TUGAS PRAKTIKUMMATA KULIAH BIOSAINS FLOWSITOMETRI

Journal Reading dan pembahasan Flowsitometri Jurnal (Siklus Sel)

Oleh Abdur Razaq Komaruzzaman Kelas Fast Track

PROGRAM MAGISATER ILMU BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN UVIBERSITAR BRAWIJAYA 2012

PGV-1 is a potent antimitotic agentBarinta Widaryanti 1) , Edy Meiyanto 1 *), Muhammad Dai 2) Kawaichi1)

1)

and Masashi

Cancer Chemoprevention research center, Faculty of Pharmacy, Gadjah Mada University 2) Division of Gene Function in Animals, Nara Institute Science and Technology, JapanMajalah Farmasi Indonesia, 19(3), 145 150, 2008

Pendahuluan Kurkumin merupakan satu dari komponen utama turmeric, agen fitokimia yang telah diketahui kandungan kemopreventifnya yang dapat melawan tumor. Berbagai kandungan medis dari kurkumin telah banyak dikenali. Kurkumin telah diketahui dapat menghambat proliferasi berbagai jenis sel-sel tumor. Inkubasi sel kanker payudara T47D dengan kurkumin 10 M selama 24 jam, dapat menginduksi akumulasi populasi sel dengan fase G1 (Dai et al, 2007). Kurkumin juga telah diketahui dapat menginduksi pemberhentian siklus sel pada fase G0/G1 dan/atau fase G2/M, meningkatkan regulasi CDK1s, p21, p27, p53, dan sedikit menekan regulasi cyclin B1 pada sel-sel endotel vena umbilikus (Park et al, 1998). Pusat penelitian kurkumin telah menemukan beberapa kandidat dari analog curcumin yang dapat berpotensi sebagai agen antikanker. Pentagamavunon-1 (PGV-1), merupakan salah satu analog dari kurkumin, yang telah diketahui memiliki potensi menghambat proloferasi sel kanker payudara pada manusia, yaitu sel T47D. Pada penelitian sebelumnya, telah ditemukan bahwa PGV-1 pada konsentrasi 2,5 M dapat memodulasi progresi siklus sel melalui fase pemberhentian G2/M, yang diikuti oleh sel-sel yang menjadi hiperploidi dan terjadi mitotic catarsrope pada sel-sel T47D (Dai et al, 2007). Pada efek ini, PGV-1 menginduksi ekspresi p21 dan defosforilasi CDK1. PGV-1 dapat berinteraksi dengan tubulin yang mengakibatkan penghambatan dari polimerisasi mikrotubul, yang diindikasikan dengan terbentuknya kondensasi tubulin. Namun, sel-sel tersebut dapat bermitosis, akan tetapi tidak diikuti dengan hasil dari cytokinesis dalam hiperploidi. Penemuan ini menunjukkan bahwa PGV-1 dapat memiliki efek inhibitor mikrotubul dan dapat dikategorikan sebagai agen antimikrotubul. Tujuan dari penelitian ini adalah mengamati mekansme yang memungkinkan PGV-1 sebagai agen anti mikrotubul, dapat berinteraksi dengan tubulin dalam polimerisasi atau depolimerisasi.

Motodologi Sel-sel dan PGV-1 T47D cell line telah didapat dari Laboratorium Divisi Onkologi Molekuler, NAIST, Jepang. Sel-sel tersebut dipelihara di dalam DMEM (sigma) plus 10% fetal bovine serum (Thermo Sci) dan penicillin/streptomycin 1%. PGV-1 didapat Pusat Penelitian Curcumin (CCRC), Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada. Analisis Flowsitometrik Sel-sel T47D diberi makan pada plate kultur dengan 6 sumur, masing-masig sumur berisi 5 x 105 sel. Setelah diinkubasi selama 24 jam, sel diberi PGV-1 2,4 M dan 1 M taxol pada 6, 12, dan 24 jam waktu inkubasi. Setelah diberi perlakuan, sel-sel tersebut di kumpulkan dan ditripsinasi, kemudian dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 1000 rpm selama 3 menit dan dicuci dua kali dengan PBS dingin. Kemudian sel di resuspensasi dalam larutan propidium iodida (50 g/mL dalam PBS yang berisi triton-x 100 1%) dan diberi RNAse dan DNAse free (20 g/mL) selama 10 menit pada suhu 37 derajad celcius. Sel yang diberi perlakuan kemudian di persiapkan untuk dianalisis flowcytometry dengan alat Facscalybour Flowcytometry. Profil siklus sel dianalisis menggunakan program quest aquisition. Data hasil dari analisis flowcytometry ditampilkan dengan histogram dengan menunjukkan berbagai komposisi sel-sel T47D berbagai fase. Immunofluorosence microscopy Sel-sel T47D telah ditumbuhkan dalam glass coverslip sebanyak 2,5 x 101 sel/ sumur. Setelah diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi 2,5 M PGV-1 dan 1 M taxol dan diinkubasi selama 12 dan 24 jam. Sel sel pada coverslip difiksasi dengan paraformaldehyde 4% dalam PBS selama 10 menit pada temperatur ruangan dan dipermeabilisasi dengan triton-X 100 1% pada PBS selama 5 menit. Setelah itu diblocking dengan bovine serum albumine dalam PBS selama 60 menit. Kemudian sel-sel tersebut diinkubasi dengan antibodi primer yang dapat berikatan dengan tubulin (1:200) selama 1 jam dan dicuci dengan PBS untuk menghilangkan antibodi yang tidak berikatan. Setelah itu sel-sel tersebut diinkubasi dengan anti mouse IgG FITC yang terkonjugasi dengan antibodi sekunder (1:100) selama 1 jam. Morfologi nuklear telah diperlihatkan dengan pewarnaan DAPI (0,1 g/mL). Sel-sel dalam coverslip di mounting pada permaflour dan dilihat dengan mikroskop konfokal. Pengukuran polimerisasi mikrotubul Sel-sel T47D diberi makan pada piringan 60 mm dengan jumlah sel rata-rata 8 x 105 sel/piringan. Setelah diinkubasi selama 24 jam, sel diberi 2 g/mL nocodazol selama 2 jam untuk mendepolimerisasi tubulin. Sel-sel kemudian dipisahkan dari nocodazol dan diberi lisis buffer stabilisasi mikrotubul yang berisi 4 M paclitaxel atau 4 M PGV-1, 1 M PIPES pH 6,9, 2 M glycerol, 5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 0,5% triton X-100, dan 5 g/mL leupeptin,

selama 0, 4, 8, dan 12 menit. Lisat sel kemudian disentrifugasi dengan kecepatan purat 25.000 rpm selama 30 menit pada suhu 220C untuk sedimentasi polimeric tubulin. Sedimen tersebut (yang berisi polimeric tubulin) diberi buffer solubilisasi yang berisi 25 mM tris-HCl pH 7,5, 0,4 M NaCl, 1% NP-40, 0,5% SDS, 0,1% deoxycholate, 5 g/mL leupeptin. Hasilnya kemudian dianalisis dengan western blot dengan menggunakan antibodi -tubulin.

Hasil dan diskusi Efek PGV-1 pada progresi siklus sel-sel kanker. Analisis flowcytometric terlah digunakan untuk mengobservasi distribusi populasi sel pada sklus sel. Seperti yang telah diperlihatkan pada gambar 1 (histogram), terdapat akumulasi pada fase G2/M dari sel-sel T47D yang diberi 2,5 M PGV-1 dan 1 M taxol setelah 12 jam inkubasi. Setelah inkubasi selama 24 jam, sel yang diberi PGV-1 menunjukkan penurunan populasi sel pada fase G2/M yang diikuti dengan meningkatnya poliploidi (M5) dan menurunnya fase sub G1. Sel yang diberi 1 M taxol menunjukkan peningkatan sel dengan poliploidi DNA dan menurunnya fase sub G1.

Gambar 1. Nalisis Flowcytometric. Sel-sel yang diberi perlakuan 2,5M PGV-1 dan 1 M Taxol, diinkubasi selama 12 jam dan 24 jam, dan diberi pewarnaan PI. Sel-sel T47D menunjukkan akumulasi fase G2/M.

PGV-1 menghambat polimerisasi tubulin Untuk mengobservasi efek PGV-1 pada interaksinya dengan mikrotubul, dalam penelitian ini diamati mekanisme polimerisasi pada sel-sel yang telah diberi PGV-1. Dengan menggunakan agen depolimerisasi tubulin, yaitu nocodazole, yang dapat mendepolimerisasi tubulin sementara, kemudian diikuti dengan pelepasan sampai pada medium tanpa nocodazole. Pewarnaan tubulin menunjukkan bahwa sel tanpa perlakuan memperlihatkan karakteristik pewarnaan dari mikrotubul secara individual yang diindikasikan dengan jaringan yang bertautan dengan baik dari material-material mikrotubular dan nuklei dengan pewarnaan DAPI. Sel-sel yang diberi PGV-1 menunjukkan jaringan yang bertautan sedikit baik dan menunjukkan beerapa nuklei yang utuh. Namun pada sel-sel yang diberi taxol menunjukkan kondensasi tubulin secara jelas dan cromatin yang terkondensasi (gambar 2). Pengukuran polimerisasi tubulin telah ditunjukkan dan sel-sel yang diberi taxol mengindikasikan akumulasi tubulin yang terpolimerisasi mulai dari 4 menit setelah pelepasan nocodazole danterlihat akumulasi yang menyolok setelah 12 menit pasca pelepasan nocodazole. Sebaliknya, sel yang diberi PGV-1 menunjukkan penurunan

akumulasi tubulin yang terpolimerisasi pada masing-masing menit ke 0, 4, 8, dan 12, setelah pelepasan nocodazole (gambar 3). Dari data diatas dapat disimpulakn bahwa penemuan ini mengindikasikan PGV-1 dan taxol dapat berinteraksi dengan tubulin dengan mekanisme yang berbeda.

Gambar 2. Efek PGV-1 pada polimerisasi tubulin. Mikrotubul telah diberi pewarnaan dengan FITC yang terkonjugasi antibodi alfa tubulin, DNA telah dberi pewarnaan dengan DAPI, kemudian di observase dengan mikroskop fluorosen.

Gambar 3. Efek PGV-1 pada polimerisasi tubulin. Sel-sel T47D yang diberi 2,5 M PGV-1 dan 1 M Taxol.

Dari analisis western blot terlihat ketebalan pada kontol yang menunjukkan tubulin yang terpolimerisasi. Kemudian pada saat diberi agen depolimerisasi sementara, nocodazole, sel-sel yang diberi taxol pada saat menit ke 4 mulai membentuk polimerisasi tubulin sampai pada menit ke 12 jumlah tubulin yang terpolimerisasi hampir menekati kontrol. Namun pada sel yang diberi PGV-1, pada menit ke 4 dan seterusnya, jumlah tubulin yangterpolimerisasi kurang dari kontol, hal ini ditunjukkan band pada menit ke 12 masih lebih tipis dariapada band kontrol.

Diskusi Pentagamavunon-1 (PGV-1) adalah salah satu dari analog curcumin yang menghambat proliferasi sel. IC 50 pada sel T47D adalah 1,5 mM dan pada MCF-7 lebih rendah dari curcumin (20 M) (dai et al, 2007). Data pada penelitian ini menunjukkan bahwa PGV-1 dapat menginduksi penghentian siklus sel pada fase G2/M secara signifikan pada konsentrasi 2,5 mM yang diikuti dengan hiperpliodi sel dan memperlihatkan mitotic catarstophe. Pada studi sebelumnya memperlihatkan bahwa PGV-1 dapat menginduksi ekspresi p21 dan aktivasi cdc-2 (Dai, 2007). Aktivasi cdc-2 menyebabkan akumulasi sel dengan hiperploidi area dengan analisis flowsytometry. Campuran yang berpotensi dapat menginduksi penghentian siklus sel pada fase G2/M yang diikuti dengan hiperploidi, aktivasi cdc-2 dan p21 ini mengindikasikan karakteristik antimikrotubule (Okada and Mak, 2004, Wang et al., 2000)

Mikrotubul merupakan komponen utama dari spindel mitotik, yang dapat menekan kromosom kemudian membelhnya menjadi dua pada pembelahan mitosis. Agen utama antimitotik adalah yang berinteraksi dengan tubulin. Berbagai agen antimitotik telah banyak dilaporkan dapat menginduksi p53 dan menghambat cdk (cyclin-dependent kinase), p21 dan mengaktivasi/deaktivasi berbagai macam protei kinase yang termasuk didalamnya raf/Ras, mitogen activated protein kinase, dan p34cdc2. Penelitian sebelumnya menemukan bahwa PGV-1 dapat menginduksi apoptosis yang bergantung pada p53 pada sel-sel T47D (Dai et al, 2007). Data pada penelitian ini dengan analisis mikroskopik, memperlihatkan bahwa PGV-1 dapat mengganggu susunan mikrotubul. Sel yang telah diberi taxol, menunjukkan bahwa terdapat kondensasi mikrotubul dengan jelas, serta kondensasi kromatin. Penemuan ini mengindikasikan bahwa PGV-1 memiliiki mekanisme yangberbeda dengan taxol dalam berinteraksi dengan tubulin. Taxol dapat menstabilkan polimerisasi tubulin, dan PGV-1 dapat menghambat polimerisasi tubulin. Efek antimitotik dari PGV-1 harus diteliti secara lebih lanjut dengan fakta, bahwa pengobatan dengan kompond ini memicu efek-efek molekuler yangtermasuk dalam mitotic signaling cascade. Hal ini melibatkan beberapa protein regulator mitosis seperti Bcl2, cdc25C, dan akumulasi Cyclin B.

Kesimpulan PGV-1 dapat memodilasi progresi siklus sel dengan penghentian fase G2/M dan menghambat polimerisasi tubulin.

Pembahasan Analisis siklus sel dengan Flowcytometry Flowcytometri telah digunakn untuk analisis dari berbagai komponen seluler (asam nukleat, lipid, protein, dll), organel-organel (lisosom, mitokondria, dll), atau fungsi fungsi di dalam sel (viabilitas, aktivitas enzim, dll). Namun, pada saat ini, berbagai aplikasi yang sudah ada, studinya berdasar pada immunofluorosence atau konten DNA seluler. Analisis siklus sel dengan menggunakan flowcytometri merupakan dasar penting dalam penelitian dan dunia biomedis. Di dalam farmakologi, hal ini dapat mdiunakan sebagai tert dari obat baru secara in vitro seperti faktor antitumor, dalam perkembangannya untuk menemukan cara pengobatan baru. Di dalam onkologi, konten DNA sel dan distribusinya pada berbagai fase suklus sel, dapat digunakan untuk mendeteksi sel-sel yang patologis, untuk memperkirakan prognosis atau hanya untuk memonitor perawatan (Jayat, 1993).

(a) Skema representasi dari hubungan antara kandungan DNA dan posisi sel dalam siklus untuk populasi yang asynchronous; (b) histogram distribusi teoritis berdasarkan konten DNA; (c) distribusi histogram yang diperoleh setelah analisis flowcytometry (Jayat, 1993)

Pattern dari analisis menggunakan Flowcytometry dengan berbagai pewarnaan.

Fluorescent Light yang dipancarkan oleh pewarna DNA (FL2) menghasilkan signal elektronik yang dapat direkam sebagai intensitas tinggi (FL2H) dari pewarnaan yang sama

dengan pulse area (FL2A) dan pulse width (FL2W) dari sampel. Dengan pottong FL2W dan FL2A dalam grafik dot plot dapat membedakan fase G0/G1, S, dan G2 + M (Nunez, 2001)

Gambar 4. Pemisahan tiap area pada grafik dot plot dengan grafik histogram pada setiap fase siklus sel (Nunez, 2001)

Pergeseran redistribusi dari fase-fase siklus sel dalam respon terhadap stimuli termasuk respon terhadap growth factor, obat-obatan, mutasi, atau nutrisi dapat diukur dengan menggunakan flowcytometri. Cara untuk membedakan proporsi jumlah sel-sel yang berada dalam fase G0/G1, S, dan G2/M biasanya dibagi menjadi 3 kelas, yaitu : dengan analisis DNA, eksperimen penggabungan analog DNA, dan menggunakan marker intraseluler pada siklus sel. Penggunaan pewarna yang terinterkalasi untuk mengukur kandungan DNA merupakan cara yang paling umum dan biasanya cukup bagi peneliti untuk menentukan pergeseran relatif dalam fase siklus sel.

Berbagai macam metode analisis progresi siklus sel dengan flowcytometry berkembang dalam tiga dekade terakhir. Metode-metode ini dapat dibedakan menjadi tiga, yaitu : 1. Metode yang pertama yaitu metode yang mengandalkan single time point (snapshot) cell measurement. Analisis ini dapat univariat, umumnya hanya berdasarkan pengukuran konten DNA seluler, atau multivariat (multiparameter), ketika diukur konten DNA ditambah dengan atribut sel yang lain. Atribut tambahan umumnya merupakan gambaran metabolik atau molekuler yang berhubungan dengan tingkat progresi sel selama siklus sel, atau merupakan marker potensial proliferasi atau diamnya sebuah sel. Sebuah analisis Single time-point measurement menunjukkan presentase sel-sel pada fase G1, S, dan G2/M, tetapi tidak menyediakan informasi kietik siklus sel. Durasi dari setiap fase, bagaimanapun juga, dapat diperkirakan dari persentase sel-sel pada fase tersebut jika panjang dari siklus sel (atau dua kali lipatnya waktu pada saat kultur sel) telah diketahui. 2. Metode yang kedua merupakan metode yang mengggunakan time-lapse

measurement dari populasi sel yang disinkronkan dalam siklus sel, atau perkembangan yang melalui siklus dihentikan oleh agen menangkap mereka pada titik tertentu dari siklus. Contohnya seperti metode yang menggunakan pendekatan stathmokinetic, dimana sel-sel telah terperangkap dalam kondisi mitosis oleh vinblastine or colcemide, dan tingkat masuknya sel-sel tersebut ke proses mitosis (cell birth rate) terlah dapat diukur dari lereng yang merepresentasian peningkatan kumulatif dari presentasi sel-sel yang mengalami mitosis sebagai fungsi dari waktu penangkapan. 3. Metode yang ketiga yaitu metode yang berdasarkan deteksi dari penggabungan analog thymidine 5'-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), yang sering bergabung dengan konten DNA. Pengukuran ini mungkin bisa menjadi single time-point measurement atau time-lapse strategy. Penggabungan BrdU dideteksi secara sitokimia

menggunakan pewarna DNA seperti Hoechst 33258, atau secata imunohistokimia menggunakan antibodi BrdU yang telah difluorosenkan. (Pozarowski, 2001)

Pada gambar hasil penelitian diatas, menunjukkan berbagai fase dari siklus sel beserta persentasinya. Pada penelitian ini menggunakan pewarna PI. PI (propodium Iodida) merupakan pewarna yang memiliki modus pengikatan secara intercalative. Penampakan data ditampilkan secara histogram yang menunjukkan pattern dari siklus sel. Dengan M1 adalah fase M, M2 adalah fase G1, M3 adalah fase S, M4 adalah fase G2/M, sedangkan M5 adalah fase polyploidy. Fase poly ploidi pada regio M5 dapat terjadi akibat perlakuan pada penelitian ini yang dimana sel T47D telah diberi curcumin yang telah dikethui dapat menghambat proliferasi tubulin sehingga mikrotubul tidak terbentuk sebagai fungsi pembelahan kromosom pada mitosis. Selain itu, pada penelitian ini digunakan analisis univariat atau monoparametric, yang mana hanya digunakan satu ukuran untuk menganalisis siklus sel, yaitu konten DNA seluler yang di beri pewarnaan Propidiun Iodida.

Daftar Pustaka

Jayat, Chantal and Marie-Ha1ene Ratinaud. Cell cycle analysis by flow cytometry: Principles and applications. Biol Cell (1993) 78, 15-25

Nunez, Rafael. DNA Measurement and Cell Cycle Analysis by Flow Cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. (2001) 3(3): 67-70.

Pozarowski, Piotr and Zbigniew Darzynkiewicz. Analysis of Cell Cycle by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology, vol. 281: Checkpoint Controls and Cancer, Volume 2: Activation and Regulation Protocols.

Widaryanti, et al. PGV-1 is a potent antimitotic agent. Majalah Farmasi Indonesia,19(3), 145 150, 2008