Adriana Maggi

DOCENTE DI BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHECORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO

AA 2011/2012Lezioni 21-22 Vaccini

SISTEMA IMMUNITARIO

1. immunità aspecifica o innata

2. immunità specifica o adattativa

IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA

Difese fisiche• pelle• muco• mucose

Difese chimiche/umorali• Enzimi (eg secrezioni esocrine quali saliva, lacrime ecc.)• Mediatori infiammazione • Complemento

Difese cellulari• Fagociti( macrofagi, neutrofili e cellule dendritiche)

mast cell, eosinofili, basofili e cellule natural killer

IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA Caratteristiche fondamentali

capacità di rispondere ad un vasto numero di agenti patogeni grazie al riconoscimento di un limitato numero di profili molecolari non-self estremamente diffusi in natura (come LPS, glicani ricchi in mannosio, RNA a doppia elica, ecc.).

La rapidità di risposta dovuta a meccanismi di riconoscimento presenti uniformemente su tutti i componenti dell’immunità aspecifica e sono completamente determinati a livello genetico senza alcun bisogno di processi maturativi di tipo epigenetico (cfr. immunità specifica).

IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA- Limiti

• efficacia non sempre ottimale

• l’incapacità di adattarsi alle contromisure sviluppate dai microrganismi patogeni

• una scarsa capacità di discriminazione tra self e non-self, che determina lo sviluppo di danni tessutali spesso sproporzionati rispetto all’entità dello stimolo immunogeno (infezione).

Microscopia elettronica di un neutrofilo che ingloba un

batterio di antrace

IMMUNITA’ INNATA NON SPECIFICA- Limiti

• efficacia non sempre ottimale

• incapacità di adattarsi alle contromisure sviluppate dai microrganismi patogeni

• scarsa capacità di discriminazione tra self e non-self, che determina lo sviluppo di danni tessutali spesso sproporzionati rispetto all’entità dello stimolo immunogeno (infezione).

IMMUNITA’ ACQUISITA• Immunità umorale: generazione di anticorpi efficace quando

il patogeno è nel tessuto ma non si è stabilito nelle singole cellule

• Immunità cellulo mediata: cellule citotossiche efficace per i virus ed altri patogeni localizzati a livello intracellulare

l’immunità specifica ha la capacità di adattarsi variabilità di agenti ambientali riconosciuti come un pericolo per l’organismo. Si calcola che tutte le possibili combinazioni molecolari presenti in natura e in grado di interagire con l’organismo si aggiri intorno a 1010

apprendimento – memoria - adattabilità

Immunità umorale: anticorpi che sono prodotti dalle plasmacellule derivate dai linfociti B. Il linfocita rileva un agente esterno grazie al suo recettore specifico e inizia la produzione di cellule clone che in parte saranno destinate alla memoria immunologica e in parte andranno a formare le plasmacellule. le plasmacellule poi produrranno gli anticorpi che si legheranno al corpo esterno bloccando i suoi siti attivi facilitando la fagocitosi da parte dei macrofagi.

Immunità specifica cellulare: è svolta dai linfociti T citotossici che distruggono un virus che ha già infettato una cellula. La cellula T citotossica si lega alla cellula bersaglio, rilasciando perforina che forma canali sulla membrana plasmatica della cellula bersaglio

IMMUNITA’ ACQUISITA

La cellula B riconosce e internalizza xenocomposti e agisce quale “antigen presenting cell” presentando gli antigeni alle cellule T CD4+ (T helper) che, riconosciuto l’antigene causano il differenziamento delle cellule B (nella milza e linfonodi) in cellule di memoria o plasmoblastiI plasmoblasti hanno la capacità di produrre anticorpi (con meno efficienza delle plasmacellule, si dividono e sono ancora in grado di agire quali antigen presenting cells e una vita di alcuni giorni prima di differenziarsi in cellula plasmatica ad opera di specifici fattori di trascrizioneLe cellule plasmatiche non hanno ipermutazione somatica, non sono in grado di internalizzare e presentare l’antigene, hanno una emivita che puo’ anche essere di mesi durante I quali producono anticorpi monospecifici a una velocita di migliaia/sec.

• immunità congenita• immunità naturale passiva: (es. allattamento) • immunità naturale attiva

IMMUNIZZAZIONE

COMPONENTI DEL SISTEMA IMMUNITARIO

IMMUNITA’ INNATA IMMUNITA’ ACQUISITA

Risposta aspecifica Risposta specifica

Risposta immediata e massima Intervallo tra esposizione e risposta massima

Componenti cellulari e umorali Componenti cellulari e umorali

Assenza di memoria Memoria

Presente in tutte le forme di vita Presente solo nei vertebrati superiori (gnatostomi)

• immunità congenita• immunità naturale attiva• immunità naturale passiva: (es. allattamento) • immunità artificiale attiva: vaccinazione • immunità artificiale passiva: sieroterapia

IMMUNIZZAZIONE

IMMUNIZZAZIONE ATTIVA- risposta umorale

In seguito all’immunizzazione si attivano le cellule B che esprimono sulla superficie anticorpi specifici nel riconoscere gli epitopi del vaccino. Al momento del contatto con il vaccino, in collaborazione con le cellule T helper, la cellula B si attiva e si ha una massiccia proliferazione clonale. Si originano così le plasmacellule che secernono grandi quantitativi di anticorpi solubili specifici

IMMUNIZZAZIONE ATTIVA- memoria

• Alcune cellule B attivate non diventano plasmacellule ma cellule della memoria

• Persistono per anni• Il contatto con un antigene identico induce una rapida differenziazione

a plasmacellule • Esistono anche cellule T della memoria

Le cellule della memoria si riattivano in presenza di uno stesso patogeno e danno luogo ad una reazione immunitaria più veloce ed efficace della prima.

RISPOSTA SECONDARIA

Tucidide nella sua descrizione della peste di Atene (430 ac) nota i sopravissuti alla peste potevano curare I malati senza contrarre la malattia per una seconda volta

Tucidide –mosaico da Jerash, Museo Altes, Berlino

VACCINI: le prime osservazioni

Edward Jenner (1749 - 1823)

Osservo’ che i mungitori quotidianamente a contatto col virus vaccinico (cowpox) raramente venivano infettati

“If you want to marry a woman who will never be scarred by pox, marry a milkmaid”

• Nel 1796 James Phipps (un bambino di 8 anni) fu vaccinato con materiale proveniente dalla lesione provocata dal vaiolo bovino sulla mano di Sarah Neimes

• 8 settimane dopo lo stesso bambino fu inoculato con il virus smallpox agente patogeno del vaiolo

• Il ragazzo non sviluppo’ il vaiolo

LE PRIME EVIDENZE

Hand of Sarah Neimes. Cowpox Pustule. From Jenner’s Inquiry 1798

PERCHE’?

LE PRIME VACCINAZIONI

VACCINAZIONI SUCCESSIVE

1840 Disponibile per tutti1841 Non obbligatoria1853 Diventa obbligatoria1871 Istituzione di uffici e personale

addetto alla vaccinazione Multe ai genitori che non

vaccinano i figli1948 E’ ritirata l’obbligatorieta’ della

vaccinazione

CRONOLOGIA DEI VACCINI

1790 Edward Jenner usò il virus vaccinico per proteggere dallo smallpox1880 Luis Pasteur sviluppò il primo vaccino efficace per la rabbia1890 Emil von Behring e Kitasato Shibasaburo svilupparono i vaccini per il

tetano e la difterite1900 Furono messi a punto i primi vaccini per il tifo ed il colera1910 Il vaccino per il tetano diventò disponibile1920 Si iniziò ad usare il vaccino per la tubercolosi1940 Si svilupparono i vaccini per l’influenza e la pertosse1950 Vaccini per la poliomelite (orale Sabin e Salk iniettabile)1970 Vaccino per il meningococco1980 I primi vaccini prodotti con la tecnologia del DNA ricombinante1990 Sviluppo di vaccini a subunità e vaccini contro malattie autoimmuni e

cancro. Produzione di vaccini in vettori virali ricombinanti

Elie Metchnikoff

 Paul Ehrlich

Nobel Prize in 1908

INCIDENZA DI ALCUNE PATOLOGIE PRE E POST-VACCINAZIONE

• Ultimo caso registrato a livello mondiale di “wild” smallpox

• Somalia Ottobre 1977

• Ali Maalin (23 anni)

GLI ESITI DELLE VACCINAZIONI DI MASSA PER IL VAIOLO

VACCINO

COS’E’? E’ una sospensione di organismi o una frazione di organismo, usata per indurre una risposta immunitariaCOME AGISCE? Simula un’infezione in maniera tale da attivare lo specifico meccanismo naturale di difesa dell’ospite contro il patogeno, così l’ospite rimane immune dalla malattia che normalmente segue all’infezione naturale

IMMUNIZZAZIONE PASSIVA

COS’ E’? E’ la somministrazione di anticorpi specifici per assicurare all’ospite una protezione immediata ma di breve durata.Gli anticorpi sono isolati dal siero di pazienti convalescenti o da donatori che hanno livelli particolarmente alti di specifici anticorpi

ESEMPI: - Tetano - Epatite B - Rabbia - Varicella Zoster - Siero contro il veleno di vipere e serpenti

I VACCINI: CARATTERISTICHE

INNOCUO il vaccino non deve provocare malattia o mortePROTETTIVO il vaccino deve proteggere contro la malattia che deriva dall’esposizione dell’agente patogeno vivoCONFERISCE PROTEZIONE PROLUNGATA la protezione contro l’esposizione deve durare per diversi anniINDUCE ANTICORPI NEUTRALIZZANTI alcuni patogeni infettano cellule che non possono essere sostituite (es neuroni). Per prevenire l’infezione di simili cellule sono necessari anticorpii neutralizzantiCONSIDERAZIONI PRATICHE Basso costo per dose, stabilità biologica, facilità di somministrazione, pochi effetti collaterali

I VACCINI: CLASSIFICAZIONE

1- VACCINI CONVENZIONALI

VIVI ATTENUATI

UCCISI

2- MODERNIPERFEZIONATI CON LE TECNICHE DI INGEGNERIA

GENETICA

I VACCINI VIVI ATTENUATI

a- Mediante selezione di ceppi mutanti a virulenza o tossicità ridotte es: antipolio orale, polivalente contro parotite, rosolia, morbillo

b- Mediante mutagenesi chimica es: Salmonella Typhi mutato con nitrosoguanidina

VANTAGGI: Sono sufficienti dosi minime perché proliferano nell’ospite

SVANTAGGI: - Per i vaccini virali il loro ac. nucleico può essere incorporato nel genoma dell’ospite

- Possono ritornare alla forma virulenta

I VACCINI VIVI ATTENUATI-metodologie

VACCINI UCCISI: CLASSIFICAZIONE

VACCINI UCCISI

I gen. II gen. III gen.

Sospensione inattivata del microrganismo patogeno. Purificazione poco o nulla

Purificazione del microrganismo patogeno o del componente protettivo

Combinazione di componenti protettivi o aggiunta delle proprietà immunizzanti ad esso (es: polisaccaridi coniugati a prot vettrici)

VACCINI UCCISI: organismi interi

• Inattivazione del microrganismo

• Vaccini contro pertosse, colera, febbre tifoide e antipolio

• Hanno alcuni svantaggi: inducono poca immunità cellulo-mediata, causano frequenti effetti avversi

CALOREREAGENTI CHIMICI (formaldeide, aldeide glutarica)

VACCINI UCCISI: i tossoidi

• Alcuni batteri producono tossine• Alcuni vaccini sono costituiti da tossine sottoposte a

trattamento chimico per eliminare le proprietà tossiche = TOSSOIDI

• Tale preparazione ha immunogenicità relativamente scarsa, si può migliorare adsorbendo il tossoide su una sospensione di sali di alluminio

• Con le tecnologie moderne le tossine possono essere detossificate con mutagenesi sito-diretta, questo garantisce la riproducibilità della proteina mutante e mantiene l’immunogenicità (es: tossina della pertosse)

toxin moiety antigenic determinants

chemical

modification

Toxin Toxoid

PRODUZIONE DI UN TOSSOIDE

VACCINI COSTITUITI DA UN TOSSOIDE: meccanismo d’azione

How has the vaccine industry changed in the last several years? This industry that used to be regarded as high volume, low value, low price has been transformed into an extremely high-value, first-world-

focused industry. That's come about through the realization that vaccination is an extremely cost-effective health care intervention and through the development of new products for diseases that are a heavy health burden, such as influenza and early childhood diseases. Some of

these new vaccines have become $1 billion-plus blockbusters for large pharmaceutical companies. In the last few years, the vaccine industry

has seen a wave of consolidation driven by Big Pharma, and in my view, this is likely to continue. In addition we have also seen the emergence of strong regional players in the emerging markets such as India and China, as well as greater collaboration between the public and private sectors.

Forbes intrview to Staph Leavenworth Bakali 2009

What opportunities and innovations do you see in the industry today?

Some of the big advances in vaccine research are new ways to discover novel vaccines, manufacturing technologies and delivery systems. In the past,

vaccines were always administered through a needle. Now, people are working on needle-free delivery,

including skin patches, oral vaccines, intranasal sprays and even vaccination via food.

VACCINI VIVI ATTENUATI: nuove tecnologie

• L’attenuazione non deve deprimere l’azione immunogena

• Si deve escludere il ritorno alla virulenza del microrganismo non mutazioni fini

Pathogenic virus

Delete virulence gene Mutate virulence gene

1

Isolate virulence gene

2

3b 3a

I VACCINI A BASE DI POLISACCARIDI

I semplici polisaccaridi capsulari sono antigeni scarsamente immunogeni e manifestano scarsa memoria immunologicaIl loro carattere immunogeno cresce di molto se si accoppiano chimicamente a proteine vettrici contenenti epitopi in grado di attivare cellule TTra gli esempi di vaccini coniugati di terza generazione abbiamo i vaccini polisaccaridici contro l’ Haemophilus influenzae di tipo b (ProHIBiT), recentemente introdotti in molti programmi nazionali di immunizzazione. Esso è costituito dai polisaccaridi capsulari del virus Haemophilus influenzae legati covalentemente al tossoide della difterite

NUOVE TECNOLOGIE PER LA PRODUZIONE DI VACCINI-1

1- VETTORI VIVI: per migliorare la sicurezza e l’efficacia dei vaccini si usano come vettori per gli antigeni, virus o batteri vivi inoffensivi

Il virus più utilizzato a questo scopo è il virus vaccino grazie ad alcune caratteristiche:

• Sicurezza nell’uomo• Possibilità di espressione immunogena multipla• Facilità di produzione• Relativa termoresistenza• Adattabilità a varie modalità di somministrazione

TK gene

Antibiotic resistance marker

Vaccinia promoter

Foreign gene

Ligation

Foreign gene

DNA

Vaccinia virus

Tissue culture cells

Homologous recombination

TK-negative recombinant virus

Foreign gene

Transfection Infection

selection

UTILIZZO DEL VIRUS VACCINO COME VETTORE

NUOVE TECNOLOGIE PER LA PRODUZIONE DI VACCINI-2

2- PROTEINE ESPRESSE NELLE CELLULE OSPITIPer aumentare la resa, facilitare la produzione e migliorare la sicurezza dei vaccini di proteine, spesso si fanno esprimere gli antigeni proteici in cellule ospiti facilmente manipolabili e che assicurino alti livelli di espressione.Tra gli ospiti ETEROLOGHI: lieviti, batteri e linee cellulari di mammifero

Choi

ce o

f an

Expr

essi

on

Syst

emBacterial Yeast Insect Mammalian

Fast developent Inexpensive production High fidelity protein folding

Protein can be directed to accumulate in the cell or be secreted

Posttranslational processing

Versatile

High initial product purity

High probablilty for active therapeutic

Continuous production possible

Low fidelity folding Poor posttranslational processing

N-terminal methionine Proteases, endotoxins Denatured protein requires renaturing

Fastidious host cells Specialized cell reactors Slow cell growth and product development

Expensive production $ $$

Pros

& C

ons

I VACCINI ANTICORPALI ANTI-IDIOTIPOSi basa sul concetto di evocare anticorpi contro il sito di legame per l’antigene dell’anticorpo protettivoIl metodo è particolarmente interessante per epitopi non proteici come carboidrati, difficili da isolare e da produrre in grandi quantità, oppure residui a struttura zuccherina di lipopolisaccaridi o glicoproteine tossicheIl principale inconveniente è che la porzione strutturale dell’anticorpo anti-idiotipo non ha relazione con la struttura dell’antigene originale, per questo se non si usano Ab umani può dare luogo a reazioni immunitarie.

I VACCINI BASATI SU PEPTIDI DI SINTESI-1

Si determinano gli epitopi immunogeni, si sintetizza chimicamente la piccola sequenza lineare peptidica che servirà da componente del vaccino. Si applica solo agli EPITOPI CONTINUI determinati unicamente dalla sequenza aminoacidica primaria.Per gli EPITOPI DUISCONTINUI si sintetizzano migliaia di peptidi a caso, poi si selezionano quelli che si legano in modo ottimale agli anticorpi protettivi

I VACCINI BASATI SU PEPTIDI DI SINTESI-2

VANTAGGI: - Si preparano in quantità illimitate - Si purificano facilmente - Non contengono materiali tossici o infettivi

SVANTAGGI: - Sono scarsamente immunogeni (possono però essere sintetizzati come peptidi antigenici multipli o accoppiati ad una proteina vettrice)

- Possono adottare varie conformazioni che potrebbero dare origine ad anticorpi che riconoscono il peptide e non l’antigene nativo

I VACCINI AD ACIDO NUCLEICO-1Il soggetto vaccinato riceve il DNA plasmidico o l’RNA messaggero che codifica per l’antigene desiderato. La proteina viene espressa nelle cellule ospiti ed evoca la risposta immunitariaLa via di somministrazione efficace è l’iniezione intramuscolare. Probabilmente ciò è dovuto al basso turnover delle cellule muscolari

VACCINI AD AC.NUCLEICO: meccanismo d’azione

I VACCINI AD ACIDO NUCLEICO-2

VANTAGGI: - attività immunogena intrinseca degli ac nucleici

- risposta immunitaria a lungo termine - risposta sia cellulare che umorale - possibilità di produzione su larga scala

SVANTAGGI: - sconosciuti gli effetti a lungo termine - possibile formazione di Ab anti-ac. nucleici - possibile integrazione nel genoma dell’ospite

ADIUVANTI

Sono materiali atti ad aumentare la risposta cellulare ed umorale contro l’antigene. Generalmente hanno due proprietà: a- convertono le proteine solubili in materiale particolato che è più facilmente inglobato in cellule presentanti l’antigene, quali i macrofagi.b- Contengono un costituente batterico o prodotti microbici che aumentano la risposta immunitaria

ADIUVANTI-2

I limiti:La complessità dei serotipi

(almeno 9)

Lo sviluppo di vaccini controStreptococcus Group B - GBS

(Streptococcus agalactiae)Un batterio Gram+

Rappuoli, Nat Rev Microbiol. 2006

By in silico analysis, genes encoding putative surface-associated and secreted proteins were identified from these two subgenomes:

A total of 589 proteins were identified (396 ‘core’ genes and 193 ‘variable’ genes), of which 312 were successfully expressed, purified and used to immunize mice. A

Genomic approachthe genome sequences of eight GBS strains belonging to different serotypes of GBS were analysed and compared1,811 genes ( 80% of each genome) were shared by all strains — ∼the ‘core’ genome — and 765 genes were not present in all strains — the ‘variable’ genome86.

The combination of four proteins, Sip (SAG0032), present in the core subgenome, and three other putative, surface-associated proteins (SAG1408, SAG0645, SAG0649), from the variable subgenome, elicited protection in infant mice and their combination proved highly protective against a large panel of GBS strains, including all circulating serotypes.This study validated the usefulness of the multigenome analysis approach in the identification

The proteomic approach

VACCINI ANTI-TUMORALI-1

Le cellule tumorali possono esprimere due tipi di antigeni:1. TUMOR SPECIFIC ANTIGENS (TSA)Si trovano unicamente in cellule tumoraliSono dovuti a mutazioni puntiformi o al riarrangiamento di geni cellulariAlcuni antigeni tumorali sono di natura virale, derivati dai virus

trasformanti:• virus dell’epatite B: carcinoma epatocellulare• virus Epstein-Barr: carcinoma nasofaringeo• Papilloma virus umano: cancro alla cervice

2. TUMOR ASSOCIATED ANTIGENS (TAA)Si trovano sia in cellule normali che neoplastiche ma la loro espressione è generalmente alterata/aumentata in cellule tumoraliNon sono riconosciute dal sistema immunitario

VACCINI ANTI-TUMORALI-2

Step 1: Identificare ed ingegnerizzare gli antigeni tumorali specifici (TSA) per essere riconosciuti dal sistema immunitario

Step 2: Isolare e coltivare cellule dendritiche in presenza di antigeni tumorali, quindi introdurle nuovamente nel paziente con lo scopo di stimolare un’intensa risposta immunitaria mediata da linfociti T

Staph Leavenworth Bakali has been involved in some of the biggest vaccine exits of all time. Through various senior operating and leadership positions

over a 20-year career in vaccines, Leavenworth Bakali has played a critical role in some of the most successful and leading vaccine companies. Bakali was formerly the chief operating officer of both ID Biomedical, a Vancouver,

Canada-based developer of influenza vaccines that was acquired by GlaxoSmithKline for $1.4 billion; and PowderJect Pharmaceuticals, an

Oxford, U.K.-based vaccine developer acquired by GlaxoSmithKline for $930 million. Bakali was also previously the director of worldwide sales and marketing at Chiron Vaccines and the director of SmithKline Beecham's

Vaccine Business Unit in France. He is currently a non-executive director at Vienna, Austria-based Intercell AG. Bakali holds a master's in management

from London Business School.