identifikasi alel gen sitokrom p450 2a6*4 pada subjek uji...

i

IDENTIFIKASI ALEL GEN SITOKROM P450 2A6*4 PADA SUBJEK UJI

NONPEROKOK RAS KULIT HITAM PAPUA INDONESIA DENGAN

METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Dewa Ayu Sri Handani

NIM : 168114058

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Skripsi ini saya persembahkan kepada Ida Sang Hyang Widhi Wasa yang telah

menuntun dan memberkati saya dari awal hingga akhirnya skripsi ini selesai.

Terimakasih sebanyak-banyaknya kepada Ajik, Ibu, Mb Ayu Lestari, Iwik, Dewa

Agus dan sahabat-sahabat Gasspoll yang tak henti-hentinya memberikan

semangat, dukungan, dan selalu mendoakan saya untuk kelancaran dalam

perkuliahan maupun skripsi.

Dan dengan bangga saya ucapkan terimakasih kepada almamater tercinta

Universitas Sanata Dharma sebagai tempat saya berproses, menimba ilmu

kefarmasian, dan tempat saya bertumbuh menjadi lebih dewasa.


v


vi


vii


viii


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ......................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................ v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... vi

PRAKATA ..................................................................................................... vii

DAFTAR ISI .................................................................................................. ix

DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... x

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xi

ABSTRAK .................................................................................................... xii

ABSTRACT ..................................................................................................... xiii

PENDAHULUAN ......................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ............................................................................... 3

HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................... 7

KESIMPULAN ............................................................................................. 18

SARAN ......................................................................................................... 18

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 19

LAMPIRAN .................................................................................................. 22

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................... 39


x

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik elektroforesis

........................................................................................................ 9

Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen basa nukleotida CYP2A6*1 .. 12

Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*1 ......13

Gambar 4. Elektrogram produk PCR pada kondisi optimum ..............................14

Gambar 5. Jalur Metabolisme Senyawa Prokarsinogenik Nitrosamin (NNK,

NNAL, dan NNN) ...........................................................................16


xi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan Layak Etik ........................................................23

Lampiran 2. Sertifikat analisis Go Taq Green Master Mix ................................24

Lampiran 3. Informasi Pemakaian Go Taq Green Master Mix ..........................25

Lampiran 4. Lembar Informasi Produk DNA Ladder & Markers ......................26

Lampiran 5. Hasil PCR ....................................................................................27

Lampiran 6. Hasil penelitian ............................................................................28

Lampiran 7. Informasi Pemakaian FavorPrepTM ...............................................30

Lampiran 8. Hasil kuisioner .............................................................................32

Lampiran 9. Lembar Informasi untuk Responden .............................................34

Lampiran 10. Lembar Pernyataan Persetujuan Responden ..................................36

Lampiran 11. Perhitungan jumlah sampel ..........................................................37

Lampiran 12. Primer PCR alel CYP2A6*4 ........................................................38


xii

ABSTRAK

Asap rokok yang dihirup oleh individu nonperokok mengandung senyawa

prokarsinogenik nitrosamin yang dapat menyebabkan kanker setelah diaktivasi oleh

enzim Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) melalui jalur α-hidroksilasi. Alel gen

CYP2A6*4 adalah bentuk polimorfi gen CYP2A6 akibat delesi sehingga terjadi

penurunan aktivitas metabolisme dan menurunkan risiko kanker terkait nitrosamin.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan dan frekuensi alel gen

CYP2A6*4 pada subjek nonperokok dengan ras kulit hitam Papua Indonesia.

Keberadaan CYP2A6*4 dapat memprediksi aktivitas metabolisme senyawa

prokarsinogenik nitrosamin dan risiko kanker pada nonperokok ras kulit hitam

Papua. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif observasional. Sebanyak 30

subjek uji nonperokok ras kulit hitam Papua yang memenuhi kriteria diambil

sampel darahnya dan dilakukan isolasi DNA. Metode yang digunakan adalah

Polymerase Chain Reaction (PCR) yang merupakan teknik memperbanyak DNA

dari sejumlah kecil isolat DNA. Analisis produk amplifikasi PCR dilakukan dengan

menggunakan metode elektroforesis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada ras

kulit hitam Papua terdapat alel gen CYP2A6*4 dengan frekuensi tinggi (33,33%),

sehingga 33,33% dari ras ini memiliki aktivitas metabolisme senyawa

prokarsinogenik nitrosamin lebih lambat dan risiko kanker terkait nitrosamin lebih

rendah.

Kata kunci: Prokarsinogenik Nitrosamin, CYP2A6*4, ras kulit hitam Papua,

Metode PCR, Metode Elektroforesis


xiii

ABSTRACT

Cigarette smoke that is inhaled by non smokers being contained a

procarcinogenic nitrosamine which can cause cancer after being activated by the

enzyme cytochrome P450 2A6 (CYP2A6) via the α-hydroxylation pathway. The

CYP2A6 * 4 allele is a polymorphic form of the CYP2A6 gene due to a deletion

resulting to decrease its metabolic activity as well as to reduce the risk of

nitrosamine related cancers. This study is aimed to identify the existence and its

frequency of the CYP2A6* 4 allele in non-smokers with Indonesian Papuan black

race. The existence of CYP2A6 * 4 can predict the activity of this enzyme in

metabolizing procarcinogenic compounds associated with the risk of cancer in

Papuan non-smokers. This research is an observational descriptive study. A total of

30 Papuan non-smokers who met the criteria were sampled their blood to be isolated

their DNA. This study used Polymerase Chain Reaction (PCR) which is a technique

to multiply DNA from a small DNA isolate. The PCR product analyzed using an

electrophoresis method. The results showed that the Papua race there an indicates a

CYP2A6 * 4 gene allele with high frequency (33.33%), therefore 33,33% of these

races have slower metabolic activity of nitrosamine and a lower risk of nitrosamine-

related cancers.

Keyword: Procarcinogenic Nitrosamine, CYP2A6 * 4, Papuan Black Race, PCR

Method, Electrophoresis Method


1

PENDAHULUAN

Merokok adalah perilaku berisiko sakit yang dilakukan oleh 65,19 juta

orang (34%) penduduk Indonesia. Angka tersebut menunjukkan Indonesia

merupakan negara dengan jumlah perokok terbanyak di Asean (Southeast Asia

Tobacco Control Alliance, 2016). Menurut Riskesdas (2013) sekurang-kurangnya

25.000 orang telah meninggal akibat penyakit dengan faktor risiko paparan asap

rokok di Indonesia. Penyakit yang menyebabkan kematian pada perokok pasif yaitu

infeksi pernapasan bawah, asma dan kanker paru-paru (Öberg et al., 2011).

Asap rokok (tembakau) mengandung lebih dari 4.000 bahan kimia yang

69 diantaranya adalah senyawa karsinogenik. Nitrosamin merupakan senyawa

prokarsinogenik yang terkandung dalam asap rokok. Pada penelitian Yalcin dan de

la Monte (2016) ditemukan bahwa senyawa nitrosamin yaitu NNK (N-

Nitrosometilamino)-1-(3-piridil)-1-butanon), NNN (N-Nitrosonornikotin) dan

NNAL (Nitrosaminaldehid) merupakan senyawa prokarsinogenik paling poten.

Senyawa-senyawa ini terdapat dalam jumlah tinggi pada asap rokok dan lingkungan

yang telah terkontaminasi oleh asap rokok. Senyawa NNK dan NNN yang telah

teraktivasi dalam tubuh dikategorikan ke dalam kelompok nomor 1 agen

karsinogenik (WHO, 2014). Kelompok nomor 1 menunjukkan bahwa senyawa

NNK dan NNN yang telah teraktivasi merupakan senyawa karsinogenik untuk

manusia. Salah satu enzim pengaktivasi NNN, NNK, dan NNAL yaitu enzim

sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) (Tanner and Tyndale, 2017).

CYP2A6 merupakan gen yang mengkode enzim super famili sitokrom

P450. Enzim CYP2A6 diketahui berperan dalam proses metabolisme senyawa obat

seperti asam valproat, isoniazid, dan lain-lain (Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012).

Selain itu enzim ini juga berperan dalam metabolisme senyawa yang berkaitan

dengan tembakau, seperti nikotin, kotinin, dan senyawa prokarsinogenik nitrosamin

(Mwenifumbo et al., 2010).

Gen CYP2A6 telah ditemukan sebanyak 80 variasi alel, yang kemudian

berpengaruh pada ekspresi gen dan aktivitas enzim tersebut (Patramurti dan Fenty,

2017; Pharmvar, 2018). CYP2A6*4 adalah salah satu bentuk polimorfi yang paling

penting dari CYP2A6 yang terjadi akibat adanya delesi gen yang akan


2

memperlambat metabolisme individu (slow metabolism) terhadap beberapa

senyawa seperti nikotin, NNN, NNK dan NNAL (Akrodou, 2015; Johansson and

Ingelman-Sundberg, 2011; Park et al., 2015; Raunio and Rahnasto-Rilla, 2012;

Tanner and Tyndale, 2017; Wang et al., 2013). Slow metabolizer adalah orang yang

memiliki aktivitas metabolisme enzim yang lebih lambat hingga 50% dari aktivitas

metabolisme normal, sehingga adanya CYP2A6*4 ini dapat menurunkan aktivitas

enzim atau bahkan tidak memiliki aktivitas enzim sama sekali (Liu et al., 2011;

Tanner and Tyndale, 2017). Penurunan aktivitas enzim CYP2A6*4 akan

menurunkan aktivasi nitrosamin sehingga dapat menurunkan risiko kanker akibat

nitrosamin (He and Feng, 2015; Liu et al., 2013; Tsukino et al., 2002; Wang et al.,

2013).

Variasi ras memiliki pengaruh terhadap polimorfi CYP2A6 (Wassenaar et

al., 2015). Bentuk polimorfi alel gen CYPA2A6*4 ditemukan pada ras Negroid (ras

kulit hitam) di Afrika dengan frekuensi 0,5 - 2,7% (Liu et al., 2014; López-Flores

et al., 2017; Minematsu et al., 2006; Nakajima et al., 2006; Tanner and Tyndale,

2017; Wassenaar et al., 2015; Yusof and Gan, 2009). Ras Negroid juga terdapat di

Indonesia yaitu di daerah Papua. Keberadaan bentuk polimorfi CYP2A6*4 pada

orang ras kulit hitam Afrikan menunjukkan kemungkinan ditemukannya gen

CYP2A6*4 pada orang ras kulit hitam Papua karena keduanya merupakan ras

Negroid. Kelompok yang memiliki kesamaan ras dapat memiliki kesamaan pola

genetik. Maka pada penelitian ini digunakan subjek uji yaitu orang nonperokok ras

kulit hitam Papua untuk identifikasi keberadaan alel CYP2A6*4. Keberadaan

CYP2A6*4 dapat memprediksikan aktivitas metabolisme senyawa prokarsinogenik

nitrosamin dan risiko kanker pada nonperokok ras kulit hitam Papua.

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan dan frekuensi

alel gen CYP2A6*4 pada orang nonperokok dengan ras kulit hitam Papua Indonesia

dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR adalah

teknik memperbanyak DNA dari sejumlah kecil bahan awal asam nukleat. Metode

PCR dilakukan dengan mengadaptasi proses replikasi dalam sel hidup. PCR

memfasilitasi sintesis DNA in vitro dengan cara jauh lebih sederhana,


3

menggunakan bahan dengan jumlah jauh lebih kecil, dan kondisi reaksinya

melibatkan suhu yang relatif tinggi (Verkuil et al, 2008).

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat menambah pengetahuan

mengenai alel gen CYP2A6*4 pada subjek nonperokok dengan ras kulit hitam

Papua di Indonesia. Lebih daripada itu, hal ini dapat menjadi dasar kontribusi pada

bidang kesehatan dalam usaha preventif merokok di tempat umum dapat

membahayakan individu walaupun bukan perokok karena kandungan karsinogenik

dalam asap rokoknya.

METODE PENELITIAN

Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan adalah sampel darah non perokok ras kulit hitam

Papua. Primer forward: 5' CCT CAT CAC ACA CAA CTT CCT C 3', primer

reverse: 5' CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG 3' diadopsi dari Patramurti

et al (2019), kit isolasi DNA (FavorPrep Genomic DNA Mini Kit) yang terdiri dari

Proteinase-K, FABG buffer, etanol, W1 buffer, Wash buffer, dan elution buffer,

Promega Go Taq Green Master Mix (berisi taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2,

dan buffer), Tris-Borat-EDTA (TBE) Buffer (10x) (Vivantis), gel agarose

(Vivantis), FluoroVueTM Nucleic Acid Gel Stain (10.000x) SMOBiO, 1 KB (0,25-

10 kb) DNA Ladder (SMOBiO), loading dye (bromofenol biru 25 mg, gliserol 3,3

mL, water for injection (6,7 mL), etanol absolut (Sigma Chemical Co., St. Louis),

akuabides steril (Ikapharmindo).

Alat Penelitian

Alat yang digunakan adalah Thermal cycler (Perkin Elmer 2400), satu set

elektroforesis horizontal (Sigma Aldrich), UV Transiluminator (Fisher Scientific),

mikrotube (1,5 mL) (Biologix), hot plate (CimaricTM Thermo Scintific),

mikrosentrifus (Fisher Scientific), mikropipet (Soccorex Swiss), vorteks (Fisher

Scientific), magnetic stirrer, spuit injeksi 3 mL (Terumo), vacutainer K2 yang

mengandung EDTA-NA2, tabung PCR (Axygen), neraca analitik digital dengan

ketelitian 0,0001 g (Mattler Toledo), kamera mirrorless Fujifilm XA3 dan alat-alat

gelas.


4

Kriteria Subjek Uji

Subjek uji yang digunakan dalam penilitian ini adalah subjek uji yang

telah diwawancarai dan telah mengisi kuisioner dengan kriteria yaitu orang dengan

ras kulit hitam Papua nonperokok sebanyak 30 orang, keturunan ras kulit hitam

Papua asli minimal sampai third degree relativies (kakek dan nenek orang dengan

ras Papua asli) dan tinggal di Yogyakarta, dan merupakan perokok pasif yang jarang

maupun sering menghirup asap rokok orang lain. Subjek uji merupakan orang

dewasa dengan jenis kelamin laki-laki atau perempuan. Penelitian ini

mengeliminasi subjek yang memiliki riwayat merokok kurang dari 5 tahun dan

subjek yang sedang terinfeksi virus atau bakteri. Subjek uji sehat jasmani dan rohani

serta dengan sadar bersedia menandatangani lembar pernyataan persetujuan

responden. Penelitian yang dilakukan di Laboratorium Biokimia Universitas Sanata

Dharma ini telah memperoleh surat keterangan layak etik yang telah disetujui oleh

Komisi Etik Penelitian Kesehatan Universitas Kristen Duta Wacana Yogyakarta.

Pengambilan Sampel Darah pada Subjek Uji

Pengambilan sampel darah dilakukan oleh petugas profesional perawat.

Sampel darah diambil dari pembuluh vena subjek uji dan ditampung dalam

vacutainer K2 yang mengandung EDTA-NA2. Sampel darah yang telah ditampung

segera disimpan pada suhu ± 4°C. Darah tersebut akan digunakan untuk identifikasi

alel CYP2A6*4.

Isolasi DNA

Isolasi DNA dari sampel darah dilakukan menggunakan FavorPrep

Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell). Sebanyak 200 µL sampel darah

(whole blood) disiapkan dan dipindahkan ke tabung mikrosentrifuge 1,5 mL.

Kemudian sampel darah tersebut ditambahkan 20 μL Proteinase-K dan 200 μL

FABG buffer dan divorteks. Campuran diinkubasi pada suhu 60ºC selama 15 menit

untuk melisiskan sampel. Selama inkubasi, masing-masing sampel dihomogenkan

dengan menggunakan vorteks setiap 3-5 menit. Selanjutnya sentrifugasi dilakukan

dengan kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik untuk menghilangkan sampel yang

menempel pada dinding tabung. Kemudian 200 μL etanol absolut ditambahkan ke

dalam sampel dan dihomogenkan dengan menggunakan vorteks selama 30 detik.


5

Sampel kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik.

Kolom FABG dipasangkan dengan collection tube dan pindahkan campuran sampel

dengan hati-hati ke dalam Kolom FABG. Sentrifugasi dilakukan selama 1,5 menit

pada kecepatan 13.000 rpm dan collection tube tersebut dibuang. GD column

dipasangkan dengan collection tube baru. Kemudian kolom FABG dicuci dengan

500 μL W1 buffer dan disentrifuge pada kecepatan 13.000 rpm selama 1,5 detik dan

cairan yang ada pada collection tube dibuang. Collection tube tersebut dipasangkan

kembali dengan GD column. Kemudian ditambahkan 750 μL Wash Buffer ke kolom

FABG. Kemudian sentrifugasi dilakukan selama 1,5 detik dengan kecepatan 13.000

rpm dan cairan yang ada pada collection tube dibuang. Kemudian sentrifugasi

dilakukan kembali selama 4 menit dengan kecepatan 13.000 rpm untuk

mengeringkan Kolom FABG. Kolom FABG kemudian dipasangkan ke 1,5 ml

tabung elusi, dan ditambahkan 200 μL Elution Buffer ke tengah membran Kolom

FABG. Kolom FABG didiamkan dengan posisi tegak selama 3 menit agar Elution

Buffer dapat terserap membran kolom GD. Kemudian sentifugasi dilakukan

kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit untuk mengelusi DNA. DNA

hasil isolasi disimpan pada suhu -20ºC.

Penyiapan Gel Agarose

Pada penelitian ini digunakan dua konsentrasi gel agarose yaitu 1,0% dan

1,5%. Gel agarose konsentrasi 1,0% digunakan untuk mengidentifikasi kemurnian

isolat DNA, sedangkan gel agarose konsentrasi 1,5% digunakan untuk

mengidentifikasi hasil PCR. Gel agarose 1,5% dibuat dengan cara menimbang

0,375 g agarose, kemudian gel agarose dilarutkan dalam larutan TBE 1X sebanyak

25 mL. Larutan tersebut kemudian dipanaskan diatas hot plate sambil diaduk

dengan magnetic stirrer hingga larut. Larutan gel agarose ditambahkan 2,5 µL

larutan FluoroVueTM Nucleic Acid Gel Stain dan diaduk hingga homogen. Larutan

yang telah homogen dan sudah tidak terlalu panas dituang ke dalam cetakan gel

yang telah diberi sisiran pada tepi gel dan gel dibiarkan mengeras. Sisir dicabut

setelah gel mengeras sehingga terbentuk beberapa sumuran.


6

Analisis Kualitatif Isolat DNA

Isolat DNA sebanyak 4,0 µL diletakkan di atas plat tetes, kemudian

ditambahkan aquabidest sebanyak 1,0 µL dan dicampur dengan loading dye

sebanyak 1,0 µL. Campuran tersebut diambil sejumlah 6,0 µL dan dimasukkan ke

dalam sumuran-sumuran gel menggunakan mikropipet. Satu sumur gel diisi dengan

1 Kb DNA ladder sebanyak 3,0 µL sebagai marker. Gel agarose 1,0% ditempatkan

ke dalam gel tray yang sudah berisi larutan buffer 1x TBE, dilakukan elektroforesis

dengan tegangan 100 volt dan running selama 30 menit. Molekul DNA pada gel

tray akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif pada pH netral. Hasil

elektroforesis dideteksi di bawah UV transiluminator dan didokumentasikan

menggunakan kamera mirrorless Fujifilm XA3. Panjang pita DNA dapat diketahui

dengan cara menarik garis lurus masing-masing pita sampel DNA dengan posisi

pita DNA ladder (Patramurti dan Fenty, 2017).

Amplifikasi Alel CYP2A6*4

Fragmen DNA dari alel CYP2A6*4 dilakukan amplifikasi dengan

menggunakan primer forward: 5' CCT CAT CAC ACA CAA CTT CCT C 3' dan

primer reverse: 5' CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG 3' diadopsi dari

Patramurti et al (2019). Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan Promega Go

Taq Green Master Mix (berisi Taq DNA polimerase, dNTPs, MgCl2, dan buffer)

dengan volume ahkir campuran 25,0 µL, yang terdiri dari Promega Go Taq Green

Master Mix 12,50 µL primer forward 1,25 µL, primer reverse 1,25 µL isolat DNA

5,0 µL, dan ditambahkan dengan nuclease-freewater 5 µL. Amplifikasi dilakukan

dengan mesin PCR (Thermal cycler parkin elmer 2400). Kondisi PCR yaitu

denaturasi awal pada suhu 95°C selama 5 menit dan dilanjutkan dengan denaturasi

pada 98°C selama 20 detik, serta annealing pada suhu 62,6°C selama 15 detik dan

ekstensi pada suhu 72°C selama 30 detik. Siklus amplifikasi tersebut diulangi

sebanyak 35 kali dan selanjutnya diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C

selama 5 menit (Patramurti et al, 2019)

Analisis Produk PCR Menggunakan Teknik Elektroforesis

Pada analisis produk PCR digunakan fase diam gel agarose 1,5% yang

telah ditambah FluoroVueTM Nucleic Acid Gel Stain. Gel agarose yang telah


7

mengeras diletakkan dalam gel tray yang berisi TBE 1X hingga permukaan gel

agarose terendam. Produk PCR sebanyak 5 µL dicampur dengan loading dye

sebanyak 1,0 µL. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 6 µL dengan

menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam sumuran agarose 1,5%. Satu

sumuran gel diisi dengan DNA ladder 3,0 µL. Dilanjutkan dengan elektroforesis

pada tegangan 100 Volt dan running selama 30 menit. Hasil elektroforesis

kemudian dievaluasi dengan lampu UV Trasilluminator (Patramurti dan Fenty,

2017).

Tata Cara Analisis Hasil

1. Adanya alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 dapat dideteksi dengan menggunakan

metode elektroforesis. Adanya produk yang terbentuk dengan panjang pita 350

bp maka menunjukkan alel CYP2A6*1, namun jika tidak terbentuk produk

maka menunjukkan adanya alel CYP2A6*4.

2. Mengetahui frekuensi alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 dengan rumus:

Frekuensi = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑎𝑙𝑒𝑙 𝐶𝑌𝑃2𝐴6∗1

𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙𝑢𝑟𝑢ℎ 𝑎𝑙𝑒𝑙(30) × 100%

Frekuensi = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑎𝑙𝑒𝑙 𝐶𝑌𝑃2𝐴6∗4


HASIL DAN PEMBAHASAN

Gen CYP2A6 telah diketahui memiliki banyak polimorfi. Salah satu

bentuk polimorfinya yaitu CYP2A6*4 telah diteliti pada penelitian ini dengan

subjek uji nonperokok ras kulit hitam Papua. Penelitian alel CYP2A6*4 ini

dilakukan dalam empat tahapan utama, yaitu pemilihan subjek uji, isolasi DNA dari

sampel darah, analisis kualitatif isolat DNA, dan analisis produk Polymerase Chain

Reaction (PCR) dengan teknik elektroforesis. Metode utama dalam penelitian ini

yaitu PCR untuk mengamplifikasi potongan sekuen DNA target sehingga dapat

diidentifikasi polimorfi gen yang dimiliki individu atau suatu populasi. Metode

PCR diaplikasikan dalam penelitian ini untuk mengidentifikasi alel gen CYP2A6*4

pada subjek uji non perokok ras kulit hitam Papua Indonesia. Identifikasi alel ini

dilakukan pada subjek ras kulit hitam Papua karena polimorfi alel gen

CYPA2A6*4 telah ditemukan pada ras Negroid (ras kulit hitam) di Afrika dengan


8

frekuensi 0,5 - 2,7% (Liu et al., 2014; López-Flores et al., 2017; Minematsu et al.,

2006; Nakajima et al., 2006; Tanner and Tyndale, 2017; Wassenaar et al., 2015;

Yusof and Gan, 2009).

Karakteristik Subjek Uji

Subjek uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah orang dengan ras

kulit hitam Papua nonperokok sebanyak 30 orang. Jumlah subjek uji yang

digunakan telah memenuhi jumlah minimal yang diperlukan untuk penelitian

polimorfisme gen menurut B-Rao (2001) yang dihitung dengan taraf kepercayaan

95% yang perhitungannya telah terlampir (lampiran 11). Subjek uji merupakan

orang dewasa dengan jenis kelamin laki-laki atau perempuan. Subjek uji dewasa

dalam hal ini adalah mampu mengerti penjelasan peneliti, memahami manfaat

mengikuti penelitian, dan secara sadar menandatangani inform consent. Subjek uji

merupakan perokok pasif yang jarang maupun sering menghirup asap rokok orang

lain, hal ini dikaitkan dengan banyaknya kematian perokok pasif akibat terpapar

asap rokok karena dalam asap rokok terkandung banyak senyawa karsinogenik

yang kemudian dimetabolisme oleh tubuh sehingga memicu kanker. Mengeliminasi

subjek yang memiliki riwayat merokok kurang dari 5 tahun karena menurut

penelitian (Beane et al., 2007) merokok dapat menyebabkan perubahan gen pada

yang reversibel maupun ireversibel dan waktu yang dibutuhkan untuk

menormalkan kembali gen tersebut yaitu minimal 5 tahun. Eliminasi juga dilakukan

pada subjek yang sedang terinfeksi virus atau bakteri. Hal tersebut dilakukan karena

DNA diisolasi dari sampel darah, jika dalam darah subjek terdapat bakteri atau virus

maka dikhawatirkan DNA bakteri dan virus juga terisolasi dan membiaskan hasil

penelitian.

Isolasi DNA dari sampel darah

Isolasi DNA dari sampsel darah subjek uji dilakukan menggunakan

Genomic DNA Mini Kit (FavorPrepTM). Sampel yang digunakan yaitu whole blood

karena kandungan DNA dalam sel darah lebih banyak dibandingkan dengan sampel

lainnya sehingga akan diperoleh lebih banyak DNA dengan jumlah sampel yang

sedikit (Verkuil et al, 2008).


9

Tujuan dilakukannya isolasi DNA yaitu untuk memperoleh DNA murni

dengan memisahkan DNA dari komponen lainnya seperti protein, lemak dan

karbohidrat yang terdapat dalam sel sampel darah (Murtiyaningsih, 2017). Prinsip

isolasi DNA dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit (FavorPrepTM) yaitu

pelisisan sel darah dengan menggunakan Proteinase K dan FABG buffer untuk

melisiskan sel darah merah yang tidak mengandung DNA agar dapat dipisahkan

dengan sel darah putih dan melisiskan sel darah putih untuk mengeluarkan DNA

yang terdapat dalam nukleus (Siswanto et al, 2016). Proses pelisisan sel ini juga

dibantu dengan peningkatan suhu hingga 60OC melalui inkubasi untuk mendukung

degradasi protein pada sel. Etanol absolut kemudian ditambahkan bertujuan agar

DNA mengalami dehidrasi sehingga DNA akan terpresipitasi. Lalu W1 buffer dan

wash buffer ditambahkan untuk membersihkan DNA dari sisa etanol dan senyawa

lainnya. Kemudian DNA dielusi dan dilarutkan dengan menggunakan elution

buffer. Isolat DNA tersebut kemudian disimpan pada suhu sekitar -20OC di dalam

freezer untuk mencegah kerusakan DNA akibat degradasi kimia dan enzimatik.

Kemurnian DNA dapat diidentifikasi dengan menggunakan metode elektroforesis.

Analisis kualitatif isolat DNA

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik elektroforesis

Keterangan: M : DNA ladder

1-5 : isolat DNA dengan pita tebal dan tunggal

Kondisi elektroforesis : Fase diam gel agarose 1%; fase gerak larutan TBE 1x; tegangan 100 V, running time 30 menit; volume injeksi 6 μL

3000 bp


10

Isolat DNA yang akan dianalisis kemurniannya yaitu isolat DNA yang

diperoleh dari sampel darah subjek nonperokok ras kulit hitam Papua. Analisis

kualitatif isolat DNA ini dilakukan dengan menggunakan teknik elektroforesis dan

hasilnya dilihat dengan menggunakan lampu UV transiluminator. Parameter

kemurnian isolat DNA yang dimiliki yaitu jika terbentuknya pita tunggal dan tebal

dengan ukuran lebih dari 3000 bp maka isolat DNA dikatakan murni, tidak rusak

maupun terkontaminasi. Namun jika hasil elektroforesis menunjukkan pita yang

tidak tunggal atau pita terdapat pada ukuran lebih kecil dari 3000 bp maka isolat

DNA dinyatakan tidak murni karena telah rusak maupun telah terkontaminasi.

Isolat DNA yang dihasilkan pada penelitian ini dapat dinyatakan murni karena

membentuk pita tunggal dan berukuran lebih besar dari 3000 bp (Gambar 1).

Analisis produk PCR dengan Teknik Elektroforesis

Isolat DNA yang diperoleh diamplifikasi dengan menggunakan metode

Polymerase Chain Reaction (PCR) dan primer yang spesifik untuk mendeteksi alel

CYP2A6*4. Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam PCR antara lain templat DNA,

primer, deoksinukleotida trifosfat (dNTPs), enzim DNA polimerase, MgCl2 dan

buffer. Templat DNA merupakan isolat DNA dari sampel darah orang ras kulit

hitam Papua yang akan diamplifikasi. Primer yang merupakan suatu untai DNA

pendek (18 – 28 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai

DNA dengan cara menempel pada sekuen yang komplementer pada templat DNA.

Deoksinukleotida trifosfat (dNTPs) yang terdiri atas deoksiadenosin trifosfat

(dATP), deoksitimidin trifosfat (dTTP), deoksisitidin trifosfat (dCTP), dan

deoksiguanosin trifosfat (dGTP) yang akan bertindak sebagai bahan penyusun

DNA dalam proses ekstensi. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’

dari primer dan membentuk susunan DNA baru komplementer dengan untai

Templat DNA. Enzim DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisis

reaksi sintesis rantai DNA dan akan membantu melepaskan ikatan primer yang

tidak tepat dan meluruskan wilayah yang mempunyai struktur sekunder. Dalam

proses PCR juga diperlukan buffer yang berfungsi untuk mempertahankan pH

sehingga dapat mempertahankan stabilitas enzim DNA polimerase. Ion Mg2+ yang

diperoleh dari MgCl2 berfungsi untuk meningkatkan kelarutan dNTP dengan cara


11

membentuk kompleks dengan dNTP, meningkatkan aktivitas enzim DNA

polimerase serta meningkatkan nilai Tm (melting temperature) dari untai ganda

templat DNA maupun interaksi antara primer dengan templat (Asy’ari et al, 2005;

Somma and Querci, 2006; Yusuf, 2010)

Pada proses PCR terdapat tiga fase utama yaitu denaturasi, annealing, dan

ekstensi. Denaturasi Templat DNA dilakukan untuk memisahkan untai ganda DNA

menjadi untai tunggal. Pemisahan untai DNA tersebut memungkinkan hibridisasi

primer PCR dengan sekuen DNA target. Pada tahap denaturasi digunakan suhu

sebesar 95°C berguna untuk memutuskan interaksi hidrogen pada basa nitrogen

yang menghubungkan dua untai DNA, karena interaksi hidrogen tidak stabil pada

suhu tinggi. Proses annealing pada penelitian ini menggunakan suhu sebesar

62,6°C. Penyesuaian suhu dilakukan agar primer dapat secara spesifik mengikat

DNA target dan tidak akan terlepas setelah proses annealing. Primer akan

menempel dengan berinteraksi hidrogen pada cetakan nukleotida DNA yang sesuai.

Tahap ekstensi merupakan tahap sintesis DNA. Tahap ini diperlukan untuk

memperpanjang primer PCR ujung 5’ menuju 3’ dari urutan DNA target (Verkuil,

2008). Pada penelitian ini digunakan suhu ekstensiyaitu sebesar 72 °C. Ketiga

tahapan tersebut diulangi kembali hingga 35 kali siklus agar hasil amplifikasi DNA

yang diperoleh cukup untuk dideteksi dengan teknik elektroforesis.

Situs penempelan primer pada DNA ditunjukkan pada gambar 2. Melalui

gambar tersebut dapat dijelaskan bahwa primer forward (panah merah) akan

menempel pada templat DNA 3’ ke 5’ sehingga nantinya akan terbentuk produk

PCR berupa sekuen DNA 5’-3’ yang merupakan salinan dari Templat DNA.

Sedangkan primer reverse (panah biru) akan menempel pada Templat DNA 5’ ke

3’ sehingga nantinya akan terbentuk produk PCR berupa sekuen DNA 3’-5’ yang

merupakan salinan dari Templat DNA. Ketika kedua sekuen produk PCR tersebut

terbentuk maka terbentuklah produk PCR berupa potongan DNA untai ganda

berukuran 350 bp.


12

Gambar 2. Situs penempelan primer pada sekuen nukleotida CYP2A6*1 Keterangan:

: arah penempelan primer forward

: arah penempelan primer reverse

Primer memegang peranan penting dalam menentukan keberhasilan proses

PCR. Suatu primer dikatakan baik jika primer tersebut spesifik, yaitu hanya dapat

menempel pada satu jenis alel DNA saja sehingga didapatkan produk yang sesuai

dengan target. Primer yang digunakan pada penelitian ini akan menghasilkan

produk PCR dengan alel CYP2A6*1 dengan ukuran 350 bp. Primer yang digunakan

akan spesifik mengamplifikasi alel CYP2A6*1 dari nukleotida urutan 10643 hingga

10993. Gen CYP2A6*4 memiliki banyak perbedaan dengan gen CYP2A6*1 seperti

yang ditunjukkan pada gambar 3. CYP2A6*4 mengalami whole gene deletion

akibat adanya unequal crossover junction. Unequal crossover junction

menyebabkan susunan nukleotida gen CYP2A6 alel *4 berbeda dengan alel *1

(normal). Hal ini menyebabkan tidak terekspresinya mRNA yang mengkode

CYP2A6, melainkan mengkode mRNA yang nantinya akan membentuk protein

yang berbeda sehingga tidak memiliki aktivitas enzim CYP2A6 (Fukami et al,

2007). Nukleotida urutan 10643 hingga 10993 dari kedua alel tersebut telah

ditemukan 6 perbedaan nukleotida. Adanya perbedaan nukleotida urutan ke-10993

(bertanda kuning) yaitu pada CYP2A6*1 adalah G sedangkan pada CYP2A6*4

mengkode A, sehingga menyebabkan primer reverse tidak dapat menempel pada

gen CYP2A6*4. Jika primer reverse tidak dapat menempel (annealing) pada

Templat DNA maka tidak akan terjadi amplifikasi pada proses PCR dan tidak akan

terbentuk produk.


13

CYP2A6*1 :CCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGGCACCGAAGT

CYP2A6*4 :CCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGGCACCGAAGT

CYP2A6*1 :GTTCCCTATGCTGGGCTCTGTGCTGAGAGACCCCAGTTTCTTCT

CYP2A6*4 :GTTCCCTATGCTGGGCTCCGTGCTGAGAGACCCCAGCTTCTTCT

CYP2A6*1 :CCAACCCCCAGGACTTCAATCCCAGCACTTCCTGAATGAGAAGG

CYP2A6*4 :CCAACCCTCAGGACTTCAATCCCAGCATTTCCTGAATGAGAAGG

CYP2A6*1 :GGCAGTTTAAGAAGAGTGATGCTTTTGTCCCTTTTCCATCGGTA

CYP2A6*4 :GGCAGTTTAAGAAGAGTGATGCTTTTGTCCCTTTTCCATCGGTA

CYP2A6*1 :AGACCACTGTTTGGCTGCCAGGCCACGGCTCACACCAGCAGGGG

CYP2A6*4 :AGACCACTGTTTGGCTGCCAGGCCACGGCTCACACCAGCAGGCG

CYP2A6*1 :CCTCCCTCACCCTCCTCCCCTCTCTGCGGTGTAGCCTGGTATTT

CYP2A6*4 :CCTCCCTCACCCTCCTCCCCTCTCTGCGGTGTAGCCTGGTATTT

CYP2A6*1 :CTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGAATCTACCCTTGAGCCAGCA

CYP2A6*4 :CTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGAATCTACCCTTGAGCCAGCA

CYP2A6*1 :GCTGATACTTCCTTAACTACCAAGCACCCAGTACCTGCG

CYP2A6*4 :GCTGATACTTCCTTAACTACCAAGCACCCAGTACCTGCA

Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*4

Produk hasil PCR kemudian dianalisis dengan menggunakan teknik

elektroforesis. Proses elektroforesis pada analisis produk PCR digunakan gel

agarose dengan konsentrasi 1,5%. Karena prinsip pemisahan teknik elektroforesis

dengan gel agarose yaitu berdasarkan bobot molekul dan ukuran sekuen DNA yang

dihasilkan setelah PCR lebih kecil (350 bp), maka pori-pori fase diam (gel agarose)

harus diperkecil dengan cara meningkatkan konsentrasi gel agarose agar diperoleh

pemisahan yang lebih baik pada produk PCR. Produk PCR dicampurkan dengan

loading dye sebelum dimasukkan dalam sumuran gel agarose. Loading dye berguna

sebagai penambah densitas suspensi produk PCR sehingga suspensi tetap berada

dalam sumuran dan sebagai penanda migrasi DNA (Novitasari et al., 2014). Proses

elektroforesis dilakukan dengan menggunakan fase gerak buffer TBE 1X dengan

tegangan 100 volt selama 30 menit (Patramurti dan Fenty, 2017). Hasil

elektroforesis produk PCR kemudian dilihat hasilnya dengan menggunakan UV

Transiluminator untuk memvisualisasikan posisi pita yang terbentuk setelah

pemisahan DNA pada gel (gambar 4).


14

Gambar 4. Elektrogram produk PCR pada kondisi optimum Keterangan :

M : DNA Ladder

1 dan 3-6 : Produk PCR dari isolat DNA dengan alel CYP2A6*1 (wild type) 2 dan 7 : Produk PCR dari isolat DNA dengan alel CYP2A6*4 (polimorfi delesi)

Kondisi elektroforesis: Fase diam gel agarose 1,5%; fase gerak larutan TBE 1x; tegangan

100 V, running time 30 menit; volume injeksi 6 μL

Hasil yang diperoleh setelah visualisasi dengan UV transiluminator dapat

memberikan dua kesimpulan hasil, yaitu jika terbentuk pita tebal pada panjang basa

nukleuotida 350 bp maka menunjukkan sampel memiliki alel CYP2A6*1,

sedangkan jika tidak terbentuk pita menunjukkan sampel memiliki alel CYP2A6*4.

Hasil elektroforesis yang dilakukan dengan media gel agarose tersebut diperoleh

pita yang tebal dan tunggal dengan ukuran 350 bp. Namun pada gel terlihat pita

tipis dengan ukuran

15

menunjukkan bahwa sebanyak 10 isolat DNA pada produk PCR memiliki alel

CYP2A6*4 dengan frekuensi 33,33% dan 20 isolat DNA lainnya memiliki tipe alel

normal atau wild type yaitu CYP2A6*1 dengan frekuensi 66,67%. Polimorfi

CYP2A6*4 dengan frekuensi 33,33% termasuk jumlah yang tinggi jika

dibandingkan penelitian Elisa (2018) pada individu perokok ras kulit hitam Papua

yaitu diperoleh frekuensi CYP2A6*4 sebanyak 26,6%. Selain itu, hasil penelitian

ini juga lebih tinggi dibandingkan beberapa penelitian sebelumnya pada ras

Negroid di Afrika yang hanya berkisar 0,5-2,7% (Liu et al., 2014; López-Flores et

al., 2017; Minematsu et al., 2006; Nakajima et al., 2006; Tanner and Tyndale, 2017;

Wassenaar et al., 2015; Yusof and Gan, 2009).

Dilihat dari frekuensi alel CYP2A6*4 pada subjek uji nonperokok ras kulit

hitam Papua Indonesia yang telah diperoleh yaitu sebesar 33,33%, maka dapat

diketahui bahwa pada ras tersebut terdapat variasi alel CYP2A6*4 dan 33,33% dari

ras tersebut memiliki kemampuan metabolisme yang lambat (slow metabolism)

terhadap senyawa yang seharusnya dimetabolisme oleh enzim CYP2A6.

Rendahnya metabolisme yang dihasilkan oleh individu dengan alel CYP2A6*4

akan mempengaruhi proses metabolisme senyawa-senyawa yang seharusnya

dimetabolisme oleh enzim CYP2A6 seperti senyawa prokarsinogenik nitrosamin

dan beberapa senyawa obat.

Normalnya senyawa prokarsinogenik nitrosamin seperti NNN, NNK, dan

NNAL diaktivasi oleh CYP2A6 melalui proses α-hidoksilasi (Chiang et al., 2011;

Tanner and Tyndale, 2017). NNK diubah menjadi NNAL melalui proses reduksi

oleh enzim karbonil reduktase. NNK dan NNAL dapat menjadi agen karsinogenik

setelah dimetabolisme oleh enzim CYP2A6 melalui dua jenis jalur, yaitu α-

hidoksilasi pada gugus metil dan α-hidroksilasi pada gugus metilen. Proses

hidroksilasi yaitu adanya penambahan gugus hidroksi (-OH) pada senyawa. NNK

dan NNAL akan mengalami metabolisme α-hidoksilasi pada gugus metil atau

metilen oleh enzim CYP2A6 sehingga nantinya akan terbentuk senyawa ionik dan

menyerang DNA sebagai senyawa karsinogenik (Chiang et al., 2011; He and Feng,

2015). NNN dimetabolisme oleh CYP2A6 melalui jalur 2’- dan 5’-α-hidroksilasi.

2’-hidroksi NNN akan membuka cincin pirolidin sehingga terbentuk


16

pirisiloksobutildiazohidroksida sedangkan jika 5’-hidroksi NNN akan membentuk

elektrofilik diazohidroksi yang akan menyerang DNA (gambar 5) (Xue et al.,

2014).

Gambar 5. Jalur Metabolisme Senyawa Prokarsinogenik Nitrosamin (NNK, NNAL, dan

NNN) (Chiang et al., 2011; He and Feng, 2015)

Namun individu dengan alel CYP2A6*4 yang slow metabolism, tidak dapat

memetabolisme senyawa prokarsinogen nitrosamin tersebut dengan baik karena

enzim tersebut tidak aktif. Hal ini menguntungkan bagi individu yang memiliki alel

CYP2A6*4, karena NNK, NNAL, dan NNN tidak dapat diaktivasi sehingga tidak

akan terbentuk senyawa aktifnya yang dapat menyebabkan DNA adducts yang

berujung kanker.


17

Meskipun enzim CYP2A6 tersebut tidak aktif, senyawa prokarsinogenik

nitrosamin yang telah masuk ke dalam tubuh tetap akan dimetabolisme agar dapat

diekskresikan. Terdapat tiga cara yang dapat dilalui nitrosamine agar dapat

diekskresikan, yaitu metabolism fase I, metabolism fase II dan ekskresi dalam

bentuk utuh melalui urin. Selain enzim CYP2A6, enzim CYP2A13 juga berperan

memetabolisme senyawa ini melalui metabolisme fase I yaitu dengan jalur α-

hidroksilasi (Chiang et al., 2011; He and Feng, 2015). Sehingga senyawa

prokarsinogenik nitrosamin tetap akan dimetabolisme yaitu oleh enzim CYP2A13,

namun proses metabolismenya menjadi lebih lambat dibandingkan CYP2A6

normal. Metabolism fase II senyawa nitrosamine yaitu melalui proses glukoronidasi

oleh enzim glukoronidase karena nitrosamin sudah cukup polar (Richie et al.,

1997). Sehingga dapat dipastikan bahwa senyawa prokarsinogenik nitrosamin tidak

akan terakumulasi dalam tubuh, namun tetap dimetabolisme meskipun dengan

proses yang lebih lambat.

Keberadaan CYP2A6*4 pada ras kulit hitam Papua ini dengan frekuensi

33,33% memprediksikan bahwa risiko kanker terkait nitrosamin pada ras ini

rendah. Namun dengan diperolehnya hasil penelitian ini perokok pasif harus tetap

menghindari paparan asap rokok, karena polimorfi gen CYP2A6 ini hanya salah

satu aspek prediksi risiko kanker akibat nitrosamin yang perlu diketahui, sementara

masih ada faktor lain yang dapat menjadi faktor risiko terjadinya kanker.

Hasil dari penelitian ini juga dapat digunakan sebagai dasar dalam

penentuan terapi yang akan diperoleh pasien (individual therapy). Selain

bertanggung jawab dalam metabolisme senyawa prokarsinogenik nitrosamin,

enzim CYP2A6 juga bertanggung jawab dalam metabolisme senyawa-senyawa

obat seperti asam valproat, isoniazid, halothane, dan lain-lain (Raunio and

Rahnasto-Rilla, 2012). Ketika individu telah diketahui memiliki alel CYP2A6*4

dan memperoleh terapi obat-obatan yang dimetabolisme oleh enzim CYP2A6 maka

dosis yang diterima pasien harus disesuaikan. Enzim CYP2A6*4 bersifat slow

metabolism sehingga jika dosis obat-obatan tersebut tidak disesuaikan dengan

penurunan dosis maka dikhawatirkan senyawa obat akan lebih lama dimetabolisme

dan diekskresikan. Jika proses metabolisme lama, maka konsentrasi senyawa obat


18

tersebut akan lebih tinggi dan lebih lama berada di dalam tubuh sehingga berpotensi

terakumulasi. Hal tersebut dapat menyebabkan efek toksik yang merugikan

individu dengan enzim CYP2A6*4 yang memperoleh terapi tersebut (Tan et al,

2010; McDonagh et al, 2012). Berdasarkan penelitian Tan et al (2010) individu

dengan CYP2A6*4 yang mengonsumsi asam valproat memiliki konsentrasi asam

valproate dalam plasma darah tinggi dibandingkan individu dengan gen CYP2A6*1

(normal). Hal tersebut terjadi akibat penurunan aktivitas metabolisme enzim

CYP2A6. Tingginya konsentrasi asam valproate dalam plasma dapat

mengakibatkan peningkatan paparan obat, peningkatan standar konsentrasi steady

state asam valproat dan risiko ketoksikan. Maka adanya informasi mengenai

polimorfi CYP2A6 sangat bermanfaat dalam pemilihan terapi individu yang lebih

sesuai karena antar individu memiliki genetik yang bervariasi.

KESIMPULAN

Alel gen CYP2A6*4 ditemukan pada orang nonperokok ras kulit hitam

Papua Indonesia dengan frekuensi 33,33%. Hal ini mengartikan bahwa pada

populasi tersebut sebanyak 33,33% individu memiliki aktivitas metabolisme

senyawa prokarsinogenik nitrosamin lebih lambat sehingga risiko kanker terkait

nitrosamin pada populasi ini rendah.

SARAN

Perlu dilakukan penelitian mengenai alel gen CYP2A6*4 pada ras lain dan

dikaitkan langsung dengan kejadian kanker.


19

DAFTAR PUSTAKA

Akrodou, Y.M., 2015. CYP2A6 Polymorphisms May Strengthen Individualized

Treatment for Nicotine Dependence. Scientifica, 2015, 1–7.

Asy’ari, M., Noer, A.S., 2005. Optimasi Konsentrasi Mgcl2 Dan Suhu Annealing

Pada Proses Amplifikasi Multifragmens Mtdna Dengan Metoda PCR, J. Kim.

Sains & Apl. Vol. VIII. No.1.

B-Rao, C., 2001. Sample size considerations in genetic polymorphism studies.

Human Heredity, 52(4), 191–200.

Beane, J., Sebastiani, P., Liu, G., Brody, J.S., Lenburg, M.E., Spira, A., 2007.

Reversible and permanent effects of tobacco smoke exposure on airway

epithelial gene expression. Genome Biology, 8(9), 1-17.

Bio-Rad, 2019. PCR Troubleshooting. https://www.bio-rad.com/en-

id/applications-technologies/pcr-troubleshooting?ID=LUSO3HC4S#helptop

diakses pada tanggal 9 Januari 2020.

Chiang, H. chih, Wang, C.Y., Lee, H.L., Tsou, T.C., 2011. Metabolic effects of

CYP2A6 and CYP2A13 on 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone

(NNK)-induced gene mutation-A mammalian cell-based mutagenesis

approach. Toxicology and Applied Pharmacology, 253(2), 145–152.

Tatsuki Fukami, T., Nakajima, M., Yamanaka, H., Fukushima, Y., Mcleod, H.L.,

Yokoi, T., 2007. A Novel Duplication Type of CYP2A6 Gene in African-

American Population. Drug Metabolism and Disposition, Vol. 35, No. 4.

He, X., Feng, S., 2015. Role of Metabolic Enzymes P450 (CYP) on Activating

Procarcinogen and their Polymorphisms on the Risk of Cancers. Current drug

metabolism, 16(10), 850–63.

Johansson, I., Ingelman-Sundberg, M., 2011. Genetic polymorphism and

toxicology-with emphasis on cytochrome P450. Toxicological Sciences,

120(1), 1–13.

Liu, T., David, S.P., Tyndale, R.F., Wang, H., Zhou, Q., Ding, P., He, Y.-H., Yu,

X.-Q., Chen, W., Crump, C., Wen, X.-Z., Chen, W.-Q., 2011. Associations of

CYP2A6 genotype with smoking behaviors in southern China. National

Institutes of Health, 5(106), 985–994.

Liu, T., Xie, C.-B., Ma, W.-J., Chen, W.-Q., 2014. Association Between CYP2A6

Genetic Polymorphisms and Lung Cancer: A Meta-Analysis of Case-Control

Studies. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental

Mutagenesis, 51(1), 229–235.

López-Flores, L.A., Pérez-Rubio, G., Falfán-Valencia, R., 2017. Distribution of

polymorphic variants of CYP2A6 and their involvement in nicotine addiction.

EXCLI Journal, 16, 174–196.

McDonagh, E. M., Wassenaar, C., David, S.P., Tyndale, R.F., Altman, R.B., Whirl-

Carrillo, M., Klein, T.E., 2012. PharmGKB summary: very important

pharmacogene information for cytochrome P-450, family 2, subfamily A,

polypeptide 6. PharmGKB summary, 22(9), 695–708.

Minematsu, N., Nakamura, H., Furuuchi, M., Nakajima, T., Takahashi, S., Tateno,

H., Ishizaka, A., 2006. Limitation of cigarette consumption by CYP2A6*4, *7

and *9 polymorphisms. European Respiratory Journal, 27(2), 289–292.

Mwenifumbo, J.C., Zhou, Q., Benowitz, N.L., Sellers, E.M., Tyndale, R.F., 2010.


https://www.bio-rad.com/en-id/applications-technologies/pcr-troubleshooting?ID=LUSO3HC4S#helptophttps://www.bio-rad.com/en-id/applications-technologies/pcr-troubleshooting?ID=LUSO3HC4S#helptop

20

New CYP2A6 gene deletion and conversion variants in a population of Black

African descent. Pharmacogenomics, 11(2), 189–198.

Nakajima, M., Fukami, T., Yamanaka, H., Higashi, E., Sakai, H., Yoshida, R.,

Kwon, J.T., McLeod, H.L., Yokoi, T., 2006. Comprehensive evaluation of

variability in nicotine metabolism and CYP2A6 polymorphic alleles in four

ethnic populations. Clinical Pharmacology and Therapeutics, 80(3), 282–297.

NCBI, 2019. CYP2A6 cytochrome P450 family 2 subfamily A member 6 [Homo

sapiens (human)]. NCBI (Online), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1548

diakses pada tanggal 12 Maret 2019.

Novitasari, D. A., Elvyra, R., Roslim, D.I., 2014. Teknik Isolasi dan Elektroforesis

DNA Total pada Kryptopterus Apogon (Bleeker 1851) dari Sungai Kampar

Kiri dan Tapung Hilir Kabupaten Kampar Provinsi Riau. JOM FMIPA, 260.

Öberg, M., Jaakkola, M.S., Woodward, A., Peruga, A., Prüss-Ustün, A., 2011.

Worldwide burden of disease from exposure to second-hand smoke: A

retrospective analysis of data from 192 countries. The Lancet, 377(9760), 139–

146.

Park, S.L., Tiirikainen, M.I., Patel, Y.M., Wilkens, L.R., Stram, D.O., Marchand,

L. Le, Murphy, S.E., 2015. Genetic determinants of CYP2A6 activity across

racial/ ethnic groups with different risks of lung cancer and effect on their

smoking intensity. Carcinogenesis, 37(3), 269–279.

Patramurti, C., Candaya, E.J., Kiatarto, S.F., Karut, A.K., 2019. Polimorfi Gen

Sitokrom P450 2A6 Alel *1, *4, *7, dan *9 pada Subjek Uji Perokok Suku

Tionghoa Indonesia. Jurnal Farmasi Indonesia, 11(1), 347-445.

Patramurti, C., Fenty, 2017. Studi Genotipe Sitokrom P450 2A6 Alel CYP2A6*4

dan CYP2A6*9 pada Subyek Uji Perokok Suku Jawa Indonesia. Jurnal Ilmu

Kefarmasian Indonesia, 15(1), 50-56.

Raunio, H., Rahnasto-Rilla, M., 2012. CYP2A6: Genetics, structure, regulation,

and function. Drug Metabolism and Drug Interactions, 27(2), 73–88.

Siswanto, J.E., Berlian, T., Putricahya, E., Panggalo, L.V., Yuniani, L., 2016.

Isolasi DNA pada Sampel Darah Tepi dan Swab Buccal pada Bayi Penderita

ROP: Perbandingan Hasil Uji Konsentrasi dan Indeks Kemurnian. Sari Pediatri,

Vol. 18, No. 4.

Somma, M., Querci, M., 2006, The Analysis of Food Samples for the Presence of

Genetically Modified Organisms Session 6 The Polymerase Chain Reaction

(PCR), JRC European Comission, 229.

Southeast Asia Tobacco Control Alliance, 2016. The Tobacco Control Atlas:

ASEAN Region.

Tan, L., Yu, J.T., Sun, Y.P., Ou, J.R., Song, J.H., Yu, Y., 2010. The influence of

cytochrome oxidase CYP2A6, CYP2B6, and CYP2C9 polymorphisms on the

plasma concentrations of valproic acid in epileptic patients. Clinical

Neurology and Neurosurgery, 112(4), 320–323.

Tanner, J.A., Tyndale, R.F., 2017. Variation in CYP2A6 activity and personalized

medicine. Journal of Personalized Medicine, 7(4), 1–29.

Tsukino, H., Kuroda, Y., Qiu, D., Nakao, H., Imai, H., Katoh, T., 2002. Effects of

cytochrome P450 (CYP) 2A6 gene deletion and CYP2E1 genotypes on gastric

adenocarcinoma. International Journal of Cancer, 100(4), 425–428.


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1548

21

Verkuil, E., Belkum, A., and Hays, J., 2008. Principle and Techinal Aspects of PCR

Amplification.

Wang, L., Zang, W., Liu, J., Xie, D., Ji, W., Pan, Y., Li, Z., Shen, J., Shi, Y., 2013.

Association of CYP2A6*4 with Susceptibility of Lung Cancer: A Meta-

Analysis. PLoS ONE, 8(4), 4–8.

Wassenaar, C.A., Ye, Y., Cai, Q., Aldrich, M.C., Knight, J., Spitz, M.R., Wu, X.,

Blot, W.J., Tyndale, R.F., 2015. CYP2A6 reduced activity gene variants

confer reduction in lung cancer risk in African American smokers--findings

from two independent populations. Carcinogenesis, 36(1), 99–103.

WHO, 2014. Agents Classified by the IARC Monographs , Volumes 1 – 109. World

Health Organization - International Agency for Research on Cancer,

(026148), 34.

Xue, J., Yang, S., Seng, S., 2014. Mechanisms of cancer induction by tobacco-

specific NNK and NNN. Cancers, 6(2), 1138–1156.

Yalcin, E., de la Monte, S., 2016. Tobacco nitrosamines as culprits in disease:

mechanisms reviewed. Journal of Physiology and Biochemistry, 72(1), 107–

120.

Yusof, W., Gan, S.H., 2009. High prevalence of CYP2A6*4 and CYP2A6*9 alleles

detected among a Malaysian population. Clinica Chimica Acta, 403(1–2),

105–109.

Yusuf, Z., 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek, 5(6), 1–5.


22

LAMPIRAN


23

Lampiran 1. Surat Keterangan Layak Etik


24

Lampiran 2. Sertifikat analisis Go Taq Green Master Mix


25

Lampiran 3. Informasi Pemakasian Go Taq Green Master Mix


26

Lampiran 4. Lembar Informasi Produk DNA Ladder & Markers


27

Lampiran 5. Hasil PCR


28

Lampiran 6. Hasil Penelitian

No subjek CYP2A6

*1 *4

1P - √

2P - √

3P - √

4P - √

5P √ -

6P √ -

7P - √

8P √ -

9P √ -

10P √ -

11P √ -

12P √ -

13P - √

14P - √

15P √ -

16P √ -

17P √ -

18P √ -

19P √ -

20P √ -

21P √ -

22P √ -

23P - √

24P √ -

25P √ -

26P √ -

27P √ -

28P - √

29P √ -

30P - √

Total 20 10

ANALISIS HASIL:

1. Frekuensi = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑎𝑙𝑒𝑙 𝐶𝑌𝑃2𝐴6∗1


= 20

30 × 100%

= 66,67%


29

2. Frekuensi = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ 𝑎𝑙𝑒𝑙 𝐶𝑌𝑃2𝐴6∗4


= 10

30 × 100%

= 33,33%


30

Lampiran 7. Informasi Pemakaian FavorPrepTM


31


32

Lampiran 8. Hasil kuisioner


33


34

Lampiran 9. Lembar Informasi untuk Responden


35


36

Lampiran 10. Lembar Pernyataan Persetujuan Responden


37

Lampiran 11. Perhitungan Jumlah Sampel

Persamaan yang digunakan untuk menentukan jumlah sampel minimal

pada penelitian genetik polimorfisme menurut B-Rao (2001) adalah:

Nmin ≥ log (1 – π )/2log (1 – fmin)

Keterangan:

Nmin : jumlah sampel minimal

π : probabilitas alel utama

fmin : frekuensi alel minor

Pada penelitian ini jenis alel yang akan diteliti adalah dua macam, yaitu:

CYP2A6*1 (alel utama) dan CYP2A6*4 (alel minor). Maka menurut B-Rao

(2001), nilai π dan fmin untuk kedua alel minor tersebut berturut-turut adalah: π =

0,95 dan fmin = 0,05.

Jadi jumlah sampel minimal yang diperlukan untuk penelitian adalah:

Nmin = log (1 – π )/2log (1 – fmin)

= log (1-0,95/2log (1-0,05)

= 28,89

= 29 orang

Jumlah sampel yang digunakan pada penelitan ini adalah 30 orang, oleh karena itu

jumlah ini sudah memenuhi persyaratan sampel untuk penelitian genetik

polimorfisme.


38

Lampiran 12. Primer PCR alel CYP2A6*4


39

BIOGRAFI PENULIS

Skripsi dengan judul “Identifikasi Alel Gen CYP2A6*4

pada Subjek Uji Nonperokok Ras Kulit Hitam Papua

Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction”

ditulis oleh Dewa Ayu Sri Handani, lahir di Bali, 24

November 1997 meruakan anak ketiga dari 3 bersaudara.

Anak dari pasangan Dewa Nyoman Bawana dan Gusti

Ayu Putu Suartini. Penulis menempuh pendidikan di SD

Negeri 3 Bakbakan 2004-2010, SMP Negeri 1 Gianyar

2010-2013, SMA Negeri 1 Gianyar 2013-2016, dan pada

tahun 2016 meneruskan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi USD penulis

pernah aktif dalam beberapa kegiatan kemahasiswaan dan kepanitiaan seperti

menjadi koordinator divisi Acara pada kepanitiaan Desa Mitra 1 2017 dan

Pelepasan Wisuda 1 2018, Ketua Panitia Desa Mitra 2 2017. Penulis juga pernah

berpartisipasi dalam Lomba ONMIPA Tingkat Wilayah V (Yogyakarta) dalam

bidang Kimia. Selain aktif dalam kepanitiaan, penulis juga aktif dalam Unit

Kegiatan Fakultas (UKF) yaitu UKF Patient Conseling Club (PCC) tahun 2016-

2017 dan UKF Keluarga Mahasiswa Hindu Dharma (KMHD) Universitas Sanata

Dharma tahun 2016-2019. Penulis pernah menjadi asisten dosen praktikum Kimia

Dasar 2017 dan 2018, Kimia Organik 2018, dan Biokimia 2019. Dengan motivasi

dan ketekunan untuk belajar serta pengalaman yang dimiliki, penulis dapat

menyelesaikan tugas akhir ini dan semoga penulis skripsi ini dapat menambah

pengetahuan bagi pembaca.


identifikasi alel gen sitokrom p450 2a6*4 pada subjek uji...

Documents