BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE

LEZIONE 7Proteine terapeutiche

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO

Adriana Maggi

Proteine terapeutiche

• Il numero di proteine terapeutiche attualmente in commercio supera i 250.

• I farmaci biotecnologici che vengono utilizzati per 384 indicazioni di cui 200 sono nuove terapie

• Attualmente ci sono più di 400 prodotti terapeutici biotecnologici in trial clinici. I farmaci in studio sono per la terapia di diversi tipi di neoplasie, Alzheimer, malattie cardiovascolari, diabete, sclerosi multipla, AIDS e artrite. Biotechnology Industry Organization (BIO)

Proteine terapeutiche

Proteine di I generazione identiche alle proteine endogene umane

Proteine di II generazione modificate al fine di:

-Migliorarne le caratteristiche farmacocinetica (diminuire la biodegradabilità, aumentare la penetrazione cellulare, ecc)-Generare prodotti innvativi con funzioni diverse da quelle originarie-Generare dei prodotti più stabili facilitandone la conservazione

Biosimilari

Proteine terapeutiche - Svantaggi

1.nuove metodologie di produzione2. riproducibilità nella produzione3.purificazione della macromolecola di

sintesi4.contaminanti nella purificazione5.stabilità del prodotto finito6.vie di somministrazione e

farmacocinetica

Proteine terapeutiche – Vantaggi

1.Generalmente esercitano una attività estremamente mirata e specifica2.Data la loro specificità hanno limitati effetti collaterali indesiderati3.Data la loro alta specificità ed essendo di origine umana sono generalmente ben tollerati4.Possono sopperire a un difetto genetico – nuovi bersagli terapeutici5.Il tempo di approvazione da parte delle autorità regolatorie è significativamente inferiore a quello di molecole di sintesi (1 anno per 33 proteine/ 294 piccole molecole approvate tra 1980 e 2002 )6.La protezione brevettuale può essere più lunga di altri composti per le difficoltà di ottenere prodotti biosimilari

RICERCA PRECLINICA E FARMACI BIOTEC

DRUG DISCOVERY:- scelta del bersaglio biologico- scelta dell’origine della molecola a potenziale

attivita’ farmacologica (lead compound)- identificazione della molecola attiva sul

bersaglio mediante opportuno screening

FORMULAZIONE FARMACEUTICA

FARMACOCINETICA E METABOLISMOFARMACOLOGIA GENERALE

TOSSICOLOGIA

FORMULAZIONE DEL DOSSIER PER INIZIO SPERIMENTAZIONE CLINICA

A fronte di un mercato farmaceutico in crescita del 7% rispetto al 2006, il mercato dei farmaci biotecnologici è cresciuto del 17.9% e oggi è pari a 65 miliardi di dollari (circa il 10% del mercato dei farmaci globale), inoltre due prodotti Biotech, Aranesp e Enbrel, sono state tra i primi dieci farmaci più venduti nel mondo nel 2006.

Farmaci biotecnologici

INSULINA

INSULINAormone polipeptico prodotto dalle cellule del pancreas

PREPROINSULINA

aa 51

catena B(30aa)

catena A(21aa)

RETICOLO ENDOPLASMATICO

PROINSULINAGRANULI DI SECREZIONE DEL GOLGI

SINTESI E MATURAZIONE DELL’INSULINA

peptide segnale

peptide C

PRODUZIONE DI INSULINA

PANCREAS DI MAIALE

ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE

insulina

A 8 A 10 B 30

umana Thr Ile Thr

suina Thr Ile Ala

bovina Ala Val Ala

1921-Scoperta dell’insulina (Banting e Best) e sua produzione per estrazione dal pancreas bovino o porcino

PRODUZIONE DI INSULINA

Zn++

Zn++

DIMERI DI INSULINA

ESAMERO DI INSULINA

1921- 1980: Aumento stabilità chimica delle

preparazioni di insulina con Zn++ e con formulazioni neutre (in ambiente acido avvengono reazioni di deamidazione)

Ottimizzazione tecniche estrattive e di purificazione (cromatografie)

PRODUZIONE DI INSULINA

catena B

Prodotto di

digestione+

SE

FA

DE

XDigestione con tripsina pH7.5 Gly23 e Arg22

Octapeptide C-terminale

insulina umana sintetizzato

chimicamente

Conversione enzimatica insulina SUINA in UMANA

da 10g di insulina suina ne vengono

prodotti 7 di umana

PRODUZIONE DI INSULINA

GENE INSULINA UMANA

PLASMIDE D’ESPRESSIONE

E.COLI

ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE

19821982DNA RICOMBINANTEDNA RICOMBINANTE

VANTAGGI

REAZIONI IMMUNITARIE

ELIMINAZIONE USO ANIMALI

PRODUZIONE DI INSULINA

GENENTECHGENENTECH: produzione in E.Coli di catene A e B separate e poi incubate in ambiente ossidativo per formare i ponti disolfuro

E.COLI

A B

PRODUZIONE DI INSULINA

ELYLILLYELYLILLY

FERMENTAZIONE

PROINSULINA CRUDA

PROINSULINA PARZIALMENTE PURIFICATA

INSULINA CRUDA

INSULINA PURIFICATA

INSULINA ALTAMENTE PURIFICATA

recupero delle cellule

cristallizzazione

proteolisi

enzimatica

colonne di scambio ionico gel filtrazione

RP-HPLC

MODIFICAZIONI DELL’ INSULINA

l’inserzione di un aa carico promuove la

repulsione fra monomeri (fast acting

insulin aspart)

la conversione di HisB10 in Glu aumenta

l’attività di 5 volte

Residui aa che interagiscono con il recettore e importanti per la

dimerizzazione:

A1,A4,A5,A19,A21B12,B16,B23,B24,B25,B26

STRATEGIE INNOVATIVE DELL’INSULINA

INSULINA GLARGINA

L’aumento del punto isoelettrico dell’insulina da 5.4 verso la neutralità (due arginine vengono aggiunte all’N-term. di B), causando la precipitazione nel sito d’iniezione, provoca un ritardo nell’assorbimento ed un prolungamento dell’effetto

INSULINA DETEMIR

L’acilazione covalente della LysB29 promuove il legame reversibile dell’insulina all’albumina ritardandone la distribuzione e il trasporto transendoteliale

TISSUEPLASMINOGEN

ACTIVATOR: t-PA

Di solito l’infarto e’ dovuto ad occlusione di arterie coronarie causata dalla formazione di un trombo di una placca aterosclerotica.Studi clinici hanno dimostrato che la lisi dei trombi con attivatori del plasminogeno diminuisce la mortalita’.

FARMACI USATI PER AMI:•STREPTOCHINASI•ANISTREPLASI•UROCHINASI•T-PA

L’INFARTO ACUTO AL MIOCARDIO (AMI) E ’LA PIU’ COMUNE CAUSA DI MORTE NEGLI STATI UNITI

lumeplacca

FARMACI TROMBOLITICI

La terapia con farmaci trombolitici tende a dissolvere i trombi e i depositi di fibrina nei siti dove è avvenuto un danno vascolare.Ovviamente tutti questi farmaci sono altamente tossici perché provocano emorragie.

NONOSTANTE L’IMPIEGO DEGLI AGENTI TROMBOLITICI ATTUALMENTE DISPONIBILI IL 45% DEI PAZIENTI NON PRESENTA DOPO 90’ UN RIPRISTINO COMPLETO DEL FLUSSO CORONARICO A CAUSA:

•COMPLESSITA’ STRUTTURALE DELLA PLACCA ATEROSCLEROTICA SU CUI SI FORMA IL TROMBO CORONARICO OCCLUDENTE

•REGIME TERAPEUTICO

LIMITI DEL TRATTAMENTO

INCAPACITA’ DI LISARE UNA SIGNIFICATIVA PROPORZIONE DI TROMBI CORONARICI

COMPLICANZE EMORRAGICHE

LA COAGULAZIONE

PLASMINOGENO (proenzima)

PLASMINA(enzima fibrinolitico)

FIBRINA PRODOTTI DEGRADATI

t-PA

LA FIBRINOLISI

PAI-1 E PAI-2

2-ANTIPLASMINA

trombo

Cellule endoteliali

Plasminogeno legato alla fibrina

Plasmina legata alla fibrina

Degradazione fibrina

t-PA

Il t-PA viene prodotto dalle cellule endoteliali e attiva il plasminogeno con

taglio enzimatico all’Arg560

STRUTTURA t-PA

•SERIN PROTEASI

•aa 527 (64kD)

•17 PONTI DISOLFURO

•4 N-GLICOSILAZIONI

•2 FORME (CON/SENZA GLICOSILAZIONE ASP184)

Viene scisso legame Arg275-Ile276

catena pesante N-terminale responsabile del legame alla fibrina •DOMINIO FINGER•DOMINIO EGF-LIKE•DUE KRINGLE

catena leggera C-terminale responabile dell’attività catalitica

•DOMINIO SERIN PROTEASI

His-Asp-Ser che taglia il plasminogeno

Nel corso della fibrinolisi la FIBRINA depositata nel

coagulolega il t-PA e lo attiva

FINGER

KRINGLE SERINPROTEASE

TAGLIO

NomeNome AlteplaseAlteplase AlteplaseAlteplase ReteplaseReteplase TeneTene

cteplasecteplase

Nome Nome

CommercialCommercialee

ActivaseActivase CatfhloCatfhlo

ActivasActivasee

RatavasRatavasee

TNKaseTNKase

Casa Casa

ProduttriceProduttriceGenentechGenentech GenentecGenentec

hhBoehringeBoehringe

rr

MannheimMannheim

GenentechGenentech

Uso Uso

terapeuticoterapeutico

InfartoInfarto

acuto del acuto del miocardiomiocardio

(AMI) (AMI)

Ripristino Ripristino della della

funzionalitàfunzionalità

cateteri cateteri vascolarivascolari

Infarto acuto Infarto acuto del miocardio del miocardio

(AMI) con (AMI) con aumento aumento

della della funzione funzione

ventricolare ventricolare in seguito in seguito all’eventoall’evento

Riduzione Riduzione della della

mortalità mortalità associata associata

all’infarto del all’infarto del miocardio miocardio acuto(AMI)acuto(AMI)

PRODOTTI COMMERCIALIZZATI

ALTEPLASE

IDENTICO ALL’ENDOGENO t-PA

UMANO

PRODOTTO A UNA O DUE CATENE IN CHO

EMIVITA <5MIN

LA CLEARANCE EPATICA E’ RECETTORE MEDIATA: LE CELLULE DEL KUPPFER E ENDOTELIALI ATTRAVERSO IL RECETTORE DEL MANNOSIO, GLI EPATOCITI CON UN RECETTORE CARBOIDRATO INDIPENDENTE

SOMMINISTRAZIONE I.V. DOSE RACCOMANDATA: 0.9 mg/kg PER INFUSIONE DI 60’, IL 10% DI FARMACO DEVE ESSERE INIETTATO IN BOLO IN 1’

RETEPLASE (2a generazione)

MUTANTE DI DELEZIONE (MANCA KRINGLE 1 , FINGER E EGFLIKE DOMAINS) NON GLICOSILATO

AUMENTA L’EMIVITA (15 MIN)

DIMINUISCE IL LEGAME CON LA FIBRINA

PRODOTTO IN E.COLI

SOSTITUZIONI AMINOACIDICHE IN DUE PUNTI DEL KRINGLE 1 AUMENTANO LA SPECIFICITA’ CON LA FIBRINA E DIMINUISCONO LA CLEARANCE PLASMATICA PROLUNGANDO L’EMIVITA (17 min)

GLY PER ASN 117

ASN PER THR A 103

ALA-ALA-ALA-ALA PER LYS-HIS-ARG-ARG A 296-299

TENECTEPLASE

QUATTRO SOSTITUZIONI AMINOACIDICHE NEL SITO CATALITICO AUMENTANO RESISTENZA AL PAI-1 E

AUMENTANO LA SPECIFICITA’ CON LA FIBRINA

NUOVE PROSPETTIVE: LANOTEPLASE

PRODOTTO IN CHO

MUTANTE DI DELEZIONE DEL t-PA NATIVO (MANCA DEL FINGER E EGF LIKE DOMAIN)+MUTAZIONE PUNTIFORME DA ASN117 A GLN

QUESTA MODIFICAZIONE EVITA LA CLEARANCE DA PARTE DEI REC

PER IL MANNOSIO EPATICI PROLUNGANDO L’EMIVITA A 10’

Proteine terapeutiche di I e II generazione: una nuova classificazione

funzionale

Leader et al. Nature Reviews Drug Discovery

7: 21-35, 2008

PROTEINE TERAPEUTICHE –classificazione funzionale

Gruppo I: proteine terapeutiche con attività enzimatica o regolatoria1a che rimpiazzano una proteina deficiente o anormale1b che aumentano attività esistenti1c che danno nuove funzioni/attività

Gruppo II: proteine terapeutiche con bersagli mirati2a che interferiscono con l’attività fisio-patologiche2b che rilasciano un composto terapeutico in un distretto specifico

Gruppo III: vaccini proteici3a che proteggono nei confronti di microorganismi esterni3b per il trattamento di malattie autoimmuni3c per la terapia anti-neoplastica

Gruppo IV proteine con attività diagnostica

Gruppo I

proteine terapeutiche con attività enzimatica o regolatoria

1a che rimpiazzano una proteina deficiente o anormale

1b che aumentano attività esistenti

1c che danno nuove funzioni/attività

Gruppo II proteine terapeutiche con bersagli mirati

2a che interferiscono con l’attività fisio-patologiche

2b che rilasciano un composto terapeutico in un distretto specifico

Da Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders, 1999

STRUTTURA DELLE IMMUNOGLOBULINE

Reclutamento di funzioni effettrici

Regione cerniera

Riconoscimento antigene

Stabilità

Legame al recettore di

riciclo

Frammento Fc

Riconoscimento antigene

LE IMMUNOGLOBULINE SONO NATURALMENTE SUDDIVISE IN DOMINI FUNZIONALI

Da Abbas, Lichtman & Pober: Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders, 1999

PRINCIPALI AVANZAMENTI BIOTECNOLOGICI CHE HANNO CONSENTITO LO SVILUPPO DELLA IMMUNOTERAPIA CON

ANTICORPI

1975 George Kohler and Cesar Milstein (Nobel 1984) sviluppano la tecnologia di ibridazione somatica per la produzione di anticorpi monoclonali

PRINCIPALI VANTAGGI:

OMOGENEITA’ DELLE PREPARAZIONI

SEMPLICITA’ DI PREPARAZIONE

Anticorpi Monoclonali MURINI in vivo:

Murino

Umanizzato

Chimerico

Umano

XX

Cellula ES

Inattivazione dei geni endogeni

IgH murina Igk murinaIgH umana Igk umana

Linea trasgenica producente anticorpi umani

Inserimento dei geni esogeni

Fusione sferoplasti contenenti cloni YAC

Linea trasgenica producente anticorpi murini e umani

Linea trasgenica incapace di produrre anticorpi murini

A

B

C

RituximabIl rituximab si lega a CD20, che si trova sulla superficie di uno dei tipi principali di globuli bianchi normali (linfociti B). Questa proteina si trova anche sulla superficie della maggior parte dei linfociti B che causano alcune forme di linfoma non Hodgkin. Il rituximab agisce attaccando sia i linfociti B maligni sia quelli normali; tuttavia, l’organismo è in grado di sostituire rapidamente eventuali globuli bianchi normali danneggiati, riducendo in tal modo sensibilmente il rischio di effetti collaterali.

Quando l’anticorpo monoclonale riconosce la proteina, LA LEGA e in questo modo stimola il sistema immunitario dell’organismo ad aggredire le cellule neoplastiche e può anche indurre le cellule a distruggere se stesse.

Primo anticorpo per terapia oncologica

Il trattamento con rituximab da solo o in combinazione con chemioterapia e’ in grado di dare una significativa risposta clinica (40% vs 10% ) ed un significativo prolungamento di tempo alla ricaduta (27 mesi vs 7 mesi)

> 350.000 pazienti trattati

>80 trial clinici in corso (www.clinical trials.gov)

Rituximab: alcuni dati!!

NOME GENERICO / NOME

COMMERCIALE

TIPO DI ANTICORPO

BERSAGLIOAPPROVAZION

E FDA

Trastuzumab/Herceptin

Umanizzato

Her2R 1998

Bevacizumab/Avastin

VEGF 2004

Cetuximab/Erbitux

Chimerico

EGFR 2004

Blocco del segnaledi crescita

Fc ReceptorAg

Signals blocked by MAb

ComplementC1q

TargetEffector

MAbLigands blocked by MAb

Target

TargetAg

Signals activated by MAb

TargettingA

BlockingB

SignallingC

MAb

Fc ReceptorAg

Signals blocked by MAb

ComplementC1q

TargetEffector

MAbLigands blocked by MAb

Target

TargetAg

Signals activated by MAb

TargettingA

BlockingB

SignallingC

MAb

HER2/EGFR

Altri meccanismi immunologici

Transtuzumab e Cetuximab meccanismo d’azione

Primo anticorpo approvato per terapia tumori solidi

Il trattamento con trastuzumab da solo come prima linea nei tumori metastatici ha dato 26% di risposta ed in combinazione con chemioterapici da’ un significativo prolungamento di tempo medio di risposta

> 100.000 pazienti trattati

Trastuzumab: alcuni dati!!

Herceptin (trastuzumab) the first protein kinase inhibitor to be approved, back in 1998, remains by far the most effective kinase inhibitor for treating any of the common cancers.

Nature Biotechnology, 2006

Gli anticorpi possono agire in vivo meglio di piccole molecole di sintesi?

Trastuzumab

Il trastuzumab (Herceptin() è un anticorpo monoclonale ricombinante umanizzato, con elevata affinità di legame per la proteina Her-2/neu e in grado di inibirne gli effetti sulla trasformazione cellulare maligna a livello dei tessuti epiteliali. HER-2/neu è una proteina di 185 kd, codificata dal gene c-erbB2 appartenente alla famiglia dell'epidermal growth factor receptor ad attività tirosin kinasica di tipo I.

Questo recettore, attraverso il legame con il ligando (Heregulin) e processi di fosforilazione, stimola la proliferazione e il differenziamento cellulare. HER-2/neu è espresso in molti tessuti normali ma è la iperespressione di questo recettore, che consegue a meccanismi del tipo amplificazione genica, ad avere un ruolo determinante nella patogenesi molecolare di alcune neoplasie epiteliali e, in particolare, del cancro mammario. L'iperespressione di HER-2/neu è stata rilevata in circa il 30% dei pazienti con carcinoma mammario metastatico e sembra costituire un fattore prognostico negativo

Il primo agente anti-angiogenico in grado di prolungare la sopravvivenza

Il trattamento con bevacizumab da solo o in combinazione con chemioterapia e’ in grado di dare una significativa risposta clinica in ca. renale (45% vs 35% ) e ca. colon

>> trial clinici in corso (www.clinical trials.gov)

Bevacizumab: alcuni dati!!Umanizzato

Studi in avanzato stato di sviluppo

Attualmente in corso negli USA con anticorpi monoclonali 84 trial clinicidi fase III (www.clinical trials.gov)

35/84 sono per tumori solidi:

3 transtuzumab + chemio

13 bevacizumab + chemio

14 cetuximab + chemio

2 bevacizumab + cetuximab + chemio

5 altri

Panitumomab: alcuni dati!!Umano

anticorpo anti EGFR da topo trasgenico (IgG2)

Studio di fase III randomizzato in 443 pt con ca. Colon metastatico in ripresa di malattia: il trattamento con panitumomab in combinazione con chemio vs chemio e’ in grado di dare una significativo prolungamento del tempo alla progressione (49% vivi vs 30% dopo 32 settimane)

Le risposte correlano con la tossicità cutanea

Si prevede l’approvazione FDA a breve

Ipilimumab: alcuni dati anticorpo anti CTLA-4 da topo

trasgenico (successivamente ingegnerizzato a IgG4 per evitare reclutamento C’ o FcR)

Studi di fase I/II nel melanoma e nel ca. ovarico

Incidenza di autoimmunità (grado III-IV) nel 15-25% dei casi

Meccanismo: modulazione dell’inibizione, adiuvante in vaccinologia, altro (sviluppo di anticorpi anti MICA)

AACR, April 2006:

Umano

TNF, tumor necrosis factor, produced by immuno competent cells, binds to TNF receptors (TNFR) and induces pro-inflammatory cytokine secretion (the NFkB pathway can be involved), increased cell migration to epidermis, activation of keratinocytes

TNF alpha antagonists

Infliximab is a monoclonal antibody. It binds to TNF, and inhibits binding of TNF to cell surface TNF receptors

Etanercept is a fusion protein consisting of an extracellular part of a TNFR linked to the Fc portion of IgG1. Etanercept binds TNF & blocks its interaction with cell surface TNF receptors

Mechanism of action of TNF-α antagonists. The monoclonal antibody (infliximab, adalimumab) and the receptor analog (etanercept) bind to circulating TNF-α and block its interaction with membrane receptor.

ANTAGONISTI DI TNFalfa

Abatacept ( Orencia ) è il capostipite di una nuova classe di farmaci denominati modulatori selettivi della costimolazione delle cellule T.

Abatacept inibisce la funzione delle cellule T, ma non produce deplezione di queste cellule.

Le cellule T attivate sono coinvolte nella cascata infiammatoria, con conseguente infiammazione a livello delle articolazioni e danno strutturale irreversibile. Abatacept è indicato nella riduzione dei segni e dei sintomi dell’artrite reumatoide in forma moderato-grave nei pazienti adulti, con inadeguata risposta ad almeno un farmaco modificante la malattia ( DMARD ).

Abatacept: proteina di fusione tra il dominio extracellulare di CTLA4 e la porzione Fc modificata dell’IG umana G1; inibisce le cellule T legando CD80 e CD86 bloccandone la interazione con CD28 e quindi bloccando la attivazione autoiimune delle cellule T

ENFUVIRTIVE: peptide di 36 aa che blocca l’entrata del virus HIV nella cellula ospite legando la proteina di superficie del virus gp120/gp41

Analoghi del GH : Pegvisomant

Analogo ricombinante di hGH - lys 120 sostituita con una glypreviene la dimerizzazione funzionale del recettore

qualsiasi aminoacido tranne lys o ala in questa posizione:Promotore della crescita Þ antagonista GH

- Pegilazione – coniugazione via i gruppi aminici a 4 - 6catene di polietilen-glicoleAumento di T1/2 (SC) a circa 6 giorniPicco plasmatico 33 - 77 ore

Ridotta immunogenicitàla pegilazione maschera i determinanti antigeniciRidotta affinità di legamealtri otto aminoacidi sostituiti

pegvisomant

Gruppo II proteine terapeutiche con bersagli mirati

2a che interferiscono con l’attività fisio-patologiche

2b che rilasciano un composto terapeutico in un distretto specifico

TOSITUMOMAB

lega l’antigene di superficie CD20 e stimola apoptosi; puo’ essere accoppiato con Iodio radionmarcato per svolgere una attività radiotossica