharmacology, 54(5), 511–517.
Yuenleni, 2019. Langkah-Langkah Optimasi PCR. Indonesian Journal of
Laboratory, 1(3), 51-56.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Lampiran 4. Product Datasheet of Primer Forward and Reverse CYP2A6 *4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Lampiran 5. Product Datasheet of DNA ladder and marker
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Lampiran 6. Product Datasheet of FluorovueTM Nucleid Acid Gel Stain
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Lampiran 7. Product Datasheet of FavorPrepTM Blood Genomic Mini DNA
Extraction Kit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Lampiran 8. Elektrofogram Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA Suku Tionghoa
M 1 2 3 4 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Lampiran 9. Elektroforegram Hasil PCR CYP2A6 *4
M 1 2 3 4 5 6 7
M 8 9 10 11 12 13 14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
M 15 16 17 18 19 20 21
M 22 23 24 25 27 28 26
M 29 30
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
Lampiran 10. Data Subyek
Kode Polimorfisme
CYP2A6 *4
Risiko terkena
kanker paru akibat
asap rokok
1T Tidak ada Normal
2T Ada Rendah
3T Tidak ada Normal
4T Tidak ada Normal
5T Tidak ada Normal
6T Ada Rendah
7T Tidak ada Normal
8T Tidak ada Normal
9T Tidak ada Normal
10T Tidak ada Normal
11T Tidak ada Normal
12T Tidak ada Normal
13T Tidak ada Normal
14T Ada Rendah
15T Tidak ada Normal
16T Ada Rendah
17T Tidak ada Normal
18T Tidak ada Normal
19T Tidak ada Normal
20T Tidak ada Normal
21T Tidak ada Normal
22T Tidak ada Normal
23T Ada Rendah
24T Tidak ada Normal
25T Tidak ada Normal
26T Tidak ada Normal
27T Ada Rendah
28T Ada Rendah
29T Ada Rendah
30T Ada Rendah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
Lampiran 11. Frekuensi Alel
Alel Jumlah Subyek Frekuensi Alel
CYP2A6 *1 21 70%
CYP2A6 *4 9 30%
Frekuensi alel CYP2A6 ∗ 1 = Jumlah alel CYP2A6 ∗ 1 yang diperoleh
Jumlah seluruh subyek uji (30 orang)x 100 %
=21
30x 100% = 70%
Frekuensi alel CYP2A6 ∗ 4 = Jumlah alel CYP2A6 ∗ 4 yang diperoleh
Jumlah seluruh subyek uji (30 orang)x 100 %
=9
30x 100% = 30%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
Lampiran 12. Inform Consent
FORMULIR KUISIONER SUBJEK UJI
Nama : ..........................................................
Tempat/tgl.lahir : ..........................................................
Umur : .............tahun
Jenis kelamin : laki-laki/perempuan
No. Tlp. (WhatsApp) : .........................................................
Alamat : .....................................................................................
...............................
Jawablah pertanyaan berikut!
1. Apakah Anda merupakan keturunan asli Papua?*
Jawab : Ya/Tidak
*Asli Papua : Kakek dan nenek, Ibu dan Bapak keturunan asli Papua
2. Apakah Anda seorang perokok?
Jawab : Ya/Tidak
3. Apakah Anda pernah merokok?
Jawab : Ya/Tidak
4. Jika Anda pernah merokok, kapan terakhir kali Anda merokok? (jika
tidak pernah merokok, tidak perlu menjawab pertanyaan ini)
A. < 5 tahun
B. > 5 tahun
5. Apakah Anda tinggal di lingkungan perokok?
Jawab : Ya/Tidak
6. Seberapa sering orang lain merokok di dalam tempat tinggal Anda?
A. Setiap hari
B. Setiap minggu
C. Setiap bulan
D. Tidak pernah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
7. Seberapa sering anda terpapar asap rokok orang lain?
A. Tidak pernah
B. Jarang/kadang-kadang
C. Sering
D. Sangat sering
8. Apakah saat ini anda sedang sakit?
A. Tidak
B. Ya
9. Jika anda sedang sakit, sakit apa yang anda alami? Dan sudah berapa
lama?
Jawab: ............................................................./.....................................
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
LEMBAR INFORMASI UNTUK RESPONDEN
Saya Dr. Christine Patramurti, Apt. dari Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma akan melakukan penelitian yang berjudul “Identifikasi Alel Gen
Sitokrom P450 2A6 *4, *7, dan *9 pada Subjek Uji Nonperokok Suku Tionghoa
dan Ras Kulit Hitam Papua Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction
(PCR)”. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan dan frekuensi alel
gen Sitokrom P450 2A6 *4, *7, dan *9 pada subjek uji nonperokok suku Tionghoa
dan ras kulit hitam Papua Indonesia. Peneliti mengajak saudara/i, untuk ikut serta
dalam penelitian ini. Penelitian ini membutuhkan sekitar 30 subjek uji, dengan
jangka waktu keikutsertaan masing-masing subjek sekitar 2 hari.
A. Kesukarelaan untuk ikut penelitian
Keikutsertaan saudara/i bersifat sukarela, saudara/i dapat mengundurkan
diri dari penelitian setiap saat tanpa dikenakan denda.
B. Prosedur Penelitian
Penelitian ini akan dilakukan pada penduduk Indonesia dari suku
Tionghoa dan ras kulit hitam Papua. Semua subjek uji berjenis kelamin laki-laki atau
perempuan dan merupakan penduduk asli Indonesia ras Tionghoa dan ras kulit hitam
Papua asli, yang ditunjukkan dari Kartu Identitas Penduduk yang dimiliki dan telah
mengisi kuisioner serta inform consent.
Subjek uji kelompok nonperokok yang terpapar asap rokok orang lain
(perokok pasif), dalam keadaan sehat yaitu tidak sedang sakit akibat virus atau
bakteri. Jumlah subjek uji masing-masing 30 orang untuk tiap kelompok suku
Tionghoa dan ras kulit hitam Papua.
Sampel biologis yang akan digunakan pada penelitian ini berupa sampel
darah. Jumlah sampel biologis yang diambil adalah sebanyak 3 mL. Sampel darah
yang diambil dibagian pembuluh darah vena.
Pengambilan sampel darah akan dilakukan di Laboratorium Biokimia
Universitas Sanata Dharma oleh tim medis (perawat) yang terlatih,
berpengalaman, dan professional.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
C. Risiko dan Efek Samping dan Penanganannya
Pada penelitian ini tidak dilakukan pemberian intervensi kepada subjek
uji. Risiko yang mungkin terjadi pada saat pengambilan darah diatasi dengan
mengeliminasi subjek yang mungkin tidak punya keberanian untuk diambil
darahnya. Ruangan yang memadai saat pengambilan darah juga mendukung
situasi yang aman bagi subjek uji. Selain itu setelah pengambilan darah, subjek uji
diberikan waktu untuk istirahat.
Untuk memperkecil risiko yang mungkin terjadi, pengambilan darah
dilakukan oleh tenaga medis perawat yang terlatih, berpengalaman, dan
professional. Alat-alat yang dipakai juga telah memenuhi standar untuk proses
pengambilan darah.
D. Manfaat
Penelitian ini mempunyai manfaat bagi subjek uji, yaitu memberikan
informasi bahwa risiko kanker akibat paparan asap rokok orang lain dapat
dipengaruhi gen individu tersebut.
E. Kerahasiaan
Informasi yang didapat dari penelitian ini bersifat rahasia, hanya akan
digunakan untuk tujuan penelitian.
F. Pembiayaan
Jika pada saat pengambilan sampel darah terjadi kesalahan yang
mengakibatkan subjek mengalami pendarahan, maka semua beban biaya yang
dikeluarkan untuk mengatasi kesalahan ini ditanggung sepenuhnya oleh peneliti.
G. Kompensasi
Peneliti mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada saudara/i
yang telah berkenan ikut serta dalam penelitian ini. Serta sebagai ungkapan terima
kasih peneliti memberikan uang kompensasi sebesar Rp.50.000,00.
H. Informasi Tambahan
Saudara/i diberi kesempatan untuk menanyakan semua hal yang belum
jelas sehubungan dengan penelitian ini. Bila sewaktu-waktu terdapat pertanyaan
atau membutuhkan penjelasan lebih lanjut, saudara/bapak dapat menghubungi Dr.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
Christine Patramurti, Apt. pada no. Hp 085729800913.
Saudara/i juga dapat menanyakan tentang penelitian kepada Komite Etik
Penelitian Kedokteran dan Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
Lampiran 13. Formulir Kuisioner Subyek Uji dan Inform Consent
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
BIOGRAFI PENULIS
Penulis bernama Vink Dellin, lahir di Tanjung Balai
Karimun tanggal 19 Febuari 1999, yang merupakan anak
pertama dari pasangan suami istri Hamzani Kho dan Siti
Ng. Penulis telah menempuh Pendidikan TK hingga
SMA di Tanjung Balai Karimun, yaitu TK Maha Bodhi
(2003-2004), SD Maha Bodhi (2004-2010), SMP Santo
Yusup (2010-2013), dan SMA Santo Yusup (2013-
2016). Penulis melanjutkan studi Pendidikan S1 di
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Selama
masa perkuliahan, penulis aktif dalam berbagai jenis kepanitiaan yakni Desa Mitra
1 tahun 2017 sebagai divisi acara, panitia TITRASI tahun 2017 sebagai divisi teater,
panitia PROTON LCC, LKTI, dan PI sebagai divisi pendaftaran, panitia FACTION
#2 sebagai divisi dekorasi tahun 2017 dan panitia FACTION #3 sebagai divisi
pendaftaran tahun 2018. Penulis juga mengikuti perlombaan PHARMALYMPIC
tahun 2017 dan PORSFI tahun 2018, serta mengikuti organisasi Badan Eksekutif
Mahasiswa Farmasi (BEMF) tahun 2016/2017 sebagai anggota divisi Hubungan
Internasional project officer IPSF.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
top related