accuratezza e correlazione istologica degli anticorpi anti actina nella malattia celiaca dottoranda:...
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ACCURATEZZA E CORRELAZIONE ISTOLOGICA DEGLI ANTICORPI ANTI ACTINA NELLA MALATTIA CELIACA
ACCURATEZZA E CORRELAZIONE ISTOLOGICA DEGLI ANTICORPI ANTI ACTINA NELLA MALATTIA CELIACA
Dottoranda: Coordinatore: Dott. ssa Fabbro Elisa Chiar. mo Prof. Alessandro Ventura
Tutore e Relatore: Dott. Not Tarcisio
Dottorato in Medicina Materno - Infantile, Pediatria dello Sviluppo e dell’Educazione, Perinatologia (XX ciclo)
Definizione di celiachia (CD):“E’ un’enteropatia autoimmune che si manifesta in individui geneticamente predisposti in seguito al consumo di glutine.”
LA CELIACHIALA CELIACHIA
In particolare la In particolare la frazione tossica frazione tossica del glutine del glutine è rappresentata è rappresentata dalla sua dalla sua componente componente alcool solubile:alcool solubile: LA GLIADINALA GLIADINA
La celiachiaLa celiachiaSINTOMI E
SEGNI
I VILLI INTESTINALI:
Sottili filamenti situati nell’intestino tenue deputati ad aumentare la superficie di assimilazione del tubo digerente. Il danno subito dai villi porta quindi ad una riduzione di tale superficie e ad un conseguente malassorbimento di nutrienti
La celiachiaLa celiachia SINTOMI GASTROINTESTINALI
Diarrea cronica con steatorrea ( perdita di grassi non assorbiti con le feci)Dolori addominali, epigastralgia e dispepsia
Meteorismo
Vomito
Spasmi addominali
La celiachiaLa celiachia SINTOMI EXTRAINTESTINALI
Anemia da carenza di ferro, di acido folico e/o vit. B12Aumento delle transaminasiOsteoporosiInfertilità / abortiDisturbi neurologiciCrampiRitardo della crescita ( nei bambini)Secchezza delle mucose
La celiachiaLa celiachia
PATOLOGIE ASSOCIATE
Diabete mellito insulino dipendenteTiroiditi autoimmuniArtrite reumatoide Sclerosi multiplaCardiomiopatia dilatativa Idiopatica
La celiachiaLa celiachia
DIAGNOSI
Per porre diagnosi di celiachia si seguono Per porre diagnosi di celiachia si seguono due due
diverse stradediverse strade : :
TECNICHE NON INVASIVETECNICHE NON INVASIVE
TECNICHE INVASIVETECNICHE INVASIVE
La celiachiaLa celiachia
Le tecniche invasive sono rappresentate da Le tecniche invasive sono rappresentate da esami strumentaliesami strumentali: : EGDS (esofagogastroduodenoscopia)EGDS (esofagogastroduodenoscopia)E’ la metodica attualmente più usata per E’ la metodica attualmente più usata per ottenere delle biopsie, che di solito sono ottenere delle biopsie, che di solito sono multiple, a livello della seconda o terza porzione multiple, a livello della seconda o terza porzione del duodeno.del duodeno.Soltanto la biopsia intestinale ci permette di Soltanto la biopsia intestinale ci permette di dimostrare, attraverso l’esame istologico, la dimostrare, attraverso l’esame istologico, la presenza delle lesioni intestinali che sono alla presenza delle lesioni intestinali che sono alla base della definizione di malattia celiaca base della definizione di malattia celiaca
DIAGNOSI
La celiachiaLa celiachia
DIAGNOSI
Le tecniche non invasive sono rappresentate dalla diagnostica di laboratorio
Sensitività % Sensitività % Specificita %Specificita %
AGA-IgG 69 – 85 73 – AGA-IgG 69 – 85 73 – 9090
AGA-IgA 75 – 90 82 – AGA-IgA 75 – 90 82 – 9595
EMA (IgA) 85 – 98 97 – EMA (IgA) 85 – 98 97 – 100100
TTG (IgA) 90 – 98TTG (IgA) 90 – 98 94 – 97 94 – 97
Test sierologici nella Test sierologici nella celiachiaceliachia
Sintomi1:5000
Anticorpi anti-glutine
1:500 – 1:250
Anticopri anti-endomisio1:150
Anticorpi anti-transglutaminasi
1:90
DIAGNOSIDIAGNOSIDiarreaDiarrea, Difetto di Difetto di CrescitaCrescita
Anemia, Bassa Statura
Malattie Autoimmuni
Programmi di “Case finding” Screening di Popolazione
EpidemiologiaEpidemiologia
ANTICORPI ANTI ACTINA:ANTICORPI ANTI ACTINA: nuovi marker sierologici nella nuovi marker sierologici nella
celiachiaceliachia Anticorpi Anti-Actina (A.A.A.):Anticorpi Anti-Actina (A.A.A.):
sensibilità ( 82-25%) sensibilità ( 82-25%)
specificità ( 100%)specificità ( 100%)
Valutazione Valutazione retrospettiva degli retrospettiva degli A.A.A. in sieri ( - 20°C )A.A.A. in sieri ( - 20°C )
sensibilità ( 43 %)sensibilità ( 43 %)
Type 0 Type 1 Type 2 Type 3
Marsh, Gastroenterology 1992, Vol 102: 330-354
NormalCeliac Diseae
(latent)
InfilitrativeCeliac
Giardiasis
Milk intolerance
Tropical sprue
Marasmus
GVHR
Hyper plastic
Celiac
Giardiasis
Milk intolerance
Tropical sprue
Marasmus
GVHR
Flat destructive
Celiac
Giardiasis
Milk intolerance
Tropical sprue
Marasmus
GVHR
Gli A.A.A. correlano con la lesione Gli A.A.A. correlano con la lesione istologica della mucosa intestinaleistologica della mucosa intestinale
Obiettivi:Obiettivi:
Allestire una metodica di Allestire una metodica di “immunofluorescenza indiretta“immunofluorescenza indiretta””
Misurare la riproducibilità del test
A.A.A. nella mucosa intestinale di un pz. con A.A.A. nella mucosa intestinale di un pz. con CDCD
Confrontare gli A.A.A. con gli anticorpi anti Confrontare gli A.A.A. con gli anticorpi anti Ttg nella CDTtg nella CD
Gli A.A.A. in una patologia autoimmune con Gli A.A.A. in una patologia autoimmune con danno del citoscheletro :danno del citoscheletro :la Cardiomiopatia Dilatativa Idiopaticala Cardiomiopatia Dilatativa Idiopatica
Obiettivi:Obiettivi:
Verificare il ruolo di fattori sierici leganti l’ Actina (A. B. P.) nell’inibizione del legame tra la proteina e il suo anticorpo
A. B. P.A. B. P. : proteine in grado di legare e di : proteine in grado di legare e di modificare la struttura molecolare modificare la struttura molecolare dell’dell’ActinaActina..
• GelsolinGelsolinaa
• CofilinaCofilina
risultati falsamente risultati falsamente negativi negativi ••
A. B. PA. B. P. sequestrano . sequestrano l’Actinal’Actina al legame con al legame con anticorpi specificianticorpi specifici
Materiali e MetodiMateriali e Metodi
Allestimento di vetrini attivati con Allestimento di vetrini attivati con cellule cellule “Hep2”“Hep2”
TrattamentoTrattamento fisico - chimicofisico - chimico dei dei sierisieri
Lettura al microscopio a Lettura al microscopio a fluorescenzafluorescenza
Celiaci diagnosticati tra il Celiaci diagnosticati tra il 2000 e il 20042000 e il 2004 : :
102 (12 =3a, 102 (12 =3a,
40=3b ,40=3b ,
48=3c);48=3c);
età media : 20 a. a.;età media : 20 a. a.;
sesso: 57 f., 45 m.;sesso: 57 f., 45 m.;
Controlli : 103 donatori saniControlli : 103 donatori sani
76 soggetti malati 76 soggetti malati (Chron, Rettocoliti U.)(Chron, Rettocoliti U.)
Immunofluorescenza indiretta (IFA)Immunofluorescenza indiretta (IFA)
1 2
3IgA anti-actina su cellule “Hep2.” Le tre foto (x40) illustrano la reattività di un siero di celiaco (lesione istologica 3b): 1 siero non trattato; 2 siero riscaldato; 3 siero in EDTA.La positività del test è evidente nei fotogrammi 2-3, mentre risulta essere poco visibile (freccia) nella foto 1.
Trattamento Trattamento fisico-chimico fisico-chimico dei dei sierisieri
Il pre trattamento facilita 1.l’osservazione al microscopio 2.rende il test più sensibile
1)1) Risultato: Risultato:
Pz Pz
celiaci:celiaci:
№ № =102 =102
Cntr.Cntr.
sani: sani:
№ № =103=103
Cntr.Cntr.
malati:malati:
№ № =76=76
% Positivi% Positivi
Sieri nonSieri non
Trattati Trattati (N.T.)(N.T.)
48 % 48 %
(№ :49)(№ :49)14,6 %14,6 %
(№:15)(№:15)18,4 %18,4 %
(№:14)(№:14)
Sieri Riscaldati
( R )
82,4 %82,4 % (№:84)(№:84)
24,3 %24,3 %
(№:25)(№:25)48,7 %48,7 %
(№:37)(№:37)
Sieri conE.D.T.A.
( E )
76,5 %76,5 % (№:78)(№:78)
13,5 %13,5 %
(№:14)(№:14)29 %29 %
(№:22)(№:22)
Positività degli A.A.A. nei gruppi di studio e nei Positività degli A.A.A. nei gruppi di studio e nei tre differenti metodi di trattamento dei tre differenti metodi di trattamento dei campioni.campioni.
sensibilitàsensibilità specificitàspecificità
Correlazione tra positività degli A.A.A. e grado di Correlazione tra positività degli A.A.A. e grado di
lesione istologica.lesione istologica.
TrattameTrattamento dei nto dei
sierisieri
Lesione Lesione 3a3a
LesionLesione 3be 3b
Lesione Lesione
3c3c
Non Non
TrattatoTrattatop = no p = no signsign..
4 4 (33.3%)(33.3%)
19 19 (47,5%(47,5%
))
2222
(45,8%)(45,8%)
RiscaldatRiscaldatoo
p = 0,039p = 0,039
88
(66,7%)(66,7%)
3131
(77,5%(77,5%))
4444
(91,7 %)(91,7 %)
Con Con EDTAEDTA
p = 0,001p = 0,001
66
(50%)(50%)
2727
(67,5%(67,5%))
4343
(89,6 (89,6 %)%)
2) 2) Risultato:Risultato:
La % di positivi è tanto maggiore quanto più grave è la lesione solo se i sieri sono pre-trattati
sensibilità
NT R E0.450.500.550.600.650.700.750.800.850.900.95
specificità
trattamento
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0.75
0.80
0.85
NT R E
Riproducibilità degli A.A.A.: i risultati di tre operatori
3)Risultato: 3)Risultato: Riproducibilità degli A.A.A.Riproducibilità degli A.A.A.
Metodica Metodica del del
trattametrattamentonto
KappKappaa
Forza di Forza di agreemenagreement Landis-t Landis-
KochKoch
RiproducibiRiproducibilitàlità
FleissFleiss
Non Non TrattatoTrattato 0,590,59 ModerataModerata BuonaBuona
TrattameTrattamentonto
FisicoFisicoO,61O,61 SostanzialSostanzial
eeBuonaBuona
TrattameTrattamentonto
ChimicoChimico0,640,64 SostanzialSostanzial
eeBuonaBuona
KappaKappa Forza della Forza della concordanzaconcordanza
< 0,00 < 0,00 PoveraPovera
0,00 – 0,0200,00 – 0,020 LieveLieve
0,21- 0,400,21- 0,40 DiscretaDiscreta
O,41-0,60O,41-0,60 ModerataModerata
0,61-0,800,61-0,80 SostanzialeSostanziale
0,81-10,81-1 Quasi perfettaQuasi perfetta
KappaKappa RiproducibilitàRiproducibilità
>0,75>0,75 EccellenteEccellente
0,40-0,740,40-0,74 BuonaBuona
0,00-0,0390,00-0,039 MarginaleMarginale
Tab. 1: griglia di valutazione di Landis-Koch
Tab. 2: griglia di valutazione di Fleiss
Valore predittivo positivo (VPP):Valore predittivo positivo (VPP):prob. che un individuo positivo al test abbia effettivamente la prob. che un individuo positivo al test abbia effettivamente la patologia in esamepatologia in esame
Valore predittivo negativo(VPN):Valore predittivo negativo(VPN):prob. che un individuo negativo al test NON abbia effettivamente la prob. che un individuo negativo al test NON abbia effettivamente la patologia in esamepatologia in esame
TrattameTrattamentonto
dei sieridei sieriVPPVPP VPNVPN
NonNon
TrattatoTrattato62,8 %62,8 % 74 %74 %
TrattameTrattamentonto
Chimico Chimico
(EDTA)(EDTA)
68,4 %68,4 % 85,6 %85,6 %
TrattameTrattamentonto
FisicoFisico
(CALORE(CALORE))
56 %56 % 86,7 %86,7 %
Attività inibitoria degli Attività inibitoria degli A .B. A .B. P.P.
Molecole sieriche che mascherano il legame degli A.A.A. alla proteina
Sequenza del test d’inibizione:Sequenza del test d’inibizione:1. Preincubazione delle cellule 1. Preincubazione delle cellule
con pool di sieri (A.A.A.-)con pool di sieri (A.A.A.-)2. Incubazione con siero di 2. Incubazione con siero di
celiaco pretrattato (A.A.A. celiaco pretrattato (A.A.A. +++)+++)
Attività inibitoria di fattori sierici (Attività inibitoria di fattori sierici (A. A. B. P.B. P.))::
L’attività inibitoria del pool (A.A.A. -) viene abolita dalla preincubazione con dosi crescenti di actina g (5-10-15-20 g/ml)
Pre incubazione dello stesso pool di sieri re incubazione dello stesso pool di sieri A.A.A. - con l’Anticorpo A.A.A. - con l’Anticorpo anti anti Gelsolina Gelsolina (Sigma G4896)(Sigma G4896)
Prove di identificazione:
4 )Risultato4 )Risultato
5)Risultato:5)Risultato:Confronto Ig A anti AAA- Confronto Ig A anti AAA- anti anti tTgtTg
IgA ANTI - ACTINAIgA ANTI - ACTINA IgAIgAANTI- ANTI- tTGtTG
PZ. CELIACIPZ. CELIACI (№ :102 )(№ :102 )
NONNON
TRATTATITRATTATI
TRATTAMENTOTRATTAMENTO
FISICOFISICO
TRATTAMENTTRATTAMENTOO
CHIMICOCHIMICO 100 % 100 % (№:102)(№:102)
48 %48 %(№ :49)(№ :49)
82,4%82,4%(№:84)(№:84) 76,5 % 76,5 %
(№:78)(№:78)
CONTROLLICONTROLLIMALATIMALATI
(№ :103 )(№ :103 )
18,4 %18,4 %
(№:14)(№:14)48,7 %48,7 %(№:37)(№:37)
29%29%(№:22)(№:22)
0 %0 %(№:0)(№:0)
CONTROLLICONTROLLI SANISANI
(№ :76 )(№ :76 )14,6 %14,6 %(№:15)(№:15)
24,3 %24,3 %(№:25)(№:25)
13,5 % 13,5 % (№:14)(№:14)
0 %0 %(№:0)(№:0)
Anticorpi Anti ActinaAnticorpi Anti Actina nella mucosa intestinale nella mucosa intestinale
selezione di anticorpi specifici per
actina
30 anticorpi anti Actina
4 anticorpi anti Actina
Da una libreria di anticorpi presenti nella mucosa intestinale di
un controllo sano
Da una libreria di anticorpi presenti nella mucosa intestinale di
un pz. celiaco ( 3 C, A.A.A.+ nel
siero)
5)Risultato:5)Risultato: Presenza A.A.A. nella mucosa Presenza A.A.A. nella mucosa intestinale di un celiaco intestinale di un celiaco
Incubazione con anticorpi ricombinantiIncubazione con anticorpi ricombinanti
Allestimento di vetrini attivati con cellule Hep 2b
Lettura al microscopio a fluorescenza
RICONFERMA DELLA POSITIVITA’:RICONFERMA DELLA POSITIVITA’:
FINGERPRINTING (P.C.R., digestione enzimatico, separazione elettroforetica)
P.M. A2 E5 G8 H7 A8 B12 C5 D7 D8 F8 H5 F2 B12 D5 E10 H6 D4 A7 D3 G6 H11 E9 F11
Caratterizzazione A.A.A.
Sequenziamento:Il sequenziamento del DNA è la determinazione dell'ordine dei diversi nucleotidi che costituiscono l'acido
nucleico. CLON
EVH Gene V Score CDR3
B5 VH 1 DP-14/V1-18+ 1173 GLGYCAGGCQVPYYALDV
B7 VH1 DP-14/V1-18+ 1173 GLGYCAGGCQVPYYALDV
E8 VH1 2M27/11M27... 1110 EEVRPTGDSYYTGLDV
C10 VH1 DP-14/V1-18 1164 GLGYCAGGCQVPYYALDV
H8 VH1 DP-14/V1-18 1173 GLGYCAGGCQVPYYALDV
C8 VH1 2M27/11M27 1092 EEVRPTGDSYYTGLDV
H10 VH5 VHVCW/COS-24 1263 HSDSYGSYYFDY
H9 VH3 COS-6/DA-8 1281 DLRRSDY
A5 VH6 DP-74/VH-VI 1236 GAPLCAL
B8 VH1 2M27/11M27 1110 EEVRPTGDSSCLV
H11 VH1 DP-14/V1-18 1173 GLGYCAGGCQVPYYALDV
A9 VH5 VHVCW/COS-24+ 1254 HSDSYGSYYFDY
H2 VH1 DP-14/V1-18+ 1128 GLGYCAGGCQVPYYALDV
H5 VH1 DP-14/V1-18+ 1146 GLGYCDGGCQVPYSALDV
C9 VH2 S12-10 1233 TGCSGDCSYYSYYGLDV
E10 VH3 DP-35/V3-11... 1236 GRVSGWLPFDY
A3 VH3 DP-47/V3-23.. 1182 LTSKYYHRMDV
A6 VH6 DP-74/VH-VI... 628 GSYRNTWVW
B11 VH3 V3-48/hv3d1 1218 DVHYGFDL
F9 VH1 DP-7/21-2...+ 1263 DVDGSGSFSPHSSYKYRMDV
H7 VH4 VIV-4/4.35+ 1239 YNWNDAPDGYDI
SOTTOGRUPPO DI CMPD
Patologia autoimmune organo specifica
Autoanticorpi riconoscono con lo specifico antigene
LA CARDIOMIOPATIA DILATATIVA IDIOPATICA (CMPD)patologia cronica e severa del miocardio caratterizzata patologia cronica e severa del miocardio caratterizzata
da una ridottada una ridotta
funzione contrattile dei ventricoli associata a funzione contrattile dei ventricoli associata a dilatazione delle camere cardiachedilatazione delle camere cardiache
Eziopatogenesi sconosciuta
Predisposizione genetica
Associazione con specifici alleli
HLA II
Contr. Sani:
№№=103=103
ProbanProban
di:di:
№ № =63=63
Parenti:Parenti:
№ №=84=84
% Positivi% Positivi
59,7 % 59,7 %
(№:36)(№:36)
21,4 %21,4 %
(№:18)(№:18)
SIERSIERII
% Positivi% Positivi
11,6 % 11,6 %
(№:12)(№:12)
6)Risultato:6)Risultato: CARDIOMOPATIA E AAA: una nuova CARDIOMOPATIA E AAA: una nuova associazioneassociazione
Positività degli A.A.A. in 63 pazienti con CMPD ,in 84parenti Positività degli A.A.A. in 63 pazienti con CMPD ,in 84parenti di di
primo grado e in un gruppo di 103 controlli saniprimo grado e in un gruppo di 103 controlli sani
Leggenda: rosso = A.A.A. + bianco = A.A.A.-
giallo = probando
CMPD Famiglia & Autoimmunità
Conclusioni:Conclusioni:
Il trattamento chimico e fisico migliora la sensibilità del test, Il trattamento chimico e fisico migliora la sensibilità del test, anche in sieri conservati a -20°C per 2-4 anni, a scapito di unaanche in sieri conservati a -20°C per 2-4 anni, a scapito di unaridotta specificità (80%)ridotta specificità (80%) TEST A.A.A. NON DEVE ESSERE UTILIZZATO NELLOTEST A.A.A. NON DEVE ESSERE UTILIZZATO NELLOSCRIINING DI CELIACHIASCRIINING DI CELIACHIA
Il dosaggio degli anticorpi anti tTg:Il dosaggio degli anticorpi anti tTg:•Sensibilità, Specificità= 98%Sensibilità, Specificità= 98%•Significativa correlazione con la gravita’ della lesione intestinaleSignificativa correlazione con la gravita’ della lesione intestinale
DOSAGGIO DELLE tTg:DOSAGGIO DELLE tTg:TEST PIU’ EFFICACE NELLA DIAGNOSI DI CELIACHIATEST PIU’ EFFICACE NELLA DIAGNOSI DI CELIACHIA
Conclusioni Conclusioni
Immunofluorescenza indiretta:test operatore-dipendente Immunofluorescenza indiretta:test operatore-dipendente
CARATTERIZZATO DA UNA BASSA RIPRODUCIBILITA’CARATTERIZZATO DA UNA BASSA RIPRODUCIBILITA’
DISPONIBILITA’ DI ANTICORPI ANTI DISPONIBILITA’ DI ANTICORPI ANTI ACTINA ISOLATI DA MUCOSA ACTINA ISOLATI DA MUCOSA INTESTINALEINTESTINALEda utilizzare controllo positivo nei test per il da utilizzare controllo positivo nei test per il dosaggio degli A.A.A.dosaggio degli A.A.A.
La Gelsolina sierica è una delle cause pricipali La Gelsolina sierica è una delle cause pricipali della bassa sensibilità del testdella bassa sensibilità del test
Obiettivi futuri:Obiettivi futuri:
Comprendere i meccanismi patogenetici alla baseComprendere i meccanismi patogenetici alla base
dell’associazione A.A.A.- CMPD in vivo e in vitrodell’associazione A.A.A.- CMPD in vivo e in vitro
Studi prospettici per comprendere il Studi prospettici per comprendere il ruolo predittivo degli A.A.A. in ruolo predittivo degli A.A.A. in familiari dei soggetti con CMPDfamiliari dei soggetti con CMPD
Verificare il ruolo degli A.A.A. nella patogenesiVerificare il ruolo degli A.A.A. nella patogenesi
del danno intestinale della CD del danno intestinale della CD
Available online at www.sciencedirect.comClinica Chimica Acta 390 (2008) 134–137
Uselessness of anti-actin antibody in celiac disease Uselessness of anti-actin antibody in celiac disease screeningscreening
Elisa FabbroElisa Fabbro, Laura Rubert, Sara Quaglia, Fortunato Ferrara,Valentina Kiren,Tarcisio Not
Department of Reproductive and Development Science, University of Trieste and I.R.C.CS“Burlo Garofolo”Trieste,ItalyReceived 20 November 2007 ;received in revised form 15 January 2008; accepted 15 January 2008
www.elsevier.com/locate/clinchim
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