ALTIN BİRİKTİRİLMİŞ POLİVİNİL FERROSEN MODİFİYE PT ELEKTRODUNU TEMEL ALAN

GLUKOZ BİYOSENSÖRÜNÜN GELİŞTİRİLMESİ

Meral TOPÇU

Yüksek Lisans Tezi KİMYA ANABİLİM DALI

ISPARTA 2003

T.C.

SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ALTIN BİRİKTİRİLMİŞ POLİVİNİL FERROSEN MODİFİYE PT ELEKTRODUNU

TEMEL ALAN GLUKOZ BİYOSENSÖRÜNÜN GELİŞTİRİLMESİ

Meral TOPÇU

DANIŞMAN

Prof.Dr. Handan GÜLCE

Yüksek Lisans Tezi

KİMYA ANABİLİM DALI

ISPARTA 2003

Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğü’ne

Bu çalışma jürimiz tarafından KİMYA ANABİLİM DALI’nda YÜKSEK

LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir.

Başkan : Prof. Dr. Handan GÜLCE

Üye : Yard. Doç. Dr. Filiz ARI

Üye : Yard. Doç. Dr. Hakan AKTAŞ

ONAY

Bu tez ….. / ….. / ………. tarihinde Enstitü Yönetim Kurulunca belirlenen yukarıdaki jüri

üyeleri tarafından kabul edilmiştir.

….. / ….. / ……….

Enstitü Müdürü

Prof.Dr. Remzi KARAGÜZEL

i

İÇİNDEKİLER

Sayfa

İÇİNDEKİLER .................................................................................................................. İ

ÖZET............................................................................................................................... İV

ABSTRACT..................................................................................................................... V

TEŞEKKÜR.................................................................................................................... Vİ

ŞEKİLLER DİZİNİ .......................................................................................................Vİİ

ÇİZELGELER DİZİNİ.................................................................................................... X

1. GİRİŞ ............................................................................................................................ 1

2. GENEL BİLGİLER...................................................................................................... 4

2.1. Enzim Teknolojisinin Tarihi...................................................................................... 4

2.2. Enzimler ..................................................................................................................... 5

2.2.1. Enzimlerin Yapısı ................................................................................................... 7

2.2.2. Enzimlerin Sınıflandırılması .................................................................................. 8

2.2.3. Enzimlerin Çalışma Mekanizması ......................................................................... 9

2.2.4. Enzim Reaksiyonlarının Kinetiği ......................................................................... 10

2.2.5. Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri ..................................................................... 13

2.2.5.1. Taşıyıcıya Bağlama ........................................................................................... 13

2.2.5.2. Çapraz Bağlama................................................................................................. 15

2.2.5.3. Tutuklama .......................................................................................................... 15

3. BİYOSENSÖRLER ................................................................................................... 17

3.1. Biyosensörlerde Kullanılan Biyokatalizörler.......................................................... 19

3.1.1. Enzimler ve Enzim Sistemleri.............................................................................. 19

3.1.2. Bakteri ve Hücreler............................................................................................... 20

3.1.3. Dokular.................................................................................................................. 20

3.2. Algılayıcı (Transducer)............................................................................................ 21

3.3. Biyosensörlerin Çalışma Mekanizması................................................................... 22

3.4. Biyosensör Çeşitleri................................................................................................. 23

3.4.1. Elektrokimyasal Biyosensörler ........................................................................... 23

3.4.1.1. Amperometrik Biyosensörler ............................................................................ 23

3.4.1.2. Potansiyometrik Biyosensörler ......................................................................... 23

ii

3.4.1.3. Kondüktometrik Biyosensörler ......................................................................... 24

3.4.2. Optik Biyosensörler .............................................................................................. 25

3.4.3. Kalorimetrik Biyosensörler .................................................................................. 26

3.4.4. Piezoelektrik Biyosensörler................................................................................. 26

3.5. Biyosensör Performans Kriterleri............................................................................ 26

3.5.1. Kalibrasyon Karekteristikleri ............................................................................... 27

3.5.2. Seçicilik ve Güvenirlik ......................................................................................... 27

3.5.3. Tekrarlanabilirlik, Kararlılık ve Ömür................................................................. 27

3.5.4. Kararlı Hal ve Geçiş Cevap Süreleri .................................................................... 27

3.6. Biyosensörlerde Kullanılan Metal-Nanotanecikleri ............................................... 28

3.6.1. Metal Nanotaneciklerin Kullanıldığı Bazı Uygulamalar..................................... 29

4. GLUKOZ BİYOSENSÖRLERİ İLE YAPILAN BAZI UYGULAMALAR.......... 33

5. POLİVİNİLFERROSEN MODİFİYE ELEKTROTLAR ........................................ 39

6. KULLANILAN DENEYSEL YÖNTEMLER.......................................................... 46

6.1. Kronoamperometri................................................................................................... 46

6.2. Dönüşümlü Voltametri ............................................................................................ 47

7. DENEYSEL KISIM ................................................................................................... 50

7.1. Kullanılan Çözücünün Saflaştırılması..................................................................... 50

7.2. Kullanılan Elektrotlar .............................................................................................. 50

7.3. Kullanılan Aletler .................................................................................................... 50

7.4. Elektroliz Hücresi .................................................................................................... 50

7.5. Enzim Çözeltisinin Hazırlanması............................................................................ 51

7.6. Tampon Çözeltinin Hazırlanması............................................................................ 51

7.7. Glukoz çözeltisinin hazırlanması ............................................................................ 51

7.8. KAuCl4 çözeltisinin hazırlanması ........................................................................... 52

7.9. Vinilferrosenin Kimyasal Polimerizasyonu............................................................ 52

7.10. Serbest Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi ............................................................ 52

7.11. Enzim Elektrodunun Hazırlanması ....................................................................... 52

7.12. Enzim Elektrot Aktivitesinin Belirlenmesi ........................................................... 53

7.13. Kan Numunelerinde Glukoz Tayini ...................................................................... 54

8. DENEYSEL BULGULAR VE TARTIŞMA............................................................ 55

iii

8.1. Serbest Glukoz Oksidaz Enzimi İçin Optimum Koşulların ve Kinetik

Parametrelerin Saptanması ............................................................................................. 56

8.1.1. Serbest Enzim İçin Optimum pH Değerinin Belirlenmesi.................................. 57

8.1.2. Substrat Derişiminin Etkisi................................................................................... 59

8.1.3. Sıcaklığın Etkisi .................................................................................................... 62

8.2. Enzim Elektrot Aktivitesine Deneysel Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi ...... 64

8.3. (PVF-GOD) Enzim Elektrot Aktivitesinin Belirlenmesi ....................................... 65

8.3.1. Uygulanan Gerilimin Etkisi.................................................................................. 66

8.3.2. PVF Derişiminin Etkisi ........................................................................................ 67

8.3.3. PVF’de Bekletme Süresinin Etkisi....................................................................... 68

8.3.4. Enzim Derişiminin Etkisi ..................................................................................... 69

8.3.5. Enzimde Bekletme Süresinin Etkisi..................................................................... 71

8.3.6. Çalışma pH’ının Etkisi ....................................................................................... 72

8.3.7. PVF-GOD Enzim Elektroduna Substrat Derişiminin Etkisi ............................... 72

8.4. PVF-Au-GOD Enzim Elektrot Aktivitesinin Belirlenmesi.................................... 75

8.4.1. Uygulanan Gerilimin Etkisi.................................................................................. 79

8.4.2. KAuCl4 Derişiminin Etkisi................................................................................... 80

8.4.3. KAuCl4 Çözeltisinde Bekletme Süresinin Etkisi................................................. 81

8.4.4. PVF-Au-GOD Enzim Elektroduna Substrat Derişiminin Etkisi......................... 82

8.4.5. Sıcaklık Etkisi ....................................................................................................... 85

8.5. Geliştirilen Elektrodun Uzun Süreli Kararlılığı ...................................................... 86

8.6. Girişimler ................................................................................................................. 88

8.7. Geliştirilen Elektrodun Gerçek Numunelerde Kullanımı....................................... 89

9. SONUÇLAR............................................................................................................... 92

KAYNAKLAR ............................................................................................................... 96

iv

ÖZET Basit ve hassas amperometrik glukoz enzim elektrodunun tasarlanması için yeni bir yöntem tanımlanmıştır. Polivinilferrosen (PVF) kaplı Pt elektroda dayanan enzim elektrodunun geliştirilmesini sağlayacak basit bir enzim tutuklama yöntemi araştırılmıştır. Bu çalışmada iki yeni glukoz enzim elektrodu geliştirilmiştir. Çalışmanın birinci adımında, PVF kaplanmış Pt elektrot enzim çözeltisine daldırılarak glukoz oksidaz enziminin (GOD) polimer matriks içerisinde tutuklanması sağlanmıştır ve bu enzim elektrot PVF-GOD enzim elektrodu olarak tanımlanmıştır. Elektrot cevabı üzerine polimerik film kalınlığı, pH, sıcaklık, substrat ve enzim konsantrasyonu etkisi araştırılmıştır. 25°C sıcaklıkta pH 7,4 olarak bulunmuştur. Cevap süresi 25-35 s ve lineer çalışma aralığının üst sınırı 14,60 mM glukoz derişimidir. Tutuklanmış enzim sistemi için görünür Michaelis-Menten sabiti (Kmg) ve aktivasyon enerjisi sırasıyla 20,38 mM glukoz ve 24,05 kJ/mol olarak bulunmuştur. Çalışmanın ikinci adımında GOD, PVF kaplanmış ve ardından Au biriktirilmiş Pt elektrot üzerinde aynı yöntemle tutuklanmıştır ve bu enzim elektrot PVF-Au-GOD enzim elektrodu olarak tanımlanmıştır. Enzim elektrot cevabı üzerine Au etkisi araştırılmıştır. 25°C sıcaklıkta pH 7,4 olarak bulunmuştur. Cevap süresi 50-90 s ve lineer çalışma aralığının üst sınırı 21,58 mM glukoz derişimidir. Tutuklanmış enzim sistemi için görünür Michaelis-Menten sabiti (Kmg) ve aktivasyon enerjisi sırasıyla 30,4 mM glukoz ve 24,89 kJ/mol olarak bulunmuştur. Enzim elektrotlarının amperometrik cevapları, enzimatik yükseltgenme sonucu oluşan H2O2’nin SCE’ye karşı sabit potansiyelde ölçülmesine dayanır. Serbest ve tutuklanmış enzim sistemlerinin Kmg ve Ea değerlerini karşılaştırmak amacıyla aynı koşullar altında farklı glukoz konsantrasyonlarında oluşan H2O2 elektrokimyasal olarak ölçülmüştür. pH 7,4 tamponunda kaplanmamış Pt elektrot kullanılarak serbest enzim için maksimum akım değerleri ölçülmüştür. Serbest enzim için KM ve Ea değerleri sırasıyla 28,2 mM glukoz derişimi ve 27,83 kJ/mol’dür. Girişim yapabilecek maddelerin etkisi ve enzim elektrodunun kararlılığı araştırılmıştır. Aynı zamanda gerçek kan numunelerindeki glukoz konsantrasyonu PVF-Au-GOD enzim elektrodu ile standart ekleme yöntemi kullanılarak ölçülmüştür. Bulunan sonuçlar hastane sonuçları ile uyum içindedir. Anahtar Kelimeler: Glukoz, Polivinilferrosen, Altın biriktirme, Enzim elektrot

v

ABSTRACT

A novel strategy to construct a simple and sensitive amperometric glucose enzyme electrode was described. A simple method of enzyme immobilization was investigated which is useful for devolopment of enzyme electrodes based on polyvinylferrocene (PVF)coated, Pt electrodes. In this study, two novel glucose enzyme electrodes were investigated. In the first step of this study, the glucose oxidase enzyme (GOD) was incorporated into the polymer matrix by immersing PVF coated PT electrode in enzyme solution for several times, and this enzyme electrode was called as PVF-GOD enzyme electrode. The effects of the thickness of the polymeric film, pH, temperature, substrate and enzyme concentration on the response of the enzyme electrode were investigated. The optimum pH was found to be 7.4 at 25°C. The response time was found to be 25-35 s and upper limit of the linear working portion was found to be 14.598 mM glucose concentration. The apparent Michaelis-Menten constant (Kmg) and the activation energy of this immobilized enzyme system were found to be 20.38 mM glucose and 24.05 kJ/mol, respectively. In the second step of this study, GOD was immobilized on PVF coated and then Au deposited Pt electrode by the same strategy, and this enzyme electrode was called as PVF-Au-GOD enzyme electrode. The effect of the amount of Au on the response of the enzyme electrode was investigated. The optimum pH was found to be 7.4 at 25°C. The response time was found to be 50-90 s and upper limit of the linear working portion was found to be 21.58 mM glucose concentration. The apparent Michaelis-Menten constant (Kmg) and the activation energy of this immobilized enzyme system were found to be 30.4 mM glucose and 24.89 kJ/mol, respectively. The amperometric responses of the enzyme electrodes due to the electrooxidation of enzymatically generated H2O2 were measured at a constant potential versus SCE. In order to compare the Kmg and Ea values of immobilized enzyme systems with free enzyme systems under the same solution condition, the H2O2 generated from solutions of different glucose concentrations were measured electrochemically. The maximum current values were obtained for the free enzyme using a bare Pt electrode in a buffer solution of pH 7.4. The KM and Ea values of free enzyme system were 28.2 mM glucose concentration and 27.823 kJ/mol, respectively. The effects of interferents and stability of the enzyme electrode were also investigated. The glucose concentration in real blood samples were also measured using the PVF-Au-GOD enzyme electrode by utilizing standard addition method and the results were found to be compatible with the hospital results. Key Words: Glucose, Polyvinylferrocene, Gold deposition, Enzyme Electrode

vi

TEŞEKKÜR

Bu çalışmayı hazırlamamda maddi manevi desteğini esirgemeyen danışman hocam

Prof.Dr. Handan GÜLCE’ye ayrıca tezin yazılmasında ve bütün çalışmalarım boyunca

beni yalnız bırakmayan eşim Süleyman SULAK’a ve aileme teşekkür ederim.

vii

ŞEKİLLER DİZİNİ

Sayfa

Şekil 2.1. Reaksiyon Hızının Substrat Derişimi ile Değişimi ........................................ 11

Şekil 2.2. Lineweaver-Burk Grafiği ................................................................................11

Şekil 2.3. Sıcaklıkla reaksiyon hızının değişimi ............................................................. 12

Şekil 2.4. Aktivasyon enerjisinin belirlenmesi ............................................................... 12

Şekil 3.1. Bir biyosensörün genel şematik gösterimi ..................................................... 19

Şekil 5.1. Ferrosen Polimerinin yükseltgenme-indirgenme tepkimesi ...........................39

Şekil 5.2. Elektrokimyasal olarak katkılanmış PVF ....................................................... 40

Şekil 6.1.a) Kronoamperometrik uyarı. b) Kronoamperometrik cevap ......................... 46

Şekil 6.2. (a) Dönüşümlü voltametride elektroda uygulanan gerilim programı……..... 47

(b) Elde edilen akım gerilim eğrisi .............................................................… 47

Şekil 7.1. Elektrokimyasal çalışmaların yapıldığı hücre ................................................ 51

Şekil 8.1. Polimer ile kaplandıktan sonra Au biriktirilen elektrot için serbest enzim

çalışmasında elde edilen cevap eğrileri............................................................................56

Şekil 8.2. Kaplanmamış elektrot için serbest enzim çalışmasında elde edilen cevap

eğrileri............................................................................................................................... 57

Şekil 8.3. Kaplandıktan sonra Au biriktirilmiş elektrotda serbest enzim için ortamın pH

değerinin reaksiyon hızına etkisi......................................................................................58

Şekil 8.4. Polimer ile kaplandıktan sonra Au biriktirilen elektrotta serbest enzim için

gözlenen akım değerlerinin glukoz derişimi ile değişimi................................................60

Şekil 8.5. Kaplanmamış elektrotta serbest enzim için gözlenen akım değerlerinin

glukoz derişimi ile değişimi ............................................................................................ 60

Şekil 8.6. Polimer ile kaplandıktan sonra Au biriktirilmiş elektrodun serbest enzim için

Linewear-Burk grafiği ..................................................................................................... 61

Şekil 8.7. Kaplanmamış elektrodun serbest enzim için Linewear-Burk grafiği ............ 61

Şekil 8.8. Serbest enzim için reaksiyon hızının sıcaklıkla değişimi ...............................63

Şekil 8.9. Serbest enzim için Arrhenius bağıntısına göre çizilen ln i değerine karşı 1/T

grafiği ...............................................................................................................................64

Şekil 8.10. PVF-GOD enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile değişimi ..........66

Şekil 8.11. Uygulanan potansiyelin PVF-GOD elektrot akım cevabına etkisi .............. 67

viii

Şekil 8.12. PVF-GOD enzim elektrot aktivitesinin PVF derişimi ile değişimi ............. 68

Şekil 8.13. PVF-GOD enzim elektrot için PVF çözeltisinde bekletme süresine karşı

elde edilen akım değerleri ............................................................................................... 69

Şekil 8.14. PVF-GOD enzim elektrodunda tutuklama işlemi sırasında kullanılan

çözeltideki enzim derişimine karşı elde edilen akım değerleri .......................................70

Şekil 8.15. PVF-GOD enzim elektrodunda tutuklama işlemi sırasında kullanılan enzim

çözeltisinde bekletme süresine karşı elde edilen akım değerleri ................................... 71

Şekil 8.16. PVF-GOD enzim elektrodunda kullanılan tampon çözelti pH’sına bağlı

olarak elde edilen akım değerleri .................................................................................... 72

Şekil 8.17. (a) PVF-GOD enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile değişimi .... 73

Şekil 8.17. (b) PVF-GOD enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile değişimini

veren doğrusal çalışma aralığı .........................................................................................74

Şekil 8.18. Tutuklanmış enzim için Lineweaver-Burk grafiği ....................................... 75

Şekil 8.19. PVF-Au-GOD enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile değişimi ... 77

Şekil 8.20. ( ___ ) PVF-GOD enzim elektrodunun dönüşümlü voltomogramı.

(…....) PVF-Au-GOD enzim elektrodunun 15,4 mM glukoz ilavesinden

sonraki dönüşümlü voltomogramı.

(…...) PVF-Au-GOD enzim elektrodunun dönüşümlü voltomogramı.

( ) PVF-GOD enzim elektrodunun15,4 mM glukoz ilavesinden son-

raki dönüşümlü voltomogramı …………………………………………. 78

Şekil 8.21. ( _____ ) H2O2 eklenmemiş dönüşümlü voltomogram

( ) Temiz Pt elektrotta H2O2’nin voltametrik davranışı

( ) PVF kaplanmış Au biriktirilmiş Pt elektrotta H2O2’nin voltamet-

rik davranışı

( ) PVF kaplanmış Pt elektrotta H2O2’nin voltametrik davranışı ... 79

Şekil 8.22. Uygulanan potansiyelin PVF-Au-GOD enzim elektrot akım cevabına etkisi

.......................................................................................................................................... 80

Şekil 8.23. PVF-Au-GOD enzim elektrodunda kullanılan KAuCl4 derişimine karşı elde

edilen akım değerleri ....................................................................................................... 81

Şekil 8.24. PVF-Au-GOD enzim elektrodunda kullanılan KAuCl4 çözeltisinde

bekletme süresine karşı elde edilen akım değerleri ........................................................ 82

Şekil 8.25. PVF-GOD-Au enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile değişimi ... 83

ix

Şekil 8.26. PVF-Au-GOD enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile değişimini

veren doğrusal çalışma aralığı .........................................................................................83

Şekil 8.27. PVF-Au-GOD enzim elektrot için Lineweaver-Burk grafiği ...................... 84

Şekil 8.28. Tutuklanmış GOD enzimi için reaksiyon hızının sıcaklıkla değişimi ......... 85

Şekil 8.29. (…..) PVF-Au-GOD enzim elektrodu için Arrhenius grafiği

( __ ) PVF-GOD enzim elektrodu için Arrhenius grafiği ....................... 86

Şekil 8.30. Aynı elektrot ile farklı günlerde alınan maksimum akım değerleri ............. 87

Şekil 8.31. 51. günde PVF-Au-GOD enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile

değişimini veren doğrusal çalışma aralığı .......................................................................88

Şekil 8.32. PVF-Au-GOD enzim elektrot ile kanda glukoz tayini için elde edilen cevap

eğrileri .............................................................................................................................. 89

Şekil 8.33. Hastane sonuçlarına karşı PVF-Au-GOD enzim elektrotla elde edilen

sonuçlar ............................................................................................................................91

x

ÇİZELGELER DİZİNİ

Sayfa

Çizelge 3.1. Biyonsensörlerle tayin edilebilen maddeler …………...………............. 18

Çizelge 3.2. Biyonsensör algılayıcıları ……………………………….……...…....... 22

Çizelge 8.1. PVF-Au-GOD enzim elektrodu ile yapılan ölçüm sonuçları ve hastane

sonuçları ……………………………………………………...…………...……........ 90

Çizelge 8.2. Serbest ve tutuklanmış enzim için Ea ve KM değerlerinin karşılaştırılması

........................................................................................................................................ 94

1

1. GİRİŞ

Biyosensörler klinik tıpta teşhis ve tayin amacıyla, fermantasyon analizi ve

kontrolünde biyoloji, kimya, gıda endüstrisi, ziraat ve veterinerlikteki çeşitli

analizlerde, endüstriyel gaz ve sıvıların analizinde, çevre kirlenmesinin izlenmesinde,

patlayıcılar ve diğer askeri alanlarda kullanılmaktadır. Analitik kimyada en büyük

problem seçicilik ve düşük analitik konsantrasyonunda çalışmaktır. Sensörlerin

gelişimi yüksek seçicilik ve kolay kullanımı ile analiz problemini kaldırmıştır.

Geliştirilen çeşitli sensör tipleri uygulamada kullanılmaktadır.

Biyosensörler sağlık alanında çeşitli tıbbi teşhislerde (glukoz, fruktoz, laktat, üre,

kolestrol) kan analizleri ile çeşitli hastalıkların teşhisi ve tedavisi amacıyla

kullanılmaktadır. Genellikle şeker hastalarına kandaki glukoz seviyesine göre, dışardan

insülin hormonu verilir. Burada önemli olan glukoz konsantrasyonunun hızlı ve hassas

olarak ölçümüdür. Bu amaçla geliştirilen ilk sensör, amperometrik ölçüm esaslı glukoz

biyosensörüdür. Glukozun yükseltgenmesinde, reaksiyon ortamdaki oksijen azalması

hidrojen peroksit veya glukonik asit oluşumu ile izlenebilir. Genellikle glukoz tayini

için geliştirilen enzim elektrotlarında tercih edilen yöntem H2O2’nin anodik veya

katodik bozunmasıdır. İlk geliştirilen enzim elektrot oksijen seviyesinin belirlenmesi

temeline dayanmaktadır. Söz konusu çalışmada Clark tipi oksijen elektrot kullanılmış,

oksijenin kısmi basıncının değişiminden yararlanılarak glukoz miktarı belirlenmiştir.

Oksijen elektrot, oksijen dışındaki bileşenlere karşı duyarsız olduğundan, ölçümlerdeki

hata düzeyinin son derece düşük olduğu ileri sürülmektedir.

Clark’ın çalışmasından sonra pH elektrotları üzerine tutuklanmış enzim içeren

membranların kullanılmasıyla biyoelektrot çalışmaları devam etmiştir. Guilbault ve

Lubrano selofan membran içinde tutuklanmış enzimle çalışmışlar ve yaklaşık 12

saniye cevap süresine ulaşmışlardır. Daha sonraki yıllarda metalik elektrot yüzeyine

glukoz oksidaz içeren membran kaplanarak amperometrik çalışmaların da

uygulanabileceği fikri ortaya çıkmıştır. Mascini ve arkadaşları Pt elektrot yüzeyini

içinde tutuklanmış enzim bulunan naylon ağ ile kaplamıştır ve sürekli kullanıma uygun

hazırlanması kolay, mekanik dayanıklılığı yüksek bir sensör geliştirmişlerdir. Coulet

2

ve arkadaşları bu tekniği kollojen zarlarına uygulamışlardır. Bu yöntem zaman içinde

ticari öneme sahip olmuştur .

1980’li yıllarda çeşitli monomerlerden yola çıkarak elde edilen polimer matriksi

içerisinde glukoz oksidaz enziminin tutuklanmasıyla değişik pek çok elektrot

hazırlanmıştır.

Nanoparçacık araştırmaları son yıllarda muazzam bir gelişme göstermiştir.

Nanoparçacıklara olan epeyce ilginin sebebi ise; bu materyallerin olağan dışı fiziksel

(organik, elektronik, manyetik ve optik) ve kimyasal özelliklere sahip olmasıdır.

Taneciklerin özellikleri genellikle onların hacmine, şekline ve kararlılığı sağlayan

reaktife bağımlıdır ve hazırlama koşulları tarafından kontrol edilir. Metal-

nanoparçacıklar fiziksel ve kimyasal yöntemlerle hazırlanabilir.

Elektroanalizde metal-nanoparçacıkların diğer önemli bir uygulaması enzimatik

sensörlerin yapımıdır ki bunların çoğunda altın nanoparçacıkları kullanılmıştır.

Kolloidal altın ana parçacıklar olarak adlandırılan çok küçük oktahedral birimlerden

oluşmuş metalik kolloid parçacıklarıdır. Altın parçacıklarının büyüklüğü esas olarak

kolloidal altının oluşturulma yoluna bağlıdır. Altın nanoparçacıkları net negatif yük

taşırlar. Bir protein ve diğer biyolojik molekül kolloidal altına eklendiğinde bu negatif

yük parçacıkların yüzeyine bu moleküllerin fiziksel adsorpsiyonuyla nötralize edilir.

Elektron mikroskopu ile yapılan işlemler kolloidal altının yaygın bir şekilde

kullanılmasını açıklamakta kullanılmıştır ki pek çok makromolekül kolloidal altın

üzerine adsorplandığında biyolojik aktivitelerini kaybetmemişlerdir. Bu gözlemler

altının iletkenliğinin de dikkate alınmasıyla araştırma gruplarını kolloidal altın üzerine

adsorplanmış enzimleri temel alan biyosensör elektrotlarını hazırlamaya sevketmiştir.

Çalışmamızda elektrokimyasal olarak hazırlanan polyvinilferrosen (PVF) modifiye

elektroduna altın biriktirilmiş ve ardından glukoz oksidaz (GOD) enziminin

tutuklanmasıyla glukoz tayininin basit ve güvenilir bir şekilde gerçekleştirilmesi için

amperometrik glukoz biyosensörünün geliştirilmesi amaçlanmıştır.

3

İlk aşamada polivinilferrosen (PVF), vinilferrosenin kimyasal polimerizasyonuyla

hazırlanmış ve elektrodun kaplanmasında metilen klorürdeki PVF çözeltisi

kullanılmıştır. Çalışma elektrodunun polimerle kaplanması daldırma kurutma yöntemi

ile yapılmıştır. Pt elektrot belirli derişimdeki polimer çözeltisine belirli bir süre

bekletilip çıkarıldıktan sonra kurutularak yüzeyin polimer film ile kaplanması

sağlanmıştır. Daha sonra PVF modifiye elektrot altın çözeltisinde bekletilerek

aşağıdaki reaksiyona göre altının elektrot yüzeyinde önderiştirmesi yapılmıştır.

3PVF +Au+3 →3PVF+ +Au

Au nanotanecikleri biriktirilmiş modifiye elektrotta glukoz oksidaz enzimi

tutuklanarak glukoz biyosensörü hazırlanmıştır. Hazırlanan biyosensöre PVF derişimi,

kaplama süresi, altın derişimi, altında bekletme süresi, ortam pH sı gibi çeşitli deneysel

parametrelerin etkileri araştırılarak optimum koşullar saptanmıştır. Tüm bu çalışmalar

oksijen ve azot ortamında denenmiş ve karşılaştırmaları yapılmıştır. Biyosensörün

hazırlanmasında glukoz oksidaz enzimi tutuklanmış olarak kullanılmıştır. Deneylerin

sonucunda tutuklanmış enzim için Lineweaver-Burk grafikleri çizilerek görünür

Michaelis-Menten sabiti, elektrot aktivitesinin sıcaklıkla artış gösterdiği aralıktaki

deneysel veriler kullanılarak Arrhenius eşitliğine göre reaksiyonun aktivasyon enerjisi

hesaplanmıştır. Tutuklanmış enzim için yapılan çalışmalar serbest enzim sistemi

içinde tekrarlanmış ve serbest enzim için en uygun çalışma koşulları belirlenmiştir.

Elde edilen sonuçlar tutuklanmış enzim için bulunan sonuçlarla karşılaştırılarak

tutuklama işleminin enzim yapısında herhangi bir deformasyona neden olup olmadığı

yorumlanmıştır. Glukoz tayini için altın biriktirilmiş PVF modifiye elektrodu ilk kez

bu çalışmada geliştirilmiştir. Ayrıca bu çalışmada hazırlanan enzim elektrodunun

özellikleri literatürde verilen çalışmalarla karşılaştırılarak değerlendirilmiştir.

Bu çalışmada hazırlanan biyosensörün bir uygulaması olarak çalışmamız genelinde

geliştirilen altın biriktirilmiş polivinil ferrosen modifiye elektrodu kanda bulunan

glukoz miktarının tayini için gerçek numunelerde de denenmiş ve bulunan sonuçlar

hastane değerleriyle karşılaştırılmıştır.

4

2. GENEL BİLGİLER

2.1. Enzim Teknolojisinin Tarihi

Bugünkü modern enzim teknolojisi 1874’de Danimarka’lı kimyager Christian

Hansen’in, kurutulmuş sığır midelerinden ‘renet’ enzimini tuz ekstraksiyonu ile elde

etmesiyle başlamıştır. Bu preparat, endüstriyel amaçla üretilmiş ve kısmen saf olan ilk

enzim preparatı olarak literatüre geçmiştir. Aslında bu önemli buluşa, daha önceden

yapılmış uzun evrimsel işlemler sonucu ulaşılmıştır. Enzimler, ya enzim açısından

zengin sebzeler olarak, ya da ekmek ve bira yapımı gibi çeşitli amaçlarla kullanılan

mikroorganizmalar olarak insanoğlu tarafından yüzyıllar boyunca kullanılmıştır. Hatta

enzimlerin antik çağlarda peynir yapımında kullanıldığına ilişkin ipuçları da vardır.

İ.Ö. 800 yılı civarında yazılmış olan ünlü Ilyada ve Odessi epik şiirinden, oğlak ya da

koyun midelerinin, ki bunlarda da sığır midesinde bulunan enzimin aynısı bulunuyor,

peynir yapımında kullanıldığı anlaşılmıştır (Arnold, 1999).

Enzimlerin işlevleri anlaşılmış ve tarih boyunca kullanılmışlarsa da, bunların gerçek

özelliklerinin anlaşılması yakın geçmişte olmuştur. Enzimatik işlemler, özellikle de

fermantasyon, on dokuzuncu yüzyılın en gözde ilgi alanıydı ve bu dönemde çok

değerli buluşlar yapıldı. Özellikle önemli olan bir deney, 1833’de Payen ve Persoz

tarafından yapılan ve çimlendirilmiş arpadan (malt) bir enzim kompleksinin

saflaştırılması olmuştur. Tıpkı maltın kendisi gibi, jelatinleşmiş nişastayı şekere,

özellikle de maltoza, çeviren bu madde "diyastaz" olarak adlandırılmıştır. Bu terim

Fransızca konuşulan ülkelerde bütün enzim izolatları için hâlâ kullanılmaktadır.

Bundan sonra diyastaz ve bunun gibi aktivitesi olan maddelere "ferment" denilmiştir.

Daha sonraki yıllarda fermantasyon teknolojisi alanında gelişmeler devam etmiştir.

Özellikle Schwann, Liebig, Pasteur ve Kühne’nin bu gelişime büyük katkıları

olmuştur. Leibeg’e göre fermantasyon yaygın, kimyasal bir işlemdi ve maya

parçalanma sırasında daima bulunan cansız bir maddeydi. Öte yandan Pasteur, canlı

organizmalar olmadan fermantasyonun olamayacağını söylemiştir.

5

Günümüzde anlaşılmıştır ki, ikisinin de iddiası tam olarak doğru değildir. Bu tartışma

en sonunda 1897’de, her iki bilgin de hayatını kaybettikten sonra, çözüme

kavuşmuştur. Buchner kardeşler mayadan elde edilen ve hücreden ayrıştırılan bir

ekstrenin, tıpkı canlı maya hücreleri gibi, glukozu karbondioksit ve etanole çevirdiğini

göstermişlerdir. Başka bir deyişle, fermantasyon işleminin mayanın kendisi tarafından

değil, mayanın içinde bulunan maddeler tarafından gerçekleştirildiği anlaşılmıştır.

1876’da Kühne, canlı organizmalardan elde edilen bu fermentlere "enzim" denilmesini

önermiştir. Bu kelime "mayanın içinde" anlamındadır ve yunancada "en" "içinde" ve

"zyme" de "maya" ya da "hamur mayası" anlamına gelmektedir ( Lodish vd., 1995).

2.2. Enzimler

Enzimler, canlı için yaşamsal önemi olan pek çok fonksiyonun kontrolünde rol alan,

bir yandan da organizmada hemen hemen bütün kimyasal tepkimelere katılarak,

oluşumlarını inanılmaz boyutlarda hızlandıran biyolojik katalizörlerdir. Etki ettiği

maddenin sonuna "Ase = Az" eki getirilerek ya da katalizlediği tepkimenin çeşidine

göre adlandırılırlar. Örneğin, kitine etki eden kitinaz enzimi vs. Çok defa renksizdirler,

bazen sarı, yeşil, mavi, kahverengi ya da kırmızı olabilirler. Suda ya da tuz çözeltisinde

çözülebilirler. İşlem sonunda, tepkimeye girdikleri ilk hallerinde tepkimeden çıkarlar.

Bu nedenle, her enzim bir biyokatalizördür. Başka bir deyişle, enerji açısından normal

koşullarda hiç gerçekleşemeyecek ya da çok yavaş gerçekleşebilecek kimyasal

tepkimelere katılarak, kendileri bir değişikliğe uğramadan, bu tepkimelerin çok hızlı

bir şekilde gerçekleşmesini sağlarlar. Kuramsal olarak bir enzim belli bir tepkimeye

girip, bir değişikliğe uğramadan çıktığı için, sürekli olarak aynı türden tepkimelere

katılabilmelidir. Ancak gerçekte durum böyle değildir, çünkü enzimlerin de bir ömrü

vardır (Arnold, 1999).

Enzimler birer proteindir ve bu nedenle de amino asit denen temel yapı taşlarından

oluşmuşlardır. Amino asitler bir tane karbon atomuna (C) bağlanmış bir amino grubu

(NH2), bir hidrojen (-H), bir karboksil grubu (-COOH) ve bir de değişken yan gruptan

(-R) oluşurlar. Yirmi amino asitin hepsi de bu temel yapıya sahiptir. Onları farklı

yapan tek şey, taşıdıkları yan grupların büyüklük, şekil, elektrik yükü, suya duyulan

6

ilgi ve aktiflik açısından farklı olmalarıdır. İşte enzimi oluşturan bu amino asitler

birbirleriyle etkileşerek, zincirin kıvrılıp bükülmesine ve sonuçta da üç boyutlu bir yapı

kazanmasına neden olurlar. Yapıdaki bazı amino asitlerin taşıdıkları yan gruplar,

enzimin üç boyutlu yapısında bir bölgede toplanarak "aktif bölge" denen bir alan

oluştururlar. İşte enzimlerin tepkimeleri kataliz etme ve çok seçici olmalarının sırrı bu

bölgedir. Bölgenin oluşturduğu boşluğun şekli o kadar özeldir ki, sadece o enzimin

katalize edeceği tepkimeye girecek madde, başka bir deyişle enzimin substratı, bu

boşluğa girebilir. Bir kez enzimin içıne girdikten sonra, substratla enzimin bu aktif

bölgesinde bulunan kimyasal gruplar arasında kimyasal etkileşimler meydana gelir.

Sonuçta substrat, "geçiş durumu yapısı" denen ve normalde çok kararsız olan bir

yapıya dönüşür. Daha sonra bu yapı ya ürünü oluşturacak, yada substrata geri

dönecektir. Enzimin saniyede etki ettiği substrat molekül sayısına Enzimin Etkinlik

Değeri = Turnover Sayısı denir.

Substrat + Enzim Ürünler

İşte enzimin aktif bölgesinde oluşan bağlar, bu kararsız yapıyı kararlı kılmaya yarar ve

böylece, ürünün oluşması için enzime daha fazla zaman tanınmış olur. Normalde

kimyasal tepkimenin oluşması için bu geçiş durumu yapısının oluşması, bunun için ise

aktivasyon enerjisi denen bir miktar enerjinin sağlanması gerekir. Katıldıkları

tepkimelerde enzimler, aktif bölgelerinin üç boyutlu özel şekilleri sayesinde, bu geçiş

durumunun oluşumunu kolaylaştırır ve dolayısıyla gerekli enerjiyi azaltırlar. Böylece,

tepkimenin daha az enerjiyle daha çabuk gerçekleşmesini sağlarlar.

Asitler, bazlar ya da metal oksitler gibi inorganik katalizörlerin tersine enzimler, son

derece seçicidir. Başka bir deyişle, her enzim tek bir madde, ya da birbiriyle çok yakın

ilişkili olan bir grup madde üzerinde etkilidir. Bazı durumlarda bu seçicilik öyle

boyutlardadır ki, enzim tepkime için maddenin yalnızca belli bağlarını seçer.

Enzimlerin bu seçicilikleri sayesinde, endüstriyel uygulamalarda, istenilen ürün çok

büyük miktarlarda ve saf olarak üretilirken, işlem sonucunda oluşabilecek istenmeyen

maddeler de en az düzeye indirilmiş olur.

7

Enzimlerin başka bir özelliği de son derece verimli çalışmalarıdır. Örneğin, karaciğer

ve kırmızı kan hücrelerinde bol miktarda bulunan katalaz enzimi o kadar etkindir ki,

bir enzim molekülü bir dakika içinde 5.000.000 hidrojenperoksit (H2O2) molekülünü

su (H2O) ve oksijene (O2) parçalayabilir. Enzimlerin önemli olan başka bir özelliğiyse

ılımlı şartlar altında çalışıyor olmalarıdır. Canlılarda çalıştıkları için, atmosferik basınç

altında ve çok uç olmayan sıcaklık ve asiditedeki ortamlarda etkinlerdir.

2.2.1. Enzimlerin Yapısı

Tüm enzim proteinleri genler tarafından şifrelenir. Dolayısıyla amino asit dizilimi

kendine özgüdür. Bazı enzimler (pepsin ve üreaz gibi) yalnız proteinden oluşmuştur.

Fakat diğer çoğunluğu iki farklı kısımdan meydana gelmiştir.

Bunlar:

a) Protein Kısmı (enzimin apoenzim kısmı): Bu kısım enzimin hangi maddeye etki

edeceğini saptar.

b) Koenzim Kısmı: Organik ya da inorganik, çok defa fosfattan meydana gelmiş,

protein kısmına göre çok daha küçük moleküllü bir kısmıdır. Enzimde işlev gören ve

esas iş yapan kısım bu kısımdır. Koenzim kısmı genellikle protein kısmından

ayrılabilir ve analizlerinde birçok vitamini bünyesinde bulundurduğu (thiamin, niacin,

riboflavin vs.) görülmüştür. Buradan şu genellemeyi yapabiliriz: Bütün vitaminler

hücrede enzimlerin koenzim kısmı olarak ödev görürler. Ne koenzim ne de apoenzim

kısmı yalnız başına etkindir. Bazı enzimler ortama yalnız belirli iyonlar eklendiğinde

etkindirler, örneğin bazı enzim zincirine ancak Mg2+ iyonu eklenince glukozu laktik

aside çevirebilir. Tükürükteki amilaz nişastayı yalnız Cl- iyonlarının bulunduğu

ortamda parçalayabilir. Canlı bünyesinde bulunan eser elementler, Mn, Cu, Zn, Fe ve

diğer elementler bu enzimatik işlevlerde aktivatör olarak kullanılır. Bazen enzimin iş

görebilmesi için bir metal iyonuna gereksinim vardır. Yani koenzim kısmı metal iyonu

ise (Ca2+, K+ Mg2+, Zn2+) buna "Kofaktör" denir. Enzimin etkinlik göstermesi için

gereksinim duyduğu organik moleküllere "K o e n z i m" denir. Bazı durumlarda

8

koenzim kısmı apoenzim kısmına kuvvetlice (kovalent) bağlanmıştır; bu sıkı bağlanan

kısma "Prostetik Grup"; prostetik grupla apoenzim kısmının her ikisine birden de

"Holoenzim" denir (Lodish vd., 1995).

2.2.2. Enzimlerin Sınıflandırılması

Her enzimin 4 rakamlı bir numarası vardır, örneğin, 3.6.1.3. "ATP fosfohidrolaz" da

birinci numara sınıfını, ikinci numara alt sınıfını, üçüncü numara grubunu, dördüncü

numara da kendine özgü sıra numarasını verir. Buna göre enzim sınıfları şunlardır:

1. Oksidoredüktazlar: Redoks tepkimelerini katalizler.

a) Dehidrogenazlar: Elektron kazandırıcı tepkimeleri etkilerler.

b) Oksidazlar: Elektron kaybeden tepkimeleri etkilerler.

c) Redüktazlar: Substratı bir redüktör aracılığıyla indirgeyen enzimlere denir. Örneğin

asetaldehit redüktaz, asetaldehiti alkole indirger.

d) Transhidrogenazlar: Bir molekülden diğerine hidrojen taşıyarak onu indirgerler.

e) Hidroksilazlar: Substratlarına bir hidroksil ya da su molekülü katan enzimlere denir,

örneğin, fenilalanin hidroksilaz bir hidroksil grubunu fenilalanine ekleyerek onu

tirozine dönüştürür.

2. Transferaz Enzimler: Hidrojenin dışında bir atomun veya atom grubunun (metil,

karboksil, glukozil, amino, fosfat grupları) bir molekülden diğerine aktarılmasını

sağlarlar.

Dekarboksilazlar: Karboksilik asitlerden CO2 çıkmasını sağlarlar.

9

3. Hidrolaz Enzimler: Bir molekül su sokmak suretiyle ya da su molekülü aracılığıyla

moleküllerin yıkılmasını sağlayan enzimlerdir. Ester, peptit, asetanhidrit ve glukozidik

bağlarına etki ederler.

a) Esterazlar: Ester bağını yıkan enzimlerdir (lipaz, ribonükleaz, fosfataz, pirofosfataz,

glukozidaz).

b) Proteazlar: Peptit bağını yıkan enzimlerdir (proteinaz).

4. Liazlar: Su molekülü çıkarmadan molekülleri yıkan enzimlerdir, örneğin C-C bağı,

aldolaz ve dekarboksilazla yıkılır. Keza C-0 ve C-N bağını yıkanlar da vardır.

5. İzomerazlar: Molekül içinde değişiklik yaparak onun uzayda dizilişini değiştiren

enzimlerdir. Örneğin razemaz, epimeraz.

6. Ligazlar (Sentetazlar): Enerji kullanarak substrat moleküllerinin birbirine

bağlanmasını sağlarlar.

2.2.3. Enzimlerin Çalışma Mekanizması

Enzimin hangi substratla çalışılacağını saptayan kısmı apoenzim kısmıdır. Demek ki

apoenzim kısmıyla substrat arasında bir ilişki vardır. Alman kimyacısı EMIL

FISCHER tarafından bunun kilit anahtar uyumu gibi olacağı savunulmuştur. Koenzim

kısmı daha çok kimyasal bağa yakın olarak işlev gösterir, örneğin ester bağlarını

parçalar. Enzimin apoenzim kısmı bir ya da birkaç yerinden (aktif bölgelerden)

substrat molekülüne yapışır ya da bağlanır (yani bir enzim-substrat kompleksi

oluşturuyor) ve bu arada koenzim kısmı substrat üzerindeki bağlarla gerçek anlamda

birleşmeye veya bağlanmaya giderek onu parçalar. Enzimlerin kimyasal yapıları,

özellikle üçüncül yapıları tam olarak bilinmediğinden (ilk yapısı açıklanan enzim

ribonükleaz, 124 amino asitten meydana gelmiştir) çalışma mekanizmaları da hala tam

anlamıyla açıklığa kavuşturulamamıştır (Arnold vd., 1999).

10

2.2.4. Enzim Reaksiyonlarının Kinetiği

Enzimler reaksiyon kinetiği ve mekanizması yönünden kimyasal katalizörlere

benzerler. Reaksiyonda önce enzim ile substrat arasında bir ara bileşik oluşur. Bu

kararsız ara bileşiğin oluşma hızı enzim ve substrat derişimine bağlıdır. Reaksiyon

koşulları ve enzim derişimi sabit tutulurken substrat derişimi arttırılırsa reaksiyon hızı

belli bir maksimum değere erişir. Bu değerden sonra, substrat derişimi artırılsa bile

reaksiyon hızında bir değişme gözlenmez. Bunun nedeni, ortamdaki enzim

moleküllerinin ortam substrat moleküllerini karşılayamamasıdır. Başka bir deyişle

enzim-substrat ara bileşiğinin oluşum hızında enzim derişiminin kısıtlayıcı rol

oynamasıdır. Enzimlerin bu davranışı 1913 yılında L. Michaelis ve M. Menten

tarafından önerilen bir mekanizmayla açıklanmıştır.

E + S ES P + E (2.1)

Burada; E enzimi, S substratı, ES arabileşiği ve P ürünü göstermektedir. Bu

mekanizmanın kinetik analizi 1926’da Brips ve Haldane tarafından yapılmıştır.

Reaksiyon hızı için;

rm.[S]

r = (2.2)

KM+S

eşitliği elde edilir. Bu eşitlik (2.2)’de görüldüğü gibi belli bir değerden sonra substrat

derişiminin artırılmasıyla tepkime hızının artmayıp sabit değerde kalmasını sağlar. Bu

denklem Michaelis-Menten eşitliği ve “KM” de Michaelis-Menten sabiti diye

tanımlanır. Fiziksel olarak KM katsayısı enzim ve substratın birbirine olan ilgisini

göstermektedir. Enzim ve substrat arasındaki ilgi fazla ise oldukça düşük substrat

derişimlerinde enzimi substrat ile doyurmak mümkün olur (Uslan, 1986).

Lineerleştirmek için eşitlik (2.2)’nin tersi alınır ve düzenlenirse;

11

1 KM 1 1

= × + (2.3)

r rm S rm

denklemi elde edilir. (1/[S])’e karşı (1/r) grafiği çizildiğinde doğru elde edilir.

r

s

Şekil 2.1. Reaksiyon Hızının Substrat Derişimi ile Değişimi (Uslan, 1986).

1/r

1/s

Şekil 2.2. Lineweaver-Burk Grafiği (Uslan, 1986).

Enzimin Km değeri bulunurken Şekil 2.2.’de görünen ve (2.3) denklemi ile tanımlanan

Lineweaver-Burk çiziminden yararlanılır.

Michaelis-Menten eşitliği, çözünmüş substratlar ve kütle aktarım kısıtlaması olmayan

sistemler için geçerlidir. Bu nedenle çözünmez substrat sisteminde ve immobilize

enzimlerde difüzyon kısıtlamalarından ötürü görünür Km değerleri verilir (Bailey ve

Ollis, 1997).

Enzim reaksiyonlarının hızı kimyasal kinetikten farklılık göstererek, sıcaklıkla önce

artar; sonra azalır (Şekil 2.3.). Başka bir deyişle enzim aktivitesi belirli bir optimum

12

sıcaklığa kadar artar, sonra ısısal deaktivitasyon nedeniyle düşer. Enzimatik

reaksiyonlar, kimyasal reaksiyonlarda olduğu gibi bu optimum sıcaklığa kadar

Arrhenius kanununa uyar. Bu bölgede reaksiyon hız sabiti ve maksimum hız için;

k=A.e-Ea/RT (2.4)

rm=k3[E]o (2.5)

yazılabilir. Bu eşitlikler birleştirilirse;

rm=Eo.A.e-Ea/RT (2.6)

[Eo].A= α sabit ise

lnrm=lna-Ea/RT (2.7)

bulunur. Belirli sıcaklık değerlerine karşı gelen maksimum reaksiyon hızları eşitlik

2.7’ye göre grafiğe geçirilirse elde edilen doğrunun eğiminden enzimin aktivasyon

enerjisi hesaplanır (Şekil 2.4.).

r

T opt

T

Şekil 2.3. Sıcaklıkla reaksiyon hızının değişimi (Uslan, 1986).

Lnr

1/T

Şekil 2.4. Aktivasyon enerjisinin belirlenmesi (Uslan, 1986).

13

2.2.5. Enzim İmmobilizasyon Yöntemleri

Enzimler suda çözünen spesifik katalızörlerdir. Biyosensör sisteminde en yaygın

kullanılan biyokatalizörler enzimlerdir. Serbest enzim reaksiyon ortamından istenilen

anda uzaklaştırılamadığından uygulamalarda reaksiyonu kontrol etmek oldukça güçtür.

Ortama inhibitör katılması düşünülebilir. Fakat bu da reaksiyon ürünleri için yeni bir

kirlilik unsuru olacaktır. Ürünlerin arıtılması ek bir maliyet doğuracaktır. Ayrıca

enzimi reaksiyon ortamında aktivitesini yitirmeden çıkarmak olanaksız olduğundan

enzimin tekrar kullanılması söz konusu değildir. Bu yüzden enzimler spesifik fakat

pahalı katalizörlerdir.

Tüm bu problemleri ortadan kaldırmak için enzimler immobilize edilmektedir.

İmmobilize enzimlerin serbest enzime üstünlükleri;

- Reaksiyon sonunda ortamdan kolayca uzaklaştırılabilir.

- Çevre koşullarına karşı daha dayanıklıdır.

- Birçok kez ve uzun süre kullanılabilir.

- Sürekli işlemlere uygulanabilir.

- Doğal enzime kıyasla daha kararlıdır.

- Birbirini izleyen çok adımlı reaksiyonlar için uygundur.

- Enzimin kendini parçalama olasılığı azalır.

- Mekanistik çarpışmalar için uygundur.

- Bazı durumlarda serbest enzimden daha fazla aktivite gösterebilir.

2.2.5.1. Taşıyıcıya Bağlama

En eski immobilizasyon yöntemidir. Taşıyıcıya bağlama kimyasal kovalent, iyonik

veya adsorptif biçimde yapılabilir. Enzime göre taşıyıcı seçimi çok önemlidir. Taşıyıcı

seçiminde partikül büyüklüğü, toplam yüzey, hidrofilik grupların hidrofobik gruplara

oranı, taşıyıcının kimyasal bileşimi önemlidir. Bu tip enzim immobilizosyonunda

kullanılan taşıyıcılar doğal veya sentetik olabilir. En çok kullanılan sentetik taşıyıcılar

14

polistren, poliakrilamit ve polimetakrilattır. Doğal taşıyıcılar ise selüloz, nişasta, aktif

karbon ve camdır.

Taşıcıya bağlama yöntemi ile enzim immobilizasyonu üç alt grupta incelenir.

a. Kovalent Bağlama

Enzimlerin reaktif taşıyıcılara kovalent bağlanması sulu ortamda gerçekleştirilir.

Enzimin taşıyıcıya kovalent bağlanmasında önemli nokta, bağlanmanın enzim

aktivitesi için zorunlu gruplar üzerinden olmaması ve bağlama sırasında sterik

engellemeler nedeniyle bu grupların rahatsız edilmemesidir. Enzim

immobilizasyonunda kullanılacak taşıyıcılar reaktif değillerse yardımcı bir reaktif ile

aktive edilmeleri gerekir. İmmobilizasyon çok yumuşak koşullarda gerçekleştiril-

melidir. Taşıyıcı suda çözünmemeli, büyük ölçüde hidrofobik karakterli olmalı, suda

ıslanabilmeli ayrıca mekanik kararlı olmalıdır.

b.İyonik Bağlama

Bu yöntem iyon değiştirme yeteneğine sahip suda çözünmeyen taşıyıcılara enzimin

iyonik bağlanması temeline dayanır. İyonik bağlama çok yumuşak koşullarda

gerçekleştirildiğinden enzimin konformasyonunda ve aktif merkezinde değişikliğe

neden olmaz. Ancak enzim ile taşıyıcı arasındaki kovalent bağ kadar güçlü

olmadığından enzim kaçışı söz konusudur.

c. Adsorpsiyon

Enzim immobilizasyonunda kullanılan en basit yöntemdir. Adsorbsiyonun asıl amacı

önceleri enzimi saflaştırmaktı. Yöntem, yüzey aktif suda çözünmeyen bir adsorbanın

enzim çözeltisi ile karıştırılması ve enzimin aşırısının iyice yıkanarak uzaklaştırılması

temeline dayanır. Enzimin taşıyıcıya bağlanmasında etkin olan Wander walls

kuvvetleridir. İyi bir adsorpsiyon sağlayabilmek için genellikle adsorbanın bir ön

15

işlemden geçirilmesi gerekir. En çok kullanılan adsorbanlar aktif karbon, gözenekli

cam, CaCO3, kül, kolladyum, silikajel, nişasta ve kalsiyum fosfattır.

2.2.5.2. Çapraz Bağlama

Küçük moleküllü bi veya multi fonksiyonel reaktifler enzim molekülleri arasında

bağlar yaparak sonuçta suda çözünmeyen komplekslerin oluşmasını sağlarlar. Çapraz

bağlama derecesi protein ve reaktif konsantrasyonuna, pH ve immobilize edilecek

enzime çok bağımlıdır. Bu yöntem ile enzim immabilizazyonu dört farklı şekilde

gerçekleştirilir.

- Enzimin yalnız bifonksiyonel reaktif ile reaksiyonu.

- Enzimin ikinci bir protein varlığında bifonksiyonel reaktif ile reaksiyonu

- Enzimin suda çözünen bir taşıyıcıda adsorbsiyonundan sonra bifonksiyonel reaktif ile

reaksiyonu

-Enzimin bifonksiyonel reaktif tarafından aktive edilmiş polimer taşıyıcıyla reaksiyonu

En çok kullanılan çapraz bağlama reaktifleri, glutaraldehit, izosiyanat türevleri,

bisdiazobenzidin, N-N-polimetilen bisiyodasedanit , 2-5- diflora -2,4-dinitro benzen ve

N,N-etilenbismaleimittir. Çapraz bağlı enzimler mekanik bakımdan çok kararsızdır.

Yalnız immunolojik testlerde kullanılmışlardır. Ayrıca çapraz bağlamada önemli

derecede aktivite kaybı söz konusudur.

2.2.5.3. Tutuklama

Prensip olarak tutuklama enzim molekülünü belirli bir mekanda durmaya

zorlamaktadır. Enzim bulunduğu çevreden dışarıya çıkamaz. Bu işlem polimer matriks

içindeki kafeslerde gerçekleştirilebildiği gibi yarı geçirgen membranlar içinde

mikrokapsülleme ile de gerçekleştirilebilir.

16

Bu yöntemi diğer immobilizasyon yöntemlerinden ayıran en önemli özellik enzim

molekülünün fiziksel veya kimyasal olarak herhangi bir taşıyıcıya bağlanmamış

olmasıdır.

a. Polimer Kafeste Tutuklama

Polimerizasyon ve çapraz bağlamanın oluştuğu ortamda enzim bulunduğu taktirde

enzim çapraz bağlama sonucu oluşan odacıklarda (kafes) tutuklanmaktadır. Bu amaçla

en çok kullanılan polimer N,N’-metilenbisakrilamid ile çapraz bağlanmış

poliakrilamiddir. Yöntem, yüksek derecede çapraz bağlı bir polimerin enzim çözeltisi

içinde oluşturulması temeline dayanır. Polimerleşme sonucu enzim molekülleri çapraz

bağ ağları arasında tutuklanmakta ve böylece ana çözeltiye geçmeleri

engellenmektedir.

Yöntemin yararları; çok kolay uygulanması, gerçek bir fiziksel yöntem oluşu ve çok az

miktar enzimle gerçekleştirilmesi, nötral, suda çözünmeyen taşıyıcılarla da

immobilizasyonunun gerçekleştirilebilmesi, yüklü taşıyıcıya gerek duyulmamasıdır.

Yöntemin sakıncaları ise, immobilizasyon işlemi sırasında aktivitasyonun deney

koşullarına çok sıkı bağlı olması ve immobilize enzimin ancak küçük moleküllü

substratlara karşı iyi bir aktivite göstermesidir.

b. Mikrokapsülleme

Bu yöntem enzim moleküllerinin yarı geçirgen bir membran içinde tutuklanmasından

ibarettir. Mikrokapsüllerin büyüklüğü 50-100 µm arasında değişmektedir. Enzimler

daha çok kimyasal mikrokapsülleme ile immobilize edilmektedirler. Bu yöntem ile

enzim immobilizasyonu, sürekli ve sürekli olmayan yarı geçirgen membran

mikrokapsülle tutuklamak üzere iki grupta incelenebilir. Sürekli mikrokapsüllerde

çerçeve membran katı, süreksiz mikrokapsüllerde ise sıvı bir tabakadır.

İmmobilizasyonda kullanılan çerçeve maddesinin yarı geçirgen olması zorunludur.

17

3. BİYOSENSÖRLER

Sensör ölçüm yapılacak türe duyarlı kısım anlamına gelir. Bir sensör fiziksel boyuttaki

değişmeleri elektriksel boyuttaki değişimler olarak ölçer. Bu değişimler akım, gerilim,

sıcaklık vs olabilir.

Gelişmekte olan eşsiz ilgi ve analitik aletlerin keşfi ve belirli kimyasal türlerin

izlenmesi biyosensörlere dayandırılmaktadır. Biyosensörler doğadaki canlıların

izlenip, gözlenmesinden sonra ortaya çıkmıştır. Örneğin yılan balıklarının su içine

atılan çok az miktarda zehri bile algılayabilmeleri gibi.

Biyosensörler, diğer adıyla biyospesifik elektrotlar, biyoajanları immobilize halde

kullanan, çeşitli gaz, iyon ve biyolojik maddelerin teşhisi, kantitatif tayini ve orjinal

sistemlerde izlenmesi amacıyla geliştirilmiş problardır. Biyosensörler klinik tıpta teşhis

ve tayin amacıyla, fermantasyon analizi ve kontrolünde biyoloji, kimya, gıda

endüstrisi, ziraat ve veterinerlikteki çeşitli analizlerde, endüstriyel gaz ve sıvıların

analizinde, çevre kirlenmesinin izlenmesinde, patlayıcılar ve diğer askeri alanlarda

kullanılmaktadır (Campanella ve Tomasetti, 1989). En basit tanımıyla biyolojik

katalizör taşıyan sensörler olarak tanımlanır. Biyosensörler canlılardaki çeşitli

maddelerin algılanmasını mümkün kılan biyolojik maddelerin birleştirilmesiyle ortaya

çıkmıştır. Bu sistemler bir yandan biyolojik sistemin yüksek seçimliliğini diğer yandan

sensörlerin tayin duyarlılığını birleştirmiş ve çok geniş uygulama alanı bulmuştur.

1962 yılında Clark ve Lyons’un ilk enzim elektrot fikrini ortaya atmasıyla başlayan,

sonraki yıllarda gelişen biyosensör teknolojisinin ürünleri günümüzde çok değişik

alanlarda çok sayıda maddenin tayin ve izlenmesinde yaygın olarak kullanılır hale

gelmiştir. Aşağıdaki çizelgede biyosensörlerle tayin edilebilen maddeler verilmektedir.

18

Çizelge 3.1. Biyosensörlerle tayin edilebilen maddeler (Pişkin, 1986). Analizi Yapılan Maddeler Örnekler

Amino Asitler Alanin, arginin, asporjin, aspartik asit,

sistin, glutamin, glutamik asit, glutation

histidin, levsin, lisin, metionin, fenil

alenin, sarkosin, serin, tayrosin, teitofan,

valin

Gazlar NH3, H2, CH4, SO2, NO

Kofaktörler AMPT, ATP, NAD(P)H

Amidler ve aminler Aminopirin, anilin, aromatik aminler,

asetil kolin, kreatin, kreatinin, guanidin,

guanosin, penisilin, spermin, ürik asit, üre,

zantin

Karboksilik asitler Asetik asit, formik asit, glukonik asit,

izositrik asit, askorbik asit, laktik asit,

malik asit, okzalik asit, pruvik asit,

süksinik asit

Kompleks maddeler Antibiotikler, mutojenler, vitaminler

İnorganik iyonlar F-, NO2-, NO3

-, PO3-2, SO3

-2, SO4-2, Hg+2,

Zn+2

Bir biyosensör algılayıcı ile bütünleşmiş veya tamamen birleştirilmiş hassas biyolojik

element içeren bir alettir. Biyosensörler esas olarak üç temel bileşenden ibarettir.

Birinci kısım biyolojik olarak duyarlı materyal yani biyokatalizör tabakası. İkinci

kısım kovalent bağlı biyolojik bileşenlerle temas edecek şekilde olan algılayıcı

(transducer). Bu kısım kovalent bağlı aktif biyolojik bileşenlerin absorbsiyonuna ve

eliminasyonuna izin veren yarı geçirgen bir zar içerir.

Biyosensörün üçüncü kısmı ise doğrudan biyokatalizör tabakasına bağlı elektronik

aygıttır. Bu kısımda biyokatalizör ile tayin edilecek maddenin teması sonucu ortaya

çıkan biyokimyasal sinyal uygun bir mekanizmayla kantitatif olarak elektrik sinyaline

dönüştürülür. Aşağıda bir biyosensörün şematik gösterilimi verilmiştir.

19

Şekil 3.1. Bir biyosensörün genel şematik gösterimi (Dinçkaya, 1998).

3.1. Biyosensörlerde Kullanılan Biyokatalizörler

Biyokatalizör, enzim ve enzim sistemleri, dokular (hayvansal, bitkisel), bakteriler,

mayalar, antikorlar, antijenler, organeller, biyolojik membran bileşenleri olabilir.

Biyokatalizör seçimliliği ve duyarlılığı probun özellikleri yönünden en önemli

noktalardan birisidir. Biyokatalizör kullanan sensörlerin diğerlerine göre önemli

avantajları seçimli ve duyarlı olmalarıdır. Biyomolekülleri tanımayı kapsayan

biyosensör mükemmel düzeyde seçiciliğe sahiptir. Fakat sıcaklık, pH, iyonik kuvvet

gibi aşırı uç olan durumlarda sorun yaşanabilir.

3.1.1. Enzimler ve Enzim Sistemleri

Biyokatalizörden en yaygın olarak bilineni enzimlerdir. Enzimler canlı sistemlerdeki

önemli biyolojik reaksiyonları katalizleyen protein yapısındaki makro moleküllerdir.

Ölçüm Cihazı

İletici

Biyoaktif Tabaka

Analit

20

Enzimler katalizledikleri reaksiyonlar için çok duyarlıdırlar. 10-8 M ve daha düşük

konsantrasyonlarda bile katalizör görevi yapabilirler.

3.1.2. Bakteri ve Hücreler

Saf enzim yerine hücrelerin çeşitli inert destek maddeleri üzerine toplanarak

saklanabildikleri ortaya çıktıktan sonra çeşitli hücreler biyosensörlerde kullanılmaya

başlanmıştır.

Bu uygulamanın avantajları;

1) Saf halde kararsız olan enzimlerin hücrede kararlı olmaları ve hücre ile hazırlanan

biyosensörlerin daha uzun ömürlü olması.

2) Enzimatik reaksiyonlar için gerekli olan bütün kofaktör ve kimyasal maddeler

hücrede bulunduğundan, çoğu pahalı olan ve zor bulunan bu maddelerin ayrıca

kullanılmalarına gerek yoktur.

3) Canlı hücrelerde hazırlanan biyosensörlerin saf enzimlerle hazırlananlara göre daha

ucuza mal olması

Dezavantajları;

1) Sterilizasyon gerektirmeleri

2) Kullanılan hücrede istenilen enzimin dışında diğer enzimlerinde bulunması

nedeniyle seçimlilik azalması

3) Mekanik çalışma güçlükleri

3.1.3. Dokular

Biyokatalizör olarak doku kesitleri de kullanılabilir. Dokularda mekanik dayanıklılık

daha iyi olduğundan bu bir avantaj olarak görülebilir. Gelişmiş organizmalarda

21

metabolizma iyi bilindiğinden amaca uygun seçim şansı vardır. Çeşitli gazların

hayvansal organizmadaki difüzyon süreleri sabittir. Bu tip biyokatalizörler reaksiyonu

belirli bir verim ve stokiyometri ile yürütürler.

Enzimler, antikorlar, hücreler vb gibi çok fazla biyolojik moleküller çözelti fazında

çok kısa bir ömre sahiptirler. Bu yüzden uygun bir matrikse sahip olmak zorundadırlar.

Biyolojik komponentlerin çevresel durumlara bağlı olarak düşebilir.

3.2. Algılayıcı (Transducer)

Algılayıcı biyokimyasal sinyali elektonik sinyale çevirir. Ölçülen elektriksel sinyal

analit derişimiyle orantılıdır. Elektronik bir alet olan algılayıcı tarafından sinyal

ayrıntılı bir şekilde okunur, görüntülenir ve saklanır. İlgili türlerin biyokimyasal

etkileşiminin doğasına göre uygun bir algılayıcı sistem seçilmelidir. Fiziksel

algılayıcılar elektrokimyasal, spektroskopik, termal, piezoelektronik ve yüzey akustik

dalga teknolojisi olarak çeşitlendirilebilir.

Algılayıcıları;

1) Elektrokimyasal algılayıcılar

- Amperometrik esaslı

- Potansiyometrik esaslı

- Konduktometrik esaslı

2) Optik algılayıcılar

- Absorbans ölçümünü temel alanlar

- Floresans veya fosforesans ölçümünü temel alanlar

- Kırılma indisini temel alanlar

3) Kütle değişimini temel alan algılayıcılar

4) Isı değişimini temel alan algılayıcılar

22

- Termistörler

Ölçülen madde türü, yayınlanan makale sayısı ve ticari olarak üretilen tür ve sayılar

dikkate alındığında, elektrokimyasal ölçüm bazlı sistemlerin diğer sistemlere göre çok

daha fazla ilgi gördüğü söylenebilir. Elektrokimyasal algılayıcılardan en yaygın olarak

kullanılanı potansiyometrik ve amperometrik esaslı olanlardır.

Aşağıda biyosensörlerde kullanılan çeşitli algılayıcılar önemlerine göre belirli bir sıra

içinde verilmiştir.

Çizelge 3.2. Biyosensör algılayıcıları ALGILAYICI ÖLÇÜM ESASI

İyon seçimli elektrot Potansiyometrik

Gaz duyarlı elektrotlar Potansiyometrik

Alan etkili transistörler Potansiyometrik

Polarografik Amperometrik

Optoelektronik cihazlar Optik

Termistörler Kalorimetrik

Kondüktometri İletkenlik

Piezoelektrik Kütle değişimi

3.3. Biyosensörlerin Çalışma Mekanizması

Biyosensörlerin çalışması sırasında ilk önce substratın çözelti içerisinden biyosensör

yüzeyine taşınması gerçekleşir. Subsratın taşınması difüzyon, karıştırma vb. gibi çeşitli

şekillerde olabilir. Subsrat biyokatalizörün aktif bölgesine difüzlenir. Biyokatalizör

polimerik gözenekli membrana (selülozik diyaliz membranı gibi) emdirilmiş veya

algılayıcı ile polimerik membran (selofan, selüloz asetat/nitrat, polivinil alkol,

poliüretan vb) arasına sandviç edilmiş veya polimerik bir jel içinde hapsedilmiş

olabilir. Bu hapsetme işlemi için poliakrilamid, jelatin, kalojen, agaroz vb gibi doğal

veya sentetik polimerler kullanılabilir. Biyokatalizör ve substrat arasında reaksiyon

meydana gelir. Bu etkileşme sonucu gaz molekülleri (O2, CO2, NH3, vb) salınabilir

23

veya kullanılabilir, seçimli iyonlar oluşabilir. (H+, NH4+, diğer tek değerlikli anyon ve

katyonlar), ısı ortaya çıkar veya kaybolur, optik yoğunluk değişebilir, elektron

salınabilir veya kullanılabilir. Biyokatalizör ve substrat reaksiyonu sonucu oluşan ürün

algılayıcı yüzeyine taşınır. Algılayıcı yüzeyinde yukarıda bahsedilen değişimler

algılanıp elektriksel devrelerle ölçülebilecek bir boyuta dönüştürülür. Ölçülen

elektriksel sinyal analit derişimiyle orantılıdır.

3.4. Biyosensör Çeşitleri

3.4.1. Elektrokimyasal Biyosensörler

3.4.1.1. Amperometrik Biyosensörler

Amperometrik biyosensörlerde analizi yapılacak reaktantın yükseltgenme veya

indirgenmesi sonucu oluşan ve genellikle sabit potansiyeldeki akım ölçülür.

Amperometrik biyosensörler ilk defa ABD’de Clark ve Lyons tarafından

geliştirilmiştir. Amperometrik biyosensör sabit voltaj altında çalışan elektrokimyasal

hücreden ibarettir. Bu biyosensör sisteminde oluşan akım miktarı moleküllerin elektrot

yüzeyine difüzyon hızına dolayısıyla çözelti içindeki konsantrasyonuna bağlıdır.

Amperometrik biyosensörlerin işleyişine etki eden en önemli faktör, moleküllerin

indirgenme veya yükseltgenmesi sırasındaki, çoğunlukla iletken polimer veya aracı

içeren elektrot yüzeyi arasındaki elektron transferidir.

Son zamanlarda elektrokimyasal ölçümler üzerinde çok fazla çalışma, amperometrik

biyosensörler içi iletken polimer tabakalarının kullanımını içermektedir. İletken

polimerlerin elektron indirgenmesindeki rolünün tam anlamıyla açıklanmamış ve

anlaşılmamış olmasına rağmen, enzim immobilizasyonu için kullanılan çeşitli

polimerlerin, hassas türler için geliştirilen biyosensörlerin cevabına önemli etkileri

vardır.

3.4.1.2. Potansiyometrik Biyosensörler

24

Potansiyometrik ölçümler, yarı geçirgen membranla ayrılmış iki farklı elektrot

arasındaki önemli bir akım akışının olmadığı potansiyel ölçümünü içerir.

Potansiyometrik biyosensörler, en eski ve yaygın olarak kullanılan biyosensörlerdir.

GOD’un immobilizasyonu ile polipirol (PPY) elektrot oluşumu için amperometrik

yöntemin üstünde belirli avantajlara sahip olduğu kanıtlanmıştır (Trajanowicz ve

Krawczyk, 1995). İletken polimerli potansiyometrik biyosensörler hassas pH’a duyarlı

polimerler kullanılarak da meydana getirilebilir. NH3 polimer polipirol (PPY)

arayüzeyinde enzimlerin biyolojik görevini hafifletmek ve canlı hücrelerin elektrot

yüzeyinde elektrot potansiyelinin ayarlanması gibi görevleri yerine getirir. Çogunlukla

yaygın olan potansiyometrik aletler pH elektrotlarıdır. Fakat F-, I- CN-, Na+, K+, NH4+

veya NH3, CO2 gibi gazları içeren seçici elektrotlar da kullanılabilir. Referans elektrot

ve çalışma elektrodu arasındaki potansiyel değişimi, Nerst eşitliğinde tarif edilen gaz

fügasitesi veya iyon aktivitesiyle logaritmik olarak değişir.

Kandaki laktat ölçümü gibi doğal numunelerin analizleri için enzimlerin kullanıl-

masına izin veren, iletken polimerlein kullanıldığı biyosensörler de geliştirilmiştir.

Polimer tabakasında iyi bir tayin oluşturma avantajı elde edilebilir. Ayrıca polimer

tabakası anyonu ile potansiyometrik üre biyosensörünün dizaynı için kullanılmıştır. Bu

çalışmada sodyum ve potasyumun girişim yaptığı belirlenmiştir (Pandey ve Mishra,

1988).

Kreatin elektrot, kreatinaz, keratinaz ve sarkosin oksidazın polipirol (PPY) matrikste

immobilizasyonu ile yapılmaktadır (Yamato vd., 1995). Elektron indirgemesinin

yapıldığı polimer tabakasındaki enzim immobilizasyonunu ilgilendiren güçlükler veya

mekanizmadaki engeller ve biyosensör üzerindeki dinamik etkiler kapsamlı bir şekilde

tartışılmış ve günümüzde halen aynı enzimlerin immobilizasyonunu anlatmak için

farklı polimer matrikslerin karşılaştırılmasında kesin sonuçlar alınamamıştır.

3.4.1.3. Kondüktometrik Biyosensörler

Kondüktometrik biyosensörlerde iki metal elektrot arasındaki biyolojik komponentin

degişken iletkenliği ölçülür. Üreaz gibi birçok enzim reaksiyonları ve birçok biyolojik

25

membran reseptörleri, mikro elektrotların kullanıldığı iyon kondüktometrik veya

impedimetrik aletlerle izlenebilir. Çünkü ölçümdeki hassaslık örnek çözeltisindeki

iletkenlikle paralel olarak değişir. Contractor (1994) tarafından hazırlanan

biyosensörler, glukoz, lipaz ve hemoglobin/pepsin hakkında fikir edinmek için,

polimer matriksin çevresindeki değişken pH veya redoks potansiyeli gibi değişken

elektronik iletkenliğin izlenmesine olanak sağlar (Contractor, 1994).

Ramanathan (1995) glukoz biyosensördeki gibi polianilin filmlerinin ölçümü üzerinde

çalışmalar yapmıştır. Aynı zamanda polipirol (PPY) glukoz biyosensörünün dielektrik

spektroskopik ölçümleri üzerinde araştırmalar yapmıştır. İletkenlik polimerleri temel

alan kondüktometrik biyosensörler penisilin ve aynı zamanda glukoz, üre, lipitler ve

hemoglobin için geliştirilmiştir. Mikroelektronik aletler, altın film elektrotlar

üzerindeki polipirol (PPY) tabakanın içinde immobilize edilen üreazın kullanıldığı

kapasitans, iletkenlik ölçümleri milimolar oranında hassaslıkla hazırlanmaktadır. Akış

enjeksiyon sistemi polipirol filmler üzerinde penisilaz immobilizasyonu ve ölçüm

sırasında değişen pH yüzünden meydana gelen değişken iletkenlikle gelişmiştir

(Ramanathan, 1995).

3.4.2. Optik Biyosensörler

Optik biyosensörler iletici sistem olarak optik lifler üzerine uygun bir yöntemle uygun

bir biyomolekülün immobilize edilmesiyle hazırlanan ölçüm aygıtlarıdır. Etkileşim

sonucu meydana gelen kimyasal yada fizikokimyasal bir değişimin ölçümünü esas

alırlar. Sinyal, ışık yansıması, saçılımı yada yayımı sonucu meydana gelir. Örneğin

optik lifin üzerine enzim immobilizasyonu ile hazırlanan optik esaslı enzim sensörleri

temelde absorbsiyon, fluoresans, biyolüminesans gibi temel ilkeler çerçevesinde işlev

görürler. Bu tip biyosensörlerde ışık dalgaları fiber optik kablo yardımıyla uygun bir

dedektöre iletilir. Bu biyosensörler O2, pH, CO2 teşhisi için kullanılmaktadır. Gerard

(1999) polianilin elektrot üzerinde pürüvat konsantrasyonunu optik olarak ölçmüştür.

Bu elektrotlar 15 günlük bir dayanıklılık süresine ve 90 saniye cevap süresine sahiptir.

Singhal (2003) Langmuir–Blodgett (LB) tekniğiyle poliheksiltiyofen üzerinde glukoz

26

oksidaz immobilize etmiş ve UV-visible spektroskopi kullanarak optik glukoz sensörü

yapmıştır.

3.4.3. Kalorimetrik Biyosensörler

Kalorimetri esaslı enzim sensörleri, termal enzim sensörleri, enzim termistörleri yada

entalpimetrik enzim sensörleri gibi değişik isimlerle tanımlanırlar. Temel bir prensiple

bu tip biyosensörler tüm biyokimyasal reaksiyonlardaki entalpi değişimini içerirler.

Genel olarak enzimatik reaksiyonların ekzotermik doğasından yararlanılır. Enzimatik

reaksiyon sonucu meydana gelen sıcaklık değişimi ile substrat konsantrasyonu

arasındaki doğrusal ilişkiden sonuca ulaşılır. Masbach ve Danielson enzim

termistörleri geliştirmişlerdir. Termistörle, enzim reaksiyonundaki sıcaklık değişimi

ölçülmüştür. Substratlar, enzimler ve antijenler hakkında termistör biyosensörler

kullanılarak tahmin yapılabilir (Mosbach ve Danielson, 1981).

3.4.4. Piezoelektrik Biyosensörler

Piezoelektrik sensörler karakteristik rezonans frekansındaki farklanmayı belirleyerek

bir piezoelektrik kristal yüzeyinde toplanan örneğin kütlesinin ölçülmesi esasına göre

çalışan gravimetrik aygıtlardır. Bu tip biyosensörler elektiriksel dipole sahip doğal

anizatropile kristellerden meydana gelir. Bir piezoelektrik sensörün üzerinde enzim

immobilizasyonuyla gerçekleştirilen piezoelektrik enzim sensörlerinde, enzim

moleküllerine substratların bağlanmasından dolayı meydana gelen kütle

değişimlerinin, piezoelektrik kuartz diskin vibrasyonunda sebep oldukları

farklanmadan yararlanılarak madde miktarına ulaşılır. Bu tip biyosensörler amonyum,

hidrojen, metan, CO, nitröz oksit ve diğer organo fosfor bileşikleri ölçümünde

kullanılmaktadır .

3.5. Biyosensör Performans Kriterleri

Biyosensör cevaplarının karekterize edilmesi önemlidir. Verilen matrikste biyosensör

optimizasyonunu kolaylaştırmak ve doğal olan hız basamaklarını göstermekteki

27

parametreler bunu daha da önemli kılmıştır. Bu bölümde temel performans kriterleri

kısaca listenecektir. Performans kriterleri biyosensörlere özgü değildir. Fakat yaygın

olarak kimyasal sensör tiplerinin çoğunda veya analitik metotlarda bahsedilir.

3.5.1. Kalibrasyon Karekteristikleri

Elektrokimyasal sensörler her zaman üst limitte lineer konsantrasyon aralıklara

sahiptirler. Bu limit biyolojik reseptör veya biyokimyasal reseptörlerdeki

biyokompleksler veya biyokatalizörlerle doğrudan ilişkilidir.

3.5.2. Seçicilik ve Güvenirlik

Biyosensör seçiciliği Mc Naught ve Willimsan tarafından, potansiyometrik sensörler

veya amperometrik sensörler için ölçülmüş ve denenmiştir. Seçicilik algılayıcı veya

biyolojik reseptör seçimine bağlı olarak değişir. Enzimlerin çoğu seçicidir. Buna karşın

alkol, şeker grupları veya aminoasit oksidaz, peroksidaz, laktaz, tirosinaz gibi bazı

sınıf enzimler gelişmekte olan biyosensör sınıflaması için kullanılabilir. Bakteri ve

doku kültürleri genellikle seçici değillerdir. Biyosensörlerin güvenirliği verilen

numune için seçicilik ve tekrarlanabilirliğinin her ikisine birden bağlı olarak değişir.

Diğer açıdan analiz güvenirliği verilen numune için, biyosensör cevapları doğrudan

analit konsantrasyonuna bağlı olmalıdır.

3.5.3. Tekrarlanabilirlik, Kararlılık ve Ömür

Biyosensör cevaplarının tekrarlanabilir olması büyük önem taşır. Biyosensörlerdeki

biyoaktif bileşen kararlı olmalıdır. Biyoaktif bileşenin kararlı olması çok sayıda analize

imkan vereceği için biyosensörün ekonomik olmasını sağlar.

3.5.4. Kararlı Hal ve Geçiş Cevap Süreleri

28

Kararlı hal cevap süresi ölçüm hücresine her bir analit eklenmesi için kolaylıkla

belirlenebilir. Kararlı hal cevabı çıkış sinyali %90’nın oluşması için gerekli süre olarak

tanımlanır. Geçiş cevap zamanı analit eklenmesini izleyen çıkış sinyalinin maksimum

değerinin birinci türevi {dR/dt}max için gerekli süreye karşılık gelir. Her iki cevap

süresi analit, substrat ve ürünün farklı tabaka yada membranlardan aktarım hızlarına

bağlıdır. Bu yüzden film kalınlığı ve geçirgenliği esas parametrelerdir. Her iki cevap

süresi ayrıca kullanılan biyomoleküllerin aktivitesine bağlıdır. Bu aktivitenin yüksek

olması cevap süresini kısaltır. Son olarak cevap süreleri ölçüm hücresine numunenin

eklenme ve karıştırılma koşullarına bağlıdır.

3.6. Biyosensörlerde Kullanılan Metal-Nanotanecikleri

Metal-nanotanecikler farklı reaksiyonlar için katalizör gibi hareket ederler. Bazı metal-

nanotanecikler (örneğin platin) bazı moleküllerin redoks özelliklerini katalizler bu etki

elektroanalitik teknikler kullanılarak izlenir. Diğer taraftan metal-nanotanecikler

elektronik geçişi kolaylaştırır ve ayrıca ligandlar ve biyomoleküller modifiye edilebilir.

Sonuçta elektroanalitik teknikler, metal-nanoparçacıkların elektrokimyasal özellik-

lerinin tanımlanmasında faydalı bir araç olan elektrotlara sahiptir.

Elektrotların redoks aktif bileşenlerin düzenli bir sırayla fonksiyonalize edilmesi

sensörik aktivitelerin bir araya toplanmasını sağlamıştır. Bu yolla elektrot yüzeylerinin

redoks aktif metal nanoparçacıklarla modifiye edilmesi pekçok elektrokimyasal

sensörün hazırlanmasına olanak sağlamıştır. Bunlar iki ana grupta düşünülebilir.

Birincisi enzimatik olmayan sensörlerdir ki bunlarda metal nanoparçacıklar ya da

fonksiyonalize edilmiş nanoparçacıklar duyucu faz olarak rol oynarlar. İkincisi

enzimatik sensörlerdir, bunlarda enzim modifiye edilmiş nanoparçacıklar duyucu faz

olarak rol oynarlar, aynı zamanda nanoparçacıklar elektron transfer aracısı olarak

görev yapar.

Metal-nanoparçacıkların diğer önemli bir uygulaması enzimatik sensörlerin yapımıdır

ki bunların çoğunda altın nanoparçacıkları kullanılmıştır. Kolloidal altın ana

29

parçacıklar olarak adlandırılan çok küçük oktahedral birimlerden oluşmuş metalik

kolloid parçacıklarıdır. Altın parçacıklarının büyüklüğü esas olarak kolloidal altının

oluşturulma yoluna bağlıdır. Altın nanoparçacıkları net negatif yük taşırlar. Bir protein

ve diğer biyolojik molekül kolloidal altına eklendiğinde bu negatif yük parçacıkların

yüzeyine, bu moleküllerin fiziksel adsorpsiyonuyla nötralize edilir. Elektron

mikroskopisi ile yapılan işlemler kolloidal altının yaygın bir şekilde kullanılmasını

açıklamakta kullanılmıştır ki pek çok makromolekül kolloidal altın üzerine

adsorplandığında biyolojik aktivitelerini kaybetmemişlerdir. Bu gözlemler altının

iletkenliğinin de dikkate alınmasıyla araştırma gruplarını kolloidal altın üzerine

adsorplanmış enzimleri temel alan biyosensör elektrotlarını hazırlamaya sevketmiştir

(Crumbliss vd., 1992).

3.6.1. Metal Nanotaneciklerin Kullanıldığı Bazı Uygulamalar

Stonehuerner ve çalışma grubu camsı karbon elektrotların enzim altın kolloidler ile

modifiye edilmesi ile H2O2, hipoksantin, ksantin ve glukoz için enzimatik sensörler

hazırlamışlardır. Elektrot yüzeyinin modifiye edilmesi elektrobiriktirme ya da enzim

altın kolloidlerinin buharlaştırılması yoluyla gerçekleştirilmiştir. Bu enzimatik

sensörlerin en önemli özelliği elektron transfer aracısı gerektirmemesidir. Kolloidal

altın parçacıkları enzimlerin prostetik grupları ile elektrot yüzeyi arasında elektron

aktarımını sağlar ve böylece elektron aktarım işlemleri kolaylaşır. Bu sensörlerin

kararlılığı ve duyarlılığı çok iyidir (Stonehuerner vd., 1996).

Chen ve arkadaşları yaptıkları çalışmada GOD üzerindeki farklı boyuttaki altın

nanoparçacıklarının davranışlarını ve GOD‘ın aktivitesine etkisini incelemişlerdir.

GOD‘ın aktivitesine altın nanoparçacıklarının etkisi ilginç ve tatmin edici bir şekilde

açıklanmıştır. Yapılan bu çalışmada 2 nm ve 6 nm parçacıkları içeren matriks

kullanılmıştır. 2 nm büyüklüğündeki parçacık GOD‘ın aktivitesinin oldukça fazla

artmasını sağlamıştır. Çalışmada quartz kristal mikrobalans (QCM) yöntemi

kullanılmıştır (Chen vd., 1998).

30

Celej ve Rivas glukoz oksidaz içeren altın parçacıkları dağıtılmış karbon pasta

elektrotu kullanarak bir amperometrik glukoz biyosensörü geliştirmişlerdir. Bu

durumda altın parçacıkları enzimatik reaksiyon sonucunda üretilen H2O2’nin

elektroyükseltgenmesini ve elektroindirgenmesini katalizlemektedir. Bu sensör glukoz

tayini için akış enjeksiyon sisteminde kullanılmıştır. Analitik sinyaller için iyi bir

tekrarlanabilirlik ve kalibrasyon grafiği elde edilmiştir (Celej ve Rivas, 1998).

Hu ve çalışma grubu yaptıkları çalışmada altın kolloidlerinin biriktirilmesi için

sisteamin monotabakalarının kemisorplandığı altın elektrodu kullanmışlardır. 2, 6, 16,

42, 51 nm partikül büyüklüğündeki farklı altın kolloidleri altın elektrot üzerindeki

sisteamin monotabakaları üzerinde toplanmıştır. Altın kolloid yüzeyinde adsorblanmış

Fe(CN)6-4 bir çift simetrik adsorbsiyon piki vermiştir. Altın kolloidlerinin boyutları

düştükçe adsorbsiyon dalgasının ∆Ep değeri artmaktadır. Yalın altın elektrot, sisteamin

modifiye elektrot ve altın kolloidli modifiye elektrodun 500 mV’ta voltametri ile

ölçülen spesifik kapasitansı sırasıyla 57.8, 32 ve 81.1 µF/cm2 olarak bulunmuştur.

Kolloidal Au modifiye edilmiş altın elektrotların elektrokatalitik analizde

kullanılabileceği umulmaktadır (Hu vd., 1999).

Chen ve çalışma grubu altın kolloidlerinin biriktirilmesi için ara yüzey olarak

kullanılan altın elektrot üzerinde kemisorplanmış sisteamin monotabakalarını

kullanmışlardır. Bu modifiye edilmiş elektrotlar ferrosiyanür için simetrik adsorpsiyon

pik çifti vermişlerdir. Adsorpsiyon dalgasının pik-pik ayırımı altın kolloid

parçacıklarının büyüklüğünün azalmasıyla artmıştır. Bu strateji H2O2 için duyarlı bir

amperometrik sensörün yapımında kullanılmıştır. Horseradish peroksidaz (HRP)

nanometre büyüklüğündeki altın kolloidleri üzerine tutuklanmıştır ki bunlar sisteamin

monotabakalarının tiyol kuyruk grupları tarafından desteklenmiştir. Glutaraldehit,

sisteaminin iki amino grubu arasında kovalent bağlanma için bifonksiyonel reaktif

olarak kullanılmıştır ve elektrot yüzeyinde altın kolloidleri ile birleşmesi için tiyol

kuyruk grupları içeren bir ara yüzey kullanılmıştır. Böylece elektrot yüzeyi ve HRP

molekülleri arasında uzun moleküler köprüler oluşturulmuştur. Ancak kolloidal altın

nanoparçacıkları HRP’nin prostetik grupları ile elektrot yüzeyi arasında elektron iletme

yolu olarak görev yapmıştır (Chen vd., 1999).

31

González-García ve Costa-García, karbon pasta elektrotta kolloidal altın ve kolloidal

altın etiketlenmiş antihuman IgG (immunogold)’nin elektrokimyasal davranışlarını

incelemişlerdir. Her iki kolloid elektrot yüzeyinde kuvvetle adsorplanmıştır. Onlar HCI

ortamında AuCI4- komplekslerinin oluşmasıyla yüksek potansiyellerde yükseltgen-

mişlerdir. Bundan sonra Ag/AgCI’e karşı +0.4 V civarında indirgenmişlerdir. Bu

yöntem ve diferansiyel puls voltametrisi elektrokimyasal tekniğinin kullanılmasıyla

düşük tayin sınırlarına ulaşmıştır. Ayrıca bu yöntem streptavidin-biyotin

etkileşmelerinin incelenmesinde kullanılmıştır. Bu durumda karbon pasta elektrotu

biyoince tabaka albumin ile modifiye edilmiştir ve streptavidin tayini için

kullanılmıştır (González-García ve Costa-García, 2000).

Dequaire ve çalışma grubu tek kullanımlık karbon pasta elektrotunda anodik sıyırma

voltametrisiyle indirekt tayin için kolloidal altın etiketlenmiş elektrokimyasal

immunoölçüm cihazı kullanmışlardır. İmmunoglobulin G’nin yarışmasız heterojen

immunoölçümü gerçekleştirilmiştir. Anodik sıyırma voltametrisi yöntemiyle kolloidal

altın etiketinin tayini için immunoölçümün son basamağında altın metali

salıverilmiştir. Bu salıverilme tutuklanmış bağlı kısmın çözünebilir iyonik Au3+

formuna yükseltgemesi yoluyla gerçekleştirilmiştir. Tayin sınırı pikomolar

düzeyindedir (Dequaire vd., 2000).

Raj ve çalışma grubu yaptıkları çalışmada polikristalin altın elektrot üzerindeki amin

mono tabakalarına immobilize edilmiş altın nanoparçacıklarını, askorbat içinde

bulunan dopaminin seçici bir şekilde ölçümü için başarılı bir şekilde kullanmışlardır.

Altın nanoparçacık immobilize edilmiş elektrotla dopamin ve askorbat için voltametrik

pikler ayrı ayrı gözlenmiştir. Altın nanoparçacıklarının yüksek katalitik aktivitesi

yüzünden askorbat için yükseltgenme potansiyeli daha düşük pozitif potansiyele

kaymıştır. Altın nanoparçacıklı elektrot mükemmel hassaslık ve iyi seçicilik

göstermiştir. Altın nanoparçacıklı elektrotla askorbat içinde mikromolar seviyede

bulunan dopaminin ölçümünü yapmak mümkündür (Raj vd., 2002).

32

Hu ve arkadaşları tarafından kolloidal altın modifiye edilmiş karbon pasta elektrot

üzerine absorplanmış GOD‘ın elektrokimyası araştırılmıştır. Adsorplanmış GOD‘ın

0,1 M pH=5 tamponunda 449±1 mV formal potansiyelde bir çift indirgenme piki

görülmüştür. 10-100 mV/sn arasındaki tarama hızında yüzey kontrollü elektrot prosesi

ile sabit elektron transfer hızı (38,9±5,3)/s olarak ölçülmüştür. Altın nanoparçacıkları

üzerinde adsorplanmış GOD‘ın biyoaktivite ve kararlılığı incelenmiştir. İmmobolize

GOD‘ın indirgenmesinde oluşan çözünmemiş O2 indirgenme pik akımını artırmıştır.

Glukoz ilavesi ile indirgenme pik akımı düşmüştür. Hazırlanan sensör 8,4 µA/mM

hassaslıkta 0,004-0,28 mM doğrusal çalışma aralığı ve 0,01 mM tespit sınırında glukoz

ölçümü için kullanılabilir. Ayrıca hazırlanan sensör ürik asit ve askorbik asit gibi

girişime neden olabilecek maddelerin girişim etkisini dışlamaktadır (Liu ve Ju, 2003).

33

4. GLUKOZ BİYOSENSÖRLERİ İLE YAPILAN BAZI UYGULAMALAR

Zang ve Lei yaptıkları çalışmada palladinize glassy karbon elekrot üzerinde

elektropolimerize poli 3,3’-diaminobenzidin içinde tutuklanmış GOD’a dayandırılan

kararlı ve hassas amperometrik glukoz enzim elektrodunu hazırlamışlardır.

Gözeneklerde palladyum mikroparçacıklarının elektrobiriktirilmesi elektrot yüzeyine

daha çok enzim yüklenmesini sağlamıştır. Palladyum mikroparçacık matriksi içinde

tutuklanan enzim mükemmel bir biyokatalitik akivite ve kararlılık göstermiştir. Bu

enzim elektrot 1.10-6-2.10-3 mol/dm3 glukoz konsantrasyonunun üstünde doğrusal

cevap ve 5.10-7 mol/dm3 tespit sınırı ölçülmüştür. Yarı geçirgen ve iletken olmayan

poli 3,3’-diaminobenzidin film diğer elektroaktif türlerin girişim etkisini azaltmış ve

proteinler tarafından enzim elektroda gelebilecek bozucu etkileri engellemiştir.

Hazırlanan bu elektrot serum içindeki glukoz ölçümü için kullanılmıştır (Zhang ve Lei,

1996).

Diğer bir çalışmada glukoz için amperometrik biyosensörde, GOD tutuklanması için

pamuk tülbent matriksi kullanılmıştır. Pamuk tülbent içinde tutuklanmış GOD çok

kararlı olmakla birlikte, önerilen biyosensörün performans özellikleri varolan glukoz

alıcılarından daha iyi olduğu bulunmuştur. Sensör cevapları 10-3-2.10-2 mol glukoz

konsantrasyonları arasında doğrusaldır. Sulandırılmış kan örneklerinde bulunan glukoz

için sonuçlar, klinik laboratuarlarda standart kalorimetrik metotlarla bulunan

sonuçlarla uyum içindedir. Sensör için cevap süresi 30 s ve elektrot kararlılığı 12 ay

olarak bulunmuştur (Kumar vd., 1996).

Bir başka çalışmada ise radikal kopolimerizasyonla hazırlanan polivinil ferrosen ve co-

2 hidroksietil metakrilat, amperometrik glukoz sensörleri için polimerik aracı olarak

kullanılmıştır. GOD ve redoks kopolimerleri karbon pasta ile karıştırılmış ve karbon

pasta enzim elektrodu glukozun amperometrik ölçümü için hazırlanmıştır. Bu

kopolimerler GOD’ın aktif merkezi ve elektrot arasında polimerik aracılar olarak

görev almışlardır. Biyosensörün cevap süresi 20 saniyedir (Saito ve Watanabe, 1997).

34

Chuang ve arkadaşları yaptıkları çalışmada karbon pasta ve grafit elektrot gibi iki tip

elektrot kullanmışlardır. Her iki elektrotta da glukoz oksidaz ve polietiliminin ferrosen

içeren bölümü (B-PEI) birleştirilmiştir. B-PEI yüksek konsantrasyonda birincil amino

grupları içermiş ve basit enzim ve taşıyıcı aracılar oluşturmak için kolayca modifiye

edilebilmiştir. Polietiliminin ekstra avantajı esnek karakterinden dolayı etkili bir

elektron aracısı olmasıdır. Her iki elektrotta da ferrosen içeren polietilimin polimerine

kovalent bağla GOD hidrofilik polimer matris içinde modifiye edilmiştir. Hazırlanan

elektrotlar glukoz konsantrasyonlarını hızlı bir şekilde yanıtlamış ve kararlı hal akım

cevapları 10 s’den daha az sürede elde edilmiştir. Amino gruplarını kapsayan

polietilimin polimerinin yüksek glukoz tepki hızı, yükseltgenme indirgenme

polimerinin amino grupları ile enzim arasında etkileşiminden dolayı polimer ve

enzimin yakın ilişkisinin elektron transfer hızını değiştirdiğini göstermiştir (Chuang

vd., 1997).

Mizutani ve arkadaşları tarafından polyon kompleks membranı üzerine tutuklanmış

GOD ile bir amperometrik glukoz elektrodu hazırlanmıştır. İlk önce altın elektrot

yüzeyinde 3-merkaptopropiyonik asit monotabakası yapılmıştır. Poli lizin ve poli-4-

stirensülfonat çözeltileri elektrot yüzeyine yerleştirilmiş ve kuruması sağlanmıştır.

GOD tabakası poli lizin/poli-4-stirensülfonat kompleks tabakası ile enzimin çapraz

bağlanması ile oluşturulmuştur. Polyon kompleks tabakası askorbik asit, ürik asit,

asetaminofenol gibi elektrokimyasal olarak girişime neden olan maddelerin etkisini

etkili bir şekilde ortadan kaldırmıştır. Sonuçta 5 s’den daha hızlı bir cevap, düşük

girişim seviyesi elde edilmiş ve tespit sınırı 1 mM olarak bulunmuştur. Hazırlanan bu

elektrodun içeceklerdeki glukoz miktarının tespiti için 2 aydan daha fazla

kullanılabildiği görülmüştür (Mizutani vd., 1998).

Liu ve çalışma grubu AI2O3 sol–jelden yeni bir glukoz biyosensörü geliştirmişlerdir.

Hazırlanan enzim elektrot, platinize glassy karbon elektrot üstündeki AI2O3 sol–jel

matriksi içinde tutuklanmış GOD’dan oluşmuştur. Platin siyahı yüzeye büyük

spesifiklik sağlamamış fakat sol-jel filmin yüzeye yapışmasını sağlamıştır. AI2O3

jelini hazırlama koşulları, çalışma elektrot potansiyeli, pH gibi parametreler

incelenmiştir. Glutamik, laktik, sitrik, asetik asit, prolin, metiyonin, lizin, histidin,

35

aspartik asit 1.10-4 mM glukozda hiçbir girişime neden olmamaktadır. Optimum

koşullar altında glukoz için dogrusal çalışma aralığı 4.10-5-2,19.10-2 mM ve tespit sınırı

1.10-5 M olarak ölçülmüştür. Biyosensörün kararlılığı 2 hafta olarak bulunmuştur. Elde

edilen sonuçlardan hazırlanan sensörün 6,02.10-4 – 1,75.10-3 M arasındaki seyreltik kan

numunelerindeki glukoz ölçümü için uygun olduğunu göstermiştir (Liu vd., 1999).

Xu ve Chen yaptıkları çalışmada etakridin potansiyostatik ve dönüşümlü voltametri

yöntemleri ile Pt elektrotta başarılı bir şekilde polimerleştirilmiştir. GOD ince

polietakridin matriksi içine tutuklanmış ve bu elektrot 2 s içinde glukoza amperometrik

cevap sergilemiştir. Michealis-Menten sabiti ve maksimum akım sırasıyla 15,7 mM ve

209 µA/cm2 olarak bulunmuştur. Polietakridin seçici geçirgen özelliğinden dolayı L-

askorbik asit, ürik asit, asetaminofenol ve L-sistein gibi elektroaktif maddelerin

girişimlerini azaltmıştır. Hazırlanan bu elektrot bazı türlerin girişim etkisini azalttığını

ve 18 mM kadar glukoz konsantrasyonunda geniş bir doğrusal cevap aralığına sahip

olduğu bulunmuştur (Xu ve Chen, 1999).

Bir başka çalışma grubu kalıp lipit filme dayanan bir glukoz biyosensörü

geliştirmişlerdir. 4-vinilpiridin kopolimeri içinde tutuklanan GOD glassy karbon

elektrottaki lipit film üzerine yerleştirilmişitr. Ölçüm yüzeyinden hidrofilik elektroaktif

materyalleri etkili bir şekilde uzaklaştırmış ve girişim etkisini büyük ölçüde azalttığı

görülmüştür. Yüksek elektron transferi veriminden dolayı aracı olarak TTF

(tetrathiafulvalene) seçilmiştir ve lipid filmle sağlam bir şekilde birleştirilmiştir. GOD

lipit film üzerine kaplanmış hidrojelde tutuklanmıştır. Optimum analitik performans

için pH ve gerilim etkileri incelenmiştir. Geliştirilen biyosensör için cevap süresi 20 s,

doğrusal aralık 10 mM ve tespit sınırı 2.10-5 mol/l olarak bulunmuştur. Biyosensör

aynı zamanda iyi bir kararlılık ve tekrarlanabilirlik göstermiştir (Wu vd., 2000).

Chen ve Dong yaptıkları çalışmada glukoz biyosensörü geliştirmek için titanyum

oksit-kopolimer bileşimi bir materyal kullanmışlardır. GOD’ı bu bileşik içinde

tutuklamışlardır. Bu bileşik materyal inorganik türler, titanyum oksit, organik türlerin

en iyi özelliklerini kapsamaktadır. Asetaminofenol ve ürik asit glukoz biyosensörüyle

hiçbir girişim vermezken askorbik asitte girişim gözlenmiştir. Biyosensörün cevap

36

süresi 20 s ve dayanıklılık süresi 1 ay olarak bulunmuştur. Doğrusal çalışma aralığı

9mM’a kadar ve duyarlılık 405 nA/mM olarak ölçülmüştür. Alınan sonuçlar titanyum

oksit/polivinilalkol (PVA)–g–polivinilferrosen (PVF) karışık materyali sadece

enzimlerin değil diğer biyomolekülllerin tutuklanması için de uygun olduğunu

göstermiştir (Chen ve Dong, 2002).

Yang ve arkadaşları biyosensör uygulamalarında enzimin yüzeye kovalent bağlanması

için, gözenekli organik-inorganik sol jel bileşiklerini kullanmışlardır. Bu bileşikler

grafit tozu, ferrosen, amino ve metil silikattan oluşmuşlardır. Grafit tozu elektrot için

iletkenlik sağlarken, ferrosen ise yüzey ve enzimin aktif bölgesi arasında aracılık

yapmışır. Amin grupları ise karboimid reaksiyonu üzerinden enzim için kovalent bağ

oluşturmuşlardır. Deneyler pH=7 ve 26 oC’de yapılmıştır. Glukoz biyosensörünün

seçiciliğini değerlendirmek için sukroz, fruktoz, maltoz, ksiloz, sülfit, oksalat, ürik asit

gibi girişim yapabilecek maddelerin etkisi araştırılmıştır. Fruktoz, maltoz, ksiloz,

sukroz, oksalat (0,5 mM) çalışılan şartlarda %2 bulunduğunda hiçbir girişime yol

açmadığı bulunmuştur. Asetaminofenol ve ürik asit 0,5 mM konsantrasyonda girişim

yapmıştır. Sülfit ve askorbik asit elektrot yüzeyinde doğrudan okside olduğundan

ciddi bir girişime sebep olduğu bulunmuştur. Elektrot yüzeyindeki hidrofilik ve

hidrofobik davranışlar silikat yapısındaki amin ve metil gruplar tarafından kontrol

edilmiştir. Glukoz için optimal elektrot cevabı 0,1-27 mM arasında doğrusal, hassaslık

1,3 µA mM-1, kararlılık 2 ay ve tespit sınırı 26 µM olarak bulunmuştur (Yang vd.,

2002).

Sung ve Bae yaptıkları çalışmada yeni bir glukoz biyosensörü hazırlamak için pirol ile

birlikte polianyon, polietilen glikol ve GOD konjugatlarının elektrokimyasal

polimerizasyonunu kullanmışlardır. Pt elektrot yüzeyinde polipirol matriksi içinde

tutuklanan GOD, PEG (polietilen glikol) üzerinden polianyon ile birleşmiştir.

Çalışmada PEG 1000, 2000, 3000, 4000 gibi dört farklı zincir uzunluğu denenmiş,

bunların enzim immobilizasyonu ve elektrot işlevi üzerindeki etkisi incelenmiştir.

Enzim elektrodun hazırlanmasında 800mV potansiyel ve 225 mC/cm2 film kalınlığı

kullanılmıştır. Elektrot üzerindeki immobilize enzimin aktivitesi 119-209 mU/cm2

arasında değişmiş biyoaktivite daha uzun PEG’lerde artmıştır. Amperometrik cevap

37

270 nA mM-1cm-2 kadar değişen duyarlılık ile 20 mM glukoz konsantrasyonuna kadar

doğrusallık gözlenmiştir (Sung ve Bae, 2002).

Diğer bir çalışmada glukoz, etanol ve biyojenik aminlerin amperometrik biyosensörleri

için oksidaz/peroksidaz bienzim sistemleri yapılmıştır. Tepkimede oksidaz tarfından

üretilen H2O2 sarmaşık patates meyve kabuğundan arıtılan peroksidaz yoluyla

ölçülebilir sinyale dönüştürülmüştür. Bütün bu geliştirilmiş biyosensörler oksidazların

redoks hidrojel formuna dayandırılmış ve sarmaşık patatesinden arındırılan peroksidaz

redoks polimerine çapraz bağlanmıştır (Castillo vd., 2002).

Suzuki ve Kumagai yaptıkları çalışmada GOD’ı pH duyarlı kopolimer olan poli N-

izopropilakrilamit/akrilik asit jelinde tutuklamışlardır. Geliştirilen alette akrilik asitin

algılama gücünü anlamak için farklı sıcaklıklardaki jel hacmine bakılmıştır. Girişim

etkilerini belirlemek için jel hazırlığı sırasında glukoz yerine L-askorbik asit, ürik asit

ve asetaminofenol ilave edilmiştir. Hazırlanan jelin sıcaklık artışı ile hacim değişmesi

pH ile kontrol edilmiş ve pH=7,4 olarak belirlenmiştir. Civalı termometreye benzeyen

tek kullanımlık glukoz sensörü için dezavantaj yanıt süresinin uzun olmasıdır (Suzuki

ve Kumagai, 2002).

Bir başka çalışmada GOD, enzim ile poli-lizin zinciri arasında araya eklenilen peptit

bağlayıcısı ile genetik olarak değiştirilmiştir. Duyarlılık ve glukoz biyosensörünün

kararlılığını geliştirmek amacıyla GOD’a ferrosen karboksilik asit ilave edilmiştir.

Glukoz biyosensörü gen düzeyinde değiştirilen GOD ile geliştirilmiştir. Bu değişiklik

sinyal düzeyi, cevap hızı, glukoz alıcısının ömrünü geliştirmiştir (Chen vd., 2002).

Uang ve Chou yaptıkları çalışmada birçok enzimle uyum gösteren, pirol

monomerinden kolayca sentezlenen polipirol kullanmışlardır. Pt çalışma elektrodu

yüzeyinde galvanostatik elektropolimerizasyonla hazırlanan polipirol filmi hazırlanmış

ve GOD bu film içinde tutuklanmıştır. Biyosensörün amperometrik akımı H2O2

konsantrasyonuna bağlı olarak değişmiştir. Glukoz biyosensörünün hassaslığı

tutuklanan enzim miktarı ve film kalınlığına bağlı olarak değişmiştir. Girişime neden

olan askorbik asitin girişim etkisi ise film kalınlığı artıkça azalmıştır. Geliştirilen

38

sensörün doğrusal aralığı 0-10 mM ve duyarlılık 7 nA/mM olarak ölçülmüştür. Cevap

süresi 15 s ve Michaelis–Menten sabiti 37,6 mM olarak bulunmuştur (Uang ve Chou,

2003).

Bir başka çalışmada poliglutamat–GOD kompleksi hazırlanmış ve hazırlanan

kompleks sisteamin modifiye altın elektrodu üzerine damlatılmıştır. Elektrot

yüzeyindeki sisteamin ve poliglutamat arasında elektrostatik bağ oluşumu sonucunda

GOD’ın elektroda bağlanması sağlanmıştır. Hazırlanan enzim elektrodu <15 s gibi

oldukça hızlı cevap göstermiştir çünkü enzim tabakası oldukça incedir. Poliglutamat-

GOD yerine modifiye edilmemiş GOD kullanıldığı zaman enzim elektrodunun

hassaslığı oldukça düşmüştür. Bu da kompleksteki poliglutamat zincirlerinin modifiye

elektrot yüzeyindeki immobilizasyon için gerekli olduğunu açıkça göstermiştir. 5-100

µM arasında glukoz konsantrasyonu ve kompleks immobilize edilen elektrodun akım

cevabı arasında doğrusal bir ilişki vardır. Yapılan deneylerin sonucu bu

immobilizasyon tekniği biyoçiplerin ve biyosensörlerin hazırlanmasında

kullanılabileceğini göstermiştir (Yabuki vd., 2003).

Jawaheer ve arkadaşları β-D-glukoz, toplam D-glukoz, sukroz ve askorbik asit için

sensörler geliştirmişlerdir. Enzimin hapsedilmesi ve kararlılığı geliştirmek için pektin

ve bitki hücrelerindeki doğal polisakkarit kullanmışlardır. Askorbik asit hariç diğer

bütün sensörler karbon elektrotlarda H2O2 üretmiştir. Β-D-glukoz biyosensöründe 7

mM glukoz için 20 mm2 çalışma elektrodunda akım ortalama 0,41 µA bulunmuştur.

Çalışma potansiyeli 350 mV olarak seçilmiştir. Askorbik asit girişimini engellemek

için biyosensör %5 selüloz asetat zarı ile kaplanmıştır (Jawaheer vd., 2003).

39

5. POLİVİNİLFERROSEN MODİFİYE ELEKTROTLAR

Ferrosen tersinir bir elektron aktarımıyla kolaylıkla ferrosenyum katyonuna

yükseltgenebilen fonksiyonel bir moleküldür. Ferrosen içeren doymamış bileşiklerden

vinilferrosenin radikal homo ve kopolimerizasyonu, serbest radikal başlatıcılarla

polimerleştiği bulunmuştur (Aso vd., 1969).

Kimyasal polimerizasyonla elde edilmiş polivinilferrosenin (PVF) elektrot yüzeyine

kaplanmasında metilen klorürdeki PVF çözeltisinden; a) Elektrot yüzeyine

elektrokimyasal çöktürme; b) Daldırıp kurutma ya da c) damlatma-döndürerek

buharlaştırma yöntemleri kullanılabilir. Elektrokimyasal çöktürme yönteminde polimer

çözeltisine daldırılan elektroda uygun bir gerilim uygulanarak yapılan elektrolizle

polimerin yükseltgenmiş formu elektrot yüzeyinde biriktirilir. Daldırıp-kurutma

yönteminde elektrot polimer çözeltisinde bir süre bekletildikten sonra kurutulur,

damlatma-döndürerek buharlaştırma yönteminde ise elektrot yüzeyine polimer

çözeltisi damlatılıp elektrodun döndürülmesi yoluyla çözücü buharlaştırılır. PVF bir

redoks polimeridir, yani polimerin kendisi de elektroaktiftir. Elektriksel iletkenlik

polimerin yapısındaki yükseltgenmiş ve indirgenmiş gruplar arasında elektron atlaması

yolu ile sağlanır. Değişik yöntemler kullanılarak PVF ile kaplanan elektrotlarda yüzeye

bağlanmış bir ferrosen polimerinin tersinir bir yükseltgenme indirgenme tepkimesi

verdiği bulunmuştur (Umana, 1980; Gülce, 1993).

Şekil 5.1. Ferrosen Polimerinin yükseltgenme-indirgenme tepkimesi (Umana, 1980).

40

Elektrokimyasal olarak katkılanmış PVF filmleri, metilen klorürde çözünmüş PVF'nin

sabit gerilimdeki anodik elektrolizi ile hazırlanmıştır. Elektrot yüzeyine biriktirilen

polimerin CIO4- karşıt anyonu ile ferrosen ve ferrosenyum gruplarını içeren kısmen

yükseltgenmiş bir yapıda olduğu ileri sürülmüştür (Shirota vd., 1984).

Şekil 5.2. Elektrokimyasal olarak katkılanmış PVF (Shirota vd., 1984).

Elektrokimyasal olarak biriktirilmiş PVF'nin dağılmış yansıma (elektronic diffuze

reflection) spektrumunda, 460 ve 625 nm' de ferrosen ve ferrosenyuma ait adsorbsiyon

pikleri gözlenmiştir. Bu polimerin oda sıcaklığındaki yaklaşık iletkenliği l.105 cm-l

olarak ölçülmüştür. Bu iletkenliğin katkılama derecesine bağlı olduğu %60 katkılama

ile en büyük iletkenlik değerinin elde edildiği belirtilmiştir.

Pt elektrot üzerine anodik elektrolizle biriktirilmiş PVF filmlerinin kararlı hızlı ve

tersinir redoks davranışları gösterdiği Bard grubu tarafından belirlenmiştir. Ferrosen ve

ferrosenyum içeren kısmen yükseltgenmiş polimer filmleri sabit ve tekrarlanabilir

gerilim göstermişlerdir. Bu elektrotların referans elektrot olarak kullanılabilirliği

denenmiştir. 0,1 M TBAP içeren asetonitrilde 3,1 mM tiyoantrasenin bu referans

elektrotta karşı bir Pt elektrottaki yükseltgenmesi amacıyla 21 saat sürekli gerilim

taraması yapılmıştır. Bu süre içinde ±2 mV ortalama bir sapma ile sabit pik gerilimi

ölçülmüştür. Ancak benzonitril, metanol, dimetilformamid ve suyun çözücü olarak

41

kullanıldığı deneylerde elektrodun daha az kararlı olduğu gözlenmiştir (Peerce ve

Bard, 1980; 1997).

Daldırma kurutma yöntemiyle kaplanmış PVF film elektrotların dönüşü voltametrik ve

kronoamperometrik davranışlarına destek elektrolitin türünün ve derişiminin etkisi

incelenmiştir. Kullanılan destek elektrolitin türü ve derişimi ile pik gerilim ve

akımlarının değiştiği gözlenmiştir. Bunun nedeni yüzeydeki filmin yükseltgenmesi

sonucu elektrolit anyonlarının yapıya girerek tuz oluşturması ile açıklanmıştır.

Elektrolit derişiminin artmasıyla yükseltgenmiş filmin daha da yoğun bir yapı

oluşturduğu ve difüzyonun güçleştiği belirtilmiştir (Iwakura vd., 1987).

Çeşitli destek elektrolitlerde PVF'nin yükseltgenmiş ve indirgenmiş haline bağlı olarak

polimer yapısındaki iyon ve çözücü içeriğini incelemek için [quartz crystal

microbalance (QCM)] tekniği kullanılmıştır. CIO4- ve PF6

- içeren elektrolitlerde, filmin

yükseltgenmesi sırasında filmin çözücü içeriğinde çok az değişim olduğu ya da hiç

değişim olmadığı gözlenmiştir. Sulu NaCIO4 çözeltilerinde PVF için elektrokimyasal

kuartz kristal mikrobalans (EQCM) verileri incelenmiştir. Yüksek ve düşük elektrolit

derişimlerinde, elektronötralliğin kısa zaman aralıklarında karşıt iyonun hareketi ile

sağlandığı belirtilmiştir . Nötral türlerin polimer yapısına girmesinin anyonlardan daha

zor olduğu belirlenmiştir (Hillman vd., 1991; 1992). Inzelt ve Bacskai tarafından

yapılan bir çalışmada gerilim taramaları sırasında PVF filmlerine çözücü molekülünün

ve elektrolit anyonunun katılmaları EQCM yöntemiyle incelenmiştir (Inzelt ve

Bacskai, 1992). PVF filmlerinin redoks davranışları ve film şişmesinin destek

elektrolitin türü ve derişimine bağlı olduğu bulunmuştur. Ayrıca elektrokimyasal

olarak biriktirilmiş PVF filmlerinde daha az şişme olduğu belirlenmiştir.

Gülce ve çalışma grubu yaptıkları bir çalışmada dönüşümlü voltametri ve diferansiyel

pulse anodik sıyırma metodunu kullanarak polivinilferrosenyum kaplı Pt elektrotlarla

iyodür, tiyosiyanat ve siyanürün elektroyükseltgenme davranışlarını incelemişlerdir. IR

ve UV spektroskopik data ve diferansiyel tarama kalorimetri (DSC) ölçümleri bu

anyonların polimerik yapıda anyon değişiminin sonucu olarak biriktirilmekte olduğunu

göstermiştir. Bu anyonların filmden anodik sıyırma ile ayrılmaları önderiştirmeden

42

sonra gerçekleştirilmiştir. Tiyosiyanat ve iyodür iyonları karşıt iyonlar olarak film

yapısı içinde biriktirilirken, siyanürün fazlası filmin fiziksel özelliklerinde geri

dönüşümü olmayan değişikliklere neden olmuştur. Buradan anlaşıldığı gibi PVF

modifiye yüzeylerin elektrokimyasal özelliklerinin anyonik çözeltilerde oldukça

duyarlı olduğu ve fosfat gibi diğer elektroinaktif anyonların polimerik filmin

elektroaktifliğini kaybetmesinde etkili olduğu belirlenmiştir (Gülce vd., 1993).

Gülce ve arkadaşlarının başka bir çalışmasında antrasen ve bunun bazı türevlerinin

polivinilferrosenyum kaplı Pt elektrot yüzeyindeki elektroindirgenme davranışları

incelenmiş ve kaplanmamış Pt yüzeyde asetonitril/0,1 M TBAP çözeltisinde

dönüşümlü voltametri yöntemi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Filmde elektrot

reaksiyonlarından sonra meydana gelen yapısal değişiklikler IR spektroskopi ve DSC

ölçümleri ile takip edilmiştir. Antrasen türevlerinin katalitik indirgenmesi elektrot

reaksiyonlarının kaplanmış yüzeyde yapılmasıyla meydana gelmiştir. Bu çalışma,

PVF+ClO4- ‘nin çözeltideki türlerin indirgenmesi için kimyasal olarak modifiye

edilmiş elektrot olarak kullanıldığında katalitik özelliklerinin ne kadar önemli

olduğunu göstermiştir (Gülce vd., 1994-a).

Aynı grup tarafından polivinilferrosenyum kaplı Pt elektrodunda antrasen ve 9,10-

difenil antrasenin elektroyükseltgenme davranışı incelenmiş ve asetonitril / 0,1 M

TBAP çözeltisinde dönüşümlü voltametri kullanılarak kaplanmamış Pt yüzeydeki

cevap karşılaştırılmıştır. Elektrot reaksiyonundan sonra film yapısında meydana gelen

değişiklikler IR spektroskopisi ile tayin edilmiştir. Elektrot potansiyeli +1,5 ve 0,00 V

arasında döndürüldüğünde kinon ve hidroksi substite tipi ürünlerinin oluşumunun

açıklanabileceği gösterilmiştir. Antrasenin katalitik yükseltgenmesi, potansiyel

döngüsünün +1,50 ve –2,30 V arasında tutulmasıyla elde edilmiştir. Bu çalışma

ortamında PVF+ merkezlerinin antrasenin indirgenmesini katalizlediği ortaya çıkmıştır

(Gülce vd., 1994-b).

Gülce ve arkadaşları diğer bir çalışmalarında aerobik çözelti koşullarında basit,

duyarlı, kararlı, düşük maliyetli ve hızlı cevap alınabilen bir glukoz sensörü

tanımlamışlardır. Elektrodun akım cevabı hem voltametrik pik akımı değerleri hem de

43

kararlı akım değerleri elde edilerek tayin edilmiştir. Bu çalışmada aerobik koşullar

altında glukoz tayini için glukoz oksidazın PVF redoks polimere immobilize edilerek

kullanılabileceği ilk kez belirlenmiştir. Polimerik materyalin ferrosenyum

merkezlerinin, enzimatik reaksiyon boyunca üretilen hidrojenperoksitin

yükseltgenmesi için görünür bir aracı olduğu belirlenmiştir (Gülce vd., 1995-a).

Aynı çalışma grubu bir diğer çalışmasında, glukoz oksidaz ve invertazın polivinil

ferrosenyum perklorat film içine birlikte immobilize edilmelerine dayanarak, basit,

hassas, kararlı ve düşük maliyetli bir sukroz sensörü geliştirmiştir. İnvertaz, α glukoz

ve β fruktozun sukroza dönüşümünü katalizler. Sık kullanılan bir üçüncü enzim olan

ve mutarasyon için kullanılan mutorazın kullanımını elimine eden ortam katalizörü

olan fosfat iyonları α glukoz ve β fruktoza dönüşümü sağlar. Glukoz oksidaz H2O2

üreterek glukonik asitin β glukoza yükseltgenmesini katalizler. O2’nin indirgenme

akımına dayalı sukroz elektrotlarının aksine H2O2’nin yükseltgenmesine dayanan

akımı PVF+ merkezlerinin katalizlediğini ortaya çıkarmışlardır (Gülce vd., 1995-b).

β galaktosidaz ve glukoz oksidazın redoks polimeri olan polyvinilferrosenyum

perklorat (PVF+CIO4-) içinde birlikte immobilize edilmesiyle laktoz tayini için bir

enzim elektrot geliştirilmiştir. Elektrodun amperometrik cevabı enzimatik olarak

üretilen H2O2’nin elektroyükseltgenmesini sağlayan +0,7 V’da ölçülmüştür. Optimum

pH=7,8 olarak belirlenmiştir. Substrat, tampon derişimi ve pH’nın elektrot cevabına

etkisi incelenmiştir. Laktoz tayini için polarimerik, kromatografik, spektroskopik ve

titrimetrik metotlar çok kullanılmaktadır. Bu yöntemler genellikle yorucu, zaman alıcı

ve pahalıdır. Enzim immobilizasyon tekniklerinin elektrokimyasal sensörlerle

kullanıldığında daha hızlı ve ucuz analiz metotları olarak çok daha kullanışlı olduğu

belirlenmiştir (Gülce vd., 2002-a).

Polivinilferrosenyum perklorat kaplı Pt elektrot yüzeyine galaktoz oksidaz immobilize

edilerek galaktoz tayini için, yeni bir enzim elektrodu geliştirilmiştir. Enzim

elektrodunun amperometrik cevabı SCE’ye karşı +0,70 V’da ölçülmüştür. Enzim

elektrot cevabı üzerine galaktoz derişimi ve sıcaklığın etkisi araştırılmıştır. Doğrusal

44

çalışma aralığı 40,0 mM’a kadar ve cevap süresi 30-40 s olarak bulunmuştur (Gülce,

2002-b).

Gülce ve çalışma grubu diğer bir çalışmasında, alkol tayini için polivinilferrosenyum

perklorat kaplı Pt elektrot yüzeyinde alkol oksidaz tutuklayarak, yeni bir enzim

elektrodu geliştirmişlerdir. Enzimatik olarak üretilen H2O2’nin elektroyükseltgenmesi

sabit +0,7 V’da ölçülerek amperometrik cevap alınmıştır. Enzim elektroduna substrat

tampon ve enzim derişimi, pH ve sıcaklığın etkisi araştırılmıştır. Çalışma sıcaklığı

30oC ve optimum pH=8,0 olarak belirlenmiştir. Enzim elektrodunun duyarlılığı

sırasıyla: metanol > etanol > n-butanol > benzil alkol şeklindedir. Lineer cevabın

metanol için 3,7 mM, etanol için 3,0 mM, n- butanol için 6,2 mM, benzil alkol için

5,2mM’a kadar olduğu belirlenmiştir. İmmobilize enzim sisteminde metanol için

görünür Michaelis-Menten sabiti (KMapp) 5,78 mM ve aktivasyon enerjisi 38,07 kj/mol

olarak bulunmuştur (Gülce vd., 2002-c).

Bir diğer çalışma grubu yaptıkları çalışmada laktatın amperometrik ölçümü için, Pt

elektrot üzerine kaplanan PVF+ClO4- de laktat oksidaz tutuklamışlardır. Geliştirilen

elektroda sıcaklık, pH, polimer film kalınlığı ve enzim konsantrasyonu araştırılmıştır.

Bu enzim elektrodu için doğrusal konsantrasyon aralığı 0,05-0,6 mM olarak

bulunmuştur. Bulunan maksimum akım değeri diğer çalışmalarda bulunan değerlerden

daha yüksektir. Hazırlanan enzim elektrot için günlük olarak ölçülen akım değerlerine

bakılarak kararlılık 15 gün olarak bulunmuştur (Aydın vd., 2002).

Yıldız ve çalışma grubu organik peroksitler, t-bütilhidroperoksit, 2-bütanon peroksit,

kümen hidroperoksit ve t-bütil perasetat ölçümü için amperometrik bir enzim elektrodu

geliştirmişlerdir. Enzim elektrodu polivinilferrosenyum film içinde horseradish

peroksidaz elektrostatik immobilizasyon ile hazırlanmıştır. PVF+ClO4- film Pt elektrot

üzerine 0,7 V‘ta 0,1 M TBAP’daki metilenklorid içindeki polivinilferrosenin

elektroyükseltgenmesi ile kaplanmıştır. Modifiye enzim elektrodu pH=8,5 0,05 M

fosfat tamponunda HRP‘nin anyon değiştirmesi ile hazırlanmıştır. Film kalınlığı,

immobilizasyon sırasındaki enzim konsantrasyonu, sıcaklık gibi parametrelerin enzim

elektrodunun performansı üzerine etkileri araştırılmıştır (Yıldız vd., 2002).

45

Gülce ve arkadaşları bir diğer çalışmalarında kolin tayini için yeni bir enzim elektrodu

geliştirmişlerdir. Enzim elektrodu polivinilferrosenyum perklorat kaplı Pt yüzeyine

kolin oksidaz eklenerek hazırlanmıştır. Kolin oksidaz, H2O2 üreterek kolinin betaine

yükseltgenmesini katalizler. Polivinilferrosenyum merkezlerinin H2O2

yükseltgenmesini katalizlemesi ile akım ölçülmüştür. Kolin derişimi, çalışma sıcaklığı

ve pH’ın enzim elektrodun cevabı üzerine etkileri çalışılmıştır. Cevap süresi 60-70 sn

ve lineer çalışma aralığı 1.2 mM kolin derişimi olarak bulunmuştur. Ölçülebilir akımı

üreten minimum substrat derişimi 4.10-6 mM olarak bulunmuştur. Hazırlanan bu enzim

elektrot için Michaelis-Menten sabiti aktivasyon enerjisi sırasıyla 2.32 mM ve 38.91

kJ/mol olarak bulunmuştur (Gülce vd., 2003).

Bir başka çalışmada Pt elektrot yüzeyindeki polivinilferrosenyum perklorat matriksi

içerisinde asetilkolin esteraz ve kolin oksidaz tutuklanarak sulu çözeltide asetilkoline

duyarlı yeni bir enzim elektrot geliştirilmiştir. Enzim elektrot cevabı üzerine polimerik

film kalınlığı, pH, sıcaklık, substrat ve enzim konsantrasyonlarının etkileri

araştırılmıştır. Optimum pH 7,4 ve çalışma sıcaklığı 25 oC olarak kullanılmıştır. Cevap

süresi 30-50 s, lineer çalışma aralığının üst sınırı 1,17 mM asetil kolin derişimi olarak

bulunmuştur. İmmobilize enzim sistemi için görünür Michealis-Menten sabiti ve

aktivasyon enerjisi sırasıyla 1,74 mM asetilkolin ve 14,92 kJ/mol‘dur (Şen vd.,

baskıda).

46

6. KULLANILAN DENEYSEL YÖNTEMLER

6.1. Kronoamperometri

Amperometri yönteminin esası akım ölçümüne dayanmaktadır. Amperometrik

yöntemin kullanıldığı biyosensör uygulamalarında elektrot seçimliliği ve duyarlılığı

büyük ölçüde biyokatalizörün elektrot yüzeyinde tutuklanmasına bağlıdır.

Durgun bir çözeltide çalışma elektrodu ile karşılaştırma elektrodu arasına incelenen

sistemin voltamogramında plato bölgesinde sabit bir gerilim değeri uygulanırsa basit

elektrot tepkimesi için zamanın karekökü ile azalan bir akım oluşur. Uygulanan sabit

bir gerilimde akımın zamanla gelişiminin ölçüldüğü bu yöntem kronoamperometri

adını alır. Kronoamperometri deneylerinde çalışma elektroduna uygulanan etki sabit

bir gerilim basamağı uyarmasıdır (Şekil 6.1.a). Başlangıçta çalışma elektrodunun

gerilimi pozitiftir. t=0 anında çalışma elektrodunun gerilimi elektrot yüzeyinde

tepkiyen derişimini bir anda sıfıra götürecek ölçüde negatif olan bir Eson değerine

atlatılmaktadır. Sistemin bu uyarıya cevabı zamana bağlı olarak değişen bir akımdır

(Şekil 6.1.b).

Şekil 6.1. a) Kronoamperometrik uyarı. b) Kronoamperometrik cevap. (Bard ve Faulkner, 1980).

47

6.2. Dönüşümlü Voltametri

Dönüşümlü voltametri yönteminde karşılaştırma elektroduna göre çalışma

elektrodunun geriliminin belirli bir gerilim programına uyacak şekilde değiştirilmesi

esas alınır. Bu uygulamada gerilim taraması ileri yönde belli bir gerilim değerine

ulaştıktan sonra yine doğrusal olarak azalacak biçimde ters çevrilir. Yeniden başlangıç

gerilimi değerine ulaştığında gerilim programı tamamlanır. Dönüşümlü voltametride

ileri ve geri yöndeki gerilim tarama hızları aynı tutulabildiği gibi, istendiğinde farklı

tarama hızları da kullanılabilir. İleri yöndeki gerilim tarama sırasında çalışma ve karşıt

elektrotlar arasında geçen akım kaydedilirse pik şeklinde bir akım-gerilim eğrisi elde

edilir. Bu çözeltideki elektroaktif maddenin yükseltgenmesine (ya da indirgenmesine)

karşıdır. Gerilim tarama yönü ters çevrildiğinde yükseltgenmiş elektroaktif yeniden

indirgenmesine (ya da yükseltgenmesine) karşı gelen bir pik gözlenir. Bu yöntemde

uygulanan gerilim programı ve elde edilen akım-gerilim eğrisi Şekil 6.2.’de

gösterilmiştir.

Şekil 6.2. (a) Dönüşümlü voltametride elektroda uygulanan gerilim programı (b) Elde edilen akım gerilim eğrisi (Yıldız vd., 1993)

Dönüşümlü voltomogramların ayrıntılı bir şekilde incelenmesi ile bir sistemin hangi

gerilimde ve kaç adımda indirgenip yükseltgenebileceğini, elektrokimyasal açıdan

tersinir olup olmadığını, elektrot tepkimesinin bir çözelti tepkimesi ile elele gidip

gitmediğini, indirgenme ve yükseltgenme ürünlerinin kararlı olup olmadığını, elektrot

tepkimesinde yer alan türlerin yüzeye tutunup tutunmadığını anlamak mümkündür.

t

-E

(a) (b)

İ kİ a -E

48

Elde edilen dönüşümlü voltomogramlar elektron ve kütle aktarım hızlarına, elektrot

yüzeyinde ve çözeltide oluşan bağlaşık kimyasal tepkimelere bağlı olarak değişik

şekiller alırlar.

Tersinir bir sistem için pik akımı, ip, (6.1) eşitliği ile verilir (Bard ve Faulkner, 1944).

İp= kn3/2 AD1/2 Cv1/2 (6.1)

Burada;

İp: Pik akımı (amper)

n: Elektrot tepkimesinde aktarılan mol elektron sayısı

A: Çalışma elektrodunun alanı (cm2)

D: Difüzyon katsayısı (cm2/s)

C: Elektroaktif maddenin derişimi (mol/cm3)

v: Gerilim tarama hızı (volt/s)

k: Randles-Sevcik sabiti (2,69.105)’dir.

Tersinir bir dönüşümlü voltomogramda anodik ve katodik pik akımları birbirine eşittir.

Ayrıca bu piklerin gerilimleri Epa ve Epk ile gösterilirse 25 0C’da voltametrik yarı dalga

gerilimi (E1/2) ile bu yöntemde ölçülen pik gerilimleri arasında

n0,029 EE 1/2pa += (6.2 a)

n0,029- EE 1/2pk = (6.2 b)

eşitlikleri yazılabilir (Bart ve Faulkner, 1944).

Anodik ve katodik pikler arasındaki gerilim farkı (6.3) eşitliği ile verilebilir.

nEEE pkpa

058,0=−=∆ (volt) (6.3)

49

Tam tersinmez bir elektrot tepkimesinde geri pik gözlenmez, ileri yöndeki pik akımı

gerilim tarama hızının karekökü ile orantılıdır.

50

7. DENEYSEL KISIM

7.1. Kullanılan Çözücünün Saflaştırılması

Bu çalışmada, polimer çözeltisinin hazırlanmasında kullanılan metilen klorür (Merck)

önce H2SO4 ile daha sonra destile su ve %5’lik Na2CO3 ile son olarak da destile su ile

tekrar yıkandı. Metilen klorüre, CaCl2 eklenerek ön destilasyon yapıldı. İki kez de

P2O5 üzerinden destillenerek arıtıldı. Enzim elektrot aktivitesinin belirlenmesinde

çözücü olarak kullanılan su, Millipore saf su cihazından alındı.

7.2. Kullanılan Elektrotlar

Elektrokimyasal deneylerde çalışma elektrodu olarak 2 mm çapında Pt disk elektrot

(0,0314 cm2), karşılaştırma elektrodu olarak doygun kalomel elektrot ve karşıt elektrot

olarak Pt levha elektrot kullanıldı. Pt disk elektrot her elektrokimyasal çalışmada önce

su ile bulamaç hale getirilen Cr2O3 ile düzgün bir yüzey üzerinde parlatıldı. Bu elektrot

daha sonra sırasıyla destile su ve çalışılacak çözücü ile yıkanıp kurutulduktan sonra

kullanıldı.

7.3. Kullanılan Aletler

Çalışmada, potansiyostat olarak bilgisayar kontrollü CHI 660 A Electrochemical

Analyzer kullanılmıştır. Sıcaklık denetleyici sirkülatör Selecta 1000’dir. pH

ölçümlerinde, pH/iyon analiz cihazı (Mettler Toledo MA 235) kullanılmıştır. pH

ölçümlerinde sabit sıcaklık banyosu kullanılarak 25oC ± 0,1oC sıcaklıkta çalışılmıştır.

Manyetik karıştırıcı Snijiders 34532 markadır. Oksijen Tüpü Habaş, Azot Tüpü (%

99,99 saflıkta) Bursan A.Ş.’den temin edilmiştir.

7.4. Elektroliz Hücresi

Elektrokimyasal çalışmalar rodajlı, beş girişi bulunan, ceketli bir cam hücrede yapıldı

(Şekil 7.1.). Beş girişin üç tanesine; Pt çalışma elektrodu, Pt karşıt elektrodu ve

51

karşılaştırma elektrodu yerleştirildi. Diğer iki girişten birine gaz giriş borusu, diğerine

ise gaz çıkış musluğu takıldı.

Şekil 7.1. Elektrokimyasal çalışmaların yapıldığı hücre (Gülce, 1993).

7.5. Enzim Çözeltisinin Hazırlanması

Gerekli miktardaki glukoz oksidaz (E.C. 1.1.3.4, G-6125/G-7773, Sigma from

Aspergillus niger), 1,00 mL, pH 7,4 olan 0,01 M fosfat tampon çözeltisinde

çözülmüştür. Enzim çözeltisi her çalışmadan önce taze olarak hazırlanmıştır.

7.6. Tampon Çözeltinin Hazırlanması

Tampon çözeltilerin hazırlanmasında NaH2PO4 (Merck), NaOH (Merck) ve Millipore

destille su kullanılmıştır.

7.7. Glukoz çözeltisinin hazırlanması

Glukoz (Merck) çözeltisi konsantrasyonu 0,5 M olacak şekilde pH’ı 7,4 olan 0,1 M

fosfat tamponunda hazırlanmıştır.

52

7.8. KAuCl4 çözeltisinin hazırlanması

Au3+ çözeltisi katı KAuCl4’ün (Aldrich) 0,01 M KCl çözeltisinde çözülmesiyle

hazırlanmıştır.

7.9. Vinilferrosenin Kimyasal Polimerizasyonu

Polimerizasyon için Carius tüpü kullanılmıştır. 4,24 g vinilferrosen (Aldrich), 5,00 mL

benzen ve katalizör olarak 0,0328 g AIBN (azobisizobutironitril) azot atmosferinde

Carius tüpüne konulmuştur. Elde edilen çözelti birkaç kez sıvı azotta dondurulup

eritilerek gazsızlaştırılmış ve benzen ortamdan uzaklaştırılmıştır. Daha sonra tüp

vakumda kapatılarak 70°C’da 24 saat süre ile polimerizasyon yapılmıştır. Tüpün ağız

kısmı kırılmış ve PVF destile benzende çözülerek dışarı alınmıştır. Çözelti, içinde saf

metil alkol bulunan behere aktarılarak PVF çöktürülmüştür. Birkaç kez benzende

çözme ve metil alkolde çöktürme işlemleri tekrarlanmıştır. Elde edilen çökelek

süzülerek ayrılmış ve vakum etüvünde 24 saat 60°C’da kurutulmuştur (Smith vd.,

1976).

7.10. Serbest Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi

PVF kaplanmış ve ardından Au biriktirilmiş Pt elektrot ve temiz Pt elektrot serbest

enzimin aktivitesinin belirlenmesinde kullanılmıştır. pH’ı 7,4 olan 40,00 mL, 0,1 M

fosfat tamponu elektroliz hücresine konularak O2 ile doyurulmuştur. Daha sonra 5,00

mg GOD enzimi hücreye eklenmiştir. GOD enzimi eklendikten sonra boş çözelti

kararlı hal akım değerine ulaşıncaya kadar beklenmiş ve sonra da her defasında 100 µL

glukoz eklenerek kararlı hal akım değerleri ölçülmüştür. Akım artışı gözlenmeyinceye

kadar glukoz eklenmeye devam edilmiştir.

7.11. Enzim Elektrodunun Hazırlanması

Enzim elektrodunun hazırlanması iki farlı yöntemle yapılmıştır. İlk yöntemde belirli

derişimdeki polivinilferrosen (PVF) çözeltisine daldırılan Pt çalışma elektrodu belirli

53

bir süre bekletilerek elektrodun polimer filmle kaplanması sağlanmıştır. Polimer

filmle kaplanan elektrot glukoz oksidaz (GOD) çözeltisinde bekletilerek enzimin

elektrot yüzeyinde tutuklanması sağlanmıştır. Çalışmamızda bu yöntemle hazırlanan

elektrot PVF-GOD olarak tanımlanmıştır. Hazırlanan PVF-GOD enzim elektroduna

çalışma potansiyeli, PVF derişimi, PVF’de bekletme süresi, enzim derişimi ve

enzimde bekletme süresi gibi deneysel parametrelerin etkisi araştırılmıştır.

İkinci yöntemde enzim elektrot hazırlanırken ilk yöntemde olduğu gibi Pt çalışma

elektrodu polimer film ile kaplanmıştır. PVF kaplanmış elektrot belirli derişimdeki

KAuCl4 çözeltisinde belirli bir süre bekletilerek aşağıdaki reaksiyona göre altının

elektrot yüzeyinde ön deriştirmesi yapılmıştır (Kavanoz vd., 2001).

3PVF + Au+3 → 3PVF+ + Au

Au biriktirilmiş çalışma elektrodu GOD çözeltisinde bekletilerek GOD’ın elektrot

yüzeyinde tutuklanması sağlanmıştır. PVF-GOD enzim elektrodu ile saptanan

optimum koşullar kullanılarak PVF-Au-GOD enzim elektrodunda Au taneciklerinin

etkisi araştırılmıştır. Au taneciklerinin etkisi araştırmak için polimer kaplanmış

elektrotta altın biriktirme işlemi GOD tutuklamadan önce Au biriktirme ve GOD

tutuklanmasından sonra Au biriktirme olarak iki farklı şekilde yapılmıştır. Polimer

kaplı çalışma elektrodunda GOD tutuklandıktan sonra Au biriktirilen elektrot PVF-

GOD-Au şeklinde tanımlanmıştır.

7.12. Enzim Elektrot Aktivitesinin Belirlenmesi

Bu deneylerde çalışma elektrodu olarak daha önce hazırlanan enzim elektrodu

kullanılmıştır. Karşıt elektrot olarak Pt levha, karşılaştırma elektrodu olarak da doygun

kalomel elektrot kullanılmıştır.

Hücreye 40,00 mL tampon konularak hücre etrafındaki ceket sayesinde çözeltinin sabit

sıcaklığa gelmesi sağlanmıştır. Bu işlem yapılırken çözeltiye sabit akış hızında oksijen

gönderilip, böylece çözeltinin oksijence doygunluk derişimine ulaşması beklenmiştir.

54

Sonra kısa oksijen giriş borusu takılarak çözelti üzerinden reaksiyon boyunca oksijen

geçirilmesi ve çözeltinin oksijenle doygunluk derişiminde tutulması sağlanmıştır.

Çalışma voltajı ayarlanarak elektrot amperometrik olarak işleme alınmıştır.

Elektrodu kararlı hale ulaştırmak için substrat içermeyen çözeltide kararlı hal akım

değerine ulaşıncaya kadar sabit gerilimde elektroliz yapılmıştır. Kararlı hal akım

değerine ulaşıldığı zaman ölçüm ortamına bilinen derişimlerdeki substrat (glukoz)

çözeltisinden belli hacimde eklenerek, bu derişime karşılık gelen kararlı hal akım

değeri (enzim elektrot aktivitesi) ölçülmüştür. Daha sonra glukoz çözeltisi ilavesi ile,

ölçüm ortamındaki glukoz derişimi artırılmış ve yeni kararlı hal akım değerinin eldesi

için beklenmiştir. Deneyler sırasında manyetik karıştırıcı kullanılarak karıştırma işlemi

yapılmış, karıştırıcı kapatılarak akımın sabitlenmesi beklenmiş ve bu durumdaki

difüzyon akımı ölçülmüştür. Enzim elektrodunun aktivitesine PVF derişimi, enzim

derişimi, tampon derişimi, pH ve sıcaklık gibi deneysel parametrelerin etkisi

incelenmiştir. Enzim elektrodun tekrar kullanımından kaynaklanabilecek hataların

önüne geçebilmek için deneysel parametrelerin her değiştirilişinde yeni enzim

elektrodu hazırlanarak, enzim elektrodunun en uygun çalışma koşulları belirlenmiştir.

7.13. Kan Numunelerinde Glukoz Tayini

Hazırladığımız enzim elektrot ile gerçek kan numunelerindeki glukoz ölçümü

yapılmıştır. Bu ölçümün yapılması sırasında çalışmamız genelinde tespit edilen

optimum koşullar kullanılarak enzim elektrodunun ilk önce kararlı hal akım değerine

ulaşması sağlanmıştır. Kararlı hal akım değerine ulaşıldığı zaman ölçüm ortamına

bilinmeyen derişimlerdeki kan numunelerinden belli hacimde eklenerek, bu derişime

karşılık gelen kararlı hal akım değeri (enzim elektrot aktivitesi) ölçülmüştür. Daha

sonra derişimi bilinen glukoz çözeltisi ilavesi ile, ölçüm ortamındaki glukoz derişimi

artırılmış ve yeni kararlı hal akım değerinin eldesi için beklenmiştir. Ölçülen akım

değerleri glukoz derişimine karşı grafiğe alınmıştır. Standart ekleme yöntemiyle,

ölçüm sırasındaki miktarlar dikkate alınarak kan numunesi içindeki glukoz miktarı

ölçülmüştür.

55

8. DENEYSEL BULGULAR ve TARTIŞMA

Bu çalışmada PVF modifiye elektrodunu temel alan yeni glukoz enzim elektrotları

geliştirilmiştir. Enzim elektrotlarının hazırlanması iki şekilde gerçekleştirilmiştir.

Bunlardan biri Pt elektrot yüzeyinde oluşturulan PVF filmine GOD enziminin

tutuklanmasıyla hazırlanan ve PVF-GOD enzim elektrodu olarak tanımlanan enzim

elektrodudur. Bu enzim elektrodunun aktivitesine enzim elektrodunun hazırlanması

sırasında kullanılan PVF derişimi, PVF’de bekletme süresi, enzim derişimi, enzimde

bekletme süresi, çalışma pH’ı gibi deneysel parametrelerin etkileri araştırılarak

elektrodun maksimum aktivite gösterdiği koşullar belirlenmiştir.

Bu çalışmada geliştirilen ikinci enzim elektrodu ise Au biriktirilmiş PVF modifiye

elektroduna GOD enziminin tutuklanmasıyla hazırlanan ve PVF-Au-GOD enzim

elektrodu olarak tanımlanan enzim elektrodur. Bu elektrodun hazırlanmasında PVF-

GOD enzim elektrodu için bulunan optimum koşullar kullanılarak yüzeyde altın

biriktirmesinin etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla PVF-Au-GOD enzim elektrodunun

aktivitesine, elektrodun hazırlanması sırasında kullanılan çözeltideki Au3+ derişimi,

Au3+ çözeltisinde bekletme süresi gibi deneysel parametrelerin etkileri araştırılarak

optimum koşullar belirlenmiştir. Ayrıca her iki enzim elektrot için substrat derişimi ve

sıcaklığın etkileri de araştırılarak tutuklanmış enzim sistemi için görünür Michealis-

Menten (Kmg) ve aktivasyon enerjileri (Ea) hesaplanmıştır.

Enzim elektrotların hazırlanmasında GOD enzimi tutuklanmış olarak kullanılmaktadır.

Tutuklama işleminin enzim yapısında herhangi bir deformasyona yol açıp açmadığının

belirlenmesi için yapılan çalışmalar serbest enzim içinde tekrarlanarak serbest enzim

için optimum çalışma koşulları belirlenmiş, Km ve Ea değerleri de hesaplanmıştır.

Bulunan değerler tutuklanmış enzim için bulunan değerlerle karşılaştırılarak

değerlendirilmiştir.

56

8.1. Serbest Glukoz Oksidaz Enzimi İçin Optimum Koşulların ve Kinetik

Parametrelerin Saptanması

Enzim aktivitesini etkileyen en önemli faktörler, ortamın pH’ı, sıcaklığı ve substrat

konsantrasyonudur. Bu nedenle öncelikle bu faktörlerin serbest GOD aktivitesine

etkileri incelenmiştir. Serbest enzim aktivitesinin belirlenmesi bölüm 7.10’da

anlatıldığı şekilde yapılmıştır. Aşağıdaki şekilde görülen cevap eğrileri, glukoz

derişiminin her bir eklemede 1,25 mM artırılmasıyla bulunmuştur. Serbest enzim

aktivitesinin belirlenmesi ile yapılan çalışmalarda kaplanmamış Pt elektrot ve polimer

kaplandıktan sonra Au biriktirilmiş elektrot kullanılmıştır. Şekil 8.1 ve 8.2’de serbest

enzim için elde edilen cevap eğrileri verilmiştir.

Şekil 8.1. Polimer ile kaplandıktan sonra Au biriktirilen elektrot için serbest enzim çalışmasında elde edilen cevap eğrileri (0,1 M 7,4 fosfat tamponu, 5 mg GOD, 25°C).

57

Şekil 8.2. Kaplanmamış elektrot için serbest enzim çalışmasında elde edilen cevap eğrileri (0,1 M 7,4 fosfat tamponu, 5 mg GOD, 25°C).

8.1.1. Serbest Enzim İçin Optimum pH Değerinin Belirlenmesi

Enzimler pH değişimine karşı çok duyarlıdırlar. Genellikle çok fazla asidik ve bazik

ortamda etkisizdirler. Bazı hallerde enzimler en yüksek etkinliği belirli bir pH

derecesinde gösterirler. Bu pH derecesine "Optimum pH" denir. Örneğin, proteini

parçalayan pepsin, midenin pH 2’deki asidik ortamında maksimum aktivite gösterir.

Ortam pH’sı enzimatik reaksiyonların pek çoğunda hızı etkileyen önemli bir faktördür.

Bunun nedeni, enzşmlerin protein yapısında olmalarıdır. pH'a bağlı olarak protein

molekülü üzerinde çeşitli elektrik yüklenmeleri ve buna bağlı olarak dış yüz şekli

(üçüncül yapı) meydana gelmekte ve substratla-enzim uyuşmasını sağlamaktadır.

Kuvvetli asitler ve bazlar enzimleri koagüle ederler. Enzimlerin optimum pH’ları 2-10

arasında değişmektedir. Optimum pH’sı tek bir değerde olan veya çok dar bir aralıkta

değişen enzimlerle çalışılırken, enzim ortamına uygun bir tamponun eklenmesi zorunlu

hale gelmektedir. Enzimlerin optimum pH’sı çeşitli koşullara bağlı olarak değişiklik

gösterebilmektedir. Optimum pH’da değişikliğe neden olan faktörler; enzimin elde

58

edildiği kaynak, enzimin kullanıldığı substratın tipi ve konsantrasyonu, sıcaklık,

kofaktör tipi ve süresi olarak sıralanabilir. Enzimler bütün pH değerlerinde kararlı

değildirler. Her enzimin kararlı kaldığı bir pH aralığı vardır. Bir enzimin optimum

pH’ının deneysel olarak belirlenmesi için daha önceden bu enzimin farklı pH’larda

kararlı olup olmadığı test edilmelidir. Enzimlerin kararlılığını belirlemek için çeşitli

yöntemlerden yararlanılabilmektedir.

Optimum pH değerinin saptanması için farklı pH değerlerinde serbest enzim aktivitesi

belirlenmiştir. Bu çalışmalar sırasında 0,1 M fosfat tamponu kullanılmış ve sıcaklık

25°C’de sabit tutulmuştur. Çalışma elektrodu olarak polimer ile kaplandıktan sonra Au

biriktirilen Pt elektrot kullanılmıştır. Farklı pH değerlerinde glukoz ilavesinden sonra

ölçülen akım değerleri şekil 8.3’de verilmiştir. Şekil 8.3’deki grafikten görüldüğü

üzere maksimum akım değeri pH 7,4’de elde edilmektedir. Enzimlerin genel

özelliklerinden beklendiği gibi optimum değerin dışındaki asidik ve bazik bölgelerde

enzim deaktivasyonu gözlenmektedir.

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10

pH

I/µA

Şekil 8.3. Kaplandıktan sonra Au biriktirilmiş elektrotda serbest enzim için ortamın pH değerinin reaksiyon hızına etkisi (0,1 M fosfat tamponu, 5 mg GOD, 25°C).

59

8.1.2. Substrat Derişiminin Etkisi

Enzim konsantrasyonu ve diğer faktörlerin sabit tutulduğu koşullarda, enzimatik

reaksiyon hızı artan substrat miktarına bağlı olarak belli bir artış göstermekte ve

maksimum bir düzeye eriştikten sonra da sabit kalarak devam etmektedir. Başlangıçta

bu ilişki doğrusal devam etmekte ve daha sonra da hiperbolik bir şekil almaktadır.

Düşük substrat konsantrasyonlarında doğrusal bir ilişki vardır. Buna göre de, reaksiyon

hızı substrat konsantrasyonundaki artışa paralel olarak artışlar göstermektedir. Bu

noktada ortamdaki enzimlerin ancak belli bir kısmı substrat ile birleşebilmektedir. Bu

durum enzimatik reaksiyonun denge sabitinin sonsuz derecede büyük olmamasından

kaynaklanmaktadır. Başlangıçtaki bu ilişkide sınırlayıcı faktör substrat

konsantrasyonudur. Substrat konsantrasyonundaki artış veya düşüşler enzimatik

reaksiyon hızında artış ve düşüşlere neden olur.

PVF’de bekletilerek polimer filmle kaplanan ve ardından Au biriktirilen enzim

elektrot ve temiz Pt elektrotta farklı glukoz derişimleri için elde edilen kararlı hal akım

değerleri ölçülerek glukoz derişiminin enzim aktivitesine etkisi incelenmiştir. Bu

deneyler sırasında 0,1 M pH 7,4 tamponu kullanılmış ve ortam sıcaklığı 25°C olarak

sabit tutulmuştur. Enzimle katalizlenen tepkimelerde Michaelis-Menten kinetiğine

göre substrat derişimi arttıkça reaksiyon hızı artar ve sonuçta sabit bir plato değerine

ulaşır. Bunun sebebi, ortamdaki enzim miktarının sabit olmasıdır. Belli bir substrat

konsantrasyonundan sonra reaksiyon hızı ortamdaki enzim miktarı ile kısıtlandığı için

akım sabit kalmaktadır. Glukoz derişimine karşı gözlenen akım değerleri şekil 8.4 ve

şekil 8.5’de verilmiştir.

60

Şekil 8.4. Polimer ile kaplandıktan sonra Au biriktirilen elektrotta serbest enzim için gözlenen akım değerlerinin glukoz derişimi ile değişimi (0,1 M fosfat tamponu, 5,00 mg GOD, 25°C).

Şekil 8.5. Kaplanmamış elektrotta serbest enzim için gözlenen akım değerlerinin glukoz derişimi ile değişimi (0,1 M fosfat tamponu, 5,00 mg GOD, 25°C).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Cglukoz/mM

I max

/µA

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 10 20 30 40 50

Cglukoz/mM

I max

/µA

61

Serbest enzim için Michealis–Menten sabitinin hesaplanabilmesi için 1/C’ye karşı 1/i

değerleri grafiğe geçirilmiştir. Elde edilen Lineweaver–Burk grafiği şekil 8.6 ve şekil

8.7’de verilmektedir. Bu grafiklere göre serbest enzim için Michealis–Menten sabiti

polimer kaplandıktan sonra altın biriktirilmiş elektrot için KM=43,4 mM glukoz,

kaplanmamış elektrot için ise KM=28,2 mM glukoz olarak bulunmuştur.

Şekil 8.6. Polimer ile kaplandıktan sonra Au biriktirilmiş elektrodun serbest enzim için Lineweaver–Burk grafiği.

Şekil 8.7. Kaplanmamış elektrodun serbest enzim için Lineweaver–Burk grafiği

y = 2,2402x + 0,0516R2 = 0,9752

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14

1/C

1/I

y = 2,5346x + 0,09R2 = 0,9698

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,05 0,1 0,15 0,2

1/C

1/I

62

8.1.3. Sıcaklığın Etkisi

Tepkime hızının yükselmesi, sıcaklıkla doğru orantılıdır. Fakat belirli bir noktadan

itibaren düşmeye başlar ve tamamen durur. Enzimlerin en iyi çalışabileceği sıcaklığa

optimum sıcaklık denir. Yüksek sıcaklıklarda enzimler etkisizdirler (genellikle 55-

60°C'de). Optimum noktanın biraz üzerinde enzimler etkisiz olmasına karşın, sıcaklık

düşünce tekrar etkili hale geçebilirler. Fakat bu sıcaklığın devamı ya da sıcaklığın biraz

daha yükselmesi enzimlerin etkinliğini sonsuz olarak ortadan kaldırır. Enzimler,

proteinlerin bir kısmı gibi üçüncül yapıya sahiptir veya en azından moleküllerinin bir

kısmı bu yapıdadır. Fakat yüksek sıcaklıklarda bu helozonik ya da üçüncül yapı

parçalandığından ya da birbiri üzerine yığıldığından, protein koagüle olur ve enzim

etkisiz hale geçer. Düşük sıcaklıklar enzimin etkinliğini azaltır. 0°C'de enzim ya hiç ya

da pek az işlev gösterir; fakat soğuğun enzimin yapısını bozduğu görülmemiştir.

Sıcaklık eski hale döndüğünde etkinlik yine başlar.

Sıcaklık, enzimlerin hızının yanında kararlılığını etkileyen önemli bir faktördür. Bütün

diğer koşulların sabit tutulduğu koşullarda reaksiyon ortamının sıcaklığı arttıkça

reaksiyon hızı da belli bir noktaya kadar artmaktadır. Bu noktadan sonraki sıcaklık

artışlarında enzim hızında ani düşüşler meydana gelmektedir.

Serbest GOD ile glukoz arasındaki reaksiyonun aktivasyon enerjisinin belirlenmesi

amacıyla farklı ortam sıcaklıklarında elde edilen maksimum akım değerleri

belirlenmiştir. Bu deneylerin yapılması sırasında 0,1 M pH=7,4 tamponu

kullanılmıştır. Sıcaklık 25°C ile 70°C arasında değiştirilmiş ve her bir sıcaklıkta elde

edilen maksimum akım değerleri ölçülmüştür. Elde edilen sonuçlar şekil 8.8’de

görülmektedir. Grafikten görüldüğü gibi akım değerleri kaplanmamış elektrot için

65°C, polimer kaplandıktan sonra Au biriktirilen elektrot için ise 50°C’a kadar

sıcaklıkla artış göstermiştir. Enzimatik reaksiyonların genel davranışı, belli bir

sıcaklığa kadar reaksiyon hızının sıcaklıkla artması ve daha yüksek sıcaklıklarda

enzimin denatüre olması nedeniyle reaksiyon hızının düşmesidir.

63

Şekil 8.8. Serbest enzim için reaksiyon hızının sıcaklıkla değişimi (0,1 M fosfat tamponu, 5,00 mg GOD Enzim, 25°C).

Reaksiyon hızının sıcaklıkla artış gösterdiği aralıktaki deneysel veriler kullanılarak

serbest glukoz oksidaz ile yürütülen reaksiyonun aktivasyon enerjisi Arrhenius

eşitliğinden yararlanılarak bulunmuştur. Bu amaçla 1/T’ye karşı ln imax değerleri

grafiğe geçirilmiştir (Şekil 8.9). Elde edilen doğruların eğimlerinden kaplanmamış

elektrot ve polimer kaplandıktan sonra Au biriktirilen elektrot için aktivasyon enerjileri

sırasıyla 27,83 kJ /mol ve 34,16 kJ /mol bulunmuştur.

0

2

4

6

8

10

12

14

20 30 40 50 60 70 80T/0C

I max

/µA

Kaplandıktan sonra Aubiriktirilmiş Pt elektrotKaplanmamış Ptelektrot

64

Şekil 8.9. Serbest enzim için Arrhenius bağıntısına göre çizilen ln i değerine karşı 1/T grafiği

8.2. Enzim Elektrot Aktivitesine Deneysel Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi

Bu bölümdeki deneyler hazırlanan enzim elektrodunun aktivitesine çeşitli deneysel

parametrelerin etkilerini araştırmak amacıyla yapılmıştır. Farklı şekilde hazırladığımız

enzim elektrotların aktivitesine etkili olabilecek faktörler elektrodun hazırlanması

sırasında kullanılan çözeltideki enzim derişimi, yüzeyde altının biriktirilmesi için

kullanılan çözeltideki Au3+ derişimi, yüzeydeki film kalınlığı ve ölçüm ortamı

koşullarıdır. Substrat derişimi, tampon derişimi, ortam pH’ı, enzim derişimi, enzim

çözeltisinde bekletme süresi, altın derişimi, altında bekletme süresi ve sıcaklık enzim

elektrot aktivitesi üzerinde etkili olabilecek ortam şartları olarak belirlenmiş ve bu

faktörlerin etkileri incelenmiştir. Ayrıca optimum koşullarda hazırlanan farklı enzim

elektrotlarının glukoza verdiği cevaplar araştırılarak enzim elektrotlar için görünür

Michealis-Menten sabitleri hesaplanarak karşılaştırılmıştır. Polimer ile kaplandıktan

y = -4108,3x + 17,52R2 = 0,988

y = -3346,6x + 11,48R2 = 0,9916

0

1

2

3

4

5

6

0,00295 0,003 0,00305 0,0031 0,00315 0,0032 0,00325 0,0033 0,00335 0,00341/T

lni

Polimer ile kaplandıktan sonraAu biriktirilmiş Pt elektrot

Kaplanmamış Pt elektrot

65

sonra Au biriktirilen elektrot için tutuklanmış ve serbest formdaki enzim aktivasyon

enerjileri hesaplanarak karşılaştırılmıştır.

8.3. (PVF-GOD) Enzim Elektrot Aktivitesinin Belirlenmesi

Pt elektrot üzerine kaplanmış PVF yapısına GOD enziminin tutuklanmasıyla

hazırlanan PVF-GOD enzim elektrodunun aktivitesine çeşitli deneysel parametrelerin

etkisi araştırılmıştır. Bu çalışmalar sabit bir çalışma voltajında farklı glukoz derişimleri

için elde edilen kararlı hal akımlarının ölçülmesi ile gerçekleştirilmiştir. Zamana karşı

akım değişimi izlenerek elde edilen cevap eğrileri şekil 8.10’da verilmiştir. Şekil

8.10’dakı eğriler, her defasında 0,8125 mM glukoz eklenerek elde edilmiştir.

Şekilden de görüldüğü gibi GOD eklendiği anda çözeltinin karıştırılmasıyla akımda

artış olmakta, daha sonra ise akım giderek kararlı hal akım değerine ulaşmaktadır. Bu

sırada ölçülen akım difüzyon kontrollü akımdır. GOD eklendikten sonra akımın sabit

hale gelmesi için gereken süre 25-35 saniye arasındadır. Kalibrasyon grafikleri

çizilirken difüzyon kontrollü kararlı hal akım değerleri ölçülmüştür. Şekil 8.10’da

verilen cevap eğrileri O2 ile doygun tampon çözelti ortamında elde edilen cevap

eğrileridir. Enzim elektrodunun davranışı O2’nin uzaklaştırıldığı N2 atmosferinde de

incelenmiştir. N2 atmosferinde elektrodun aktivite göstermediği belirlenmiştir. Bu

sonuca göre enzim elektrodunun cevabı enzimatik reaksiyonlar gereğince oluşan

H2O2’nin yükseltgenme akımının ölçülmesiyle belirlenmektedir.

PVF-GOD enzim elektrodunda Pt elektrot yüzeyine kaplanan PVF yapısında

tutuklanmış GOD enzimi aşağıdaki tepkimeye göre glukozu glukonik asite

yükseltgemektedir.

Glukoz + GOD/FAD Glukonik asit + GOD/FADH2

GOD/FAD ve GOD/FADH2 sırasıyla enzimin indirgenmiş ve yükseltgenmiş

formlarını göstermektedir. Enzimin indirgenmiş formu ortamdaki O2 varlığında tekrar

yükseltgenmektedir.

66

GOD/FADH2 + O2 GOD/FAD + H2O2

Oluşan H2O2 Pt elektrot yüzeyinde

H2O2 O2 + 2H+ + 2e-

tepkimesine yükseltmektedir. Böylece glukoz derişimi ile orantılı olarak üretilen

H2O2’nin yükseltgenme akımının ölçülmesiyle elektrot aktivitesi belirlenmektedir.

Şekil 8.10. PVF-GOD enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile değişimi (0,10 M fosfat tamponu, pH 7,40, 1,00 mg PVF/mL, 25,00 mg GOD/mL enzim, 25°C).

8.3.1. Uygulanan Gerilimin Etkisi

PVF-GOD enzim elektrodunun hazırlanmasında akım cevabını etkileyen faktörlerden

biri uygulanan potansiyeldir. Bu çalışmada, 2 mg/mL PVF’de 5 dakika ve 10 mg

GOD/mL enzim çözeltisinde 15 dakika bekletme süresi sabit tutulmuştur. Elektroda

uygulanan gerilimin elektrot cevabına etkisini belirleyebilmek amacıyla çalışma

67

voltajı, 0,20 V–0,70 V aralığında değiştirilmiştir. Hazırlanan enzim elektrodunun

aktivitesine, uygulanan gerilimin etkisini incelemek amacıyla 0,10 M pH 7,40

tamponu kullanılmıştır. Glukoz ilavesinden sonra elde edilen sonuçlar kullanılarak

uygulanan gerilime karşı maksimum akım değerleri grafiğe geçirilmiştir. Şekil 8.11’de

görüldüğü gibi en yüksek akım 0,6 V gerilim değerinde ölçülmüştür. Bundan sonra

yapılan çalışmalarda 0,6 V gerilim değeri kullanılmıştır.

Şekil 8.11. Uygulanan potansiyelin PVF-GOD elektrot akım cevabına etkisi (0,1 M fosfat tamponu, pH 7,40, 10,00 mg GOD/mL enzim, 2,0 mg PVF/mL , 25°C).

8.3.2. PVF Derişiminin Etkisi

PVF-GOD enzim elektrodunun akım cevabını etkileyen parametrelerden birisi de

kullanılan PVF’nin derişimidir. Bu çalışmada PVF’de bekletme süresi 5 dakika ve

10,00 mg GOD/mL enzim çözeltisinde 15 dakika bekletme süresi sabit tutulmuştur.

PVF derişiminin etkisini belirleyebilmek için çalışma sırasında kullanılan PVF miktarı

0,125 mg/mL ile 2,0 mg/mL PVF derişimleri arasında değiştirilmiştir. Çalışmalarda

0,1 M pH 7,40 tamponu kullanılmıştır. Glukoz ilavesinden sonra gözlenen maksimum

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

E/V SCE'ye karşı

I/µA

68

akım değerleri PVF derişimine karşı grafiğe geçirilmiştir. Şekil 8.12’de görüldüğü gibi

kullanılan PVF derişiminin artmasıyla gözlenen akım değeri artmakta ve 1,0 mg/mL

PVF derişiminde en yüksek değerini almaktadır. 1,0 mg/mL PVF derişiminden sonra

ise akım azalmaktadır. Bundan sonraki yapılan çalışmalarda maksimum cevabın elde

edildiği bir değer olan 1,0 mg PVF/mL derişimi kullanılmıştır.

Şekil 8.12. PVF-GOD enzim elektrot aktivitesinin PVF derişimi ile değişimi (0,10 M fosfat tamponu, pH 7,40, 10,00 mg GOD/mL enzim, 25°C).

8.3.3. PVF’de Bekletme Süresinin Etkisi

PVF-GOD enzim elektrodunun akım cevabını etkileyen bir diğer parametrede

elektrodun PVF çözeltisinde bekletme süresidir. Bu çalışmada PVF’de bekletme

süresinin elektrodun akım cevabına etkisini belirleyebilmek için 10,00 mg GOD/mL

enzim çözeltisinde 15 dakika bekletme süresi sabit tutulmuştur. PVF çözeltisinde

bekletme süresi 1 ile 5 dakika arasında değiştirilmiştir. Kullanılan her bir bekletme

süresi için elektrot aktivitesi incelenmiştir. Glukoz ilavesinden sonra gözlenen

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,5 1 1,5 2 2,5

PVF Derişimi/ mg/mL

I/µA

69

maksimum akım değerleri PVF çözeltisinde bekletme süresine karşı grafiğe

geçirilmiştir. Şekil 8.13’de görüldüğü gibi PVF’de bekletme süresinin artmasıyla

gözlenen akım değeri artmış ve 3 dakika bekletme süresinde en yüksek akım elde

edilmiştir. Bundan sonraki yapılan çalışmalarda PVF çözeltisinde bekletme süresi 3

dakika olarak kullanılmıştır.

Şekil 8.13. PVF-GOD enzim elektrot için PVF çözeltisinde bekletme süresine karşı elde edilen akım değerleri (0,10 M fosfat tamponu, pH 7,40, 1,0 mg PVF/mL, 10,0 mg GOD/mL enzim, 25°C).

8.3.4. Enzim Derişiminin Etkisi

Ölçüm koşullarında PVF-GOD enzim elektrodunun akım değerini etkileyen

parametrelerden biri de polimerik yapı içerisinde tutuklanan GOD miktarıdır.

Tutuklanan enzim miktarı ise tutuklama işlemi sırasında kullanılan çözeltide bulunan

çözünmüş enzim miktarına bağlıdır. Hazırlanan enzim elektrodunun aktivitesine enzim

derişiminin etkisini incelemek amacıyla tutuklama işlemi sırasında kullanılan

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 1 2 3 4 5 6

t/(dakika)

I/µA

70

çözeltideki enzim miktarı 5,00 mg/mL ile 30,00 mg/mL enzim derişimleri arasında

değiştirilmiştir. Enzimde bekletme süresi 15 dakika olarak sabit tutulmuştur.

Kullanılan her bir enzim derişiminde elektrot aktivitesi incelenmiştir. Bu çalışmalar

sırasında 0,10 M pH 7,40 tamponu kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlar kullanılarak

enzim derişimine karşı glukoz ilavesinden sonraki maksimum akım değerleri grafiğe

geçirilmiştir. Şekil 8.14’den görüldüğü gibi tutuklama işlemi sırasında kullanılan

enzim derişiminin artmasıyla gözlenen akım değeri artmakta ve belli bir enzim

derişiminden sonra ise akım değerleri önemli miktarda değişmemektedir. Düşük enzim

derişiminde daha düşük akım değerlerinin elde edilmesi polimerik yapı içerisinde daha

az miktarda enzim tutuklanması nedeniyledir. Belli bir enzim derişiminden sonra ise

polimer yapı içerisinde maksimum miktarda enzim tutuklanmakta ve çözeltideki enzim

miktarının artırılmasıyla polimer yapıda tutuklanan enzim miktarı değişmemektedir.

Bundan sonraki çalışmalarda 25,00 mg GOD/mL enzim çözeltileri kullanılmıştır.

Şekil 8.14. PVF-GOD enzim elektrodunda tutuklama işlemi sırasında kullanılan çözeltideki enzim derişimine karşı elde edilen akım değerleri (0,10 M fosfat tamponu, pH 7,40, 1,0 mg PVF/mL, 25°C).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 5 10 15 20 25 30 35

GOD Derişimi / mg/ml

I/µA

71

8.3.5. Enzimde Bekletme Süresinin Etkisi

PVF-GOD enzim elektrodundan elde edilen akım değerini etkileyen parametrelerden

biri de enzim çözeltisinde bekletme süresidir. Hazırlanan enzim elektrodunun

aktivitesine enzim çözeltisinde bekletme süresinin etkisini incelemek amacıyla

kullanılan enzim çözeltideki bekletme süresi 10 dakika ile 40 dakika arasında

değiştirilmiştir. Kullanılan her bir bekletme süresinde elektrot aktivitesi incelenmiştir.

Bu çalışmalar sırasında 0,10 M pH 7,40 fosfat tamponu kullanılmıştır. Elde edilen

sonuçlar kullanılarak enzim çözeltisinde bekletme süresine karşı glukoz ilavesinden

sonraki maksimum akım değerleri grafiğe geçirilmiştir. Şekil 8.15’de görüldüğü gibi

enzimde bekletme süresinin artmasıyla gözlenen akım değeri artmakta ve belirli bir

bekletme süresinden sonra akım azalmaktadır. Bundan sonra yapılan çalışmalarda

enzim çözeltisinde bekletme süresi 30 dakika olarak kullanılmıştır.

Şekil 8.15. PVF-GOD enzim elektrodunda tutuklama işlemi sırasında kullanılan enzim çözeltisinde bekletme süresine karşı elde edilen akım değerleri (0,10 M fosfat tamponu, pH 7,40, 1,00 mg PVF/mL, 25,00 mg GOD/mL enzim, 25°C).

0,56

0,58

0,6

0,62

0,64

0,66

0,68

5 10 15 20 25 30 35 40 45

t(dakika)

I/µA

72

8.3.6. Çalışma pH’ının Etkisi

PVF-GOD enzim elektrodunun aktivitesine ortam pH’ının etkisini araştırmak amacıyla

pH 5,38–9,00 arasında değişen 0,10 M tampon çözeltisinde glukoz ilavesinden sonra

elde edilen maksimum akım değerleri ölçülmüştür. Farklı pH değerlerinde glukoz

ilavesinden sonra ölçülen maksimum akım eğrileri şekil 8.16’da görülmektedir. Bu

grafikte enzim elektrodunun maksimum aktivite gösterdiği pH değeri 7,40 olarak

belirlenmiştir.

Şekil 8.16. PVF-GOD enzim elektrodunda kullanılan tampon çözelti pH’sına bağlı olarak elde edilen akım değerleri (0,10 M fosfat tamponu, 1,00 mg PVF/mL, 25,00 mg GOD/mL enzim, 25°C).

8.3.7. PVF-GOD Enzim Elektroduna Substrat Derişiminin Etkisi

Hazırlanan enzim elektrodu ile yapılan ölçümlerin tutarlı bir şekilde yapılabilmesinin

ilk koşulu çalışma ortamındaki substrat derişimi ile orantılı akım değerlerinin elde

edilmesidir. Bu koşulun sağlandığı substrat derişim aralığı enzim elektrodunun

doğrusal çalışma aralığı olarak tanımlanır ve bu aralığın geniş olması istenir. PVF-

GOD elektrodu maksimum aktivitesinin ve doğrusal çalışma aralığının saptanması için

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5

pH

I/µA

73

ölçülen akım değerlerine substrat derişimi etkisi incelenmiştir. Daha önce saptanan

optimum koşullarda hazırlanan PVF-GOD enzim elektrodunun 0,10 M pH 7,40 fosfat

tamponunda ve 25°C sıcaklıkta farklı glukoz derişimlerinde verdiği akım değerleri

saptanmıştır. Ölçülen akım değerlerinin glukoz derişimi ile değişimi şekil 8.17’de

verilmiştir.

Şekil 8.17. (a) PVF-GOD enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile değişimi (0,1 M fosfat tamponu, pH 7,40, 1,0 mg PVF/mL, 25,00 mg GOD/mL enzim, 25°C).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 5 10 15 20 25 30

Cglukoz/mM

I max

/µA

74

Şekil 8.17. (b) PVF-GOD enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile değişimini veren doğrusal çalışma aralığı.

Şekil 8.17. a/b den görüldüğü gibi geliştirilen enzim elektrodu 14,60 mM’a kadar

glukoz derişimi ile orantılı akım değerleri vermektedir. Bu nedenle hazırlanan PVF-

GOD enzim elektrodunun pratik kullanım aralığı 14,60 mM’a kadar glukoz derişimi

olarak belirlenmiştir. Diğer taraftan glukoz derişimine karşılık elektrot cevabı yaklaşık

15,78 mM civarında sabit değere ulaşmakta ve daha yüksek derişimlerde akım

değerinde bir artış olmamaktadır. Bu durum hazırlanan elektrot için ölçüm ortamındaki

koşullarda 15,78 mM glukoz derişiminde, polimer film içerisindeki enzimin substrata

karşı doygunluğa ulaştığını göstermektedir. Dolayısıyla bu koşullarda 15,78 mM ve

daha yüksek glukoz derişimin de elektrot aktivitesinde difüzyon kısıtlamasının önemi

olmayacaktır.

Polimer yapıda difüzyon kısıtlaması olup olmadığını ortaya koymak amacıyla çeşitli

glukoz derişimlerinde alınan akım değerleri kullanılarak tutuklanmış enzim için de

görünür Michaelis-Menten (KM) sabiti tayin edilmiştir (Şekil 8.18).

R2 = 0,9952

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 5 10 15 20 25

C(mM)

Imax

/µA

75

Şekil 8.18. Tutuklanmış enzim için Lineweaver-Burk grafiği.

Şekil 8.18’deki verilere göre yapılan hesaplamalar sonucu PVF kaplanmış Pt çalışma

elektrodunda tutuklanan enzim için KM=20,38 mM glukoz değeri bulunmuştur.

8.4. PVF-Au-GOD Enzim Elektrot Aktivitesinin Belirlenmesi

Hazırladığımız enzim elektrotta altının etkisini anlamak için altın biriktirme işlemi iki

farklı yoldan yapılmıştır.

- İlk yöntemde polimer film ile kaplanan çalışma elektroduna Au biriktirilip daha sonra

GOD tutuklanmıştır (PVF-Au-GOD).

- İkinci yöntemde ise polimer film ile kaplanan elektrotta GOD tutuklanmış, Au

biriktirme işlemi GOD tutuklanmış elektrot üzerine yapılmıştır (PVF-GOD-Au).

y = 7,582x + 0,3719R2 = 0,9837

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

1/C

1/I

76

PVF-GOD-Au enzim elektrodunun glukoza cevap vermediği bulunmuştur. Bunun

nedeni polimer –enzim tabakasının üzerinin Au filmi ile kaplanmasıdır. Elektrodun en

dış katmanındaki Au filmi glukozun film içerisine difüzlenmesini engellemektedir.

Dolayısıyla glukozun enzim ile reaksiyonu gerçekleşmemekte ve bunun sonucunda bir

akım artışı da gözlenememektedir.

PVF-Au-GOD enzim elektrodunda ise glukoz eklenmesi ile akımda hızlı bir artış

olmakta, daha sonra ise akım azalarak kararlı-hal akımları oluşmaktadır. Elektrot

aktivitesinin belirlenmesinde bu durumdaki difüzyon kontrollü akım değerleri

ölçülmüştür. Glukozun eklenmesi ile kararlı-hal akım değerlerinin oluşması arasında

geçen süre 50-90 saniye arasındadır. Bu değer hazırlanan enzim elektrodunun cevap

süresi olarak belirlenmiştir.

Şekil 8.19’da görülen cevap eğrileri O2 atmosferinde elde edilen cevaplardır.

Literatürde verilen bazı çalışmalarda Au nanoparçacıklarının GOD/FAD için redoks

aracısı olarak davrandığı belirtilmiştir (Chen vd., 1998). Bu nedenle PVF-Au-GOD

enzim elektrodunun aktivitesi N2 atmosferinde de incelenmiş ve N2 atmosferinde

enzim elektrodunun aktivite göstermediği bulunmuştur. Yani PVF-Au-GOD enzim

elektrodunun aktivitesi de enzimatik reaksiyonlar sonucu oluşan H2O2’nin

yükseltgenme akımının ölçülmesiyle belirlenmektedir. Modifiye yüzeydeki Au

GOD/FADH2 için redoks aracısı olarak davranmamaktadır. Bunun yanında PVF-Au-

GOD enzim elektrodu ile elde edilen cevaplar PVF-GOD enzim elektrodunda elde

edilen cevapların yaklaşık olarak 2 katıdır.

Pt elektrot üzerine kaplanmış PVF yapısına altın biriktirilip, GOD enziminin

tutuklanmasıyla hazırlanan PVF-Au-GOD enzim elektrodunun aktivitesine Au

derişimi, Au çözeltisinde bekletme süresi, çalışma potansiyeli, ortam pH, sıcaklık

etkisi araştırılmıştır. PVF-Au-GOD enzim elektrodu ile yapılan çalışmalarda diğer

parametreler için PVF-GOD enzim elektrodu ile bulunan optimum değerler

kullanılmıştır.

77

PVF-Au-GOD enzim elektrodu için zamana karşı akım değişimi izlenerek elde edilen

cevap eğrileri şekil 8.19’da verilmiştir. Şekil 8.19’daki eğriler, her defasında 1,25 mM

glukoz eklenerek elde edilmiştir.

Şekil 8.19. PVF-Au-GOD enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile değişimi (0,10 M fosfat tamponu, pH 7,40, 1,00 mg PVF/mL, 4 mM KAuCl4, 25,00 mg GOD/mL enzim, 25°C).

Hazırladığımız PVF-GOD ve PVF-Au-GOD enzim elektrotlarının farklı glukoz

derişimlerindeki cevabı dönüşümlü voltametri yöntemiyle de incelenmiştir. Şekil

8.20’de PVF-GOD ve PVF-Au-GOD enzim elektrotlarının dönüşümlü

voltomogramları verilmiştir. Voltomogramlardan görüldüğü gibi PVF-Au-GOD enzim

elektrodu ile elde edilen akım değeri PVF-GOD enzim elektrodu ile elde edilen akım

değerinden daha yüksektir. Ayrıca pik potansiyeli de PVF-GOD enzim elektrodunda

elde edilen pik potansiyeline göre daha küçük değerlere kaymıştır. Bu gözlemler

amperometrik çalışmalarda elde edilen sonuçlarla uyumludur.

78

Şekil 8.20. ( ___ ) PVF-GOD enzim elektrodunun dönüşümlü voltomogramı. (…....) PVF-Au-GOD enzim elektrodunun 15,4 mM glukoz ilavesinden

sonraki dönüşümlü voltomogramı. (…...) PVF-Au-GOD enzim elektrodunun dönüşümlü voltomogramı. ( ) PVF-GOD enzim elektrodunun15,4 mM glukoz ilavesinden son-raki dönüşümlü voltomogramı.

Hazırlanan enzim elektrodunun cevabı enzimatik reaksiyonlar sonucunda oluşan

H2O2’nin yükseltgenme akımının ölçülmesiyle belirlenmiştir. Elektrot yüzeyinde PVF

kaplamanın ve Au biriktirmenin H2O2’nin yükseltgenmesine etkisini araştırmak

amacıyla temiz Pt elektrot, PVF kaplanmış Pt elektrot, PVF kaplanmış Au biriktirilmiş

Pt elektrotta H2O2’nin voltametrik davranışı incelenmiştir. Her üç elektrot için 0,044

mM H2O2 ilavesiyle elde edilen dönüşümlü voltomogramlar şekil 8.21’de verilmiştir.

79

Şekil 8.21. ( _____ ) H2O2 eklenmemiş dönüşümlü voltomogram ( ) Temiz Pt elektrotta H2O2’nin voltametrik davranışı ( ) PVF kaplanmış Au biriktirilmiş Pt elektrotta H2O2’nin voltamet-

rik davranışı ( ) PVF kaplanmış Pt elektrotta H2O2’nin voltametrik davranışı

Voltomogramlardan görüldüğü gibi kaplanmamış Pt elektrot ve PVF kaplanmış Pt

elektrotta gözlenen pik akımı değerleri aynıdır. Fakat PVF kaplanmış Au biriktirilmiş

Pt elektrotda pik akımı değerleri çok daha büyüktür. Bu gözlem yüzeyde biriktirilmiş

altının H2O2’nin yükseltgenmesini katalizlediğini göstermektedir.

8.4.1. Uygulanan Gerilimin Etkisi

PVF-Au-GOD enzim elektrodunun hazırlanmasında akım cevabını etkileyen

faktörlerden biri uygulanan potansiyeldir. Bu çalışmalar sırasında 0,10 M pH 7,40

fosfat tamponu kullanılmıştır. Ayrıca PVF derişimi, PVF’de bekletme süresi, enzim

80

derişimi ve enzimde bekletme süresi PVF-GOD enzim elektrodu ile yapılan

çalışmalarda saptanan optimum değerler kullanılmıştır. KAuCl4 çözeltisinde bekletme

süresi 5 dakika olarak sabit tutulmuştur. Elektroda uygulanan gerilimin elektrot

cevabına etkisini belirleyebilmek amacıyla çalışma voltajı, 0,40 V – 0,60 V aralığında

değiştirilmiştir. Glukoz ilavesinden sonra elde edilen sonuçlar kullanılarak uygulanan

gerilime karşı maksimum akım değerleri grafiğe geçirilmiştir. Şekil 8.22’de görüldüğü

gibi en yüksek akım 0,5 V gerilim değerinde ölçülmüştür. Bundan sonra yapılan

çalışmalarda 0,5 V gerilim değeri kullanılmıştır.

Şekil 8.22. Uygulanan potansiyelin PVF-Au-GOD enzim elektrot akım cevabına etkisi (0,1 M fosfat tamponu, pH 7,40, 25,00 mg GOD/mL enzim, 1 mM KAuCl4, 1,0 mg PVF/mL, 25°C).

8.4.2. KAuCl4 Derişiminin Etkisi

Hazırlanan PVF-Au-GOD enzim elektroduna KAuCl4 derişiminin etkisini belirlemek

için KAuCl4 derişimi 1 mM ile 8 mM arasında değiştirilmiştir. Kullanılan her bir

derişimde elektrot aktivitesi incelenmiştir. Bu çalışmalar sırasında 0,10 M pH 7,40

fosfat tamponu kullanılmıştır. Ayrıca PVF derişimi, PVF’de bekletme süresi, enzim

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 0,6 0,65

V

I/µA

81

derişimi ve enzimde bekletme süresi için PVF-GOD enzim elektrodu ile yapılan

çalışmalarda saptanan optimum değerler kullanılmıştır. KAuCl4 çözeltisinde bekletme

süresi 3 dakika olarak sabit tutulmuştur. Elde edilen sonuçlar kullanılarak farklı

KAuCl4 derişimine karşı glukoz ilavesinden sonraki maksimum akım değerleri grafiğe

geçirilmiştir. Şekil 8.23’de görüldüğü gibi KAuCl4 çözelti derişiminin artmasıyla

gözlenen akım değeri artmakta ve belirli bir derişimden sonra akım azalmaktadır.

Bundan sonra yapılan çalışmalarda 4 mM KAuCl4 derişimi kullanılmıştır.

Şekil 8.23. PVF-Au-GOD enzim elektrodunda kullanılan KAuCl4 derişimine karşı elde edilen akım değerleri (0,10 M fosfat tamponu, pH 7,40, 1,00 mg PVF/mL, 25,00 mg GOD/mL enzim, 25°C).

8.4.3. KAuCl4 Çözeltisinde Bekletme Süresinin Etkisi

Hazırlanan PVF-Au-GOD enzim elektrodunun akım cevabını etkileyen bir diğer

parametre ise KAuCl4 çözeltisinde bekletme süresidir. KAuCl4 çözeltisinde bekletme

süresi etkisini belirlemek için bekletme süresi 15 saniye ile 5 dakika arasında

değiştirilmiştir. Kullanılan her bir bekletme süresinde elektrot aktivitesi incelenmiştir.

Bu çalışmalar sırasında 0,10 M pH 7,40 fosfat tamponu kullanılmıştır. Elde edilen

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

KAuCl4 Derişimi / mM

I/µA

82

sonuçlar kullanılarak farklı bekletme sürelerine karşı glukoz ilavesinden sonraki

maksimum akım değerleri grafiğe geçirilmiştir. Şekil 8.24’de görüldüğü gibi KAuCl4

çözeltinde bekletme süresinin artmasıyla gözlenen akım değeri artmakta ve belirli bir

bekletme süresinden sonra akım azalmaktadır. Bundan sonra yapılan çalışmalarda 30

saniyelik bekletme süresi kullanılmıştır.

Şekil 8.24. PVF-Au-GOD enzim elektrodunda kullanılan KAuCl4 çözeltisinde bekletme süresine karşı elde edilen akım değerleri (0,10 M fosfat tamponu, pH 7,40, 1,00 mg PVF/mL, 4 mM KAuCl4, 25,00 mg GOD/mL enzim, 25°C).

8.4.4. PVF-Au-GOD Enzim Elektroduna Substrat Derişiminin Etkisi

Hazırlanan PVF-Au-GOD elektrodunun maksimum aktivitesinin ve doğrusal çalışma

aralığının saptanması için ölçülen akım değerlerine substrat derişimi etkisi

incelenmiştir. Daha önce saptanan optimum koşullarda 0,10 M pH 7,40 fosfat

tamponunda ve 25°C sıcaklıkta farklı glukoz derişimlerinde verdiği akım değerleri

saptanmıştır. PVF-Au-GOD ölçülen akım değerlerinin glukoz derişimi ile değişimi

şekil 8.25’de verilmiştir.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 1 2 3 4 5 6

t(dakika)

I/µA

83

Şekil 8.25. PVF-Au-GOD enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile değişimi (0,1 M fosfat tamponu, pH 7,40, 1,0 mg PVF/mL, 4 mM KAuCl4, 25,00 mg GOD/mL enzim, 25°C).

Şekil 8.26. PVF-Au-GOD enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile değişimini veren doğrusal çalışma aralığı (0,1 M fosfat tamponu, pH 7,40, 1,0 mg PVF/mL, 4 mM KAuCl4, 25,00 mg GOD/mL enzim, 25°C).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 5 10 15 20 25 30

Cglukoz/mM

I max

/µA

y = 0,1219x + 0,0638R2 = 0,9945

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 5 10 15 20

Cglukoz/mM

I max

/µA

84

Şekilden de görüldüğü gibi hazırlanan PVF-Au-GOD enzim elektrodu 21,58 mM’a

kadar glukoz derişimi ile orantılı akım değerleri vermektedir. Bu nedenle hazırlanan

PVF-Au-GOD enzim elektrodunun pratik kullanım aralığı 21,58 mM’a kadar glukoz

derişimi olarak belirlenmiştir. Diğer taraftan glukoz derişimine karşılık elektrot cevabı

PVF-Au-GOD enzim elektrodu için 27,25 mM civarında sabit değere ulaşmakta ve

daha yüksek derişimlerde akım değerinde bir artış olmamaktadır. Hazırlanan enzim

elektrot ile 2,4.10-5 M glukoz derişiminde 0,0008 µA akım değeri elde edilmiştir.

Polimer yapıda difüzyon kısıtlaması olup olmadığını ortaya koymak amacıyla çeşitli

glukoz derişimlerinde alınan akım değerleri kullanılarak PVF-Au-GOD enzim

elektrodu için görünür Michaelis-Menten (Kmg) sabitleri tayin edilmiştir (şekil 8.27).

Şekil 8.27. PVF-Au-GOD enzim elektrot için Lineweaver-Burk grafiği (0,1 M fosfat tamponu, pH 7,40, 1,0 mg PVF/mL, 4 mM KAuCl4, 25,00 mg GOD/mL enzim, 25°C)

Şekil 8.27’deki verilere göre yapılan hesaplamalar sonucu PVF-Au-GOD enzim

elektrotta tutuklanmış enzim için Kmg=30,4 mM glukoz değeri bulunmuştur.

y = 6,0483x + 0,1992R2 = 0,9882

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14

1/C

1/I

85

8.4.5. Sıcaklık Etkisi

GOD enzimi ile glukoz arasındaki reaksiyonun aktivasyon enerjisinin belirlenmesi

amacıyla farklı ortam sıcaklıklarında elde edilen maksimum akım değerleri

belirlenmiştir. Bu deneylerin yapılması sırasında 0,10 M pH 7,40 fosfat tamponu

kullanılmıştır. Bu çalışmalarda PVF-Au-GOD ve PVF-GOD enzim elektrotları

kullanılmıştır. PVF-Au-GOD enzim elektrodu için sıcaklık 20°C ile 60°C arasında,

PVF-GOD enzim elektrodu için ise sıcaklık 25°C ile 45°C arasında değiştirilmiş ve

her bir sıcaklıkta elde edilen maksimum akım değerleri ölçülmüştür. Elde edilen

sonuçlar şekil 8.28’de görülmektedir. Grafikte görüldüğü gibi en yüksek akım değeri

PVF-Au-GOD enzim elektrodu için 50°C, PVF-GOD enzim elektrodu için ise

35°C’de elde edilmiştir. Enzimatik reaksiyonlarda gözlenen davranışlara göre belli bir

sıcaklığa kadar reaksiyon hızı sıcaklıkla artmakta, daha yüksek sıcaklıklarda ise

enzimin sıcaklıkla denatüre olması nedeniyle reaksiyon hızı düşmektedir.

Şekil 8.28. Tutuklanmış GOD enzimi için reaksiyon hızının sıcaklıkla değişimi (0,10 M fosfat tamponu, pH 7,40, 1,00 mg PVF/mL enzim, 4 mM KAuCl4, 25,00 mg GOD/mL enzim, 25°C).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

15 25 35 45 55 65

T/0C

I max

/µA PVF-Au-GOD Enzim

ElektroduPVF-GOD EnzimElektrodu

86

Reaksiyon hızının sıcaklıkla artış gösterdiği aralıktaki deneysel veriler kullanılarak

tutuklanmış GOD ile yürütülen reaksiyonun aktivasyon enerjisi Arrhenius eşitliğinden

yararlanılarak bulunmuştur. Bu amaçla 1/T’ye karşı ln i değerleri grafiğe geçirilmiştir

(Şekil 8.29). Elde edilen doğruların eğiminden PVF-Au-GOD için aktivasyon enerjisi

24,89 kJ/mol, PVF-GOD için ise 24,05 kJ/mol olarak bulunmuştur.

Şekil 8.29. (…..) PVF-Au-GOD enzim elektrodu için Arrhenius grafiği ( __ ) PVF-GOD enzim elektrodu için Arrhenius grafiği (0,10 M fosfat tamponu, pH 7,40, 1,00 mg PVF/mL, 4 mM KAuCl4, 25,00 mg GOD/mL enzim, 1,00 mg PVF/mL, 25oC).

8.5. Geliştirilen Elektrodun Uzun Süreli Kararlılığı

Enzim elektrotlarında aranan en önemli özelliklerden biri de elektrodun uzun ömürlü

olmasıdır. Bu çalışmada enzim elektrodun aktivitesinin uzun süre korunduğu

gözlenmiştir. Elektrodun aktivitesi belirlenen optimum koşullarda ölçülmüş ve enzim

elektrodu kullanılmadığı zamanlarda çalışma tamponu içinde +4°C’de buzdolabında

y = -2993,3x + 11,578R2 = 0,9462

y = -2893,7x + 9,8683R2 = 0,9995

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0,00305 0,0031 0,00315 0,0032 0,00325 0,0033 0,00335 0,0034 0,00345

1/T

lni

87

muhafaza edilmiştir. Aynı elektrodun aktivitesine bir hafta ara ile 51 gün süresince

bakılmıştır. Bu süre sonunda maksimum akım değeri 0,935 µA’de sabitlenmiştir. Elde

edilen sonuçlar kullanılarak zamana karşı maksimum akım değerleri grafiğe

geçirilmiştir (Şekil 8.30). Çalışma boyunca 51 gün içerisinde 187 ölçüm

gerçekleştirilmiştir. Bu süre boyunca ilk 15 gün içerisinde elektrot aktivitesinin

azaldığı bundan sonra ise elektrot aktivitesinde önemli bir azalma olmadığı

belirlenmiştir. 51. günde enzim elektrot aktivitesi başlangıçtakinin %13’ü kadardır.

Şekil 8.30. Aynı elektrot ile farklı günlerde alınan maksimum akım değerleri (25°C, 0,1 M Tampon, pH 7,4).

PVF-Au-GOD enzim elektrodu ile 51. günde yapılan ölçümde doğrusal çalışma

aralığının 9,8 mM’a kadar olduğu şekil 31’den görülmektedir. Bu sonuç hazırlanan

elektrodun kullanılabilirliği açısından önemlidir.

0

1

2

3

4

5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

günler

I max

/µA

88

Şekil 8.31. 51. günde PVF-Au-GOD enzim elektrot aktivitesinin glukoz derişimi ile değişimini veren doğrusal çalışma aralığı

8.6. Girişimler

Ölçüm ortamında bulunabilecek bazı maddelerin hazırlanan enzim elektrodundaki

cevapları incelenmiştir. Bu çalışmada glukoz derişimi ve girişim yapabilecek

maddelerin derişimleri 5,0 mM’da sabit tutulmuştur. Ölçüm ortamında bulunabilecek

ve girişim yapabilecek maddeler metanol, etanol, sukroz, dietanolamin, trietanolamin,

asetilkolin, formaldehit ve askorbik asit olarak belirlenmiştir. Bu amaçla 5,0 mM

glukoz için kararlı hal akım değeri elde edildikten sonra hücreye girişim yapabilecek

madde eklenmiş ve akımdaki değişim ölçülmüştür. Bu maddelerin çoğu hazırlanan

enzim elektrodunda bir girişime neden olmamıştır. İncelenen maddeler içerisinde

sadece askorbik asitin girişim yaptığı belirlenmiştir. Ortamda 4,3.10-7 M kadar

askorbik asit bulunması hiçbir girişime neden olmamaktadır. Ortamda askorbik asitin

bulunması 4,3.10-7 M’dan sonra girişime neden olmaktadır. 4,95.10-3 M glukoz

ortamında 4,3.10-7 M askorbik asitin yaptığı girişim %1,44 tür.

y = 0,0414x + 0,027R2 = 0,9919

00,05

0,10,15

0,20,25

0,30,35

0,40,45

0,5

0 2 4 6 8 10 12

Cglukoz/mM

Imax

/µA

89

8.7. Geliştirilen Elektrodun Gerçek Numunelerde Kullanımı

Biyosensörler sağlık alanında çeşitli tıbbi teşhislerde (glukoz, fruktoz, laktat, üre,

kolestrol) kan analizleri ile çeşitli hastalıkların teşhisi ve tedavisi amacıyla

kullanılmaktadır. Genellikle şeker hastalarına kandaki glukoz seviyesine göre, dışardan

insülin hormonu verilir. Burada önemli olan glukoz konsantrasyonunun hızlı ve hassas

olarak ölçümüdür. Geliştirdiğimiz PVF-Au-GOD enzim elektrodu ile kan

numunelerindeki glukoz ölçümü gerçekleştirilmiştir. Şekil 8.32’de bu deneyde elde

edilen cevap eğrileri verilmiştir. Bu şekilde ilk iki ekleme ölçüm ortamına kan

eklenmesiyle elde edilen cevaplardır. Burada birinci eklemede 100 µL, ikinci

eklemede ise 200 µL’lik kan eklenmiştir. Daha sonraki eklemeler ise 0,943 mM

glukoz eklenmesiyle elde edilmiştir. Bu değerlerden yararlanılarak standart ekleme

yöntemiyle kanda glukoz tayini yapılmıştır. Çalışılan beşinci kan numunesi için elde

edilen standart ekleme grafiği şekil 8.33’de verilmiştir.

Şekil 8.32. PVF-Au-GOD enzim elektrot ile kanda glukoz tayini için elde edilen cevap eğrileri (5 nolu kan örneği).

90

Elde edilen sonuçlar hastane sonuçları ile karşılaştırılmıştır. PVF-Au-GOD enzim

elektrodu ile yaptığımız ölçüm sonuçları ve hastane sonuçları çizelge 8.1’de

verilmiştir.

Çizelge 8.1. PVF-Au-GOD enzim elektrodu ile yapılan ölçüm sonuçları ve hastane sonuçları Numune No Hastane Sonuçları

PVF-Au-GOD enzim elektrodu ile

yaptığımız ölçüm sonuçları

1 128 mg/dL 127,6 mg/dL

2 91 mg/dL 91,55 mg/dL

3 83 mg/dL 82,15 mg/dL

4 141 mg/dL 141,5 mg/dL

5 106 mg/dL 104,2 mg/dL

Sonuçlar incelendiğinde geliştirdiğimiz enzim elektrodu ile bulunan sonuçların hastane

değerleriyle uyumlu olduğu görülmektedir.

Ayrıca PVF-Au-GOD enzim elektrodu ile kan numunelerinde bulunan glukoz

değerleri hastane değerlerine karşı grafiğe geçirilmiştir (Şekil 8.34). Grafikten

görüldüğü gibi doğrunun eğimi yaklaşık olarak 1,0 ve R2 değeri 0,9991 olarak

bulunmuştur. Bu değerler de geliştirilen enzim elektrodunun gerçek numuneler için

kullanılabileceğini göstermektedir.

y = 1,0107x - 1,4803R2 = 0,999

70

80

90

100

110

120

130

140

150

70 90 110 130 150Hastane sonuçları

PVF-

Au-

GO

D E

nzim

ele

ktro

tla e

lde

edile

n so

nuçl

ar

91

Şekil 8.33. Hastane sonuçlarına karşı PVF-Au-GOD enzim elektrotla elde edilen sonuçlar

92

9. SONUÇLAR

Glukoz tayini yapmak amacıyla yeni bir enzim elektrodunun geliştirildiği bu çalışmada

elde edilen sonuçlar aşağıda verilmiş ve diğer çalışmalarla karşılaştırılarak

eleştirilmiştir.

Hazırladığımız enzim elektrodunda GOD enzimi tutuklanmış olarak kullanılmıştır.

Çalışmanın ilk aşamasında, hazırlanan enzim elektroduna referans oluşturmak üzere

GOD enzimi için optimum çalışma koşulları araştırılmış ve serbest enzim için bazı

kinetik parametreler hesaplanmıştır. Enzim elektrodunun hazırlanmasında GOD

enzimi PVF kaplanmış elektrotta ve PVF kaplanmış Au biriktirilmiş Pt elektrotta

tutuklanmıştır. Serbest enzim için yapılan çalışmalar kaplanmamış Pt ve PVF

kaplanmış Au biriktirilmiş Pt elektrot için ayrı ayrı yapılmıştır. Maksimum aktivitenin

gözlendiği pH 7,4 olarak bulunmuştur. Maksimum aktivitenin gözlendiği sıcaklık ise

kaplanmamış elektrot için 65°C, PVF kaplanıp Au biriktirilmiş Pt elektrot için ise

50°C bulunmuştur. Yapılan bu çalışmalar sonucunda serbest GOD enziminin glukozla

reaksiyonu için Arrhenius grafikleri çizilmiştir. Bu reaksiyonun aktivasyon enerjisi

kaplanmamış Pt için 27,83 kJ/mol, PVF kaplanıp Au biriktirilmiş Pt elektrot için ise

34,16 kJ/mol olarak bulunmuştur. KM değerleri ise kaplanmamış Pt elektrot için 28,2

mM, PVF kaplanıp Au biriktirilmiş Pt elektrot için ise 43,4 mM olarak bulunmuştur.

Çalışmanın ilk aşamasında Pt elektrot yüzeyinde kaplanmış PVF üzerine glukoz

oksidaz (GOD) tutuklanmıştır. PVF-GOD olarak tanımladığımız elektrotla PVF

derişimi (1,0 mg/mL), PVF’de bekletme süresi (3 dakika), enzim derişimi (25,00

mg/mL), enzimde bekletme süresi (30 dakika) olarak saptanmıştır. Çalışmalar O2

atmosferinde yapılmıştır.

Çalışmada daha sonra polimer ile kaplanmış Pt elektrot yüzeyinde Au biriktirilerek

ardından glukoz oksidaz (GOD) tutuklanmıştır. PVF-Au-GOD enzim olarak

tanımladığımız bu elektroda Au’nun etkisi araştırılmıştır. Bu çalışmalarda PVF-GOD

enzim elektrodu ile saptanan optimum koşullar kullanılmıştır. Bunun için Au

biriktirme işlemi, PVF kaplanmış Pt çalışma elektrodunda GOD tutuklandıktan sonra

93

da yapılmıştır. Çalışmamızda bu elektrot PVF-GOD-Au enzim elektrodu olarak

tanımlanmıştır. Elde edilen sonuçlardan Au’nun GOD tutuklandıktan sonra

biriktirildiğinde, Au tanecikleri GOD’ın tutuklanmış polimer matriks yüzeyinde

birikerek glukoz oksidaz ile glukoz arasındaki reaksiyonu engellediği saptanmıştır.

Hazırlanan PVF-Au-GOD enzim elektrodunun aktivitesine sıcaklığın etkisi incelenmiş

ve maksimum aktivitenin gözlendiği sıcaklık 50°C olarak bulunmuştur. Enzimin

substratına doygun olduğu glukoz derişiminde sıcaklık artmasıyla aktivitenin arttığı

bölgedeki verilerin Arrhenius bağıntısına göre değerlendirilmesiyle PVF-Au-GOD

enzim elektrodunda glukoz oksidaz ile glukoz arasındaki reaksiyonun aktivasyon

enerjisi 24,89 kJ/mol, PVF-GOD enzim elektrodunda ise 24,05 kJ/mol olarak

bulunmuştur. Glukoz derişiminin etkisinin incelenmesi sırasında elde edilen veriler

kullanılarak Lineweaver-Burk grafikleri çizilmiştir. PVF-Au-GOD enzim elektrodu ve

PVF-GOD enzim elektrodunda tutuklanmış enzimin pH’ı 7,4 olan 0,1 M fosfat

tamponunda ve 25°C'da görünür Michealis-Menten sabitleri (Kmg) sırasıyla 30,4 mM

ve 20,38 mM glukoz olarak bulunmuştur.

Hazırlanan tüm elektrotlar için yapılan çalışmalar N2 ortamında da denenmiş fakat O2

ortamında elde edilen akım artışları gözlenmemiştir. Elde edilen sonuçlar glukoz

oksidaz ile glukoz arasındaki reaksiyonun oksijen aracılığı ile gerçekleştiğini

göstermektedir.

Serbest enzim sistemi için bulunan Ea değerleri kaplanmamış Pt elektrotta 27,83

kJ/mol, PVF kaplanıp Au biriktirilmiş için 34,16 kJ/mol, tutuklanmış enzim sistemi

için ise PVF-GOD elektrotta 24,05 kJ/mol, PVF-Au-GOD elektrodunda 24,89 kJ/mol

olarak bulunmuştur. Serbest enzim ve tutuklanmış enzim reaksiyonları için bulunan Ea

değerleri karşılaştırılacak olursa, tutuklanmış enzim sistemi reaksiyonu için aktivasyon

enerjisinin daha düşük olduğu görülmektedir.

Serbest enzim sistemi için bulunan Michealis-Menten sabitleri kaplanmamış Pt

elektrotta 28,16 mM, PVF kaplanmış Au biriktirilmiş elektrotta ise 43,4 mM glukoz

değeri olarak bulunmuştur. Tutuklanmış enzim sistemi için ise, PVF-GOD elektrodu

94

için 20,38 mM glukoz, PVF-Au-GOD elektrodu için 30,4 mM glukoz olarak

bulunmuştur. Bu sonuçlar çizelge 8.2.’de karşılaştırmalı olarak verilmiştir. Serbest

enzim ve tutuklanmış enzim sistemleri için bulunan KM değerleri karşılaştırılacak

olursa tutuklanmış enzim sistemi için bulunan KM değerlerinin daha küçük olduğu

görülmektedir. Bu sonuçlar tutuklama ile enzim yapısında herhangi bir bozulma

olmadığını göstermektedir.

Çizelge 8.2. Serbest ve tutuklanmış enzim için Ea ve KM değerlerinin karşılaştırılması.

Kullanılan Elektrotlar Ea (kJ/mol) KM (mM

glukoz)

Temiz Pt elektrot 27,83 28,16 Serbest

Enzim PVF kaplanıp Au biriktirilmiş Pt

elektrot

34,16 43,40

PVF-GOD enzim elektrot 24,05 20,38 Tutuklanmış

Enzim PVF-Au-GOD enzim elektrot 24,89 30,40

Hazırlanan PVF-GOD enzim elektrodunun glukoz için doğrusal çalışma aralığı 14,60

mM’a kadar, PVF-Au-GOD enzim elektrodu için ise 21,58 mM’a kadar bulunmuştur.

Literatürde doğrusal çalışma aralığı; 10-3-2.10-2 mol (Kumar vd., 1996), 1.10-6-2.10-3

mol/dm3 (Zang ve Lei, 1996), 4.10-5-2.19 10-2 mM (Liu, 1999), 18 mM (Xu ve Chen,

1999), 10 mM (Wu vd., 2000), 9 mM (Chen ve Dong, 2002), 0,1-27 mM (Yang vd.,

2002), 20 mM (Sung ve Bae, 2002), 0-10 mM (Ming ve Chou, 2003), 5-100 µM

(Yabuki vd., 2003), 0,004-0,28 mM’a kadar (Liu ve Ju, 2003) olarak verilmiştir.

Hazırladığımız enzim elektrodunun gözlenebilme sınırı 2,4.10-5 M olarak bulunmuştur.

2,4.10-5 M glukoz derişiminde ölçülen akım 0,0008 µA’dir. Hazırladığımız enzim

elektrodunun cevap süresi PVF-GOD için 25-35 s, PVF-Au-GOD için 50-90 s

aralığında bulunmuştur. Literatürde cevap süreleri genellikle 2-30 s olarak verilmiştir.

Literatürde verilen cevap süreleri; 2 s (Xu ve Chen, 1999), 30 s (Kumar vd., 1996), 20

s (Saito ve Watanable, 1997), 10 s (Chaung vd., 1997), 5 s (Mizutani, 1998), 25 s (Xu

95

ve Chen, 1999), 20 s (Wu vd., 2000 ve Chen ve Dong, 2002), 15 s (Ming ve Chou,

2003 ve Yabuki vd., 2003).

Bu çalışmada geliştirilen enzim elektrodu literatürde verilen değerlerle

karşılaştırıldığında, doğrusal çalışma aralığının iyi, cevap süresinin ise literatürdeki

değerlere göre daha uzun olduğu görülmektedir. Ayrıca bu enzim elektrodu ile 51 gün

içerisinde 187 ölçüm yapılmış ve 51. günde enzim elektrot aktivitesinde %87’lik

azalma olmuştur.

Geliştirdiğimiz PVF-Au-GOD elektrot ile gerçek kan numunelerindeki glukoz ölçümü

yapılmıştır. Elde ettiğimiz sonuçlar hastane sonuçları ile büyük ölçüde uyum içindedir.

Sonuç olarak bu çalışmada geliştirilen enzim elektrodu, literatürde verilen çalışmalarla

karşılaştırıldığında hazırlanmasının kolay, ucuz, doğrusal çalışma aralığının geniş

olması gibi avantajlara sahip olduğu söylenebilir. Kullanılan enzim tutuklama yöntemi

daha basittir ve enzim yapısında deformasyona yol açmamaktadır. Ayrıca kan

numunelerindeki glukoz ölçümü için kullanılabilir.

96

KAYNAKLAR

Arnold, S. Donnert C., (1999). Directed evolution of ındustrial enzymes, Trens in

Biotechnology, 17, 135-136.

Aso, B.C. Kunitake, T. Nakashima, T., (1969) Cationic Polymerization and

Copolymerization of Vinylferrocene, Die Makromolekulare Chemie, 124,

232-240.

Aydın, G. Çelebi, S.S. Özyörük, H. Yıldız, A. (2002) Amperometric Enzyme Electrode

for L(+)-lactate Determination Using Immobilized L(+)-lactate Oxidase in

Poly(vinylferrocenium) Film, Sensors and Actuators B, 87, 8-12.

Bailey, J.E Ollis, F.D., (1997) Biochemical Engineering Fundamentals. Mc Graw-Hill

Kogakusha Ltd, Tokyo. 198s.

Bard, A.J. and Faulkner, L.R., (1980) Electrochemical Methods (Fundamentals and

Applications). John Wiley & Sons, Inc. 5,136-212.

Campanella, L. Tomassetti,M. and Sammartino, M.P., (1989) An Enzyme Sensor for

Determination of Acetylholine and Choline in Rat Brain Extracts,

Anal.Letters, 22, 1389-1402.

Castillo, J. Gaspar, S. Sakharo, I. Csörei, E., (2002). Bienzyme biosensor for glucose,

ethanol and putrescine built on oxidase and sweet potato peroxidase.

Biosensors & Bioelectronics, 18, 705-714.

Celej, M.S. Rivas, G., (1998). Electroanalysis, 10, 771.

Chen, X. Li, J. Li, X. Jiang, L., (1998). A new step to mechanism of the enhancement

effect of gold nanoparticles on glucose oxidase. Biochemical and Biophysical

Research Communications, 245, 352-355.

Chen, M. Cai, W.P. Zhu, Q.Z. Wang, X.S. Xu, J.G., (1999). Determination of glucose

based on the photons as a substitute for glucose oxidase. Analytica Chimica

Acta, 388, 11-17.

Chen, X. Dong, S., (2002). Sol-gel-derived titanium oxide / copolymer composite

based glucose biosensor. Biosensors & Bioelectronics, 18, 999-1004.

Chen, L. Zhang, X. Xi, W. Zhou, Y. Zang, Z. Cass, A., (2002). Genetic modification of

glucose oxidase for improving performance of an amperometric glucose.

Biosensors & Bioelectronics, 17, 851-857.

97

Chuang, C.L. Wang, Y.J. Lang, H.L., (1997). Amperometric glucose sensor based on

ferrocene-containing B-polyethylenimine and immobilized glucose oxidase.

Analytica Chimica Acta, 353, 37-44.

Contractor, A.Q. Sureshkumar, T.N. Narayanan, R. Sukeerthi, S. Lal, R. Srinivasa,

R.S., (1994). Conducting polymer-based biosensors. Electrochimica Acta, 39,

1321-1324.

Crumbliss, A.L. Perine, S. Stonehuerner, J. Tubergen, K. Zaho, J. Henkens, R. Odaly,

J.P., (1992). Biotech. Bioeng., 40, 483.

Dequaire, M. Degrand, C. Limoges, B., (2000). An electrochemical

metalloimmunoassay based on a colloidal gold label. Analytica Chimica

Acta, 72, 5521.

Dinçkaya, E., 1999. Biyosensörler, Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Yayınları, 81s.,

İzmir.

Gerard, M. Chaubey, A. Malhatro, B.D., (2001). Application of conducting polymers

to biosensors. Biosensors & Bioelectronics, 17, 345-359.

González-García, M.B. Costa-García, A., (2000). Silver electrodeposition catalyzed by

colloidal gold on carbon paste electrode: application to biotin–streptavidin

interaction monitoring. Biosensors & Bioelectronics, 15, 663-670.

Gülce, H., (1993) Polivinilferrosen Modifiye Elektrodunun Sulu ve Susuz

Ortamlardaki Elektrokimyasal Davranışı, Hacettepe Ün. Fen Bil. Enst,

Doktora Tezi, 111 s, Ankara.

Gülce, H. Özyörük, H. Yıldız, A., (1993) Electrochemical Response of

Poly(vinylferrocenium)-coated Pt Electrodes to Some Anions in Aqueous

Media, Electroanalysis, 2, 178-183.

Gülce, H. Özyörük, H. Yıldız, A., (1994-a) Electrochemical Reduction of Anthracenes

on Poly(vinylferrocenium) Coated Pt electrodes in Acetonitrile, Phys. Chem,

98, 228-233.

Gülce, H. Özyörük, H. Yıldız, A., (1994-b) Electrochemical Oxidation of Anthracenes

on Poly(vinylferrocenium) Coated Pt electrodes in Acetonitrile, Phys. Chem,

98, 828-832.

Gülce, H. Özyörük, H. Çelebi, S.S. Yıldız, A., (1995-a) amperometric enzyme

electrode for aerobic glucose monitoring prepared by glucose oxidase

98

immobilized in Poly(vinylferrocenium), Journal of Electroanalytical Chem,

394, 63-70.

Gülce, H. Özyörük, H. Çelebi, S.S. Yıldız, A., (1995-b) amperometric enzyme

electrode for sucrose determination prepared from glucose oxidase and

invertase co- immobilized in Poly(vinylferrocenium), Journal of

Electroanalytical Chem., 397, 217-223.

Gülce, H. Gülce, A. Yıldız, A., (2002-a). A Novel Two-Enzyme Amperometric

Electrode for Lactose Determination.Analytical Sciences, 18, 1-3.

Gülce, H. Ataman, I. Gülce, A. Yıldız, A., (2002-b). A new amperometric enzyme

electrode for galactose determination. Enzyme and Microbial Technology, 30,

41-44.

Gülce, H. Gülce, A. Kavanoz, M. Coşkun, H. Yıldız, A., (2002-c). A new

amperometric enzyme electrode for alcohol determination. Biosensors δ

Bioelectronics, 17, 517-521.

Gülce, H. Aktaş, Y.S. Gülce, A. Yıldız, A., (2003). Polyvinylferrocenium immobilized

enzyme electrode for choline analysis. Enzyme and Microbial Technology,

32, 895-899.

Gündoğan, M. Çelebi, S.S. Özyörük, H. Yıldız, A., (2002). Amperometric enzyme

electrode for organic peroxides determination prepared from horseradish

peroxidase immobilized in poly(vinylferrocenium) film. Biosensors &

Bioelectronics, 17, 875-881.

Hillman, A.R. and Hughes, N.A., (1992) Solvation Phenomena in polyvinylferrocene

films: effect of history and redox state, J.Electrochem. Soc, 139, 74-77.

Hu, X.Y. Xiao, Y. Chen, Y.H., (1999). Adsorption characteristics of Fe(CN)63-/4- on Au

colloids as monolayer films on cysteamine-modified gold electrode. Journal

of Electroanalytical Chemistry, 466, 26-30.

Inzlet, G. and Bacskai, J., (1992) Electrochemical quartz crystal microbalance study of

the swelling of poly(vinylferrocene) films, Electrochemica Acta, 37, 647-654.

Iwakura, C. Kawai, T. Nojima, M. and Yoneyama, H., (1987) A new electrode-active

material for polymer batteries, J. Electrochem. Soc, 134, 791-795.

99

Jawaheer, S. White, S.F. Rughooputh, S.D. Cullen, D., (2003). Development of a

common biosensor format for an enzyme based biosensor array to monitor

fruit quality. Biosensors & Bioelectronics, 18, 1429-1437.

Kavanoz, M., (2001). Modifiye elektrot kullanılarak altın tayini için yöntem

geliştirilmesi. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü,

Yüksek Lisans Tezi, 76 s, Isparta.

Kumar, S. Kulkarni, A.V. Kalyanraman, R. Krishamoorty, T.S., (1996). Whole blood

glucose determination using glucose oxidase immobilized on cotton cheese

cloth. Analytica Chimica Acta, 338, 135-140.

Liu, Z. Liu, B. Zhang, M. Kong, J. Deng, J., (1999). Al2O3 sol-gel derived

amperometric biosensor for glucose. Analytica Chimica Acta, 392, 135-141.

Liu, S. Ju, H., (2003). Reagentless glucose biosensor based on direct electron transfer

of glucose oxidase immobilized on colloidal gold modified carbon paste

electrode. Biosensors & Bioelectronics, 1-7.

Lodish, H., (1995). Molecular cell biology. W.H. Freeman and Company

Mizutani, F. Sato, Y. Hirata, Y. Sawaguchi, T. Yabuki, S., (1998). Glucose

oxidase/polyion complex–bilayer membrane for elimination of electroactive

interferents in amperometric glucose sensor. Analytica Chimica Acta, 364,

173-179.

Mosbach, K. Danielsson, B., (1981). Thermal bioanalyzers in flow streams––enzyme

thermister devices. Anal. Chem., 53, 83A–94A.

Pandey, P.C. Mishra, A.P., (1988). Conducting polymer-coated enzyme microsensor

for urea. Analyst, 113, 329–331.

Peerce, P.J. and Bard, A.J., (1980-a) Polymer films on electrodes, Part I The

application of poly(vinylferrocene)-coated platinum electrodesas reference

electrodes in acetonitrile, J. Electroanal.Chem, 108, 121-125.

Peerce, P.J. and Bard, A.J., (1980-b) Polymer films on electrodes, Part II film structure

and mechanism of electron transfer with electrodeposited

poly(vinylferrocene), J.Electroanal.Chem, 112, 97-115.

Peerce, P.J. and Bard, A.J., (1980-c) Polymer films on electrodes, Part III

digitalsimulation model for cyclic voltammetry electroactive polymer film

100

and electrochemistry of poly(vinylferrocene) on platinum,

J.Electroanal.Chem, 114, 89-115.

Pişkin, E., (1986) Biyosensörler. Temel ve Uygulamalı Enzimoloji. Ege Üniversitesi

Fen Fakültesi Yayınları, İzmir. 205-223.

Raj, C.R. Okajima, T. Ohsaka, T., (2003). Gold nanoparticle arrays for the voltametric

sensing of dopamine. Journal of Electroanalycal Chemistry, 543, 127-133.

Ramanathan, K. Annapoorni, S. Malhotra, B.D., (1994). Application of poly(aniline) as

a glucose biosensor. Sensors and Actuators B, 21, 165-169.

Saito, T. Watanabe, M., (1997). Characterization of poly(vinylferrocene-co-2-

hydroxyethyl methacrylate) for use as electron mediator in enzymatic glucose

sensor. Reactive & Functional Polymers, 37, 263-269.

Shirota, Y. Kakuta, T. Mikawa, H., (1984) Electrochemical oxidation of

poly(vinylferrocene) with concurrent precipitation on the electrode;

preparation of an electrically conducting polymer, Makromol.Chem., Rapid

Commun, 5, 337-340.

Singhal, R. Chaubey, A. Srikhirinb, T. Aphiwantrakul, S. Pandey, S. Malhot, D.,

(2003). Immobilization of glucose oxidase onto Langmuir–Blodgett films of

poly-3-hexylthiophene. Current Applied Physics, 3, 275-279.

Smith, T.W. Kuder, J.E. and Wychick, D., (1976) J. Polym. Sci, 14, 2433.

Stonehuerner, J.G. Zhao, J. O'Daly, J.P. Crumbliss, A.L. Henkens, R.W., (1996).

Comparison of colloidal gold electrode fabrication methods: the preparation

of a horseradish peroxidase enzyme electrode. Biosensors & Bioelectronics,

7, 421-428.

Sung, W. Bae, Y., (2002). A glucose oxidase electrode based on polypyrrol with

polyanion / PEG / enzyme conjugate dopant. Biosensors & Bioelectronics,

18, 1231-1239.

Suzuki, H. Kumagai, A., (2002). A disposable biosensor employing a glucose-sensitive

biochemomechanical gel. Biosensors & Bioelectronics, 18, 1289-1297.

Şen, S., Gülce A., Gülce H., (baskıda). Polyvinlyferrocenium modified Pt electrode for

the design of amperometric choline and acetylcholine enzyme electrodes.

Biosensors & Bioelectronics

101

Thevenot, D. Toth, K. Durst, R. Wilson, G., (2001). Electrochemical biosensor:

recommended definitions and classifications. Biosensors & Bioelectronics,

16, 121-131.

Trajanowicz, M. Krawczyk, K. Geschke, T., (1995). Biosensor based on oxidases

immobilized in various conducting polimers. Sensors and Actuators B, 28,

191-199.

Uang, Y. Chou,T., (2003). Fabrication of glucose oxidase / polypyrrole biosensors by

galvanostatic methode in various pH aqueous solutions. Biosensors &

Bioelectronics, 1-7.

Umana, M. Rolison, D.R. Nowak, R. Daum, P. Murray, R.W., (1980) X-Ray

photoelectron spectroscopy of metal, metal oxide, and carbon electrode

surfaces chemically modified with ferrocene and ferrocenium, Surface

Science, 101, 295-309.

Uslan A.H., (1986) Enzim Kinetiği. Temel ve Uygulamalı Enzimolji. (Telefoncu,A.),

Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Yayınları, İzmir. 59-91.

Wu, Z. Wang, B. Dong, S. Wang, E., (2000). Amperometric glucose biosensor based

on lipid film. Biosensors & Bioelectronics, 15, 143-147.

Xiao, Y. Ju, H.X. Chen, H.Y., (1999). Hydrogen peroxide sensor based on horseradish

peroxidase-labeled Au colloids immobilized on gold electrode surface by

cysteamine monolayer. Analytica Chimica Acta, 391, 73-82.

Xu, J. Chen, H., (1999). Amperometric glucose sensor based on glucose oxidase

immobilized in electrochemically generated poly(ethacridine). Analytica

Chimica Acta, 423, 101-106.

Yabuki, S. Mizutani, F. Sato, Y. Hirata, Y., (2003). Immobilization of polyglutamate-

glucose oxidase onto a cysteamine-modified gold electrode. Sensors and

Actuators B, 91, 187-190.

Yamato, H. Ohna, M. Wernet, W., (1995). A Polypyrrole/Three-Enzyme Electrode for

Creatinine Detection. Analytical Chemistry.

Yang, X. Hua, L. Gong, H. Tan, S., (2002). Covalent immobilization of an enzyme

(glucose oxidase) onto a carbon sol-gel silicate composite sulface as a

biosensing platform. Analytica Chimica Acta, 478, 67-75.

102

Yıldız, A., Genç, Ö., Bektaş, S., 1993. Enstrümantal Analiz Yöntemleri. Hacettepe

Üniversitesi Yayınları No:64, 506s. Ankara.

Zhang, Z. Lei, C., (1996). Electrochemical fabrication of amperometric glucose

enzyme electrode. Analyst, 121/7, 971-975.

1

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Meral TOPÇU

Doğum Yeri : Sivas

Doğum Yılı : 25.09.1978

Medeni Hali : Evli

Eğitim ve Akademik Durumu

Lise : 1993-1997 Sivas Kongre Lisesi

Lisans : 1997-2001 Süleyman Demirel Üniversitesi

Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü

Yabancı Dil : İngilizce

2

ALTIN BİRİKTİRİLMİŞ POLİVİNİL FERROSEN MODİFİYE PT ELEKTRODUNU TEMEL ALAN GLUKOZ İYOSENSÖRÜNÜN

GELİŞTİRİLMESİ

Meral TOPCU Kimya Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, 102s., 2004 Anahtar Kelimeler: Glukoz, Polivinilferrosen, Altın biriktirme, Enzim elektrot Basit ve hassas amperometrik glukoz enzim elektrodunun tasarlanması için yeni bir yöntem tanımlanmıştır. Polivinilferrosen (PVF) kaplı Pt elektroda dayanan enzim elektrodunun geliştirilmesini sağlayacak basit bir enzim tutuklama yöntemi araştırılmıştır. Bu çalışmada iki yeni glukoz enzim elektrodu geliştirilmiştir. Çalışmanın birinci adımında, PVF kaplanmış Pt elektrot enzim çözeltisine daldırılarak glukoz oksidaz enziminin (GOD) polimer matriks içerisinde tutuklanması sağlanmıştır ve bu enzim elektrot PVF-GOD enzim elektrodu olarak tanımlanmıştır. Elektrot cevabı üzerine polimerik film kalınlığı, pH, sıcaklık, substrat ve enzim konsantrasyonu etkisi araştırılmıştır. 25°C sıcaklıkta pH 7,4 olarak bulunmuştur. Cevap süresi 25-35 s ve lineer çalışma aralığının üst sınırı 14,598 mM glukoz derişimidir. Tutuklanmış enzim sistemi için görünür Michaelis-Menten sabiti (Kmg) ve aktivasyon enerjisi sırasıyla 20,38 mM glukoz ve 24,05 kJ/mol olarak bulunmuştur. Çalışmanın ikinci adımında GOD, PVF kaplanmış ve ardından Au biriktirilmiş Pt elektrot üzerinde aynı yöntemle tutuklanmıştır ve bu enzim elektrot PVF-Au-GOD enzim elektrodu olarak tanımlanmıştır. Enzim elektrot cevabı üzerine Au etkisi araştırılmıştır. 25°C sıcaklıkta pH 7,4 olarak bulunmuştur. Cevap süresi 50-90 s ve lineer çalışma aralığının üst sınırı 21,58 mM glukoz derişimidir. Tutuklanmış enzim sistemi için görünür Michaelis-Menten sabiti (Kmg) ve aktivasyon enerjisi sırasıyla 30,4 mM glukoz ve 24,89 kJ/mol olarak bulunmuştur. Enzim elektrotlarının amperometrik cevapları, enzimatik yükseltgenme sonucu oluşan H2O2’nin SCE’ye karşı sabit potansiyelde ölçülmesine dayanır. Serbest ve tutuklanmış enzim sistemlerinin Kmg ve Ea değerlerini karşılaştırmak amacıyla aynı koşullar altında farklı glukoz konsantrasyonlarında oluşan H2O2 elektrokimyasal olarak ölçülmüştür. pH 7,4 tamponunda kaplanmamış Pt elektrot kullanılarak serbest enzim için maksimum akım değerleri ölçülmüştür. Serbest enzim için KM ve Ea değerleri sırasıyla 28,2 mM glukoz derişimi ve 27,823 kJ/mol’dür. Girişim yapabilecek maddelerin etkisi ve enzim elektrodunun kararlılığı araştırılmıştır. Aynı zamanda gerçek kan numunelerindeki glukoz konsantrasyonu PVF-Au-GOD enzim elektrodu ile standart ekleme yöntemi kullanılarak ölçülmüştür. Bulunan sonuçlar hastane sonuçları ile uyum içindedir. Jüri: Prof. Dr. Handan GÜLCE (Danışman) Yrd. Doç. Dr. Filiz ARI Yrd. Doç. Dr. Hakan AKTAŞ

3

DEVELOPMENT OF GLUCOSE BIOSENSOR BASED ON GOLD DEPOSİTED PVF MODİFİED PT ELECTRODE

Meral TOPCU

Chemistry Department, M. Thesis, 102 pg, 2004

Key Words: Glucose, Polyvinylferrocene, Gold deposition, Enzyme Electrode A novel strategy to construct a simple and sensitive amperometric glucose enzyme electrode was described. A simple method of enzyme immobilization was investigated which is useful for devolopment of enzyme electrodes based on polyvinylferrocene (PVF) coated, Pt electrodes. In this study, two novel glucose enzyme electrodes were investigated. In the first step of this study, the glucose oxidase enzyme (GOD) was incorporated into the polymer matrix by immersing PVF coated PT electrode in enzyme solution for several times, and this enzyme electrode was called as PVF-GOD enzyme electrode. The effects of the thickness of the polymeric film, pH, temperature, substrate and enzyme concentration on the response of the enzyme electrode were investigated. The optimum pH was found to be 7.4 at 25°C. The response time was found to be 25-35 s and upper limit of the linear working portion was found to be 14.598 mM glucose concentration. The apparent Michaelis-Menten constant (Kmg) and the activation energy of this immobilized enzyme system were found to be 20.38 mM glucose and 24.05 kJ/mol, respectively. In the second step of this study, GOD was immobilized on PVF coated and then Au deposited Pt electrode by the same strategy, and this enzyme electrode was called as PVF-Au-GOD enzyme electrode. The effect of the amount of Au on the response of the enzyme electrode was investigated. The optimum pH was found to be 7.4 at 25°C. The response time was found to be 50-90 s and upper limit of the linear working portion was 21.58 mM glucose concentration. The apparent Michaelis-Menten constant (Kmg) and the activation energy of this immobilized enzyme system were found to be 30.4 mM glucose and 24.89 kJ/mol, respectively. The amperometric responses of the enzyme electrodes due to the electrooxidation of enzymatically generated H2O2 were measured at a constant potential versus SCE. In order to compare the Kmg and Ea values of immobilized enzyme systems with free enzyme systems under the same solution condition, the H2O2 generated from solutions of different glucose concentrations were measured electrochemically. The maximum current values were obtained for the free enzyme using a bare Pt electrode in a buffer solution of pH 7.4. The KM and Ea values of free enzyme system were 28.2 mM glucose concentration and 27.823 kJ/mol, respectively. The effects of interferents and stability of the enzyme electrode were also investigated. The glucose concentration in real blood samples were also measured using the e PVF-Au-GOD enzyme electrode by utilizing standard addition method and the results were found to be compatible with the hospital results.

4

Jury: Prof. Dr. Handan GÜLCE (Supervisor) Yrd. Doç. Dr. Filiz ARI Yrd. Doç. Dr. Hakan AKTAŞ