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Química Biológica

Electroforesis

2009

Electroforesis en Gel

• Migración de una molécula con carga neta en un campo eléctrico Separación de proteínas y otras macromoléculas (DNA, RNA)

• V migración (v) en el campo eléctrico depende de la fuerza del campo (E), la carga neta de la proteína (z) y del coeficiente friccional (f) v= Ez/f

• Ez propulsa la molécula cargada hacia el electrodo de carga opuesta

• La fuerza de arrastre f se opone al movimiento (fricción entre las moléculas en movimiento y el medio)

• f depende de la masa y la forma de la molécula, y de la viscosidad () del medio. Esfera de radio r f = 6rv

• Si el campo aplicado es constante alcanza una velocidad constante.

• Bajo condiciones controladas la distancia recorrida es proporcional al tiempo de la corrida

Factores que influyen en la migración de los iones

Características del ión: carga (signo y magnitud); forma, tamaño, tendencia a disociarse, comportamiento anfotérico (si existe).

Características del medio: [C] electrolitos, fuerza iónica, propiedades dieléctricas, propiedades químicas, pH, T, viscosidad, presencia de moléculas no polares

Características del campo aplicado: intensidad, pureza, distribución.

Características Técnicas

• Medios soportes: geles (actúan como tamiz molecular)

• Medios alternativos: papel y acetato de celulosa.

• Las moléculas son forzadas a moverse a través de la matriz del gel, independientemente de su tamaño.

• La electroforesis se desarrolla en una tira vertical y delgada de poliacrilamida

• El flujo se desplaza desde la parte superior a la inferior.

• Los geles son químicamente inertes

• Se forman por polimerización de poliacrilamida entrecruzada con metil-bis-acrilamida .

• Gelificación completa: 2% de bis-acrilamida

• El del poro depende de la [C] de acrilamida.

• A una dada [acrilamida] si [bis] esta en una concentración de 5% = del poro es mínimo

• Polimerización: ocurre en presencia de radicales libres (fotodescomposición de riboflavina), TEMED (catalizador) y Persulfato de Amonio (iniciador)

• Tipos de buffer: continuo y discontinuo

• Finalizada la corrida electroforética se visualizan las bandas de proteínas por tinción con Ag o colorantes (Coomasie Brilliant Blue)

Suero humano (condiciones nativas)

Electroforesis en condiciones desnaturalizantes

• Las proteínas se separan en base a su masa.

• Mezcla de proteínas en una solución de dodecilsulfato de Na (SDS) detergente aniónico que interrumpe prácticamente todas las interacciones no covalentes de la molécula nativa

• SDS= se unen a las cadenas principales en una relación = 1 anión SDS/2 residuos aa

• Complejo SDS-PROT desnaturalizada tiene carga neta negativa grande = proporcional a la masa de proteína.

• -mercaptoetanol /ditiotreitolreducen puentes disulfuro

Glicoproteínas, Glucogeno, Glucosaminoglicanos

• Tinción con ácido Peryódico-Schiff (PAS)

bandas de color magenta con un fondo rosado débil

• Ruptura de la unión de los anillos de hexosas / enlaces de hexosaminas de los glucosaminoglicanos formando grupos aldehído.

• Reacción de estos grupos con el reactivo de Schiff(leucofucsina o bisulfato de fucsina)

Auto radiografíasSe detectan marcas radioactivas colocando un placa de Rx sobre el gel

Lípidos

• Tinción con Colorantes SUDÁN (Negro Sudan, Sudan III/IV) prácticamente insoluble en agua

• El colorante se emplea disuelto en un solvente orgánico (lípidos y colorante son relativamente insolubles.

• El colorante debe ser más soluble en los lípidos que en el solvente la coloración tiene lugar porque las moléculas del colorante se distribuyen entre las moléculas de lípidos y del solvente en función de la solubilidad diferencial entre ambos.

Determinación de la Masa (kDa) por PAGE

• La movilidad de la mayor parte de los polipéptidos es proporcional al log (masa)

• Algunas proteínas ricas en carbohidratos no obedecen esa relación empírica.

• Masa molecular de proteínas incógnita: electroforesis de una proteína de PM desconocido y de otras de PM conocido (patrones) a diferentes [gel]

• SDS-PAGE es rápida, sensible y de alta resolución:

Se detecta una banda de aproximadamente 0.1 g de proteína (2 pmol) si se tiñe con Coomasie y < 0.02 g por tinción con Ag.

Se pueden distinguir proteínas que difieren en masa en un 2% ( 40 vs. 41 kDa, diferencia de 10 residuos)

Isoelectroenfoque (IEF)

• Las proteínas se separan electroforéticamente en base al contenido relativo de residuos acídicos o básicos.

• Se forma en el gel un gradiente de pH, sometiendo a electroforesis una mezcla de polianfolitos (polímeros pequeños multicargados)

• pI : pH al cual la carga neta de la proteína es cero su movilidad es cero porque z es cero.

• En la práctica el sistema se estabiliza (evitar convección y mezclado de anfolitos) incorporando sacarosa o construyendo el gradiente de pH sobre un medio soporte (polacrilamdia o agarosa)

• Por IEF se pueden resolver proteínas que difieren en < 0.01 pI difieren en una carga neta

Electroforesis Bidimensional

• Combinación de la técnica de IEF con la de SDS-PAGE para lograr una separación de alta resolución.

• La muestra se somete primero a IEF. El gel obtenido se coloca luego horizontalmente en la parte superior de

una placa de SDS-PAGE las proteínas se extienden a lo largo del gel dependiendo de cuan lejos han migrado en el IEF.

Las proteínas se desarrollan electroforéticamente en dirección perpendicular para dar un perfil de manchas en dos dimensiones las proteínas se separan en la dirección horizontal en base a su punto isoeléctrico y verticalmente en base a su masa.

• Se pueden resolver en el orden de mil diferentes proteínas en un único experimento

• Proteínas aisladas de células bajo diferentes condiciones fisiológicas pueden ser desarrolladas en una electroforesis bidimensional y luego se evalúa la intensidad de las señales obtenidas se aplica para determinar cambios enla concentración de ciertas proteínas en respuesta al estado fisiológico.

• Problema: no se puede establecer cual proteína es la regulada? Ya que este sistema aunque despliega múltiples proteínas, estas no pueden ser identificadas.

• Hoy es posible la identificación acoplando un espectrómetro de masas.