acervo (representando espécies e variantes genéticos de leishmania do novo mundo): 2.500 estoques...
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Acervo (representando espécies e variantes genéticos de Leishmania do Novo Mundo): 2.500 estoques criopreservados em diversos intervalos de tempo desde 1980.
Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz
Leishmania Type Culture Collection (WDCM)
Laboratório de Pesquisas em Leishmaniose (Departamento de Imunologia/IOC)
Centro de referência (WHO International Leishmania Reference Strain Center e SVS/MS)
FIOCRUZ
Equipe
Curadores - Elisa Cupolillo (PhD) e Gabriel Grimaldi (PhD)
Luiz Eduardo de Carvalho Paes – Tecnologista, BSc
Ângela Cristina Volpini – Tecnologista, PhD
Lilia Macedo Firoozmand – Tecnologista, BSc
Adriana Gaspar – Apoio Técnico
FIOCRUZ
Serviços prestados:
•Consultorias
•Formação de pessoal
•Depósito (guarda) de amostras
•Fornecimento, gratuito, de cepas de referência de Leishmania para grupos de pesquisas do Brasil e do exterior
•Tipagem bioquímica e molecular de amostras e isolados
FIOCRUZ
Perfil da coleção de Leishmania do IOC
•Trabalhos em colaboração com vários pesquisadores na América Latina
•Depósito de cepas de outros laboratórios, onde eram mantidas em cultura ou criobancos
•Isolados originais enviados diretamente ao nosso laboratório para identificação e que são depositados.
Nos últimos 5 anos, foram coletados mais de 1.000 isolados, provenientes de diversas áreas endêmicas no Brasil e outros países da América do Sul.
FIOCRUZ
Catalogação de dados relevantes da coleção
• Entrada das amostrasCada estoque depositado no Banco recebe um número de identificação
(IOC/L), sendo informatizados os dados relevantes sobre o
estoque.
Os estoques são reconhecidos pelo seu código (WHO 1990), que indica (1) espécie do animal reservatório ou vetor, de onde o parasito foi isolado; (2) país e (3) ano de isolamento; e (4) designação da cepa original
Ex.: MHOM/BR/1980/LSP MCHO/CR/1987/356 IFLA/BR/1967/P32
• Tipagem Bioquímica e Molecular e Classificação Taxonômica
1. Todas as amostras são classificadas em zimodemas empregando 18 sistemas loci-enzimáticos – IOC/Z
2. Perfis de RFLP dos ITSrDNA estão sendo construídos e adicionados ao banco FIOCRUZ
LeishmaniaLeishmania
-Protozoário unicelularProtozoário unicelular
- FlageladoFlagelado
- HeteroxenoHeteroxeno
- Dimórfico Dimórfico
FIGURA 1. Amastigotas FIGURA 2. Promastigotas
Espécies
L. (V. ) braziliensis
L . (V .) per uviana
Complexo
L . b r az il iens is
Espécie
L. (V. ) naiffi
Espécie
L. (V. ) lainsoni
Espécie
L. (V. ) lindembergi
Espécies
L. (V. ) guyanensis
L. (V. ) shawi
L . (V .) panamens is
Complexo
L . guyanens is
S ubgênero
V iannia
Espécie
L. (L. ) chagasi
Complexo
L . donovani
Espécies
L . (L .) mex icana
L. (L. ) amazonensis
L . (L .) venez uelens is
Complexo
L . mex icana
S ubgênero
Leishmania
Gênero
Leishmania
Família
T r ypanosomat idae
Adaptado WHO 1990 e Cupolillo et al. 1994
CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DE Leishmania NO
NOVO MUNDO
Centro de referência em Leishmania (WDCM 731)
-Estoques congelados:
(a) Leishmania na forma promastigota
(b) A maior parte dos estoques está criopreservados com glicerol 8%
- Informatização dos dados e cadastro dos estoques
Laboratório de Pesquisas
em Leishmaniose/ IOC
COLEÇÃO DE Leishmania DO IOC
1)Avaliar a estabilidade molecular (identidade) dos parasitos recuperados nas culturas empregando técnicas bioquímicas e moleculares;
2) Estabelecer um padrão ideal do número e forma morfológica dos parasitos a serem novamente criopreservados a fim de garantir amostras viáveis em um futuro descongelamento;
3) Determinar a viabilidade dos parasitos correlacionando com o tempo e condições que se mantiveram criopreservadas;
4) Garantir uma re-criopreservação com sucesso para que mais tarde as amostras ao serem descongeladas se apresentem estáveis e viáveis, isso através do conhecimento de uma faixa ideal do número de parasitas no momento da criopreservação;
6-fosfogluconato desidrogenase
Nucleosídio Hidrolase
Aconitato Hidratase
Fumarase
Glicose-Fosfo-Isomerase
Glicose-6-Fosfato-Desidrogenase
Hexoquinase
Isocitrato desidrogenase
Malato desidrogenase
Enzima Málica
Manose-Fosfato-Isomerase
Nucleotidase
Peptidase
Fosfo-Gluco-Mutase
Fosfatase Ácida
6PGDH -
NH -
ACON -
FUM -
GPI -
G6PDH -
HK -
IDH -
MDH -
ME -
MPI -
NH -
PEPD -
PGM -
ACP -
Isoenzimas
Métodos empregados nos estudos taxonômicos
Caracterização por MLEE – várias espécies de Leishmania
PCR ITSrDNA Os primers usados: ITS 1(5’ GCTGTAGGTGAACCTGCAGCAGCTGGATCATT-3’) e ITS 2 (5’-GCGGGTAGTCCTGCCAAACACTCAGGTCTG-3’)
SSU 5.8S LSU(1)
IR1 IR2
NTS
ITS
PCR - Produto específico de ITS rDNA
Organização estrutural do lócus rRNA.
RFLP
Classificação e relação filogenética
L. enriettii
Leptomonas
L.(S.) gymnodactyli
L. (S.) tarentolaeL. (S.) hoogstraali
L. (L.) amazonensisL. (L.) mexicana
L. (L.) donovani
L. (L.) tropicaL. (L.) major
L.hertigi
L. colombiensis
L. colombiensisL. equatoriensis
L. (V.) braziliensis
L. (V.) sp
L. (V.) guyanensis
L. (V.) panamensis
L. (V.) panamensis
0.1
100
57
100
100
100
100
96
70
100
98
82
94
PARALEISHMANIA
L. (Viannia)
L. (Sauroleishmania)
L. (Leishmania)
FIOCRUZ
35%
65% 69%65%
35% 31%
20 17 29
0%
20%
40%
60%
80%
100%
2 a 7 8 a 13 > 14
Intervalo de tempo em anos
Cu
ltu
ra (
%)
Negativo Positivo Amostragem
viabilidade relacionada ao tempo
Viabilidade celular de
L (L.) chagasi em relação ao tempo de
criopreservação.
GLICEROL
viabilidade relacionada a solução de congelamento
Relação entre o crioprotetor
utilizado para a preservação de
Leishmania
Procedimentos operacionais usados na manutenção e controle de qualidade dos espécimes colecionados:
•Normas padronizadas - “World Federation for Culture Collections” (WFCC), “American Type Culture Collection” (ATCC), Organização Mundial da Saúde (OMS)
•Manutenção – passagens seriadas
•Preservação – Nitrogênio líquido
•Controle de qualidade: tipagem períodica por métodos bioquímicos e moleculares
FIOCRUZ