1

Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban�

5-6

Katona Éva

Affinitás Az az erő, mellyel egy antitest megfog egy epitópot. Nem kovalens kötések, melyek hozzájárulnak: ionos kölcsönhatások, hidrogén kötések,

hidrofób kölcsönhatások. Számszerűen megadható az asszociációs konstans (Ka) meghatározásával A meghatározás egyik módszere az equilibrium dialízis. Feltételek: • az antigén (ligand) elég kicsi legyen ahhoz, hogy átjusson egy membrán (pl. celofán) pórusain • Az antigén valamilyen módon jelzett legyen

• F kamrába: ligand • B kamrába: antiszérum v. nonimmun szérum

Rendszeres időközönként mindkét kamrából mintát veszünk és mérjük a jelet. [Ab-Lg] Ka=-------------------- [Ab ] x [ Lg]

a Kd reciproka

Scatchard egyenlet

K=------------ r (n-r)(c)

r = a kötött ligand és a totál antitest cc. hányadosa n = a ligand kötő helyek száma az antitesten c = a szabad ligand cc.-ja

Ábrázoljuk az r/c hányadost az r függvényében

Ha a Ka valóban konstans, a pontokra egyenes illeszthető és a meredekség=Ka

!! IgG esetén az r maximális értéke=2

Egyenest általában csak monoklonális antitest esetén kapunk!

Példa egy poliklonális antitest K értékének meghatározására

KO= átlagos associációs konstans, az a ligand cc. melynél az ag kötő helyek fele telített (IgG esetén ez akkor teljesül, amikor r=1)

KO=------------ (2-1)c

1

KO= a szabad ligand cc.-jának reciproka, amikor r=1. Ez leolvasható a Scatchard görbéről, mivel amikor r=1, r/c=1/c= KO

Az előző adatokat a Sips egyenlet alapján transzformálva log[r/(2-r)] = a logK+ a log c A log[r/(2-r)] -t a log c függvényében ábrázolva egyenest kapunk.

A KO közvetlenül leolvasható a Scatchard görbéről: amikor r = 1, log[r/(2-r)] = 0. Theát KO= reciproka annak a c értéknek, ahol a log[r/(2-r)] = 0. A KO értéke az immunizálás során az idő (és a ráoltások) függvényében emelkedik, feltehetően azért, mert a nagyyobb affinitású antitestet termelő B sejtek szelektálódnak ki. Ez a jelenség az affinitás érés.

2

Affinitás érés

Nem jelenti azt, hogy az antitest specifikusabb lesz!

Az antitest affinitásának meghatározása nem kompetitív ELISA módszerrel

1.  Különböző koncentrációjú antigénnel fedjük az ELISA lemezek felszínét (Ag, Ag’…) 2.  Az antitest különböző koncentrációit reagáltatjuk mindegyik antigén koncentrációnál 3.  A mért OD-kat ábrázoljuk az antitest koncentráció függvényében 4.  A maximális OD 50%-nak megfelelő antitest koncentrációkat leolvassuk a görbékről 5.  A képlet alapján kiszámítjuk a Kaff értékét

Az antitest affinitásának meghatározása SPR módszerrel

1.  Sensor chip felszínére kovalensen felkötjük az antitestet 2.  Különböző koncentrációjú antigén oldatot áramoltatunk a chip

felszínén, miközben folyamatosan detektáljuk a lekötődött ag mennyiségét

3.  Görbe illesztés 4.  kon és koff meghatározása 5.  Kd=koff /kon (software elvégzi)

Egyéb módszerek: Bioassay PEIA-ellipsometry

Az antitest specificitásának vizsgálata

Az eredmény specificitása két dologtól függ: 1) az antitest specificitása 2) az alkalmazott módszer

Az antitest kötődése egy fehérjéhez nem jelenti azt, hogy minden módszerben működik (pl. immunhisztokémia).

Immunhisztokémia esetén a reakció specificitásának kontrollálására használnak: negatív kontrollt (az elsődleges antitest helyettesítése nem-immun szérummal) és pozitív kontrollt (olyan sejtek v. metszet reakciója az antitesttel, amely biztosan tartalmazza az adott fehérjét)

Mit akarunk kimutatni a specificitás jellemzésekor? Azt akarjuk demontstrálni, hogy az antitest kizárólag azt a fehérjét köti, amely az immunogén peptidet tartalmazta (ma már sok esetben peptiddel immunizálunk). Az antitest specificitásának megállapítására legalkalmasabb módszerek az immunoblot és az immunprecipitáció.

Poliklonális antitest élesztő Hda1 fehérje ellen: Immunizálás egy 21 tagú peptiddel Microarray (c): reakció 7 másik fehérjével is Immunoblot (a): reakció 3 másik fehérjével is (a másik 4 fehérjében az epitóp konformáció szenzitív lehet) Szekvencia összehasonlítás (b): jól magyarázza a keresztreakciót, DE! A szekvencia homólógia előre nem jól jelezte a keresztreakciót: 86 olyan fehérjét találtak az élesztő proteomban, ami nagyobb homológiát mutatott a peptiddel, mint a hét fehérje közül bármelyik. Továbbá csak három fehérje volt a hét közül az első 1000 találatban, melyet 6300 fehérje közül jósoltak.

Példa 1

3

Példa 2 Példa 3

Példa 4 Immunizálás humán myeloma IgG Fc fragmenssel, a monoklonális antitestek specificitásának vizsgálata

Az antitest specificitásának vizsgálata immunprecipitációval 1.  Antitest hozzáadása komplex antigén keverékhez (sejtlizátum, plazma,

szérum, egyéb testfolyadék stb.) 2.  Inkubálás 3.  Antitest-ag komplex megkötése Protein G/A Sepharose gél hozzáadásával 4.  A gél mosása 5.  Ag és at eluálása a gél felszínéről (pl. SDS-PAGE minta pufferrel) 6.  SDS-PAGE vagy egyéb kimutatása az eluált komponenseknek

Az 1-3 lépés helyett lehet immunprecipitálni kovalensen gélhez kötött antitesttel is.

Példa: hiszton poszttranszlációs módosulásaira specifikus antitestek vizsgálata

4

HOMOGÉN - HETEROGÉN

Nem szükséges elválasztani az immunkomplexben kötött és nem kötött komponenseket ahhoz, hogy a komplex mennyiségét megmérjük

A komplexben nem kötött komponenst el kell távolítani a komplex mérése előtt

KOMPETITÍV - NEM KOMPETITÍV

Nincs kompetíció, a kötőhelyek száma nem korlátozott

Jelölt és jelöletlen antigén verseng limitált mennyiségű antitest kötőhelyért

Az Ag-At reakció mérését befolyásoló tényezők

•  Affinitás •  Aviditás •  Ag:Ab arány •  Az antigén fizikai •  Formája •  Ionerősség •  pH •  Hőmérséklet •  Reakcióidő •  Hidrofil és

hidrofób molekulák jelenléte

•  A közeg viszkozitása

• 

Antigén koncentráció

Prec

ipitá

tum

men

nyis

ége

antigén túlsúly ekvivalencia

antitest túlsúly

A precipitátum mennyiségének változása az antigén koncentráció függvényében. (Heidelberger & Kendall kvantitatív immunprecipitációs görbe)

PRECIPITÁCIÓS MÓDSZEREK KVALITATÍV MÓDSZEREK Felhasználási terület Passzív géldiffúzió: kettôs immundiffúzió két vagy több teszt anyagban

lévô antigének azonosságának vagy különbözôségének eldöntése

Elektroforézissel immunelektroforézis myeloma proteinek azonosítása kombinált: kétdimenziós immunelektroforézis fehérjekeverékek vizsgálata,

aktiváció vagy más molekulákkal való kapcsolódás kimutatása counterimmunelektroforézis bakteriális antigének kimutatása vérbôl, vizeletbôl, cerebrospinális folyadékból immunfixáció myeloma proteinek azonosítása

KVANTITATÍV MÓDSZEREK Radiális immundiffúzió antigének mennyiségi Elektroimmunoassay meghatározása specifikus Turbidimetria antitestek segítségével Nefelometria

Antigén koncentráció

Prec

ipitá

tum

men

nyis

ége

antigén túlsúly ekvivalencia

antitest túlsúly

A precipitátum mennyiségének változása az antigén koncentráció függvényében. (Heidelberger & Kendall kvantitatív immunprecipitációs görbe)

is Io

= 4π2(dn/dc)2 Mc sin2Θ Naλ4r2

(Rayleigh)

Is polarizált fénnyel megvilágított kis méretű partikulumok által szórt fény intenzirtása

Io a beeső fény intenzitása dn/dc az oldószer/oldat fénytörési index változása Na Avogadro szám M molekulatömeg (g/mol) λ A megvilágító fény hullámhossza Θ A detektálás szöge R a detektor távolsága a fényszórás helyétől

A fényszórást befolyásoló tényezők

partikulum<0.1λ

5

KIS PARTIKULUMOK A fény szimmetrikusan szóródik, de 90°-ban kisebb mértékben (RAYLEIGH)

NAGYON NAGY PARTIKULUMOK A fény fôként elôre szóródik (MIE)

NAGY PARTIKULUMOK A fény fôként elôre szóródik (RAYLEIGH-DEBYE)

A részecskeméret hatása a beeső fény szóródására

Turbiditás

A megvilágító fény intenzitásának csökkenése miközben az áthalad egy partikulumokat tartalmazó oldaton. A fényintenzitás csökkenést a fény visszavarődése, szóródása és az abszorpció okozza. A turbiditás a következő képlettel fejezhető ki: I = Ioe-bt vagy t = (1/b)lnIo/I t turbiditás b a beeső fény hullámhossza

DETEKTOR

DETEKTOR FILTER

0° 90°

OPTIKA

MINTA CELLA

EXCITÁCIÓS OPTIKA

FÉNYFORRÁS

EXCITÁCIÓS FILTER

A= 0° TURBIDIMÉTER B= 30° NEFELOMÉTER C= 90° NEFELOMÉTER

A turbidimetria és nephelometria mérési elve

Wolfram-halogén lámpa (340-800 nm) Hélium-neon lézer (633 nm)

idô

jel

végpont

At Ag puffe

r

A fényszórás /abszorbancia változása az idő függvényében

idô

sebe

sség

Maximális sebesség At Ag pu

ffer

A reakció sebessége az idő függvényében (kinetikus meghatározás)

Optimális standard görbe turbidimetriás fehérje meghatározáshoz

6

Az abszorbancia változása az idő függvényében Minta vak mérés

Abs

zorb

anci

a

idô első leolvasás második leolvasás

Reagens abszorbancia Minta vak

Maximális jel At Ag

IgG

Ag koncentráció

jel

Mérési tartomány

Biztonsági tartomány

Kritikus pont

Ag koncentráció

jel

Mérési tartomány

Az antitest koncentráció hatása a biztonsági zónára (szaggatott vonal). 1: alacsony, 2: közepes, 3: magas antitest koncentráció

antigén latex partikulumhoz kötött antigénre specifikus antitest

antigén/antitest komplex turbidimetriás mérés

Turbidimetria és nefelometria érzékenyítése

Turbidimetriás/nefelometriás inhibíciós assay HIBALEHETŐSÉGEK: 1. Az antitest nincs feleslegben. 2.  A háttér fényszórás túl magas (pl. lipémia)

Ebben az esetben a kinetikus meghatározás előnyösebb, mint a végpontos.

3. Színes anyagok okozta interferencia. 4. A keverés nem megfelelő. 5. A mintában lévő immunkomplexek (reuma faktor) fals magas vagy alacsony értékeket okozhatnak a háttér korrekciótól

függően. ÉRZÉKENYSÉG: ng/L is lehet!

7

Antigén túlsúly tesztelése (kinetikus nefelometriás meghatározás)

TIME

Antigén koncentráció

Prec

ipitá

tum

men

nyis

ége

antigén túlsúly ekvivalencia

antitest túlsúly

A precipitátum mennyiségének változása az antigén koncentráció függvényében. (Heidelberger & Kendall kvantitatív immunprecipitációs görbe)

KETTŐS RADIÁLIS IMMUNDIFFÚZIÓ (Ouchterlony)

Ag antigén Ab antitest A két antigén immunológiailag A azonos B nem azonos C részlegesen azonos (sarkantyú) D a sarkantyú képz[dés sémája

Módszer: - kb. 3 mm vastag agar géllel (2-4% agar 0.9% NaCl-ban) megtöltött Petri csészét használunk

- Megfelelő eszközzel lyukakat készítünk a gélbe, melybe egy csepp 1%-os agart, majd 1-2 µl mintát töltünk

RADIÁLIS IMMUNDIFFÚZIÓ (Mancini)

1 feltöltés helye 2 ellenanyagot tartalmazó

agar-gél 3 precipitációs gyűrű St1-2-3 ismert

koncentrációjú standard fehérjeoldat

M vizsgálandó ismeretlen fehérjeoldat

IMMUNELEKTROFORÉZIS (IEP)

Módszer: - agaróz gélt öntünk üveg vagy műanyag lapra

- Megfelelő eszközzel lyukakat készítünk a gélbe, melyekbe néhány µl mintát töltünk (x, y, z)

- Az elektroforézis során a mintában lévő fehérjék eltérő elektroforetikus mobilitásuk miatt szétválnak

- Az elektroforézis után a szétválasztott fehérjék közötti hosszanti vájatokba (A, B, C) antitszérumot töltünk

- Az antitest és a szétválasztott antigének diffúziója precipitációs ívek képződéséhez vezet

IMMUNFIXÁCIÓ

Módszer: - Elektroforézist végzünk agaróz gélben

- A megfelelő antiszérumot közvetlenül a gélre szélesztjük, az antitest precipitálja az antigént

- A precipitátum a gélben marad, a többi fehérjét a gél mosásával eltávolítjuk

- A mosás után a gélt fehérje festékkel megfestjük

Elektroforézis után fehérje festés

Anti -IgG -IgA -IgM -kappa -lambda

8

Counterimmuno-elektroforézis

A gélben egymással szemben vándorol az antigén és az antitest. Ha találkoznak precipitátum képződik.

+ - minta

At

KÉTDIMENZIÓS IMMUNELEKTROFORÉZIS (CRIE)

Az első dimenzióban elektroforézissel szétválasztott fehérje frakciókat a lemezt 90°-ban elforgatva, a második dimenzióban specifikus antitestet tartalmazó gélbe futtatjuk.

KÉTDIMENZIÓS IMMUNELEKTROFORÉZIS (CRIE) Allergy Methods and Protocols Methods in Molecular Medicine Volume 138, 2008, pp 147-165

ELEKTROIMMUNOASSAY (RAKÉTA ELEKTROFORÉZIS)

Módszer: - Antiszérumot tartalmazó agaróz gélbe készített lyukakba (vagy gélre fektetett applikátor felviteli helyeire) mintákat töltünk

- Az elektroforézis során a mintában lévő fehérjék a + pólus felé vándorolnak

- Az antigént az antitest precipitálja, ha ekvivalencia koncentrációra hígul a vándorlás során, azaz a képződő rakétacsóva alakú precipitációs ív magassága az antitest eredeti koncentrációjától függ.

- Kalibrátorok alkalmazásával kalibrációs görbét készítünk

-

+

PRECIPITÁCIÓS MÓDSZEREK A diffúzió típusa Módszer neve Felhasználási terület

KVALITA- TÍV

Passzív kettős immundiffúzió két vagy több teszt anyagban lévő antigének azonosságának vagy különbözőségének eldöntése

Elektroforézist követően passzív

immunelektroforézis myeloma proteinek azonosítása

Elektroforézis

kétdimenziós immunelektroforézis

fehérjekeverékek vizsgálata, aktiváció vagy más molekulákkal való kapcsolódás kimutatása

Counter-immunelektroforézis

bakteriális antigének kimutatása vérből, vizeletből, cerebrospinális folyadékból

immunfixáció myeloma proteinek azonosítása

KVANTITA-TÍV

Passzív Radiális immundiffúzió

antigének mennyiségi meghatározása specifikus antitestek segítségével

Elektroforézis Elektroimmunoassay

nincs Turbidimetria

nincs Nefelometria