Aktivitas Isolat Bakteri Pelarut Fosfat yang diperoleh dari Tanah

Sawah di Daerah Jalan Lingkar dan Gunung Sari, Salatiga

(Activities of Phosphate Solubilizing Bacteria Isolated from Paddy

Field in the area of Ring Road and Gunung Sari, Salatiga)

Oleh

Nurul Ikhtiyarini

NIM : 412013004

SKRIPSI

Diajukan kepada Program Studi: Biologi, Fakultas: Biologi guna memenuhi

sebagian dari persyaratan untuk mencapai gelar Sarjana Sains (Biologi)

Program Studi Biologi

Fakultas Biologi

Universitas Kristen Satya Wacana

Salatiga

2017

Scan lembar pengesahan

Scan pernyataan tidak plagiat

Scan pernyataan persetujuan akses

BAB I

PENDAHULUAN Fosfor (P) merupakan salah satu unsur makro esensial bagi kehidupan tanaman

(Saraswati dkk, 2007). Ketersediaan P dalam tanah umumnya melimpah akan tetapi

sekitar 95-99% terdapat dalam bentuk fosfat tidak terlarut atau masih tersimpan dalam

batuan-batuan sehingga tidak dapat digunakan oleh tanaman (Raharjo dkk, 2007).

Rendahnya P dalam tanah ini disebabkan P terikat oleh logam, seperti Fe dan Al, menjadi

Fe-fosfat dan Al-fosfat. Tanaman tidak dapat menyerap P dalam bentuk terikat, sehingga

harus diubah menjadi bentuk yang tersedia bagi tanaman (Suliasih dan Rahmat, 2006).

Untuk meningkatkan ketersediaan fosfat bagi tanaman dapat diusahakan dengan

penggunaan pupuk fosfat. Akan tetapi pemanfaatan pupuk tersebut kurang efektif,

karena pupuk fosfat sudah dalam bentuk terlarut dan tanaman menyerapnya secara

bertahap, sehingga sebagian besar fosfat yang belum terserap akan terbawa oleh air.

Fosfat yang terbawa oleh air tersebut, justru akan diserap oleh rumput liar atau gulma

untuk pertumbuhan gulma, sehingga merugikan tanaman (Raharjo dkk, 2007). Diperlukan

alternatif lain dalam menyediakan dan meningkatkan fosfat bagi tanaman yaitu dengan

penggunaan mikroba tanah yang berperan dalam pelarutan P (Arsyad, 2007).

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya oleh Widawati menyatakan

bahwa bakteri pelarut fosfat memiliki kemampuan dalam melarutkan unsur P terikat

seperti Ca-fosfat yang berperan dalam menyediakan fosfat bagi tanaman (Kartika, 2015).

Fosfat dapat tersedia oleh mikrob tanah melalui sekresi asam organik (Arsyad, 2007).

Asam organik seperti asam asetat, asam format, asam laktat, yang dihasilkan oleh

mikroba tersebut akan bereaksi dengan ion-ion Ca2+, Fe3+ dan Al3+ yang mengikat P

sehingga unsur P akan dibebaskan dan tersedia bagi tanaman (Yani, 2011). Selain itu,

mikroba pelarut fosfat mampu memproduksi asam amino, vitamin dan zat pengatur

tumbuh yang dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman (Suliasih dan Rahmat, 2006).

Media selektif mikroba pelarut fosfat yang biasa digunakan dalam isolasi adalah

agar Pikovskaya. Mikroba pelarut fosfat yang tumbuh pada media ini akan membentuk

zona bening di sekitar koloninya. Zona bening merupakan tanda awal adanya kemampuan

mikroba pelarut fosfat dalam melarutkan fosfat. Terbentuknya zona bening ini karena

adanya pelarutan fosfat dari sumber fosfat sukar terlarut yang ada dalam media oleh

asam-asam organik yang dihasilkan. Waktu yang dibutuhkan untuk pertumbuhan,

kejernihan, besar koloni serta luas zona bening menunjukkan kemampuan mikroba

pelarut fosfat. Semakin luas dan semakin jernih zona bening yang terbentuk menunjukkan

kemampuan melarutkan fosfat yang besar, sehingga koloni tersebut dapat diisolasi lebih

lanjut untuk dikembangkan (Saraswati dkk, 2007).

Dari penelitian yang telah dilakukan sebelumnya di laboratorium Mikrobiologi,

Fakultas Biologi, UKSW, telah diperoleh dua isolat bakteri yang menunjukkan adanya

kemampuan dalam melarutkan fosfat. Dua isolat tersebut diperoleh dari tanah pertanian

padi di daerah Salatiga. Untuk mengetahui kemampuan dari kedua isolat mikroba pelarut

fosfat tersebut perlu dilakukan pengujian lebih lanjut dalam media Pikovskaya cair. Di

dalam media Pikovskaya cair ini sel-sel mikroba pelarut fosfat akan memanfaatkan nutrisi

dalam media untuk berkembang (Saraswati dkk, 2007). Ke dua isolat bakteri yang diduga

melarutkan fosfat ini, belum pernah diteliti lebih lanjut kemampuannya dalam

melarutkan fosfat. Oleh karena itu, diperlukan penelitian lebih lanjut terhadap aktivitas

ke dua isolat bakteri pelarut fosfat ini, serta membandingkannya dengan Pseudomonas

putida, sehingga diharapkan dapat diketahui isolat mana yang paling optimal dalam

melarutkan P.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui kemampuan dua isolat

bakteri dalam melarutkan P dengan menggunakan Pseudomonas putida sebagai

pembanding, serta menentukan isolat yang paling besar kemampuannya dalam

melarutkan P.

BAB II

BAHAN DAN METODE

1. Isolat bakteri pelarut fosfat

Dua isolat bakteri pelarut P yang digunakan di penelitian ini diisolasi dari tanah

pertanian padi di daerah Jalan Lingkar Salatiga (disebut isolat A), dan dari tanah pertanian

padi di daerah Gunung Sari Salatiga (disebut isolat B). Sebagai pembanding, digunakan

isolat Pseudomonas putida. Ke dua isolat bakteri pelarut fosfat (isolat A dan B) dan isolat

Pseudomonas putida diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Biologi, UKSW.

2. Karakterisasi isolat bakteri pelarut fosfat dan pemeliharaan

Sebelum dilakukan uji kemampuan bakteri dalam melarutkan P, terlebih dahulu

dilakukan karakterisasi morfologi dan fisiologis ke dua isolat bakteri. Pengamatan

karakter morfologi yang dilakukan meliputi morfologi koloni dan sel. Sedangkan uji

fisiologi yang dilakukan meliputi uji Gram, MR, VP, dan uji katalase. Ke dua isolat bakteri

yang telah murni dipelihara pada 50 ml medium Pikovskaya. Setiap selang waktu 2 hari

dilakukan pemindahan pada medium segar.

3. Pengujian aktivitas pelarutan fosfat (Saraswati dkk, 2007)

Ke dua isolat bakteri yang telah murni dipelihara pada prekultur yang berisi 50 ml

medium Pikovskaya dan digojok selama 48 jam pada suhu 30°C. Prekultur umur 48 jam

tersebut kemudian diukur absorbansinya pada OD 600 nm untuk menentukan besarnya

volume prekultur yang akan dipindahkan ke medium kultur selanjutnya. Prekultur umur

48 jam tersebut kemudian diinokulasikan pada 100 ml medium Pikovskaya cair dengan

komposisi (g/l) : glukosa 10, Ca3(PO4)2 5, (NH4)2SO4 0,5, KCl 0,2, MgSO4.7H2O 0,1, MnSO4,

FeSO4, ekstrak khamir 0,5, agar 15. Kemudian, kultur diinkubasi pada suhu 30°C dan

dishaker dengan kecepatan 120 rpm. Set penelitian diulang 3 kali.

Pengambilan sampel dilakukan pada hari ke 0, 7, dan 14. Pada setiap

pengambilan sampel dilakukan penentuan konsentrasi biomassa dan P terlarut.

Kemampuan melarutkan P dihitung dengan membandingkan konsentrasi P awal dalam

medium dan saat pengambilan sampel hari ke 7 dan 14.

Berikut cara menetukan fosfat terlarut dan produksi biomassa:

Fosfat terlarut (mg/l) = ([fosfat]t - [fosfat]0)

dimana [fosfat]t dan [fosfat]0 adalah konsentrasi fosfat saat t jam dan 0 jam.

Produksi biomassa (mg/l) = ([BK]t – [BK]0)

dimana [BK]t dan [BK]0 berat kering sel saat t jam dan 0 jam.

Kemampuan melarutkan fosfat (mg P/mg sel) = ([fosfat]t – [fosfat]0)/BK

dimana [fosfat]t dan – [fosfat]0 adalah konsentrasi fosfat saat t jam dan 0 jam,

sedangkan BK adalah berat kering sel yang melakukan aktivitas melarutkan P.

4. Penentuan konsentrasi biomassa sel (Qirom dkk, 2012)

Pengukuran biomassa sel dengan menyaring sampel sebanyak 10 ml dengan

menggunakan membran filter yang telah diketahui berat keringnya. Padatan yang

tersaring kemudian dikeringkan dalam oven selama 2 jam pada suhu 105°C. Kemudian

ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik dan berat kering ditentukan dengan

cara:

Konsentrasi biomassa (mg/l) = {(berat membran bersama sel – berat membran

awal)/10 ml}x1000

5. Penentuan konsentrasi fosfat (Saraswati dkk, 2007)

Penentuan konsentrasi fosfat dilakukan dengan cara menambahkan 2,5 ml

Reagen Bartons pada 10 ml filtrat kultur, dan dijadikan 50 ml menggunakan air suling.

Kemudian diinkubasi selama 10 menit dan diukur absorbansi pada panjang gelombang

430 nm. Kemudian disiapkan kurva standar dengan membuat larutan stok dengan

konsentrasi P 0,05 mg/l (0,2195 gram KH2PO4 dilarutkan menjadi 1 liter). Kemudian dari

larutan stok ini dibuat seri larutan standar dengan konsentrasi 10,14,20, 30, 40, 60,80,

dan 100 mg/l. Setiap larutan standar ditentukan absorbansinya dengan cara yang sama

dengan sampel. Data konsentrasi larutan standar dan absorbansi dibuat kurva standar

dan ditentukan persamaan linier nya. Konsentrasi fosfat pada sampel ditentukan dengan

mengonversikan absorbansi sampel menggunakan persamaan kurva standar fosfat.

BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Karakterisasi isolat bakteri pelarut fosfat

Hasil karakterisasi bakteri pelarut fosfat yang telah diperoleh, dapat dilihat pada

Tabel 1. Berdasarkan hasil karakterisasi, isolat A yang berasal dari lahan pertanian padi di

daerah jalan lingkar Salatiga, memiliki kemiripan morfologi koloni dan sel dengan isolat

Pseudomonas putida. Sedangkan isolat B memiliki perbedaan dalam hal morfologi koloni

dan sel. Akan tetapi dari uji fisiologis yang dilakukan, karakter fisiologis ke tiga isolat

(isolat A, isolat B dan Pseudomonas putida) memiliki karakter yang sama.

Tabel 1. Karakter morfologi koloni, sel, dan fisiologi bakteri pelarut fosfat

Isolat

Karakter

Morfologi koloni Morfologi sel Fisiologis

Bentuk Tepi Elevasi Warna Bentuk Gram MR VP Katalase

A tidak

beraturan

berombak timbul putih

tulang

batang negatif negatif positif positif

B tidak

beraturan

berlekuk datar putih

tulang

batang negatif negatif positif positif

Ps tidak

beraturan

berombak timbul putih

tulang

batang negatif negatif positif positif

2. Aktivitas bakteri pelarut fosfat dalam melarutkan P

Dari hasil penelitian terbukti ketiga isolat mampu melarutkan P (Gambar 1). Pada

gambar 1, terlihat bahwa dengan bertambahnya waktu inkubasi, konsentrasi fosfat

terlarut semakin tinggi. Menurut Raharjo dkk (2007), konsentrasi fosfat terlarut dalam

medium yang ditumbuhi mikroba pelarut fosfat akan meningkat dari hari ke hari

disebabkan adanya pembentukan asam organik oleh mikroba. Beberapa asam organik

yang dihasilkan oleh mikroba seperti asam asetat, asam format, asam laktat akan

bereaksi dengan ion-ion Ca2+, Fe3+, dan Al3+ yang akan mengikat P dan unsur P akan

dibebaskan dan tersedia bagi tanaman (Yani, 2011).

Gambar 1. Konsentrasi fosfat terlarut pada medium Pikovskaya yang ditumbuhi isolat A

( ), isolat B ( ), dan isolat Pseudomonas putida ( ) selama 14 hari.

Konsentrasi fosfat terlarut pada medium Pikovskaya yang ditumbuhi masing-

masing isolat mengalami peningkatan seiring dengan lamanya waktu inkubasi, yaitu

tertinggi pada pengamatan hari ke 14. Fosfat yang dilarutkan oleh isolat A selama 14 hari

sebesar 6,61 mg/l. Sedangkan pada isolat B, fosfat yang dilarutkan sebesar 10,9 mg/l.

Fosfat yang dilarutkan oleh isolat Pseudomonas putida selama 14 hari, sebesar 11 mg/l.

Dari hasil tersebut dapat dilihat bahwa fosfat yang dilarutkan oleh isolat B dan isolat

Pseudomonas putida relatif hampir sama, sedangkan fosfat yang dilarutkan oleh isolat A

lebih rendah dibandingkan dengan isolat B dan Pseudomonas putida. Hal ini menunjukkan

bahwa setiap spesies bakteri memiliki kemampuan yang berbeda-beda dalam aktivitasnya

melarutkan fosfat. Menurut Raharjo dkk (2007), kenaikan konsentrasi fosfat terjadi

karena mikroba menghasilkan asam organik. Adanya peningkatan produksi asam organik

akan menurunkan pH. Penurunan pH ini akan menghambat aktivitas enzim

fosfofruktokonase dan dan piruvat dekarboksilase sehingga pembentukan asam piruvat

dan asetil ko-A yang berperan dalam biosintesis asam organik menjadi terhambat.

Adanya penghambatan dalam biosintesis asam organik dapat menyebabkan proses

pelarutan fosfat menurun.

Gambar 2. Konsentrasi biomassa isolat A ( ), isolat B ( ), dan isolat

Pseudomonas putida ( ) pada medium Pikovskaya.

Tabel 2. Kemampuan isolat A, isolat B dan isolat Pseudomonas putida dalam melarutkan

fosfat selama 14 hari.

Nama isolat Konsentrasi fosfat

yang dilarutkan

(mg/l) selama 14 hari

Produksi biomassa

(mg/l)

Kemampuan

melarutkan fosfat (mg

P/mg BK)

A 6,61 830 0,008

B 10,9 191 0,057

Pseudomonas putida 11 420 0,026

3. Pertumbuhan dan produksi biomassa sel

Pertumbuhan biomassa sel pada kultur cair dapat dilihat menggunakan metoda

optical dencity (OD). Pada umumnya optical dencity (OD) berkorelasi dengan jumlah sel

yang terdapat pada media. Gambar 2 menunjukkan bahwa pertumbuhan populasi dari

masing-masing isolat mengalami peningkatan. Berdasarkan hasil perhitungan

kemampuan melarutkan fosfat pada Tabel 1, dapat dilihat bahwa dari dua isolat yang

telah diperoleh sebelumnya, yaitu isolat A dan isolat B, yang paling besar aktivitasnya

dalam melarutkan P adalah isolat B. Hal ini berkaitan antara produk biomassa yang

dihasilkan dengan aktivitas pelarutan fosfat yang dihasilkan oleh masing-masing isolat.

Dari ketiga isolat tersebut pada hari ke14 yang memiliki pertumbuhan biomassa tertinggi

adalah isolat A, diikuti isolat Pseudomonas putida dan yang terakhir adalah isolat B

(Gambar 2). Produksi biomassa yang tinggi ini tentunya membutuhkan kecukupan

nutrien, diantaranya adalah P. Adanya kebutuhan P untuk pertumbuhan ini kemungkinan

menyebabkan adanya penggunaan fosfat oleh bakteri, sehingga kadar fosfat terlarut

menjadi rendah.

Dalam hal aktivitas melarutkan fosfat, isolat yang memiliki aktivitas tertinggi

dalam melarutkan fosfat adalah isolat B (dapat dilihat pada Gambar 1 dan Tabel 2). Pada

Gambar 1 dan 2 dapat dilihat bahwa isolat yang memiliki aktivitas melarutkan fosfat

paling besar adalah isolat yang produksi biomassanya rendah, tetapi mampu melarutkan

fosfat dengan konsentrasi yang tinggi. Pada isolat A, meskipun produksi biomassanya

tinggi, tetapi kemampuan melarutkan fosfatnya lebih rendah dibandingkan dengan isolat

B, sehingga isolat yang paling tinggi aktivitasnya adalah isolat B. Berdasarkan pada Tabel 2

dapat diambil kesimpulan bahwa isolat yang paling besar kemampuannya dalam

melarutkan fosfat adalah isolat B.

BAB IV

KESIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa

selama 14 hari pertumbuhan pada medium Pikovskaya, isolat B memiliki kemampuan

lebih besar dalam melarutkan fosfat dibandingkan dengan isolat A. Kemampuan isolat B

dalam melarutkan P setara dengan isolat Pseudomonas putida.

DAFTAR PUSTAKA Arsyad, R. H. 2007. Penggunaan rhizobium dan mikrob pelarut fosfat (MPF) untuk

memperbaiki pertumbuhan ibit akasia (Acacia mangium dan Acacia crassicarpa)

[Skripsi]. Bogor: Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Kartika, I. 2015. Pembuatan flipchart dinamika bakteri pelarut fosfat dalam proses

pengomposan sampah coklat dan sampah hijau [Laporan Penelitian]. Pontianak:

Universitas Tanjungpura.

Qirom, M. A. Saleh, M. B. Kuncahyo, Budi. 2012. Evaluasi penggunaan beberapa metode

penduga biomassa pada jenis Acacia mangium Wild. Jurnal Penelitian Hutan dan

Konservasi Alam. 9 (3): 251-263.

Raharjo, B. Suprihadi, A. Agustina, D. K. 2007. Pelarutan fosfat anorganik oleh kultur

campur jamur pelarut fosfat secara In Vitro. Jurnal Sains & Matematika. 18 (2) :

45-54.

Saraswati, R. Husen, E. Simanungkalit, R. D. M. 2007. Metode Analisis Biologi Tanah.

Bogor: Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Sumberdaya Lahan Pertanian.

Suliasih. dan Rahmat. 2006. Aktivitas fosfatase dan pelarut kalsium fosfat oleh beberapa

bakteri pelarut fosfat. Jurnal Biodiversitas. 8 (1) : 23-26.

Yani, R. 2011. Karakterisasi kemampuan melarutkan fosfat bakteri pelarut fosfat asal

Tithonia diversifolia pada media agar ekstrak tanah [Skripsi]. Padang: Universitas

Andalas.