clonaggio funzionale clonaggio posizionale conoscenza proteina malattia genetica determinazione...

Clonaggio funzionale Clonaggio posizionale

Conoscenza proteina Malattia genetica

Determinazione sequenza amminoac. Mappatura genetica con marcatori polimorfici

Deduzione sequenza nucleotidica Identificazione cloni genomiciche coprono il sito mappato

Sintesi sonda oligonucleotidica Ricerca del gene (varie tecniche)

Isolamento clone di cDNA Deduzione della struttura aminoac.

Isolamento clone genomico Ricerca mutazioni nucleotidiche

Caratterizzazione clone genomico Ricerca funzione proteica

Ricerca delle mutazioni

METODI DI CLONAGGIO

CLONAGGIO ATTRAVERSO VETTORE

ENZIMI DI RESTRIZIONE

DIGESTIONE MULTIPLA E CLONAGGIO

Specie Dimensioni

del genoma (bp)

Numero di cloni

Frammenti Frammenti

da 17 kb da 35 kb

E. coli 4,6 x 106 820 410

S. cerevisiae 1,8 x 107 3225 1500

D. melanogaster 1,2 x 108 21500 10000

Riso 5,7 x 108 100000 49000

Uomo 3,2 x 109 564000 274000

Rana 2,3 x 1010 4053000 1969000

Numero di cloni necessario per costruire librerie genomiche

N = ln (1 – P) / ln (1- a/b)

a = dimensione media del frammentob = totale del genoma da clonareP = frammento qualunque sia clonato

MAPPATURA FISICA

COSTRUZIONE DI LIBRERIE GENOMICHE A PARTIRE DA DNA OTTENUTO DA:

DNA GENOMICO TOTALE

IBRIDI SOMATICO-CELLULARIPANNELLI DI IBRIDI MONOCROMOSOMICIPANNELLI DI IBRIDI CON CROMOSOMI DELETI

IBRIDI DA RADIAZIONE

SINGOLI CROMOSOMI ISOLATI CON CITOMETRIA A FLUSSO

STIMA DELLA RELAZIONE TRA DISTANZA GENETICA E FISICA

Stima della distanza genetica totale (in cM) nella specie umana:somma della lunghezza totale dei cromosomi ottenuta dalla mappatura genetica con marcatori polimorfici

Nel maschio = 2644 cM

Nella femmina = 4481 cM

Per 3000 Mb = 3 x 10 9 bp di genoma

Maschio 1 cM = 1.13 Mb = 1.13 x 106 bp

Femmina 1 cM = 0.67 Mb = 0.67 x 106 bp Media : 1 cM = 0.9 Mb = 0.9 x 106 bp

SEPARAZIONE DI CROMOSOMI CON CITOMETRIA A FLUSSO

VETTORI DI CLONAGGIO DIMENSIONI DELL’INSERTO

Vettori plasmidici standard 0 - 10 Kb

Vettori lambda 10 - 20 Kb

Vettori cosmidici 30 - 44 Kb

Vettori BAC (cromosomi artificiali batterici) fino a 300 Kb

Vettori YAC (cromosomi artificiali di lievito) 0.3 - 2.0 Mb

Libreria di DNA genomico in termini di genoma-equivalenti

1 genoma equivalente: 3000 Mb/40 Kb = 75000 cloni indipendenti

GENOMA UMANO

ASSEMBLAGGIO DEI CLONI IN CONTIGUI ATTRAVERSO:

1) walking cromosomico:- con cloni interi (e soppressione di sequenze ripetitive); - con le estremità dei cloni

2) fingerprinting per identità di: - mappa di frammenti di restrizione- presenza DNA ripetitivo in frammenti di restrizione, - prodotti PCR compresi tra elementi ripetuti (IRE, intersperse repetitive elements, es. Alu),

3) contenuto di Sequence Tagged Site (STS) (Siti contrassegnati da una sequenza)

DIGESTIONE PARZIALE DEL DNA E PRODUZIONE DI CLONI CON FRAMMENTI CHE SI SOVRAPPONGONO

CHROMOSOME WALKING

METODI PER L’ANALISI DEI CLONI GENOMICI PER ORDINARLI IN CONTIGUI

- Distribuzione dei cloni in piastre da microtitolazione per produrre griglie ordinate

- Produzione di filtri con i singoli cloni da utilizzare per analisi con ibridazione

- Produzione di pool di DNA di cloni e selezione attraverso PCR specifiche

- Piastra agar con cloni ricombinanti-Trasferimento delle singole colonie in piastre da microtitolazione con pozzetti con terreno (96 pozzetti per microtiter)- Produzione filtro corrispondente

Libreria specifica del cromosoma 6 con cloni ordinati su griglia

- Piastra di agar 22 x 22 cm con cloni ricombinanti

-Trasferimento delle singole colonie in piastre di microtitolazione con pozzetti con terreno (96 pozzetti per microtiter)

- Trasferimento delle singole colonie in piastre da microtitolazione ad alta densità 96 x 4 = 384 pozzetti per microtiter

- Trasferimento automatizzato su filtro 54 microtiter x 384 pozzetti = 20736 cloni = 4 genomi equivalenti

ASSEMBLAGGIO DEI CLONI IN CONTIGUI ATTRAVERSO:

1) walking cromosomico:- con cloni interi (e soppressione di sequenze ripetitive); - con le estremità dei cloni

2) fingerprinting per identità di: - mappa di frammenti di restrizione- presenza DNA ripetitivo in frammenti di restrizione, - prodotti PCR compresi tra elementi ripetuti (IRE, intersperse repetitive elements, es. Alu),

3) contenuto di Sequence Tagged Site (STS) (Siti contrassegnati da una sequenza)

FINGERPRINTING PER MAPPADI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE

Presenza nei diversi cloni di frammenti di restrizione della stessa dimensione

FINGERPRINTING DEI CLONI PER PRESENZA DI DNA RIPETITIVO

IRE = elementi ripetuti intercalati, es sequenze Alu:inter Alu-PCR

ASSEMBLAGGIO DI CLONI MEDIANTE ANALISI DEL CONTENUTO DI SEQUENCE TAGGED SITE (STS) (SITI ETICHETTATI DA UNA SEQUENZA)

STS = sequenza a singola copia amplificabile con PCRLa presenza del prodotto PCR di peso molecolare atteso rivela la presenzadi quella STS all’interno di un clone

ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS

ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS

Screening di intere librerie genomiche con PCR su pool di DNA

PREPARAZIONE DI POOL DI DNA DI CLONI YAC E SCREENING CON PCR

CLONAGGIO POSIZIONALE: UTILIZZO DEI MARCATORI ASSOCIATI GENETICAMENTE PER

COSTRUZIONE DI UN CONTIGUO DI CLONI GENOMICI