aanmaak reporterconstructen en stabiele transgene lijnen ... · fyla platyhelminthes, nemertea,...

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT WETENSCHAPPEN

OPLEIDING BIOLOGIE

ACADEMIEJAAR 2010 – 2011

Aanmaak reporterconstructen en stabiele transgene lijnen bij de

nematode Caenorhabditis elegans

door

Glenn VERMOTE

Promotor: Prof. Dr. Bart P. Braeckman Scriptie voorgelegd tot het

Begeleider: Sasha De Henau behalen van de graad van

Onderzoeksgroep: Vanfleteren Lab – Verouderingsfysiologie, Master in Biologie

Cellulaire fysiologie en Moleculaire evolutie

1

Inhoudstafel

1 Inleiding …………………………………………………………………………….. … 4

1.1 Geschiedenis ……………………………………………………………..……… … 4

1.2 Globines ……………………………………………………………….………… … 4

1.2.1 Verspreiding ……………………………………………………………… … 4

1.2.2 Types ……………………………………………………………………... … 5

1.2.3 Structuur en affiniteit …………………………………………………….. … 6

1.2.4 Functies ………………………………………………………………...… … 7

1.3 Caenorhabditis elegans …………………………………………………………. … 9

1.3.1 Algemeen ………………………………………………………………… … 9

1.3.2 Levenscyclus …………………………………………………………..…. … 10

1.3.3 Morfologie ……………………………………………………………….. … 11

1.3.4 Voortplanting …………………………………………………………….. … 13

1.3.5 Genetische code ………………………………………………………..… … 14

1.4 Reportersystemen …….…………………………………………………………. … 15

1.4.1 Algemeen ………………………………………………………………… … 15

1.4.2 Groen fluorescent proteïne (GFP) ……...……………………………...…. … 16

1.4.3 Reporterconstructen …..………………………………………………….. … 16

1.4.4 Aanmaak reporterconstructen ….………..……………………………….. … 17

1.4.4.1 Algemeen ………………………………………………………… … 17

1.4.4.2 PCR Fusie …………………………………………...…………… … 17

1.4.4.3 Agarose gelelektroforese …………………………….…………… … 19

1.4.4.4 Kloneren in een vector (BP recombinatie reactie) ….……………. … 20

1.4.4.5 Transformatie bij Escherichia coli………………………………... … 21

1.4.4.6 Plasmidenisolatie ………………………………………………… … 21

1.4.4.7 Restrictie digest en sequentie analyse ……………………….…… … 21

1.5 Aanmaak stabiele transgene Caenorhabditis elegans lijnen….....………………. … 22

1.5.1 Algemeen ………………………………………………………………… … 22

1.5.2 Kiemlijn injectie ………………………...……………………………...…… 22

1.5.3 Microdeeltjes beschieting …….………………………………………….. … 23

2 Doelstelling ………...……………………………………………………………….. … 25

2

3 Materiaal en methode …..………………………………………………………….. … 26

3.1 Caenorhabditis elegans …………………………………………………….…… … 26

3.1.1 Kweek van Escherichia coli ………….………………………..………… … 26

3.1.2 Maken van nutriënt agar platen …….…...………………………………... … 26

3.1.3 Maken van NGM platen …………....…...……………………………..….… 27

3.1.4 Opstarten van een synchrone cultuur …...……………………………..…. … 28

3.1.4.1 Nematoden bevriezen ..…………………………………………… … 28

3.1.4.2 Chloroxen ….………………………………………...…………… … 28

3.1.4.3 Wormen op plaat brengen …..……………………….…………… … 29

3.2 Aanmaak reporterconstructen ...…………………………………………….…… … 29

3.2.1 Algemeen …………………….……….………………………..………… … 29

3.2.2 PCR Fusie ………………………….…...……………………………..…. … 30

3.2.2.1 Algemeen ..………………………………………..……………… … 30

3.2.2.2 PCR 1 ….………………………………………...……………..… … 30

3.2.2.3 PCR 2 ..…………………………………………………………… … 32

3.2.2.4 PCR 3 ….………………………………………...………..……… … 33

3.2.2.5 Controle PCR fusie ………………………………….…………… … 34

3.2.2.6 Gelextractie ……………………………………...………..……… … 35

3.2.2.7 Concentratie bepalen ………..…………………...………..……… … 36

3.2.3 Kloneren (BP reactie) …...………....…...……………………………..…. … 37

3.2.4 Transformatie …………....………....…...……………………………..…. … 37

3.2.4.1 Algemeen ..………………………………………..……………… … 37

3.2.4.2 Kolonie cracking ………………………………...……………..… … 38

3.2.5 Plasmidenisolatie …....…………......…...……………………………..…. … 39

3.2.5.1 Algemeen ..………………………………………..……………… … 39

3.2.5.2 Eerste plasmidenisolatie ………………………………..……....… … 39

3.2.5.3 Restrictie digest ……………………..……………..…………….. … 40

3.2.5.4 Tweede plasmidenisolatie ……………………………..……….… … 41

3.2.5.5 Nanodrop analyse…………………..……………..………………. … 42

3.2.5.6 Restrictie digest……….……………………………..……….…… … 43

3.3 Aanmaak stabiele transgene Caenorhabditis elegans lijnen……………….……. … 44

3.3.1 Microdeeltjes beschieting ….....………………………………………….. … 44

3.3.1.1 Algemeen ..………………………………………..……………… … 44

3.3.1.2 Voorbereiding…….……………………………...……………..… … 44

3

3.3.1.3 Beschieting…………..……………………………………………. … 45

3.3.1.4 Verzorging van de wormen na beschieting…………………...…... … 46

3.3.2 Detectie transgene lijnen.…………………………………………….…… … 47

4 Resultaten ……...………………………………………………………………..….. … 48

4.1 Aanmaak reporterconstructen ………...…………………………………….…… … 48

4.1.1 PCR Fusie ………...……………………………………………………… … 48

4.1.1.1 Algemeen ..………………………………………..……………… … 48

4.1.1.2 PCR 1 ….………………………………………...……………..… … 48

4.1.1.3 PCR 2 ….………………………………………...……………..… … 51

4.1.1.4 PCR 3 ….………………………………………...……………..… … 55

4.1.2 Klonering ………...………………………………………………………. … 61

4.1.3 Transformatie……...……………………………………………………… … 62

4.1.4 Plasmidenisolatie...……………………………………………………….. … 62

4.2 Aanmaak stabiele transgene Caenorhabditis elegans lijnen…………………….. … 69

4.2.1 Microdeeltjes beschieting………………………………………………… … 70

4.2.2 Detectie transgene lijnen………………………………………………….. … 70

5 Discussie …..………………………………..……………………………………….. … 72

5.1 Aanmaak reporterconstructen……………………………...…………………….. … 72

5.2 Aanmaak stabiele transgene Caenorhabditis elegans lijnen…………………….. … 74

6 Conclusie ……...………………………………………...………………………….. … 76

7 Summary …..…………………………………………………..…………………… … 77

8 Dankwoord ……...………………………………………………………………….. … 80

9 Referenties …..………………………………………………………………..…….. … 81

4

1. Inleiding

1.1 Geschiedenis

Algemeen wordt aangenomen dat het allereerste leven op aarde ontstond zonder de

aanwezigheid van zuurstof. Dit element werd pas beschikbaar ongeveer 2300 MYA (Bekker

et al. 2004). Het was een belangrijke stap in de evolutie, daar de reductie van zuurstof een

grotere hoeveelheid energie opwekt dan anaerobe respiratie. Een grote uitdaging voor veel

organismen ligt echter in de distributie van zuurstof doorheen het lichaam. Deze selectiedruk

zorgde voor het ontstaan van drie soorten proteïnen: hemerythrines, hemocyanines en

hemoglobines (Kurtz 1991, Van Holde & Miller 1995, Hardisson 1996). Hiervan zijn de

globines het best verspreid, ze komen in alle koninkrijken van het leven voor. Oorspronkelijk

werd de term hemoglobine gegeven aan deze eiwitfamilie, genaamd naar het

zuurstofvervoerende proteïne in het bloed, maar tegenwoordig is deze niet meer van

toepassing, de algemene term globines vertegenwoordigt deze proteïnefamilie nu beter.

1.2 Globines

1.2.1 Verspreiding

Globines komen voor in alle rijken van levende organismen (Weber & Vinogradov 2001). In

tegenstelling tot de verspreiding van globines binnen de gewervelden, is de verspreiding van

globines binnen de ongewervelden niet uniform. In het dierenrijk komen globines voor in de

fyla Platyhelminthes, Nemertea, Nematoda, Annelida, Vestimentifera, Pogonophora, Echiura,

Phoronida, Arthropoda, Mollusca, Echinodermata en Chordata. Dit voorkomen lijkt echter

sporadisch, aangezien globines slechts in ongeveer 33% van de klassen teruggevonden zijn. In

het laatste decennium van vorige eeuw werden eenvoudige globines ontdekt in niet-

legumineuze planten, algae en een aantal prokaryota. Eveneens werden chimere globines

gevonden bij de bacteria en gisten.

5

1.2.2 Types

Primordiale hemoglobines functioneerden als stikstofoxide dioxygenases. Conversie van

dergelijke haem-gebaseerde enzymes naar deze gespecialiseerd in het ter plaatse brengen van

zuurstof gebeurde toen moleculaire zuurstof talrijker werd door opkomende fotosynthese en

was een belangrijke stap in de ontwikkeling van grotere organismen. Hoewel sommige

organismen hemocyanines of hemerythrines gebruiken, zijn hemoglobines veruit de meest

verspreide zuurstof dragende moleculen met leden in alle vijf de koninkrijken van het leven

(Figuur 1) (Royer et al. 2005; Weber & Vinogradov 2001).

Figuur 1: De 5 koninkrijken van het leven.

De tertiaire structuur van hemoglobines is steeds dezelfde, de globine opvouwing, maar er

kunnen variaties voorkomen, de ontdekking van getrunceerde globines, hexagecoördineerde

globines, neuroglobines en cytoglobines tonen dit duidelijk aan. Ondanks aminozuur

sequentie diversiteit staat vast dat al deze hemoglobines evolutionair verbonden zijn aan de

hand van duidelijke overeenkomsten in de tertiaire structuur. Alles samen zijn er heel wat

verschillende types globines beschreven: bacteriële flavohemoglobines, Vitreoscilla

hemoglobines, plant symbiotische en niet-symbiotische hemoglobines en de dierlijke

hemoglobines, die bestaan uit de hemoglobines, myoglobines, neuroglobines en cytoglobines

6

(Geuens et al. 2004). Speciale hemoglobines zijn de chimere en getrunceerde hemoglobines

(Wittenberg et al. 2002). De chimere hemoglobines zijn een speciale groep binnen de globine

familie, aangezien zij de groep hemoglobines vertegenwoordigen die uit twee domeinen

bestaan, zoals de flavoglobines die naast een N-terminaal globine ook een FAD-reductase

domein bevatten (Vinogradov & Moens 2008). Getrunceerde hemoglobines (trHbs) zijn dan

weer een relatief nieuwe familie van hemoglobines, sterk verspreid bij bacteriën, unicellulaire

eukaryoten en planten. Getrunceerde hemoglobines vormen een familie van kleine zuurstof

bindende haem eiwitten die een vereenvoudigde globine opvouwing kennen. Ze zijn bijna

alomtegenwoordig in het plantenrijk, komen bij veel agressieve pathogene bacteriën voor en

men vermoed dat ze van zeer oude oorsprong zijn. Meer dan 40 vermeende trHb genen zijn

reeds geïdentificeerd. Een fylogenetische studie toonde aan dat deze trHbs een aparte familie

vormen binnen de hemoglobines (Wittenberg et al. 2002).

1.2.3 Structuur en affiniteit

Bijna alle globines bezitten één en dezelfde drie over drie sandwich structuur, genaamd de

globine opvouwing (Figuur 2). Deze bestaat uit zes tot acht -helix segmenten, A tot H

genaamd, gescheiden door korte lussen (Kendrew 1963, Perutz 1979, Wajcman et al. 2009).

Figuur 2: De globine opvouwing.

7

Deze worden omschreven als de volle-lengte globines. Binnen de globinefamilie bestaan er

echter ook globines met een twee over twee sandwich structuur, de getrunceerde globines

(Milani et al. 2004). Deze bezitten slechts 4 -helices. Globines zijn globulaire

metalloproteïnen, aangezien zij binnenin een door hydrofobe residu’s afgelijnde holte

bezitten, waarin een haemgroep niet-covalent kan binden. Deze haem-prosthetische groep is

een Fe-protoporfyrine IX molecule, opgebouwd uit vier pyrrolkernen verbonden door

metheenbruggen. Binnenin de haemgroep zit een Fe(II) ion in een bipyramidale d2sp3

hybridisatie. Dit zorgt ervoor dat het als acceptor kan dienen voor zes elektronenparen en zo

dus zes bindingen kan aangaan. Vier van deze bindingen worden gevormd door de pyrrol N-

atomen. Proximaal en distaal van de haemgroep bevinden zich de F- en de E-helix (Figuur 3).

Figuur 3: De haemgroep van hemoglobine.

Wanneer we de primaire structuur bekijken binnen de globinefamilie merken we een grote

variatie op (Vinogradov & Weber 2001). Drie hydrofobe inter-helicale residu’s (CD1, CD4 en

FG4), F8 en de aminozuren op 33 hydrofobe intra-helicale plaatsen (A8, A11, A12, A15, B6,

B9, B10, B13, B14, C4, E4, E7, E8, E11, E12, E15, E18, E19, F1, F4, G5, G8, G11, G12,

G13, G15, G16, H7, H8, H11, H12, H15 en H19) zijn echter sterk geconserveerd (Bashford et

al. 1987; Gerstein et al. 1994; Lecomte et al. 2005; Kapp et al. 1995). Hierbij zijn F8 en E7

zeer belangrijk. Het aminozuurresidu op plaats F8 is invariabel een histidine en zorgt voor de

8

lokalisatie van de haemgroep door het vijfde ligant te vormen met deze groep. E7 is bijna

altijd eveneens een histidine bij vertebraten, het heeft een regulatorische functie bij de

ligandbinding (Olson & Phillips 1997). Het kan ook direct gebonden zijn aan de haemgroep,

hierbij spreekt men van een hexacoördinatie in tegenstelling tot pentacoördinatie, wanneer

E7His niet gebonden is met de haemgroep. Functionele globines bij ongewervelden kunnen

enorm variëren van structuur. Zoals eerder vermeld heb je bijvoorbeeld de getrunceerde

hemoglobines (trHbs). TrHbs vertonen vaak een aminozuur sequentie 20-40 residu’s korter

dan de invertebrate Hbs waarmee ze verwant zijn. De tertiaire structuur van trHbs is

gebaseerd op een 2-op-2 -helicale sandwich. Een uiterst speciale afwijking dus op de sterk

geconserveerde globine opvouwing. Bovendien is er in tegenstelling tot de volle-lengte

globines, waarvan de bindingssite voor het ligand geblokkeerd is en verbroken dient te

worden bij ligand binding, een bijna continue hydrofobe tunnel, vertrekkende van de

moleculaire oppervlakte doorheen de eiwitmatrix tot aan de distale zijde van het haem, die

gebruikt kan worden voor ligand diffusie tot bij het haem (Wittenberg et al. 2002). De

kenmerkende 2-op-2 -helicale sandwich opvouwing blijkt een subset van de karakteristieke

globine opvouwing. De hoofdzakelijke secundaire elementen zijn de antiparallelle helix paren

B/E en G/H. De N-terminale A helix is bijna volledig afwezig en de ganse CD-D regio is

herleid tot 3 residu’s, waarschijnlijk het absolute minimum nodig om de C-E overgang te

maken. Ook de haem-proximale F-helix is vervangen door een polypeptide segment (pre-F)

en een F-helix van één draai die het HisF8 bevat noodzakelijk voor de haem-ijzer coördinatie.

Men kan dus stellen dat de kortere polypeptide keten van de trHbs niet simpelweg een

vereenvoudiging is van de klassieke globine opvouwing, maar specifieke deleties en

substituties vertoont.

1.2.4 Functies

Er wordt algemeen aangenomen dat globines een zeer brede waaier aan functies verzorgen.

(Wajcman et al. 2009) Het lijkt dat de predominante functies van de globines enzymatisch

zijn en dat zuurstoftransport, de best gekende functie van de globines, slechts een specialisatie

betreft samenhangend met de evolutie van de metazoa (Vinogradov et al. 2005). Van

vertebrate hemoglobines en myoglobines is gekend dat ze dienen als opslagplaats en

transportmiddel van zuurstof. Van de neuroglobines denkt men dat ze een belangrijke rol

spelen in de neuronale zuurstof homeostase en de bescherming tegen hypoxie (Burmester et

al. 2007). Terwijl men vermoed dat cytoglobines betrokken zijn in collageen synthese

(Hankeln et al. 2005). Anderzijds zijn er de zenuwglobines bij invertebraten, waarvan

9

verondersteld wordt dat ze als opslagplaats van zuurstof dienen tijdens anoxische condities

om zo de zenuwactiviteit op peil te houden (Geuens et al. 2004). Maar ook heel wat andere

functies worden uitgevoerd door vertegenwoordigers van de globine familie (Weber &

Vinogradov 2001). Bepaalde globines kunnen functioneren als terminale oxidatoren, waarbij

NAD+ wordt gevormd om de glycolyse te onderhouden en zo de ATP productie veilig te

stellen bij hypoxische condities. Ook doen sommige globines dienst als opruimers van

reactieve zuurstof- of stikstof-vormen, zoals de flavohemoglobines. Daarnaast zijn er ook

myoglobines die functioneren als dioxygenase, waardoor schadelijk NO kan worden omgezet

in nitraat (Vinogradov & Moens 2008). Eveneens zouden getrunceerde hemoglobines een rol

hebben in de bescherming tegen NO. Verder zijn er de globinegekoppelde sensoren, die

veranderingen in intracellulaire gasconcentraties kunnen registeren, wat via hun

signaaltransducerend proteïnedomein leidt tot genregulatorische respons (McGrath et al.

2009; Persson et al. 2009). Leghemoglobines geassocieerd met stikstof fixerende bacteriën in

de wortels van leguminose planten zorgen er dan weer voor dat de bacteriële omgeving

anaeroob blijft tijdens het leveren van zuurstof voor het bacteriële metabolisme (Lecomte et

al. 2005). Een speciale functie is deze waarin globines functioneren als pigment om lichtinval

te detecteren, zoals bij larvale stadia van de nematode Mermis nigrescens (Burr et al. 2000).

Vaak echter is de echte functie van een globine niet gekend.

1.3 Caenorhabditis elegans

1.3.1 Algemeen

C. elegans is een kleine, vrijlevende bodemnematode (Figuur 4) (WormBook). Het is een

filtervoeder die zich voedt met bacteriën. Deze soort behoort tot het koninkrijk van de

Animalia, Phylum Nematoda, Klasse Secernentea, Orde Rhabditida, Familie Rhabditidae,

Genus Caenorhabditis.

Het is een organisme uiterst geschikt als modelorganisme. Ten eerste kan men C. elegans zeer

gemakkelijk in cultuur brengen in het laboratorium. De organismen worden standaard

opgegroeid in petrischalen op een oppervlakte van agar en gevoed met E. coli. Deze

nematoden kunnen eveneens permanent bewaard worden in vloeibare stikstof, leidend tot

gereduceerde arbeid en kosten. Bovendien komen deze wormen voornamelijk voor als

hermafrodieten en doen ze aan zelfbevruchting. Een ander groot voordeel van C. elegans is

10

hun korte levenscyclus. De wormen bereiken maturiteit al na amper drie dagen en leven dan

nog ongeveer twee tot drie weken. Uiteraard speelt ook het feit dat C. elegans alle

belangrijke, gedifferentieerde celtypes bezit een belangrijke rol. Het gaat hierbij om

spiercellen, zenuwstelsel, spijsverteringsstelsel, voortplantingsstelsel en de epidermis. Alle

voorgaande argumenten maakten van C. elegans een goed modelorganisme, en toen men ten

slotte tijdens het ophelderen van de volledige genetische code vond dat meer dan de helft van

de C. elegans genen menselijke orthologen bleek te hebben was er geen enkele twijfel meer

dat deze wormen een perfect modelorganisme waren.

Figuur 4: Caenorhabditis elegans.

1.3.2 Levenscyclus

De levenscyclus van C. elegans bestaat uit vier larvale stadia (L1 tot L4) en één adulte fase

(Figuur 5). De vier larvale stadia gaan over in elkaar door middel van vervellingen, dit proces

duurt ongeveer 3 dagen bij 25°C en resulteert in de uiteindelijke vervelling naar het adulte

stadium. Een alternatieve levenscyclus bestaat eveneens wanneer de condities niet optimaal

zijn, bvb. door hoge temperatuur, overbevolking of voedseltekort. In deze omstandigheden

gaat de L1 larve over in een predauer L2 larve (L2d), die op zijn beurt vervelt naar een dauer

stadium. Dit dauer stadium is een alternatieve L3 fase die ongunstige condities kan overleven

en dit tot 10 maal de normale levensduur. Dauers vertonen een afwijkende morfologie en

11

hebben een gewijzigd metabolisme, waardoor ze resistent zijn tegen stress. Dauers eten niet,

dit is te wijten aan een cuticulaire blokkade van de mondholte, ze leven volledig van hun

inwendige vetvoorraden en hebben hierdoor geen last van voedseltekorten in de omgeving.

Wanneer de omstandigheden terug beter worden kan de dauer vervellen tot een L4 larve en

uiteindelijk zijn cyclus vervolledigen tot een normale adult.

Figuur 5: De levenscyclus van C. elegans.

1.3.3 Morfologie

C. elegans vertoont een typische nematode lichaamsvorm. De wormen hebben een cilindrisch

lichaam, dat versmalt naar de uiteinden toe. Hun lichaam is eveneens niet-gesegmenteerd.

Adulte hermafrodieten bezitten onveranderlijk 959 somatische nuclei en mannetjes bezitten er

1031. De lichaamswand is opgebouwd uit een hypodermis, spieren en zenuwen, dit alles

omgeven door een stevige collagene cuticulus. Binnenin vinden we de organen terug,

behorende tot het spijsverteringstelsel en het voortplantingsstelsel. Deze bevinden zich in een

12

pseudocoel, een lichaamsholte gevuld met vloeistof, die via hydrostatische druk de

lichaamsvorm onderhoudt (Figuur 6).

Figuur 6: Doorsnede Caenorhabditis elegans.

Het spijsverteringsstelsel van C. elegans is relatief simpel, beginnend met de mond in de kop,

lopend over de farynx en ingewanden doorheen het lijf en eindigend in het rectum in de staart.

De farynx bestaat uit twee lobben en is sterk gespierd. Het orgaan dient om voedsel vooruit te

stuwen en te malen, voordat het afgegeven wordt in de ingewanden. Buiten de vele

spiercellen komen ook talrijke neuronen, epitheliale cellen en kliercellen voor in de farynx.

De ingewanden dienen voor de vertering van het voedsel en worden voornamelijk gevormd

door twintig epitheliale cellen met uitgebreide apicale microvilli.

Het voortplantingsstelsel bestaat uit drie delen: de somatische gonaden, de kiemlijn en het ei-

leggend apparaat. Bij hermafrodieten bestaan de gonaden uit twee identieke U-vormige

kanalen, elk via een spermatheek verbonden met een gemeenschappelijke uterus. Deze

gonaden worden al gevormd tijdens de laatste larvale fase (L4). De kiemcellen evolueren

echter pas na de laatste vervelling tot oocyten, deze worden tijdens het passeren door één van

13

de U-vormige kanalen bevrucht in de spermatheek. Bij mannetjes echter is er maar één

gonade, die bestaat uit een testis, seminaal vesikel en vas deferens.

Het zenuwstelsel tenslotte is ondanks zijn kleine omvang zeer sterk ontwikkeld bij C. elegans

(Figuur 7). Maar liefst 302 van de 959 cellen aanwezig in C. elegans hermafrodieten zijn

neuronaal en daar bovenop zijn er ook nog 56 gliacellen aanwezig. In totaal behoort dus meer

dan 37% van de somatische cellen tot het zenuwstelsel.

Figuur 7: Zenuwstelsel van C. elegans.

Bovendien is dit stelsel zeer gedifferentieerd, met maar liefst 118 verschillende neuronale

klassen. Het regelt dan ook een grote waaier aan responsen op omgevingsstimuli. Het

merendeel van de neuronen bevinden zich in de kop, meer precies rond de farynx, maar ook

langs de ventrale as en in de staart. De neuronen rond de farynx vormen de zenuwring,

vanwaar zenuwdraden doorheen de as van het lichaam lopen. Zowel de ventrale als de dorsale

zenuwdraden lopen vanaf de zenuwring in de kop doorheen het lichaam tot bijna volledig in

de staart. Ze zijn opgebouwd uit verschillende soorten motorische neuronen, hiernaast bestaat

de ventrale zenuwring ook uit enkele sensorische neuronen. Het merendeel van de sensorische

neuronen bevind zich echter in de kop, waarschijnlijk omdat dit deel van het lichaam als

eerste in contact komt met een nieuwe omgeving en hiervoor sensorische organen nodig heeft.

Mannetjes vertonen op dit vlak één groot verschil met hermafrodieten, een groter deel van

hun 381 neuronen bevinden zich in de staart in plaats van de kop. De staart is dan ook zeer

belangrijk bij mannetjes, aangezien zijn rol bij het paren.

1.3.4 Voortplanting

C. elegans plant zich voornamelijk voort door middel van zelfbevruchting. De hermafrodieten

kunnen zowel sperma als oocyten produceren. Één hermafrodiet produceert ongeveer 280

eieren, die nagenoeg allemaal resulteren in hermafrodieten bij zelfbevruchting. Minder dan

0,2% zijn echter mannetjes. Deze ontstaan door een zeldzaam proces, genaamd meiotische

disjunctie, waardoor mannetjes maar één X-chromosoom hebben, in vergelijking met de twee

14

X-chromosomen van hermafrodieten. Mannetjes kunnen gemakkelijk herkend worden aan de

hand van hun gedrag en de morfologie van hun staart, deze is gespecialiseerd voor de

copulatie en draagt spicules en een ventilator-achtige structuur met sensorische stralen. Een

hermafrodiet en een mannetje kunnen aan kruisbevruchting doen door te paren, hierbij

produceren ze hermafrodieten en mannetjes in een gelijke hoeveelheid. Door deze paring

vergroten hermafrodieten hun fecunditeit tot ongeveer 1000 eieren, aangezien sperma de

limiterende factor is bij zelfbevruchting.

1.3.5 Genetische code

In 1998 werd het genoom project van C. elegans afgewerkt, zo werd C. elegans het allereerste

multicellulaire organisme waarvan het volledige genoom gekend was. Toen ook het menselijk

genoom volledig ontcijferd werd, bleek ongeveer 53% van de C. elegans genen een

menselijke ortholoog te hebben, 26% zelfs een strikte ortholoog. Ook ongeveer 42% van de

menselijke ziektegenen, betrokken bij kanker, nieraandoeningen, immunologische

afwijkingen, neuronale aandoeningen, enz., bleek een homoloog te hebben in het genoom van

de nematode. Op eiwit niveau zijn de gelijkenissen heel wat minder, slechts 43% homologen

en 10% strikte orthologen werden waargenomen. Toch bleek 49% van de aminozuurresidu’s

van deze homologen identiek en zelfs 69% gelijkaardig. De genetische kaart van C. elegans

werd in 2003 vervolledigd, terwijl acht jaar voordien de fysische kaart al was afgewerkt.

Het volledige genoom van C. elegans telt ongeveer 100.3Mb, verdeeld over zes

chromosomen. Deze zes chromosomen kunnen op hun beurt opgedeeld worden in vijf

autosomen en één sekschromosoom. Het is dit laatste chromosoom dat bepaald of de

nematode een hermafrodiet of een mannetje wordt. Hermafrodieten hebben namelijk twee

exemplaren van het sekschromosoom, terwijl mannetjes slechts één kopie bezitten. De vijf

autosomen komen elk twee maal voor, dit zowel bij hermafrodieten als mannetjes.

Binnen het genoom zijn momenteel 20170 plaatsen aangeduid als zijnde genen, waarvan nog

3492 alternatieve splitsingswijzen bekend zijn, wat het aantal verwachte proteïnen op 23662

brengt. Opmerkelijk is dat het genoom van C. elegans minstens 33 globinegenen bevat. Een

opmerkelijk hoog aantal (Hoogewijs et al. 2007). De genen zijn relatief klein in vergelijking

met genen van vertebraten, ze zijn gemiddeld 3kb groot (inclusief introns), de mediaan geeft

zelfs amper 2kb. Het kleinste gen is 48 basen groot, terwijl het grootste proteïnecoderend gen

toch 80957 basen lang is. Gemiddeld gezien is een gen opgebouwd uit 6,4 exons met een

mediale grootte van 123 basen, tussen de exons in liggen de introns met en mediale grootte

15

van 47 basen. De genen komen ongeveer in gelijke aantallen voor op beide DNA strengen en

zijn ongeveer uniform verspreid over de chromosomen, alleen het sekschromosoom is iets

minder bedeeld. Over één chromosoom gezien liggen de genen iets dikker bezaaid centraal

dan aan de armen, alleen korte arm van chromosoom II is hier een uitzondering op. Naast de

proteïnecoderende genen komen ook transfer RNA (tRNA), ribosomaal RNA (rRNA) en

klein nucleair RNA (snRNAen snoRNA) coderende genen voor. Meer dan 1300 van deze

genen zijn geïdentificeerd, waarvan 608 nucleaire tRNA genen, 22 mitochondriale tRNA

genen, 78 snRNA genen en 17 snoRNA genen. De rRNA genen anderzijds komen voor in

grote tandem herhalingen, met het 5S-gen als een 1kb grote tandem herhaling met ongeveer

110 kopieën op chromosoom V en de 18S, 28S en 5,8S genen als een 7,2kb grote tandem

herhaling met ongeveer 55 kopieën op chromosoom I. Opmerkelijk binnen het genoom van C.

elegans, maar evengoed bij andere nematoden, is het voorkomen van operons. Dit zijn twee of

meer dicht bij elkaar gelegen genen, die polycistronische clusters vormen, dit wil zeggen dat

na transcriptie er slechts één enkel polycistronisch mRNA gevormd wordt. Nadien echter

worden individuele mRNA’s bekomen via transsplicing. In C. elegans zijn al meer dan 1000

dergelijke operons geïdentificeerd. Het aantal betrokken genen schommelt tussen de twee en

de acht. Dit alles komt ongeveer neer op 15% van het totale aantal genen. Wat opvalt is dat de

elementair belangrijke genen van genexpressie frequent in operons voorkomen, terwijl

weefselspecifieke genen zelden in operons gelegen zijn.

1.4 Reportersystemen

1.4.1 Algemeen

Wanneer wetenschappers hun eiwit van interesse wensen te onderzoeken via in vitro

visualisatie zorgt dit vaak voor een probleem, aangezien veel eiwitten op zich geen

enzymatische of biochemische activiteit vertonen en er vaak ook geen goede antilichamen

voor handen zijn. In deze gevallen zijn reportersystemen een ideale oplossing. Een

reportergen is een gen waarvan de fenotypische expressie gemakkelijk te volgen is. Detectie

is bovendien goedkoop en snel. Voorbeelden van reportersystemen zijn: chloramphenicol

acetyltransferase (CAT), -galactosidase (LacZ), luciferase, groen fluorescerent proteïne

(GFP), … De voornaamste toepassingen houden onder meer controle van transformatie-

efficiëntie, analyse van genexpressie en eiwit-eiwit interactie studies in.

16

1.4.2 Groen fluorescent proteïne (GFP)

GFP is een autofluorescent proteïne, afkomstig van de kwal Aequorea Victoria. Excitatie

gebeurt door blauw licht (~480 nm), waarbij een groen emissielicht (~520 nm) vrijgesteld

wordt. De grote voordelen van GFP zijn de grote stabiliteit van het eiwit en het feit dat in vivo

analyse mogelijk is, wegens het niet schadelijke en niet invasieve karakter van GFP (Figuur 8)

(Chalfie et al. 1994).

Figuur 8: De werking van GFP bij een muis.

1.4.3 Reporterconstructen

Recombinante reporterconstructen zijn samengestelde DNA stukken. Dergelijke constructen

kunnen transcriptionele reporters vormen, waarbij een reportergen is aangebracht aan de

promotorregio van het eiwit van interesse. Dergelijke constructen heten transcriptionele

reporters. Wanneer dit construct vervolgens getransformeerd wordt in een cel of organisme,

wordt bij promotor-activatie het reportergen tot expressie gebracht wat visueel waarneembaar

is. In sommige gevallen, zoals bij het reportersysteem GFP, wordt ook het effectieve gen van

het eiwit van interesse in frame aan het construct toegevoegd. Dit omdat regulatorische

elementen kunnen aanwezig zijn in de intronen of 3’ flankerende sequentie. Zodoende wordt

bij expressie een chimeer eiwit gevormd bestaande uit het eiwit van interesse en de reporter.

Men spreekt in dit geval van een translationele reporter.

17

1.4.4 Aanmaak reporterconstructen

1.4.4.1 Algemeen

De aanmaak van een grote hoeveelheid reporterconstructen kan men samenvatten in 4

stappen: PCR fusie, klonering in een vector, transformatie in E. coli cellen en isolatie van de

reporterconstructen uit de E. coli cellen. De PCR fusie techniek is een snelle manier om twee

of meer stukjes DNA met elkaar te fusioneren tot één construct, in dit geval het targetgen en

het reportergen (Hobert, 2002). De laatste drie stappen dienen dan om het reporterconstruct in

grote getale te vermenigvuldigen.

1.4.4.2 PCR fusie

PCR is de afkorting van polymerase chain reaction, of in het Nederlands vertaald polymerase

kettingreactie. Het is een techniek die de amplificatie van een specifiek stuk DNA kan

bewerkstelligen. Het enige wat men nodig heeft zijn de nucleotide sequenties van de twee

omliggende stukjes DNA van het target DNA. Met die info kan men immers specifieke

primers maken die binden op deze omliggende stukjes DNA en door middel van inbouw van

dNTP’s aan de 3’ zijde van de primers, met behulp van het DNA polymerase enzym, de

targetgenen tussen de twee primers vermenigvuldigen. Het proces bestaat uit drie stappen, die

een aantal keer herhaald worden. De eerste stap is denaturatie van het dubbel strengig DNA

(dsDNA) tot enkel strengig DNA (ssDNA), dit gebeurt bij 95°C. Tijdens het tweede deel van

het proces wordt de temperatuur teruggebracht tot ongeveer 50°C, zodat de primers zich

kunnen vasthechten op de complementaire stukjes ssDNA. Deze fase heet annealing- of

aanhechtingfase. Ten slotte laat men de temperatuur opnieuw stijgen tot 72°C voor de

extensiefase, waarbij dNTP’s door polymerases worden ingebouwd aan de primers die

dusdanig als template dienen. Doordat beide strengen van het dsDNA worden gekopieerd in

één cyclus is er een exponentiële toename van het targetgen, vandaar ook de naam

kettingreactie aangezien elke cyclus voor extra beginproducten zorgt voor de volgende cyclus.

Zoals eerder vermeld kan men via de PCR fusie techniek één construct bekomen uit meerdere

stukjes DNA. Dit is mogelijk doordat de fragmenten een kleine overlappende regio (~24 bp)

bevatten. De overlappende regio wordt in de fragmenten ingebouwd door middel van primers,

wat inhoudt dat elke sequentie kan worden gefusioneerd met een reportergen om zodoende

een reporterconstruct te vormen. In ons geval wensen we drie stukjes DNA te fusioneren tot

één construct: de promotorregio van de globinegenen, de reporter GFP (gecombineerd met

18

een tweede purificatie-epitoop = LAP-tag) en de eiwitcoderende regio van de globinegenen.

Om dergelijke fusie te bekomen gebeurt het proces in 3 stappen: PCR 1, PCR 2 en PCR 3.

Deze eerste stap omvat de synthese van de drie primaire PCR-producten. Tijdens PCR 1

worden de twee targetsequenties (promotor+5’ flankerende sequentie en gen+3’ flankerende

sequentie) geamplificeerd uit genomisch DNA van C. elegans. In parallel wordt de gfp

coderende sequentie geamplificeerd uit de Fire vector pPD95.77

(www.ciwemb.edu/pages/firelab.html).

De 3’ primer voor de promotor targetsequentie evenals de 5’ primer voor de eiwitcoderende

targetsequentie bezitten een 24-nucleotide overlap met het 5’ uiteinde van het LAP-gen.

Doordat hier de coderende sequentie van het gen wordt gebruikt, moeten de primers zo zijn

opgebouwd dat het gfp gen in-frame wordt gefusioneerd met de targetsequenties. De andere

primers moeten geen sequentie bezitten die een overlap vertoont met de targetsequentie,

waardoor dit een algemene primer is die bij elke fusiereactie kan worden gebruikt.

Voor de synthese van de primers wordt de genomische sequentie van het targetgen uit

WormBase (www.wormbase.org) opgehaald. De sequentie van de primers wordt gebaseerd

op de uiteinden van deze fragmenten, waarbij de lengte ongeveer 24 bp groot moet zijn en een

nucleotide niet meer dan vier keer direct achter elkaar herhaald mag worden. Dit verzekert de

nodige specificiteit van de primers.

Figuur 9: Fusie PCR: Een voorbeeld van fusie PCR.

19

Tijdens PCR 2 gebeurt dan de fusie tussen twee van de drie fragmenten (Figuur 9). In ons

geval hebben we eerst de LAP-tag en de eiwitcoderende targetsequentie aan elkaar

gefusioneerd. De concentratie van de producten uit PCR 1 werd ruw geschat via agarose

gelelektroforese en eventueel verdund tot een 10-50 ng/µl. De primers die in deze PCR

gebruikt werden waren de 3’ primer van de LAP-tag en de 5’ primer van de eiwitcoderende

sequentie.

Via een derde PCR worden dan uiteindelijk de promotor targetsequentie met de overlap en het

product uit PCR 2 aan elkaar gefusioneerd en wordt het translationele reporterconstruct

gevormd. Voor een succesvolle fusie moeten nested primers worden gebruikt. Aangezien

tijdens PCR vaak ook atypische DNA fragmenten worden geamplificeerd kunnen we bij fusie

PCR de techniek van nested primers toepassen, waarbij de primers in een volgende stap een

net iets kleiner stukje DNA vermenigvuldigen dan in de voorgaande stap, maar nog steeds de

volledige gewenste DNA regio, zodoende dat het amplificeren van atypische DNA

fragmenten sterk wordt gereduceerd (Figuur 10).

Figuur 10: Fusie PCR: Het principe van nested primers.

1.4.4.3 Agarose gelelektroforese

Eens de reporterconstructen aangemaakt zijn kunnen deze via gelelektroforese geïsoleerd

worden tot één enkele band in de gel, gekleurd worden via Nijlblauwe kleuring, waarna dit

reporterconstruct-bandje wordt uitgesneden en de constructen uit de gel worden herwonnen

20

(Yang et al. 2000). Agarose gelelktroforese werkt op basis van een elektrisch veld, waardoor

nucleïnezuren en proteïnen in een gel gescheiden worden op basis van hun grootte. Om het

DNA te visualiseren wordt gebruik gemaakt van ethidiumbromide. Deze stof kan intercaleren

in dubbelstrengige fragmenten DNA en fluoresceert dan onder invloed van UV-licht.

Daarnaast kan via de moleculaire ladder de grootte en concentratie DNA ruw geschat worden

en zo een indicatie geven van de kwantiteit van het DNA.

1.4.4.4 Kloneren in een vector (BP recombinatie reactie)

Figuur 11: Klonering: De originele Gateway® methode, waarbij eerste drie vectoren (entry clones) worden

verkregen voor de drie verschillende delen van het construct om deze daarna via homologe recombinatie één plasmide te laten vormen met alle drie de delen van het reporterconstruct.

De originele Gateway®

methode om reporterconstructen te maken is eigenlijk niet via PCR

fusie en klonering, maar via gewone PCR van de verschillen delen van het construct om deze

dan via klonering in meerdere vectoren te laten recombineren tot één construct (Figuur 11)

(Hartley et al. 2000; MultiSite Gateway® Three-Fragment Vector Construction Kit, User

Manual). Echter blijkt deze methode niet te lukken voor onze constructen (persoonlijke

communicatie met begeleider). Hierdoor kiezen wij voor de variant van PCR fusie toe om

21

daarna het DNA fragmenten in één vector te kloneren, de Gateway® donorvector (pDONR™

vector). Dit gebeurt via de BP recombinatie reactie. Hierbij wordt via homologe recombinatie

een stuk DNA uit de vector vervangen door het gewenste construct. De klonering van de

reporterconstructen in vectoren is noodzakelijk om ze te kunnen inbrengen in andere

organismen zoals E. coli of C. elegans.

1.4.4.5 Transformatie bij E. coli

Eens de plasmiden met de reporterconstructen gemaakt zijn moeten deze getransformeerd

worden naar E. coli cellen om de plasmiden in grote getale te vermenigvuldigen. Dit gebeurt

via het proces van opname door gebruik te maken van competente cellen (E. coli type DH5

alpha) en deze opname stabiel te maken door hitteshock (MultiSite Gateway®

Three-Fragment

Vector Construction Kit, User Manual). Aangezien in de Gateway®

donorvector (pDONR™

vector) het gen voor kanamycine resistentie is ingebouwd kunnen op nutriënt agar platen

enkel die E. coli organismen overleven die intacte plasmiden hebben opgenomen.

1.4.4.6 Plasmidenisolatie

Aangezien vaak ook E. coli cellen kunnen overleven op met kanamycine behandelde nutriënt

agar platen is het noodzakelijk dat we alvorens tot plasmidenisolatie over te gaan de kolonies

identificeren die wel degelijk een volledig plasmide bevatten. Dit gebeurt via de techniek

kolonie cracking, waarbij een aantal E. coli kolonies gelyseerd worden en via gelektroforese

onderzocht worden op de aanwezigheid van het plasmide (Barnes 1977). Eens de juiste

kolonies geïdentificeerd zijn kan men via een handige toolkit de correcte plasmiden met de

volledige reporterconstructen uit de E. coli stalen zuiveren en zo een concentraat bekomen

van de plasmiden met de gewenste reporterconstructen.

1.4.4.7 Restrictie digest en sequentie analyse

Om tenslotte absoluut zeker te zijn dat men de juiste reporterconstructen heeft bekomen, zijn

er twee controlemechanismen mogelijk. Ten eerste kan men een restrictie digest uitvoeren op

het concentraat. Hierbij maakt men gebruik van de wetenschap dat restrictie enzymen enkel

DNA knippen op specifieke plaatsen. Stel bijvoorbeeld een plasmide voor met een

reporterconstruct in verwerkt en waarvan men weet dat een welbepaald goed gekozen

restrictie enzym deze knipt op twee plaatsen (één maal binnen het construct, één maal

erbuiten), dan verwacht men twee fragmenten terug te vinden met een bepaalde lengte, dit kan

geverifieerd worden door het concentraat in een agarosegel te laten lopen. Wanneer echter het

22

construct niet correct is in de plasmide, dan zal het restrictie enzym ofwel niet kunnen

knippen in het construct waardoor slecht één fragment zal teruggevonden worden in de

agarosegel, ofwel zullen de lengtes van de twee fragmenten niet corresponderen met de

vooraf berekende lengtes die men zou moeten bekomen met het gegeven construct en het

gekozen restrictie enzym. Een andere optie die men kan gebruiken als controlemechanisme is

een PCR van een regio van het plasmide uitvoeren en vervolgens dit PCR product sequeneren.

Hierbij kijkt men dan of de nucleotiden die men verwacht van het correct reporterconstruct

ook effectief aanwezig zijn.

1.5 Aanmaak stabiele transgene Caenorhabditis elegans lijnen

1.5.1 Algemeen

Wanneer men de expressie van genen in reporterconstructen wenst te onderzoeken bij een

organisme zoals C. elegans is uiteraard de introductie van exogeen DNA vereist om zo tot

transgene lijnen te komen van het organisme. We hebben het al gehad over transformatie bij

E. coli cellen (1.4.4.5) waar dit proces spontaan kan gebeuren wanneer men gebruik maakt

van competente cellen en enkel een hitteshock vereist is om de transformatie stabiel te maken.

Bij transformatie van exogeen DNA bij een invertebraat zoals C. elegans is de methode echter

niet zo eenvoudig. Lang heeft men een techniek gebruikt waarbij men het DNA rechtstreeks

in de kiemlijn van de organismen injecteerde. Echter recenter is een nieuwere methode naar

voor geschoven, de zogenaamde microdeeltjes beschietingmethode, waarbij men letterlijk het

DNA in de C. elegans organismen schiet (Praitis 2005).

1.5.2 Kiemlijn injectie

Zoals vermeld is kiemlijn injectie de oudste en eveneens meest gebruikte methode om

exogeen DNA in C. elegans organismen te introduceren en zodoende reportergenen tot

expressie te kunnen brengen. Bij deze methode worden verschillende hermafrodiete

exemplaren van C. elegans micro-geïnjecteerd met het bewuste DNA, dat hierdoor

gerecombineerd wordt in het genoom van de ontwikkelende oocyten (Evans 2006). Men kan

dan in de eerste generatie (F1) nageslacht op zoek gaan naar de gewenste transgenen door te

controleren of het organisme de geïntroduceerde genen tot expressie brengt. Normaal bezitten

dergelijke transgene lijnen extrachromosomale stukken DNA, die 80 tot 300 kopijen dragen

van het exogeen DNA construct. Echter deze extrachromosomale kopijen worden niet 100%

23

correct doorgegeven aan de volgende generatie, tenzij het geïncorporeerd wordt in het

genoom doordat niet homoloog dsDNA breuk herstel geïnduceerd wordt. Bovendien stellen

zich nog enkele problemen bij deze methode. Ten eerste is de toepassing technisch moeilijk

uit te voeren, zeker voor beginnende onderzoekers en ten tweede kan genexpressie afwijkend

zijn, aangezien het hoge aantal kopijen kunnen leiden tot gen overexpressie of silencing. Wel

zijn er aanpassingen gebeurt zodat het tegenwoordig ook mogelijk is om homoloog

geïntegreerde transgene lijnen met een laag aantal kopijen te bekomen, maar hierbij is het

moeilijk om genoeg individuen te transformeren nodig voor een succesvolle studie.

1.5.3 Microdeeltjes beschieting

Recenter is echter een methode uitgewerkt om exogeen DNA te introduceren bij C. elegans,

of andere nematode soorten zoals Ascaris en Litomosoides sigmodontis, en toch transgene

lijnen te bekomen met een laag aantal kopijen, maar waar men tegelijkertijd ook genoeg

individuen bekomt nodig voor het onderzoek. Deze methode heet de microdeeltjes

beschietingmethode en zoals de naam suggereert worden microscopisch kleine gouden

deeltjes, waarop het exogeen DNA op vastgehecht is, letterlijk in de organismen geschoten

door middel van een genegun (Figuur 12).

Figuur 12: Een voorbeeld van een genegun.

Dankzij deze methode moet men niet individu per individu bewerken, maar kan men in één

beschieting een volledige populatie hermafrodieten behandelen waarna men de

24

getransformeerde individuen selecteert uit de F1 generatie op basis van het fenotype,

eventueel met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Deze selectie wordt gemakkelijker

gemaakt door het beschieten C. elegans populaties bestaande uit unc-119 mutanten. Deze

mutanten zijn immobiel. Echter bij beschieting van deze individuen met de plasmiden die de

reporterconstructen bevatten kunnen zij terug wild type (WT) organismen voortbrengen die

dus gemakkelijker te herkennen zijn dankzij hun beweeglijkheid in tegenstelling tot de unc-

119 mutanten (Praitis et al. 2001; Praitis 2005).

25

2. Doelstelling

Bij deze studie stellen we als doel het creëren van stabiele transgene Caenorhabditis elegans

lijnen. Hiervoor zullen we eerst reporterconstructen voor de globinegenen van de nematode

Caenorhabditis elegans maken. Deze reporterconstructen dienen te bestaan uit drie delen: de

promotor van het globinegen, het effectieve globinegen en een LAP-tag in de vorm van groen

fluorescent proteïne (GFP). De aanmaak hiervan zal gebeuren door middel van fusie PCR.

Vervolgens zullen we deze driedelige reporterconstructen kloneren in een vector om

plasmiden te bekomen, deze transformeren naar Escherichia coli cellen zodoende de

plasmiden in grote getale te vermenigvuldigen en ze uiteindelijk via plasmidenisolatie terug in

pure vorm en grote concentratie te bekomen. Tenslotte zullen we de plasmiden met de

driedelige reporterconstructen proberen te integreren in het C. elegans genoom door middel

van microdeeltjes beschieting om tot stabiele transgene C. elegans individuen te komen, die

bij voortplanting een stabiele lijn vormen waarin de reporterconstructen steeds doorgegeven

worden aan de nakomelingen. De aanmaak van dergelijke lijnen is belangrijk aangezien zij

kunnen dienen om expressie analyse of lokalisatie van de globines uit te voeren of

interactiepartners van deze eiwitten te identificeren.

26

3. Materiaal en methode

3.1 Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans wordt in het laboratorium meestal gekweekt op agar platen met een

laagje Escherichia coli als voedsel. De nematode groeit optimaal bij een temperatuur tussen

16 en 25°C.

3.1.1 Kweek van Escherichia coli

Benodigdheden:

E. coli kweekmedium:

- 1,5% gistextract (Sigma®)

- 3% caseïne hydrolysate broth (ICN Biochemicals)

- 2% glycerine

- Autoclaveer gedurende 15 à 25 min bij een temperatuur van 121°C

E. coli uit vorige cultuur

Werkwijze:

Voeg aan 200 mL kweekmedium 5 mL E. coli uit vorige cultuur toe

Laat overnacht schudden in een warm waterbad bij 37°C

Controleer monocultuur door uit te strijken op een agar n°1 plaat

3.1.2 Maken van nutriënt agar platen

Nutriënt agar is een rijk medium waarop een dikke laag E. coli cellen kan groeien, die als

voedsel dienen voor C. elegans. Bijgevolg kunnen op dergelijke platen veel wormen

gekweekt worden. De wildtype E. coli stam K12 wordt standaard gekweekt op deze platen.

Benodigdheden:

11g nutriënt agar

E. coli in vloeibaar medium

27

Werkwijze:

Weeg 11 g nutriënt agar (OXOID Ltd., CM0003) af

Voeg 400 mL dH2O en 0,4 mL cholesterol (uit 5 mg/mL in ethanol oplossing) toe

Autoclaveer

Voeg 10 mL K-fosfaatbuffer 1 M ; pH 6,0 (steriel) toe

Giet ongeveer 12,5 mL in een plaat met 9 cm diameter

Breng E. coli op de plaat (ongeveer 300 µL) en verspreid die over het oppervlak

Laat de E. coli overnacht groeien bij 37°C

De platen kunnen enkele weken bewaard worden bij 4°C

Laat de platen altijd acclimatiseren tot kamertemperatuur (KT) alvorens er wormen op

te brengen

3.1.3 Maken van NGM platen

NGM is een minder rijk medium, en wordt gebruikt om een dunne laag OP50 te kweken. Op

dergelijke platen kunnen lage aantallen wormen gekweekt worden zonder kans op

overwoekering door bacteriën.

Benodigdheden:

11g nutriënt agar

E. coli in vloeibaar medium

Werkwijze:

Weeg 6,8 g nutriënt agar (OXOID Ltd., CM0003), 1,2g NaCl en 1g Peptone af

Voeg 390 mL dH2O en 0,2 mL cholesterol (uit 5 mg/mL in ethanol oplossing) toe

Autoclaveer

Voeg toe

- 10 mL K-fosfaatbuffer 1 M ; pH 6,0 (steriel)

- 0,4ml 1M CaCl (CaCl2.H2O – 17,702g/100ml)

- 0,4ml 1M MgSO4 (MgSO4 – 24,648g/100ml)

Giet ongeveer 12,5 mL in een plaat met 9 cm diameter

Breng E. coli op de plaat (ongeveer 300 µL) en verspreid die over het oppervlak

28

Laat de E. coli overnacht groeien bij 37°C

De platen kunnen enkele weken bewaard worden bij 4°C

Laat de platen altijd acclimatiseren tot kamertemperatuur (KT) alvorens er wormen op

te brengen

3.1.4 Opstarten van een synchrone cultuur

3.1.4.1 Nematoden bevriezen

Spoel de platen (gemengde cultuur, voornamelijk jonge juvenielen) af met S-buffer,

breng in een 15 ml buisje en centrifugeer (3min, 3000 rpm)

Verwijder het supernatans (in flow, steriele pipetten)

Voeg 3 ml S-buffer toe + 3 ml vries oplossing (glycerol 30%)

Goed mengen en verdeel in 6 cryo-buisjes: vervolledig het LABEL!!

Breng in vries-container (Styrofoom)

Breng onmiddellijk tot -70°C

Smelt, de volgende dag, snel 1 buisje (in de handen) en breng op plaat (agar zonder E.

coli, = agar n°1 platen); wacht enkele uren en observeer of de overleving in orde is

Na enkele dagen, transfereer de wormen naar nutrient agar platen: voeg ~1ml S-buffer

toe, roteer de plaat, en transfereer S-buffer met wormen naar NA-plaat

3.1.4.2 Chloroxen

In het chloroxmengsel (NaOH en bleekwater) worden alle cellen van de wormen en

resterende E. Coli cellen gelyseerd door de sterk toxische omgeving. Enkel C. elegans eitjes

blijven door hun beschermende eischaal na de procedure levensvatbaar. Door de eitjes

overnacht in S-buffer te schudden wordt een synchrone J1-cultuur bekomen. Het schudden is

noodzakelijk om zuurstoftekort te voorkomen.

Benodigdheden:

NaOH, 10M

gedistilleerd en gedeïoniseerd water (ddH2O)

Bleekwater (werkoplossing): 300 mL ddH2O 600 mL javel (NaOCl, stockoplossing

12° Cl)

29

S-buffer : 100 mM NaCl + 50 mM K-fosfaatbuffer pH 6,0

Werkwijze:

Was de platen met graviede wormen af met S-buffer en breng ze in een steriele 15 mL

buis

Laat de wormen bezinken en zuig de S-buffer weg (2×)

Voeg ddH2O toe tot een volume van 30 mL en doe er 8 mL bleekwater en 2 mL NaOH

bij

Goed schudden gedurende 4,5 minuten

Centrifugeer 3 minuten bij 3000 toeren per minuut en giet de vloeistof af

Was 3 met S-buffer

Breng de eitjes in een kleine hoeveelheid S-buffer in een schudincubator bij 20°C

Wanneer de J1-larven uit de eitjes geslopen zijn (ongeveer na één dag) worden ze op agar

platen gebracht.

3.1.4.3 Wormen op plaat brengen

Werkwijze:

Schat het aantal J1-juvenielen in 50 µL

Breng ongeveer 10 000 wormen op één plaat

Incubeer de platen bij een temperatuur tussen 16 en 24°C, naargelang het experiment

3.2 Aanmaak reporterconstructen

3.2.1 Algemeen

De aanmaak van een grote hoeveelheid reporterconstructen kan men samenvatten in 4

stappen: PCR fusie, klonering in een vector, transformatie in E. coli cellen en isolatie van de

reporterconstructen uit de E. coli cellen. De PCR fusie techniek is een snelle manier om twee

of meer stukjes DNA met elkaar te fusioneren tot één construct, in dit geval het targetgen en

30

het reportergen (Hobert, 2002). De laatste drie stappen dienen dan om het reporterconstruct in

grote getale te vermenigvuldigen.

3.2.2 PCR Fusie

3.2.2.1 Algemeen

Zoals eerder vermeld kan men via de PCR fusie techniek één construct bekomen uit meerdere

stukjes DNA. Dit is mogelijk doordat de fragmenten een kleine overlappende regio (~24 bp)

bevatten. De overlappende regio wordt in de fragmenten ingebouwd door middel van primers,

wat inhoudt dat elke sequentie kan worden gefusioneerd met een reportergen om zodoende

een reporterconstruct te vormen. In ons geval wensen we drie stukjes DNA te fusioneren tot

één construct: de promotorregio van de globinegenen, de reporter GFP (LAP-tag) en de

eiwitcoderende regio van de globinegenen. Om dergelijke fusie te bekomen gebeurt het

proces in 3 stappen: PCR 1, PCR 2 en PCR 3.

3.2.2.2 PCR 1

Deze eerste stap omvat de synthese van de drie primaire PCR-producten. Tijdens PCR 1

worden de twee targetsequenties (promotor+5’ flankerende sequentie en gen+3’ flankerende

sequentie) geamplificeerd uit genomisch DNA van C. elegans. In parallel wordt de gfp

coderende sequentie geamplificeerd uit de Fire vector pPD95.77.

De 3’ primer voor de promotor targetsequentie evenals de 5’ primer voor de eiwitcoderende

targetsequentie bezitten een 24-nucleotide overlap met het 5’ uiteinde van het LAP gen.

Doordat hier de coderende sequentie van het gen wordt gebruikt, moeten de primers zo zijn

opgebouwd dat het gfp gen in-frame wordt gefusioneerd met de targetsequenties. Da andere

primers moeten geen sequentie bezitten die een overlap vertoont met de targetsequentie,

waardoor dit een algemene primer is die bij elke fusiereactie kan worden gebruikt.

Voor de synthese van de primers wordt de genomische sequentie van het targetgen uit

WormBase (www.wormbase.org) opgehaald. De sequentie van de primers wordt gebaseerd

op de uiteinden van deze fragmenten, waarbij de lengte ongeveer 24 bp groot moet zijn en een

nucleotide niet meer dan vier keer direct achter elkaar herhaald mag worden. Dit verzekert de

nodige specificiteit van de primers.

31

Benodigdheden:

Phusion DNA Polymerase kit:

- Phusion DNA polymerase: thermostabiel polymerase afgeleid van het Pyrococcus

polymerase, met een grote nauwkeurigheid bij polymerase-activiteit

- 5 Phusion HF buffer of 5 Phusion GC buffer

genomisch DNA

Primers forward (F) en reverse (R) (Stockoplossing: de nodige hoeveelheid HCl

toegevoegd zoals aangegeven op de tube)

10 mM dNTP mix

Werkwijze:

Maak werkoplossingen voor de primers door samenvoegen van:

- 10 µL stockoplossing

- 90 µL bidi

Voeg samen op ijs, in een totaal volume van 50 µL:

- 10 µL HF buffer

- 1 µL dNTP

- 0,25 µL Phusion DNA Polymerase

- 1 µL DNA

- 1 µL 25 µM F primer

- 1 µL 25 µM R primer

- x µL ddH2O (aanvullen tot 50µl)

Vortexen en short spin

PCR programma voor de amplificatie van het template DNA:

Hold 98°C 30 s 1

Denaturatie 98°C 10 s

30 cycli

Annealing 50-72°C 30 s

Elongatie 72°C 30 s / 1 kb

Bewaar bij 4°C

32

3.2.2.3 PCR 2

Tijdens PCR 2 gebeurt dan de fusie tussen twee van de drie fragmenten. In ons geval hebben

we eerst de LAP-tag en de eiwitcoderende targetsequentie aan elkaar gefusioneerd. De

concentratie van de producten uit PCR 1 werd ruw geschat via agarose gelelektroforese en

eventueel verdund tot een 10-50 ng/µl. De primers die in deze PCR gebruikt werden waren de

3’ primer van de LAP-tag en de 5’ primer van de eiwitcoderende sequentie.

Benodigdheden:





DNA van PCR 1

Primers forward (F) en reverse (R)

10 mM dNTP mix

Werkwijze:


- 10 µL buffer

- 1 µL dNTP


- 1 µL DNA





33


Hold 98°C 30 s 1


40 cycli



Bewaar bij 4°C

3.2.2.4 PCR 3

Via een derde PCR worden dan uiteindelijk de promotor targetsequentie met de overlap en het

product uit PCR 2 aan elkaar gefusioneerd en wordt het translationele reporterconstruct

gevormd. Voor een succesvolle fusie moeten nested primers worden gebruikt.

Benodigdheden:





DNA PCR 1 en 2

Primers forward (F) en reverse (R)

10 mM dNTP mix

Werkwijze:


- 10 µL buffer

- 1 µL dNTP


- 1 µL DNA




34



Hold 98°C 30 s 1


40 cycli



Bewaar bij 4°C

3.2.2.5 Controle PCR fusie

Controle voor een geslaagde PCR fusie bestaat erin het bekomen DNA product via agarose

gelelektroforese te analyseren. Men kan bij onzekerheid ook steeds de sequentie van het

construct bepalen.

Benodigdheden:

Gelelektroforese toestel

0.5x TAE-buffer

Agarose

Ethidiumbromide (EtBr) 10 mg/mL

Moleculaire ladder

Ladingsbuffer op basis van DEPC-behandeld water

BioDOC-ItTM

Imaging System, UVP

Werkwijze:

Los 1 g agarose op in 100 mL 0.5x TAE-buffer door te koken.

Voeg EtBr toe aan de verkregen 1% agarosegel:

- Gel van 20-25 mL => 0.9 L EtBr

- Gel van 40-50 mL => 1.8 L EtBr.

Giet nu de agarose-oplossing in een gelhouder en plaats hierin het gewenste kammetje.

35

Laat de agarose-oplossing gedurende 30 min stollen en verwijder dan het kammetje.

Voeg 1 L ladingsbuffer toe aan 9 L reactiemengsel.

Laad 6.5 L ladder in één slotje

Laad 10 mL reactiemengsel in de slotjes.

Laat de gel gedurende 30 min lopen bij 100 V in 0.5x TAE-buffer

Fotografeer de gel onder UV-belichting (BioDOC-ItTM

Imaging System, UVP)

3.2.2.6 Gelextractie

Het reporterconstruct kan worden geïsoleerd door achtereenvolgens de PCR-producten van

elkaar te scheiden via gelelektroforese, de gel te kleuren met een zichtbare kleurstof zoals

Nijlblauw, het reporterconstruct-bandje uit te snijden en het construct uit het gelfragment te

zuiveren met de QIAquick Gel Extraction Kit.

Benodigdheden

Kleurstof (Nijlblauw)

QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)

isopropanol

Werkwijze

Leg de gel in de Nijlblauwe kleurstof tot het bandenpatroon blauw kleurt.

Snij het DNA-fragment zo fijn mogelijk uit de agarosegel met een scherp scalpel

Weeg het sneetje gel in een 500µl epje (1 volume) en voeg 3 volumes QG buffer toe

(100mg~100µl)

Incubeer 10 min bij 50°C of totdat het gelfragment compleet is opgelost. Om de gel

goed te laten oplossen, vortex het epje elke 2-3 min tijdens de incubatie

Wanneer het gelfragment volledig is opgelost, zou de oplossing geel gekleurd moeten

zijn. Wanneer dit niet het geval is, voeg dan 10 µl 3 M natriumacetaat (pH 5,0) toe en

meng goed. De oplossing zal geel verkleuren

Voeg aan het staal 1 volume isopropanol toe

Plaats een QIAquick spin kolom in een 2 ml verzamelbuisje. Breng het staal op kolom

om het DNA te binden en centrifugeer voor 1 min

36

Verwijder het eluaat en plaats de QIAquick spin kolom terug in het verzamelbuisje.

Voeg 0,75 ml buffer PE aan de QIAquick spin kolom toe en centrifugeer voor 1 min

Verwijder het eluaat en centrifugeer opnieuw voor 1 min

Plaats de QIAquick spin kolom in een steriel 1,5 ml epje

Breng 40 µl steriel bidi op de kolom om het DNA te elueren en centrifugeer voor 1 min.

Laat de kolom 1 min staan na het toevoegen van het bidi en centrifugeer daarna voor 1

min om een verhoogde DNA-concentratie te verkrijgen.

3.2.2.7 Concentratie bepalen

Aangezien we in de volgende stap, het kloneren, de concentratie moeten kennen van het DNA

dat we geëxtraheerd hebben, zullen we dit eerst bepalen. Dit kan gemakkelijk met behulp van

een spectrofotometer.

Benodigdheden

NanoDrop® ND-1000 spectrofotometer

DNA staal

RNase-vrij water (blanco)

Werkwijze

Start het ND-1000 programma op de pc, klik op ‘nucleid acid’.

Open de arm van de spectrofotometer en maak de meetplaatjes proper.

Breng 1 L van de blanco op het onderste meetplaatje, sluit de arm en druk op ‘OK’.


Breng 1 L van de blanco op het onderste meetplaatje, sluit de arm en druk op ‘Blank’.


Breng 1 L van het DNA staal op het onderste meetplaatje, sluit de arm, type de naam

van het staal in en klik op ‘Measure’.

Indien het staal niet genoeg geconcentreerd is, laat de oplossing dan uitdampen, zodat

de gewenste concentratie kan bekomen worden.

37

3.2.3 Kloneren (BP reactie)

Alvorens de constructen te kunnen transformeren naar E. coli cellen, dienen deze te worden

gekloneerd in een donorvector (pDONR™ vector). Dit gebeurt via de BP recombinatie

reactie. Hierbij wordt via recombinatie een stuk DNA uit de vector vervangen door het

gewenste construct.

Benodigdheden

pDONR™ vector

BP Clonase™ II enzyme mix (hou op -20°C tot net voor gebruik)

2 g/l Proteïnase K oplossing (ontdooi en bewaar op ijs)

attB PCR product

1x TE Buffer, pH 8.0 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)

Werkwijze

Voor elke BP recombinatie reactie tussen een geschikt attB PCR product en donor

vector, voeg 1-3.5 l (20-50 fmoles) attB PCR product, 0.5 l pDONR™ vector (150

ng/l) en leng aan met TE Buffer, pH 8.0 tot 4 l.

Haal de BP Clonase™ II enzyme mix uit -20°C en dooi op ijs (±2 min)

Vortex de BP Clonase™ II enzyme mix tweemaal kortstondig (±2 sec)

Voeg aan elke BP recombinatie reactie 1 l BP Clonase™ enzyme mix toe. Goed

mengen door kortstondig tweemaal te vortexen (±2 sec)

Incubeer alle reacties overnacht bij 25°C

Voeg tenslotte 0.5 l Proteïnase K oplossing toe aan elke reactie en incubeer 10 min aan

37°C

NOOT: BP recombinatie reacties kunnen bij -20°C bewaard worden tot 1 week na aanmaak

3.2.4 Transformatie

3.2.4.1 Algemeen

Transformatie van de intacte plasmiden in E. coli cellen gebeurt via het proces van opname

door gebruik te maken van competente cellen (E. coli type DH5 alpha) en deze opname

stabiel te maken door hitteshock.

38

Benodigdheden:

One shot® TOP10 chemisch competente E. coli cellen (ontdooien op ijs)

S.O.C. medium

BP recombinatie reactie producten (zie 3.2.3 Kloneren (BP reactie))

2 LB voorverwarmde platen met 50 g/ml kanamycine

Warmwaterbad

37°C incubator

Werkwijze:

Voeg de volledige inhoud van het eindproduct van de BP recombinatie reactie toe aan

een buisje One Shot® TOP10 chemisch competente E. coli en meng voorzichtig (niet op

en neer pipetteren).

Incubeer op ijs gedurende 30 min

Incubeer vervolgens in een warmwaterbad 1 min bij 37°C voor een hitteshock

Zet de buisjes onmiddellijk op ijs

Voeg 400 l S.O.C. medium op kamertemperatuur toe

De buisjes goed sluiten en schud deze horizontaal aan 200 rpm op 37°C gedurende een

uur tot anderhalf uur

Verdeel 20 ml en 100 ml van elke reactie op twee voorverwarmde selectieplaten

3.2.4.2 Kolonie cracking

Om de kolonies te identificeren die een volledig plasmide bevatten wordt de techniek kolonie

cracking toegepast. Hierbij gaat men eigenlijk de kolonies lyseren om vervolgens de lysaten

te vergelijken op basis van verschillen in elektroforetische mobiliteit.

Benodigdheden:

2x Lysebuffer: 100 ml: 20g 20% w/v Sucrose + 0,8g 200nM NaOH + 0,89g 120 nM

KCl + 0,37g 10nM EDTA + 0,5g 0,5% SDS + een snuifje bromofenol blauw

Eppendorf buisjes

39

Werkwijze:

Verdun de lysebuffer tot 1x bij kamertemperatuur

Pik de kolonies van de transfomatieplaten en breng in eppendorfs met 30l lysebuffer

Incubeer 5 tot 7 min bij 37º C

Koel gedurende 5 min op ijs

Centrifugeer gedurende 10 min op maximale snelheid

Laad 10l in een agarosegel (Opgelet: zorg ervoor dat je enkel supernatans oppipetteert

en geen pellet, indien dit gebeurt, centrifugeer opnieuw)

Kies de juiste kolonies op basis van de verschillen in elektroforetische mobiliteit

3.2.5 Plasmidenisolatie

3.2.5.1 Algemeen

Nadat de E. coli kolonies geïdentificeerd zijn, waarvan men vermoed dat ze het juiste

construct bevatten in de plasmiden, gaan we over tot de plasmidenisolatie.

3.2.5.2 Eerste plasmidenisolatie

Echter kolonie cracking is slechts een indicatie van welke E. coli culturen het juiste plasmide

bevatten. Om zeker te zijn dat we de juiste kolonies bewerken voor we effectief

plasmidenisolatie gaan toepassen op grote schaal, doen we dit eerst op kleinere schaal,

waarbij een controle volgt.

Benodigdheden:

Gen EluteTM

HP Plasmid Miniprep Kit (SIGMA Life Science, SIGMA-ALDRICH)

De correcte E. coli kolonie

Werkwijze:

Centrifugeer 1 mL van een overnachte E. coli cultuur gedurende 1 minuut aan 12 000 x

g, zodat een pellet ontstaat. Giet het supernatans weg.

40

Resuspendeer het bacteriële pellet door toevoeging van 200 l resuspentieoplossing.

Vortex zodat alle cellen volledig geresuspendeerd zijn! Onvolledige resuspentie leidt tot

slechte opbrengst.

Lyseer de geresuspendeerde cellen aan de hand van 200 l lysis oplossing. Mix de

cellen en de oplossing door middel van inversie (6 tot 8 keer) totdat de mix helder en

visceus wordt. Niet vortexen! Te hard mixen zal genomisch DNA scheuren, zodat

chromosomaal DNA het uiteindelijk plasmide DNA kan contamineren. Laat de lyseer

reactie niet langer dan 5 minuten doorgaan. Verlengde lysis kan het plasmide DNA

permanent denatureren. Precipiteer het cel debris door 350 l neutralisatie oplossing toe

te voegen. Inverteer het buisje voorzichtig 4 tot 6 keer. Centrifugeer gedurende 10

minuten aan 12 000 x g. Plasmide DNA zou in de pellet moeten voorkomen, wanneer in

het supernatans grote hoeveelheden drijvende deeltjes voorkomen centrifugeer

nogmaals.

Breng een GenElute Miniprep Bindingskolom in bij een voorzien microcentrifuge

buisje. Voeg 500 l voorbereidings oplossing toe aan elke miniprep kolom en

centrifugeer gedurende 1 minuut aan 12 000 x g. Giet de doorgestroomde vloeistof weg.

Transfer het heldere lysaat over naar de net voorbereide kolom en centrifugeer

gedurende 1 minuut aan 12 000 x g. Giet de doorgestroomde vloeistof weg.

Voeg 750 l van de verdunde was oplossing toe aan de kolom. Centrifugeer gedurende

1 minuut aan 12 000 x g. Giet de doorgestroomde vloeistof weg en centrifugeer

gedurende 1 à 2 minuten aan maximale snelheid.

Verplaats de kolom naar een vers verzamel buisje. Voeg 100 l elutie oplossing of

moleculair biologisch reagent water toe aan de kolom. Centrifugeer gedurende 1 minuut

aan 12 000 x g. Het DNA is nu aanwezig in het eluaat en meteen klaar voor gebruik of

opslag bij -20 °C.

3.2.5.3 Restrictie digest

De extra controle om zich ervan te vergewissen dat de volledige plasmiden ook de correcte

stukken DNA bevatten in de correcte volgorde kan gebeuren door een restrictie digest uit te

voeren. Hierbij laten we een restrictie enzyme de plasmides knippen op welbepaalde plaatsen

zodat wanneer het plasmide ook effectief het correcte DNA bevat, stukken DNA met vooraf

berekende lengte zou moeten bekomen worden. Via gelelectroforese wordt dan uiteindelijk

41

gecontroleerd of de bekomen stukjes DNA ook overeenkomen in aantal en lengte zoals vooraf

berekend.

Benodigdheden:

Restrictie enzyme Eco RI

Eco RI buffer

Te controleren plasmide

Werkwijze:

Vortex de Eco RI buffer.

Voeg 8 l plasmide, 1 l Eco RI en 1 l Eco RI buffer samen en plaats gedurende 1 uur

bij 37 °C.

Inactiveer het enzyme door het mengsel 20 minuten op 65 °C te plaatsen.

Voor een gelelectroforese uit.

Stalen die gelukt zijn overnacht (bij 37 °C) laten opgroeien in PDM medium, waar 8 l

kanamycine aan toegevoegd is.

3.2.5.4 Tweede plasmidenisolatie

Nu we er heel erg zeker van zijn dat de onderzochte E. coli kolonie het juiste plasmide bevat,

kunnen we overgaan tot de plasmidenisolatie op grote schaal.

Benodigdheden:

Gen EluteTM

HP Plasmid Miniprep Kit (SIGMA Life Science, SIGMA-ALDRICH)

De correcte E. coli kolonie

Werkwijze:

Centrifugeer 1 mL van een overnachte E. coli cultuur gedurende 1 minuut aan 12 000 x

g, zodat een pellet ontstaat. Giet het supernatans weg.

Resuspendeer het bacteriële pellet door toevoeging van 200 l resuspentieoplossing.

Vortex zodat alle cellen volledig geresuspendeerd zijn! Onvolledige resuspentie leidt tot

slechte opbrengst.

42

Lyseer de geresuspendeerde cellen aan de hand van 200 l lysis oplossing. Mix de

cellen en de oplossing door middel van inversie (6 tot 8 keer) totdat de mix helder en

visceus wordt. Niet vortexen! Te hard mixen zal genomisch DNA scheuren, zodat

chromosomaal DNA het uiteindelijk plasmide DNA kan contamineren. Laat de lyseer

reactie niet langer dan 5 minuten doorgaan. Verlengde lysis kan het plasmide DNA

permanent denatureren. Precipiteer het cel debris door 350 l neutralisatie oplossing toe

te voegen. Inverteer het buisje voorzichtig 4 tot 6 keer. Centrifugeer gedurende 10

minuten aan 12 000 x g. Plasmide DNA zou in de pellet moeten voorkomen, wanneer in

het supernatans grote hoeveelheden drijvende deeltjes voorkomen centrifugeer

nogmaals.

Breng een GenElute Miniprep Bindingskolom in bij een voorzien microcentrifuge

buisje. Voeg 500 l voorbereidings oplossing toe aan elke miniprep kolom en

centrifugeer gedurende 1 minuut aan 12 000 x g. Giet de doorgestroomde vloeistof weg.

Transfer het heldere lysaat over naar de net voorbereide kolom en centrifugeer

gedurende 1 minuut aan 12 000 x g. Giet de doorgestroomde vloeistof weg.

Voeg 750 l van de verdunde was oplossing toe aan de kolom. Centrifugeer gedurende

1 minuut aan 12 000 x g. Giet de doorgestroomde vloeistof weg en centrifugeer

gedurende 1 à 2 minuten aan maximale snelheid.

Verplaats de kolom naar een vers verzamel buisje. Voeg 100 l elutie oplossing of

moleculair biologisch reagent water toe aan de kolom. Centrifugeer gedurende 1 minuut

aan 12 000 x g. Het DNA is nu aanwezig in het eluaat en meteen klaar voor gebruik of

opslag bij -20 °C.

3.2.5.5 Nanodrop analyse

Als voorlaatste stap bij het aanmaken van de reporterconstructen dampen we de stalen uit tot

een concentraat en doen we een Nanodrop analyse om te bepalen hoeveel DNA nu juist

aanwezig is in het staal.

Benodigdheden:

Plasmide DNA staal

Verdamping toestel

NanoDrop® ND-1000 spectrofotometer

43

RNase-vrij water (blanco)

Werkwijze:

Damp de stalen uit tot er nog ongeveer 20 ml overschiet in de buisjes.

Start het ND-1000 programma op de pc, klik op ‘nucleid acid’.


Breng 1 L van de blanco op het onderste meetplaatje, sluit de arm en druk op ‘OK’.


Breng 1 L van de blanco op het onderste meetplaatje, sluit de arm en druk op ‘Blank’.


Breng 1 L van het DNA staal op het onderste meetplaatje, sluit de arm, type de naam

van het staal in en klik op ‘Measure’.

Indien het staal niet genoeg geconcentreerd is, laat de oplossing dan uitdampen, zodat

de gewenste concentratie kan bekomen worden.

3.2.5.6 Restrictie digest

Tenslotte voeren we nog een RE digest uit, niet alleen ter controle, maar ook om de plasmiden

te openen zodat recombinatie kan gebeuren met het DNA van de C. elegans individuen.

Benodigdheden:

Plasmide DNA staal (11.25 g)

1 l restrictie enzyme (Apa LI, Pst I, …)

RE 10x buffer

Werkwijze:

Reken uit hoeveel l plasmide DNA nodig is, met behulp van de Nanodrop® resultaten

en wetende dat er 11.25 g nodig is voor 3 beschietingen.

Reken vervolgens uit hoeveel l RE 10x buffer nodig is voor de reactie met behulp van

volgende formule: X=(P+1)/9 l, waarbij P+1 gelijk is aan de hoeveelheid plasmide

DNA in l + 1 l restrictie enzyme.

44

Wanneer beide voorgaande berekeningen zijn uitgevoerd, voeg alles samen en laat 16

uur incuberen bij 37°C.

Daarna de reactie neutraliseren door 20 min bij 65°C te incuberen.

En tenslotte controleren via gelelktroforese.



3.3.1.1 Algemeen

Eens we de gewenste plasmiden geïsoleerd hebben en hiervan een concentraat bekomen

hebben, kunnen we overgaan tot de beschieting van het DNA in de Caenorhabditis elegans

organismen.

3.3.1.2 Voorbereiding

Alvorens we de beschieting zelf kunnen uitvoeren moeten we het DNA binden op

microscopisch kleine gouden pareltjes.

Benodigdheden:

Microcentrifuge buizen

1- goudparels

Gedeioniseerd water

50% glycerol

DNA (plasmiden met reporterconstruct)

2.5 M CaCl2

0.1 M spermidine

Ethanol (70% en 100%)

Hepta adapter

45

Werkwijze:

Voeg 1 mL 70% ethanol toe aan 72 mg 1- goudparels in een gesiliconeerde

microcentrifuge buis. Vortex gedurende 5 min, laat de deeltjes gedurende 15 min tot

rust komen, spin 3 tot 5 sec in een microcentrifuge en verwijder het supernatans.

Voeg 1 mL gedeioniseerd water toe. Vortex gedurende 1 min, laat de gouddeeltjes 3

min rusten, spin 3 tot 5 sec in een microcentrifuge en verwijder het supernatans.

Herhaal de vorige stap drie maal.

Voeg 1200 L 50% glycerol toe aan het pellet van goudparels en vortex tot het pellet

goed gesuspendeerd is.

Meng de volgende reagentia in een gesiliconeerde microcentrifuge buis per beschieting:

50 L bereide goudparels in 50% glycerol

5 L DNA (concentratie ~ 1 mg/mL)

50 L 2.5 M CaCl2

20 L 0.1 M spermidine.

Vortex gedurende 1 min tussen elke toevoeging en gedurende minimum 3 min na de

laatste toevoeging. Laat de parels bezinken gedurende 1 min, spin 3 tot 5 sec in een

microcentrifuge en verwijder het supernatans.

Resuspendeer het pellet in 150 L 70% EtOH per beschieting, spin gedurende een korte

tijd en verwijder het supernatans.

Resuspendeer het pellet in 150 L 100% EtOH per beschieting, spin gedurende een

korte tijd en verwijder het supernatans.

Resuspendeer in 50 L 100% EtOH per beschieting. Vortex gedurende minimum 3 min.

Wanneer men de Hepta adapter gebruikt om de beschieting mee uit te voeren, kan men

op elk van de zeven macrodragers die gebruikt worden per beschieting 6-7 L van de

finale DNA suspensie toevoegen en dit in het centrale deel. Op het einde even laten

drogen.

3.3.1.3 Beschieting

Nu het DNA gebonden is aan de gouddeeltjes en aangebracht is op de macrodragers kunnen

we overgaan tot de beschieting van de C. elegans culturen.

46

Benodigdheden:

Bio-Rad Biolistic PDS-1000/He deeltjes afleverings systeem

Hepta adapter

De zeven macrodrager met de DNA/goudparels oplossing

Macrodrager houder

Stopscherm

1500-2000 psi breuk schijf

Isopropanol

Petrischalen met culturen van de nematode Caenorhabditis elegans

Plakband

Werkwijze:

Plaats de zeven macrodragers met de DNA/goudparels oplossing op de macrodrager

houder.

Plaats het stopscherm en de macrodrager houder samen.

Dompel een 1500 tot 2000 psi breuk schijf onder in isopropanol gedurende 3 tot 5 sec,

plaats daarna in de vastzettings holte van de Hepta adapter en maak de adapter vast aan

de kamer van het Bio-Rad Biolistic PDS-1000/He deeltjes afleverings systeem.

Plaat nu ook de macrodragers in de kamer.

Maak de petrischaal met de nematoden vast aan de onderste plank van de kamer door

middel van plakband en vergeet het deksel van de petrischaal niet af te nemen.

Sluit de kamerdeur en creëer een vacuüm tot 27 in. Hg, druk daarna op de schiettoets en

houdt deze ingedrukt tot de breuk schijf breekt.

Hef het vacuüm op en verwijder de petrischaal met het deksel er terug op.

3.3.1.4 Verzorging van de wormen na beschieting

Na de beschieting is het werk nog niet afgelopen, de wormen moeten goed verzorgt worden

en in de juiste omstandigheden opgroeien om hun verdere ontwikkeling te kunnen voltooien

en voor nageslacht te kunnen zorgen, want dit is de generatie waar we in geïnteresseerd zijn.

Benodigdheden:

M9 buffer

47

Nutriënt agar platen (100 mm)

Incubator

Werkwijze:

Laat de wormen na de beschieting ongeveer gedurende een uur bekomen.

Was daarna de nematoden van de beschietingsplaten met M9 buffer en verplaats ze naar

twee of meer 100 mm platen met verrijkt medium. Hou hierbij wel de originele

petrischalen, aangezien ook hier getransformeerde lijnen kunnen ontstaan.

Incubeer vervolgens de platen bij de vereiste temperatuur (16 tot 24 graden Celsius).

3.3.2 Detectie transgene lijnen

Nadat de beschoten kolonies de tijd hebben gehad om voor nageslacht te zorgen, kunnen we

overgaan tot het detecteren van de transgene individuen in de C. elegans populatie. Dit

gebeurt via gewone microscopie op basis van het fenotype en fluorescentiemicroscopie,

waarbij we de fluorescerende individuen isoleren en op verse nutriënt agar plaatjes brengen

zodoende deze opnieuw kunnen voortplanten om opnieuw via fluorescentiemicroscopie deze

nakomelingen te screenen op fluorescentie om te bevestigen dat het om een stabiele transgene

C. elegans lijn gaat.

48

4. Resultaten

Gedurende het volledige proces om tot stabiele transgene lijnen van Caenorhabditis elegans

te komen hebben we resultaten bekomen over de graad van succes bij elke stap. Deze

resultaten hebben we hieronder stap per stap uiteen gezet.


Zoals vermeld bestond het eerste deel erin om reporterconstructen te produceren van de

globinegenen van C. elegans. Dit deel bestond uit vier grote stappen, namelijk PCR fusie,

klonering, transformatie naar E. coli en uiteindelijk terug isolatie van de plasmiden.

4.1.1 PCR fusie

4.1.1.1 Algemeen

Aangezien we tijdens de PCR fusie van onze reporterconstructen drie stukken DNA wilden

fuseren, moest deze stap in 3 delen gebeuren. Mede daarom maakten we gebruik van drie

verschillende primer types: att primers die de overlap met de donorvector bevatten, interne

primers die een kleinere regio amplificeerden (nested primers) en externe primers, die de

dezelfde regio als de att primers vermenigvuldigden, maar de att overlap niet bevatten. De

externe primers hadden het voordeel dat de att overlap niet kon interfereren met de

amplificatie van het DNA, terwijl de interne primers atypische DNA amplificatie zoveel

mogelijk beperkten. Elke stap van de PCR fusie bleek zijn eigen slaagpercentage te hebben.

4.1.1.2 PCR 1

PCR 1 had als doel het vermenigvuldigen van de promotor- en genregio’s van de

globinegenen uit het genomisch DNA van C. elegans. Hiervoor begonnen we met maar liefst

17 globinegenen als target: C06H2.5, C09H10.8, C18C4.1, C23H5.2, C26C6.7, C29F5.7,

C36E8.2, C52A11.2, F46C8.7, F56C4.3, R01E6.6, R11H6.3, R90.5, T06A1.3, Y15E3A.2,

Y75B7AL.1 en ZK637.13. De optimale omstandigheden voor het vermenigvuldigen van deze

DNA regio’s was echter niet bekend, zo wisten we de optimale annealingtemperatuur,

hoeveelheid magnesium of optimale primers niet waarbij de verschillende DNA fragmenten

moesten vermenigvuldigd worden. Standaard begonnen we dan ook met dezelfde

49

begincondities voor alle globinegenen. Deze waren 50°C en 54°C als annealingtemperatuur,

geen extra toegevoegd magnesium en att of externe primers (naast de primers met LAP-tag

overlap). Voor C29F5.7 werd wel (op aangeven van mijn begeleider) meteen extra

magnesium toegevoegd bij de eerste poging.

Figuur 13: PCR fusie: Voorbeeld van een bandenpatroon na PCR 1 voor de globinegenen C06H2.5, C09H10.8, C18C4.1 en C23H5.2, telkens de promotorregio en genregio (van links naar rechts).

De resultaten van PCR 1 waren uitstekend (Tabel 1, Figuur 13), voor bijna alle globinegenen

werden de promotorregio en de regio van het gen meteen goed vermenigvuldigd. Slechts voor

vier genregio’s moest PCR 1 worden overgedaan omdat het beoogde target niet correct

vermenigvuldigd bleek. Dit waren de genregio’s van C26C6.7, C52A11.2, R90.5 en

Y75B7AL.1. Echter bij een tweede poging bleken al twee van deze vier DNA regio’s nu wel

goed vermenigvuldigd te zijn en tijdens de derde PCR werd ook de genregio van Y75B7AL.1

correct vermenigvuldigd. Enkel voor de genregio van C52A11.2 was een vierde PCR

noodzakelijk. Echter om deze DNA regio’s goed te kunne vermenigvuldigen in PCR 1,

moesten de condities waaronder de PCR reacties verliepen bijsturen. Tijdens de tweede

poging om de genregio’s van de globinegenen C26C6.7, R90.5 en Y75B7AL.1 te

vermenigvuldigen voegden we extra magnesium toe aan de reactie, 2 l om exact te zijn. Ook

gebruikten we hier een andere annealingtemperatuur, nl. 47°C en 54°C. Voor C26C6.7 bleek

de combinatie 47°C met het extra magnesium een succes, terwijl voor R90.5 de 54°C en extra

magnesium bleek te werken. Voor Y75B7AL.1 echter was het opnieuw geen succes, maar

toen we bij een derde poging 2 l magnesium toevoegden en een annealingtemperatuur van

59°C gebruikten werd ook dit stukje DNA met succes vermenigvuldigd. Voor de genregio

van C52A11.2 verliep het zoekproces om de optimale omstandigheden te vinden wat anders,

50

daar begonnen we bij 50°C en 54°C en att primers, terwijl we bij de tweede poging 2 l extra

magnesium toevoegden en bij de derde poging overschakelden op externe primers. Het was

echter pas bij de vierde poging, waarbij we de combinatie van 2 l extra magnesium én

externe primers gebruikten, dat het DNA fragment correct werd vermenigvuldigd.

Tabel 1: PCR fusie: Aantal pogingen nodig om tot het beoogd resultaat te komen bij PCR 1 en de optimale condities hierbij. In het rood de veranderingen ten opzichte van de standaardcondities die tot een positief resultaat leiden.

Globinegen Promoteregio Condities Promotorregio Genregio Condities Genregio

C06H2.5 1 54°C, externe primers 1 54°C, externe primers


C18C4.1 1 54°C, externe primers 1 54°C, externe primers


C26C6.7 1 54°C, att primers 2

47°C, att primers, extra

magnesium

C29F5.7 1 54°C, externe primers 1


magnesium

C36E8.2 1 54°C, att primers 1 50°C, att primers

C52A11.2 1 54°C, externe primers 4

50°C, externe primers,

extra magnesium

F46C8.7 1 54°C, externe primers 1 54°C, externe primers

F56C4.3 1 54°C, externe primers 1 50°C, externe primers

R01E6.6 1 50°C, externe primers 1 54°C, externe primers

R11H6.3 1 54°C, externe primers 1 54°C, externe primers

R90.5 1 54°C, att primers 2


magnesium

T06A1.3 1 54°C, externe primers 1 54°C, externe primers

Y15E3A.2 1 54°C, externe primers 1 54°C, externe primers

Y75B7AL.1 1 50°C, att primers 3


magnesium

ZK637.13 1 54°C, att primers 1 50°C, att primers

51

Aangezien in een volgende stap soms niet alles meteen correct verliep moesten we hierdoor af

en toe teruggaan naar een vorige stap. In tabel 2 staan dan ook het totale aantal pogingen voor

PCR 1 en het aantal pogingen waarbij de uitkomst goed was.

Tabel 2: PCR fusie: Aantal pogingen en aantal geslaagde pogingen van PCR 1.

Globinegen Promoteregio

Aantal Geslaagd

Genregio

Aantal Geslaagd

C06H2.5 1 1 1 1

C09H10.8 1 1 1 1

C18C4.1 1 1 1 1

C23H5.2 1 1 4 3

C26C6.7 1 1 2 1

C29F5.7 2 2 5 3

C36E8.2 1 1 1 1

C52A11.2 2 2 4 1

F46C8.7 1 1 1 1

F56C4.3 1 1 1 1

R01E6.6 1 1 1 1

R11H6.3 3 3 3 3

R90.5 4 4 7 6

T06A1.3 1 1 1 1

Y15E3A.2 1 1 1 1

Y75B7AL.1 4 4 8 4

ZK637.13 2 2 1 1

4.1.1.3 PCR 2

De tweede stap van onze PCR fusie, PCR 2 had als doel het koppelen en vermenigvuldigen

van de LAP-tag en genregio’s van de globinegenen. Hiervoor gebruikten we de bekomen

52

producten van PCR 1 van de 17 globinegenen waarmee we begonnen waren: C06H2.5,

C09H10.8, C18C4.1, C23H5.2, C26C6.7, C29F5.7, C36E8.2, C52A11.2, F46C8.7, F56C4.3,

R01E6.6, R11H6.3, R90.5, T06A1.3, Y15E3A.2, Y75B7AL.1 en ZK637.13. Ook bij deze

stap waren de optimale omstandigheden waarbij de reactie moest verlopen niet bekend.

Standaard begonnen we dan ook met dezelfde begincondities voor alle globinegenen. Deze

waren 48°C, 51°C, 54°C en 57°C (voor C06H2.5, C09H10.8, C18C4.1, C23H5.2, C29F5.7,

C52A11.2, F46C8.7, F56C4.3, R01E6.6, R11H6.3, T06A1.3 en Y15E3A.2) of 50°C en 55°C

(voor C26C6.7, C36E8.2, R90.5, Y75B7AL.1 en ZK637.13) als annealingtemperatuur, geen

extra toegevoegd magnesium en att of externe primers (naast de primers met LAP-tag


magnesium toegevoegd bij de eerste poging en bij C29F5.7 en C52A11.2 werd het LAP-tag

meteen verdund tot 1/200 in de plaats van 1/100.

Figuur 14: PCR fusie: Voorbeeld van een bandenpatroon na PCR 2 met de gewenste banden omcirkeld voor de globinegenen C29F5.7, C52A11.2, R11H6.3, R90.5 en Y75B7AL.1, éénmaal met 54°C als annaelingtemperatuur, éénmaal met 50°C als annaelingtemperatuur en met extra magnesium en éénmaal met 54°C als annaelingstemperatuur en met extra magnesium (van links naar rechts).

PCR 2 bleek al heel wat moeilijker te zijn dan het simpele vermenigvuldigen bij PCR 1

(Tabel 3 en figuur 14). Van de 17 globinegenen werden er weliswaar meteen 11 goed

gekoppeld aan het LAP-tag en vermenigvuldigd en voor drie van de zes globinegenen

waarvoor de PCR niet meteen correct werd uitgevoerd (R11H6.3, T06A1.3 en ZK637.13)

waren maximaal vier pogingen nodig om het gewenste resultaat te bekomen. Echter voor

R90.5 en Y75B7AL.1 waren veel meer pogingen nodig om de optimale condities te vinden,

respectievelijk twaalf en tien. Voor T06A1.3 bleek tijdens de tweede poging al dat toevoeging

53

van magnesium het gewenste effect had. Bij R11H6.3 werden de DNA-fragmenten bij de

vierde poging correct vermenigvuldigd door gebruik van interne primers, terwijl voor het

ZK637.13 globinegen eveneens de vierde poging succesvol was, door toevoeging van extra

magnesium én het extra verdunnen van het gebruikte PCR 1 staal (van 1/200 naar 1/100).

Zoals al vermeld was er heel wat meer moeite nodig om de globinegenen R90.5 en

Y75B7AL.1 correct te vermenigvuldigen tijdens PCR 2. Voor Y75B7AL.1 veranderden we

de annaelingstemperatuur en voegden we extra magnesium toe. Zelfs het toevoegen van extra

DMSO (5% en 10%) en formamide (2.5% en 7.5%), alsook het verdunnen van het LAP-tag

staal tot 1/200 zorgden niet voor beterschap. Echter merkten we op dat voor Y75B7AL.1 PCR

1 al een probleem was geweest en maakten de bedenking dat het PCR 1 staal voor dit gen

toch niet goed genoeg was, waardoor we uiteindelijk besloten PCR 1 opnieuw te doen voor

Y75B7AL.1 en probeerden PCR 2 nogmaals met dit nieuwe staal, maar ook dat bleek niet de

oplossing. Het was pas toen we externe primers gebruikten in de plaats van de att primers dat

PCR 2 correct werd uitgevoerd voor het Y75B7AL.1 globinegen. Het vermenigvuldigen van

R90.5 tenslotte was ongeveer gelijkaardig aan het proces van Y75B7AL.1, in die zin dat we

ook daar na talloze pogingen PCR 1 eveneens opnieuw deden, aangezien ook PCR 1 voor dit

gen niet vlekkeloos was verlopen, en in tegenstelling tot Y75B7AL.1 werkte deze aanpak

voor R90.5 wel, want met dit nieuwe PCR 1 staal én het toevoegen van extra magnesium

tijdens de tweede poging was het resultaat positief. Voor C23H5.2 tenslotte werden door

tijdsgebrek slechts 3 pogingen ondernomen, allen zonder resultaat.


Globinegen Aantal pogingen Optimale condities

C06H2.5 1 54°C, externe primers

C09H10.8 1 54°C, externe primers

C18C4.1 1 51°C, externe primers

C23H5.2 / /

C26C6.7 1 55°C, att primers

C29F5.7 1 54°C, externe primers, extra magnesium, LAP-tag 1/200

C36E8.2 1 55°C, att primers

54

C52A11.2 1 54°C, externe primers, LAP-tag 1/200

F46C8.7 1 48°C, externe primers

F56C4.3 1 51°C, externe primers

R01E6.6 1 51°C, externe primers

R11H6.3 4 56°C, interne primers, LAP-tag 1/200

R90.5 12 50°C, att1 primers, extra magnesium, LAP-tag 1/200

T06A1.3 2 48°C, externe primers, extra magnesium

Y15E3A.2 1 48°C, externe primers

Y75B7AL.1 10 54°C, externe primers, extra magnesium, LAP-tag 1/200

ZK637.13 4 55°C, att primers, extra magnesium

Idem zoals bij PCR 1, aangezien in een volgende stap soms niet alles meteen correct verliep

moesten we hierdoor af en toe teruggaan naar een vorige stap. In tabel 4 staan dan ook het

totale aantal pogingen voor PCR 2 en het aantal pogingen waarbij de uitkomst goed was.



Aantal Geslaagd

C06H2.5 1 1

C09H10.8 1 1

C18C4.1 2 2

C23H5.2 3 0

C26C6.7 1 1

C29F5.7 5 3

C36E8.2 2 2

C52A11.2 2 2

F46C8.7 4 2

55

F56C4.3 1 1

R01E6.6 1 1

R11H6.3 7 2

R90.5 20 2

T06A1.3 2 1

Y15E3A.2 1 1

Y75B7AL.1 16 2

ZK637.13 4 1

4.1.1.4 PCR 3

De laatste stap van de PCR fusie is PCR 3, tijdens deze stap koppelden en vermenigvuldigden

we de promotorregio van de globinegenen die we bekomen waren tijdens PCR 1 met het

eindproduct van RCR 2, zijnde de combinatie van de LAP-tag met de genregio’s van de

globinegenen. Nog steeds werkten we met de oorspronkelijke globinegenen: C06H2.5,

C09H10.8, C18C4.1, C26C6.7, C29F5.7, C36E8.2, C52A11.2, F46C8.7, F56C4.3, R01E6.6,

R11H6.3, R90.5, T06A1.3, Y15E3A.2, Y75B7AL.1 en ZK637.13, alleen C23H5.2 waarvoor

we geen positief PCR 2 staal konden maken werd weggelaten tijdens PCR 3. Maar eveneens

voor de vier globinegenen C18C4.9, F19H6.2, F21A3.6 en Y58A7A.6 voerden we PCR 3 uit

op PCR 2 stalen die mij werden aangereikt door mijn begeleider. Eveneens waren de optimale

omstandigheden bij deze niet bekend. Standaard begonnen we dan ook met dezelfde

begincondities voor alle globinegenen. Deze waren 48°C, 51°C, 54°C en 57°C (voor

C06H2.5, C09H10.8, C18C4.1, C29F5.7, F46C8.7, F56C4.3, R01E6.6, T06A1.3 en

Y15E3A.2), 51°C en 54°C (voor C26C6.7, C36E8.2, R90.5 en ZK637.13) of 52°C, 55°C,

58°C en 61°C (voor C52A11.2, R11H6.3 en Y75B7AL.1) als annealingtemperatuur, geen

extra toegevoegd magnesium en att of interne primers (naast de primers met LAP-tag


magnesium toegevoegd bij de eerste poging en bij C29F5.7 en C52A11.2 werd het LAP-tag

meteen verdund tot 1/200 in de plaats van 1/100. En voor de drie extra globinegenen die mij

werden gegeven door mijn begeleider waren de standaardcondities 45°C, 48°C, 51°C, 54°C,

57°C en 60°C, Pfu Hotstart polymerase en geen extra magnesium voor C18C4.9; 52°C en

56

54°C en geen extra magnesium voor F19H6.2 en 47°C, 50°C, 53°C en 56°C met extra

magnesium toegevoegd voor F21A3.6 en Y58A7A.6.

Figuur 15: PCR fusie: Voorbeeld van een bandenpatroon na PCR 3 met de gewenste banden omcirkeld voor de globinegenen C29F5.7, C52A11.2, R11H6.3, R90.5 en Y75B7AL.1, éénmaal met 49°C, éénmaal met 52°C en éénmaal met 55°C als annaelingtemperatuur (van links naar rechts).

PCR 3 bleek een even grote uitdaging als PCR 2, aangezien van de 19 globinegen er slechts

voor 8 meteen een positief resultaat werd gevonden (Tabel 5 en figuur 15). Voor de rest werd

net zoals bij PCR 2 gezocht naar de optimale condities en uiteindelijk werden deze wel

gevonden. Alleen voor C18C4.1 en T06A1.3 werden slechts vier en twee pogingen,

respectievelijk, ondernomen die allen negatief bleken.


Globinegen Aantal pogingen Optimale condities

C06H2.5 2 45°C, interne primers

C09H10.8 2 57°C, interne primers, extra magnesium

C18C4.1 / /

C18C4.9 1 45°C, interne primers, Pfu hotstart polymerase

C26C6.7 2 54°C, att1 primers, extra magnesium

C29F5.7 1 48°C, att1 primers, extra magnesium

C36E8.2 10 Touchdown 60-50°C, att1 primers, extra magnesium

57

C52A11.2 2 61°C, interne primers, extra magnesium

F19H6.2 2 58°C, att2 primers, extra magnesium

F21A3.6 3 51°C, att1 primers, extra magnesium

F46C8.7 1 54°C, interne primers

F56C4.3 1 57°C, interne primers

R01E6.6 1 57°C, interne primers

R11H6.3 1 55°C, interne primers

R90.5 6 49°C, interne primers

T06A1.3 / /

Y15E3A.2 1 57°C, interne primers

Y58A7A.6 1 47°C, att1 primers, extra magnesium

Y75B7AL.1 1 61°C, interne primers

ZK637.13 2 51°C, att1 primers

Idem zoals bij PCR 1 en PCR 2, aangezien in een volgende stap soms niet alles meteen

correct verliep moesten we hierdoor af en toe teruggaan naar een vorige stap. In tabel 6 staan

dan ook het totale aantal pogingen voor PCR 3 en het aantal pogingen waarbij de uitkomst

goed was.



Aantal Geslaagd

C06H2.5 4 2

C09H10.8 2 1

C18C4.1 4 0

C18C4.9 2 1

C26C6.7 8 2

C29F5.7 11 5

58

C36E8.2 17 3

C52A11.2 6 2

F19H6.2 6 3

F21A3.6 11 2

F46C8.7 3 2

F56C4.3 1 1

R01E6.6 1 1

R11H6.3 7 3

R90.5 10 3

T06A1.3 2 0

Y15E3A.2 3 1

Y58A7A.6 10 2

Y75B7AL.1 7 1

ZK637.13 3 2

Wanneer we dus het volledige PCR fusie proces bekijken (Tabel 7) valt het op dat weinig

genen, slechts vijf (C29F5.7, F46C8.7, F56C4.3, R01E6.6 en Y15E3A.2), het volledige

proces doorlopen zonder problemen. Bovendien kan, tijdens het proberen om de optimale

condities te vinden voor PCR 2 en PCR 3, het staal dat gebruikt wordt om op verder te

bouwen, op raken, zodat men terug naar de vorige stap moet en deze nogmaals moet herhalen.

Tabel 7: PCR fusie: Aantal pogingen nodig om tot het beoogd resultaat te komen.

Globinegen PCR 1 prom.regio PCR 1 genregio PCR 2 PCR 3

C06H2.5 1 1 1 2

C09H10.8 1 1 1 2

C18C4.1 1 1 1 /

C18C4.9 / / / 1

C23H5.2 1 1 / /

59

C26C6.7 1 2 1 2

C29F5.7 1 1 1 1

C36E8.2 1 1 1 10

C52A11.2 1 4 1 2

F19H6.2 / / / 2

F21A3.6 / / / 3

F46C8.7 1 1 1 1

F56C4.3 1 1 1 1

R01E6.6 1 1 1 1

R11H6.3 1 1 4 1

R90.5 1 2 12 6

T06A1.3 1 1 2 /

Y15E3A.2 1 1 1 1

Y58A7A.6 / / / 1

Y75B7AL.1 1 3 10 1

ZK637.13 1 1 4 2

Eens we een geslaagd PCR 3 product verkregen hadden, probeerden we dit in grote getale aan

te maken door PCR 3 in de exact dezelfde omstandigheden opnieuw uit te voeren, maar dan in

grotere hoeveelheid. Nadat we deze PCR 3 producten verkregen hadden moesten we deze nog

bewerken alvorens ze te kunnen kloneren in de donorvectoren. Hiervoor dampten we de

stalen uit om de concentratie aan constructen te verhogen, vervolgens lieten we ze op een

agarosegel lopen om de banden met de juiste grootte uit te snijden en de constructen terug te

bekomen via gelextractie. Dit alles werd tenslotte gecontroleerd door middel van Nanodrop

analyse en gelektroforese.

60

De eerste poging voor de globinegenen C26C6.7 en ZK637.13 bleek geslaagd (Tabel 8).

Tabel 8: PCR fusie: Controle op eindproduct na gelextractie deel I.

Globinegen Nanodrop Gelelektroforese

C26C6.7 12,73 ng/l OK

ZK637.13 11,12 ng/l OK

Echter tijdens de tweede poging voor de genen C26C6.7, F19H6.2 en Y58A7A.6 moet er iets

misgelopen zijn want na de gelextractie werd telkens tijdens de controle via Nanodrop en

gelelektroforese niet het gewenste resultaat bekomen (Tabel 9).

Tabel 9: PCR fusie: Controle op eindproduct na gelextractie deel II.


C26C6.7 0,92 ng/l Niet OK

F19H6.2 1,24 ng/l Niet OK

Y58A7A.6 1,39 ng/ l Niet OK

De derde poging met de genen C26C6.7, C36E8.2, F19H6.2, F21A3.6 en Y58A7A.6 bleek

wel terug een succes. Voor zowel C26C6.7, C36E8.2 en F21A3.6 waren de controles positief

(Tabel 10).

Tabel 10: PCR fusie: Controle op eindproduct na gelextractie deel III.


C26C6.7 10,01 ng/l OK

C36E8.2 9,22 ng/l OK

F19H6.2 7,79 ng/l Niet OK

F21A3.6 5,13 ng/l OK

Y58A7A.6 4,37 ng/l Niet OK

61

Een vierde en uiteindelijk vijfde gelextractie voor respectievelijk de globinegenen C06H2.5,

C09H10.8, F56C4.3 en R01E6.6 en de globinegenen C06H2.5, C18C4.9 en F19H6.2 waren

eveneens succesvol (Tabel 11 en 12).

Tabel 11: PCR fusie: Controle op eindproduct na gelextractie deel IV.


C06H2.5 5,53 ng/l OK

C09H10.8 5,07 ng/l OK

F56C4.3 6,29 ng/l OK

R01E6.6 8,61 ng/l OK

Tabel 12: PCR fusie: Controle op eindproduct na gelextractie deel V.


C06H2.5 13,08 ng/l Niet OK

C18C4.9 15,23 ng/l Niet OK

F19H6.2 12,78 ng/l OK

Alles samen hadden we dus voor negen globinegenen een zuiver en geconcentreerd staal van

plasmiden, deze negen waren C06H2.5, C09H10.8, C26C6.7, C36E8.2, F19H6.2, F21A3.6,

F56C4.3, R01E6.6 en ZK637.13.

4.1.2 Klonering

Alvorens de constructen te kunnen transformeren naar E. coli cellen, dienden we deze te

kloneren in een donorvector (pDONR™ vector) via de BP recombinatie reactie. Bierbij werd

via recombinatie een stuk DNA uit de vector vervangen door het gewenste construct.

Deze stap hebben we een aantal keer gedaan voor verschillende globinegenen. De eerste keer

was dit van C26C6.7 en ZK637.13. De tweede keer voor C26C6.7, C36E8.2 en F21A3.6. Een

derde maal voerden we de klonering uit voor de genen C06H2.5, C09H10.8, F56C4.3 en

R01E6.6. Tenslotte deden we ook nog een vierde klonering voor C06H2.5 alleen. Wegens

tijdsgebrek werd met het F19H6.2 staal geen klonering uitgevoerd.

62

Deze stap werd uitgevoerd zonder controle, resultaten in verband met succes of mislukking

tijdens deze stap zijn hier dus niet voor handen.

4.1.3 Transformatie

Na de klonering konden we de constructen transformeren naar de E. coli cellen. Transformatie

van de intacte plasmiden in E. coli cellen gebeurde via het proces van opname door gebruik te

maken van competente cellen (E. coli type DH5 alpha) en deze opname stabiel te maken door

hitteshock.

De constructen van de globinegenen die getransformeerd werden waren, net zoals bij de

kloneringstap, deze van C26C6.7 en ZK637.13 tijdens de eerste transformatie, C26C6.7,

C36E8.2 en F21A3.6 tijdens een volgende transformatie, C06H2.5, C09H10.8, F56C4.3 en

R01E6.6 tijdens de derde transformatie en C06H2.5 nogmaals met een vierde en laatste

transformatie.

Aangezien de donorvector waarin de constructen werden gekloneerd een gen bevatte dat de E.

coli cellen immuun maakte voor het antibioticum kanamycine en we dit antibioticum hadden

aangebracht op de agar plaatjes wisten we dat de kolonies die effectief groeiden op deze

ondergrond de donorvector hadden opgenomen. Na elke transformatie werden kolonies

gevormd en konden we er dus van uitgaan dat de donorvector was opgenomen tijdens de

transformatie, behalve van C06H2.5, waarbij in beide gevallen geen kolonies werden

gevormd.

4.1.4 Plasmidenisolatie

Nu de plasmiden vermenigvuldigd waren in de E. coli cellen moesten we deze intact terug uit

de E. coli cellen zien te krijgen. Dit gebeurde door middel van plasmidenisolatie volgens de

miniprepmethode.

Maar vooraleer deze procedure te kunnen doorlopen, moesten de E. coli kolonies geselecteerd

worden waarin ook het correcte construct aanwezig was. Dit werd gedaan aan de hand van de

methode colony cracking. Hierbij werden enkele E. coli cellen van 32 kolonies per gen

gelyseerd en via gelelektroforese werden de kolonies uitgekozen die het meest waarschijnlijk

het correcte construct opgenomen hadden aan de hand van hun bandenpatroon. Aangezien de

63

kans groter was dat een kolonie het plasmide had, werden dus de kolonies uitgekozen

waarvan de band op de gel afweek van de rest (Figuur 16).

Figuur 16: Plasmidenisolatie: Voorbeeld van een colony cracking voor C36E8.2 waar men een extra band kan zien voor twee van de kolonies.

Figuur 17: Plasmidenisolatie: Voorbeeld van een restrictie enzym test voor C06E4.7, C09H10.8, F49E2.4, F56C4.3 en R01E6.6, waarbij het verwachte bandenpatroon werd aangeduid door middel van de rode cirkels.

64

Tijdens de eerste colony cracking werden volgende kolonies geselecteerd: 13 en 14 van

C26C6.7 en 24 en 25 van ZK637.13. Ook werd colony cracking uitgevoerd op een aantal

kolonies van R102.9 en F19H6.2. Deze kolonies werden mij aangereikt door mij begeleider.

Van deze genen werden de volgende kolonies geselecteerd voor de plasmidenisolatie: 3 en 6

van R102.9 en 10 en 13 van F19H6.2. Op deze kolonies werd dus de eerste plasmidenisolatie

uitgevoerd. Als controle op deze stap werd een Nanodrop analyse uitgevoerd op de stalen en

werd eveneens een restrictie enzym test (RE test) gedaan. De Nanodrop analyse werd

uitgevoerd om te zien of de concentratie aan DNA in het staal voldoende hoog was om mee

verder te werken. Aangezien we 100ng nodig zouden hebben bij de volgende stappen en we

na de plasmidenisolatie ongeveer 200l verkregen moest dus een concentratie van minstens

0.5 ng/l bekomen worden bij de Nanodrop analyse. Bij de restrictie enzym test werden de

stalen met de verwachte plasmiden bewerkt met een restrictie enzym dat de plasmiden knipte.

Aangezien dit gedaan werd met een gekend restrictie enzym kon men vooraf voorspellen

welke en hoeveel banden men moest terugvinden bij gelelektroforese van de behandelde

stalen (Figuur 17). Het restrictie enzym dat we gebruiken was NotI en dit had voor de

volgende gelelektroforese resultaten moeten zorgen van de genen: Voor C26C6.7 hadden op

de gel twee banden zichtbaar moeten zijn, met groottes van 5067bp en 6362bp, voor C36E8.2

twee banden met groottes 2189bp en 4469bp, eveneens twee banden voor R102.9 met

groottes 3028bp en 6362bp en tenslotte voor ZK637.13 twee banden met groottes 2789bp en

5275bp. De resultaten van deze controles zijn te vinden in tabel 13. Enkel voor globinegen

R102.9 was de restrictie enzym test positief met twee correcte banden die werden

weergevonden op de gel.

Tabel 13: Plasmidenisolatie: Controle na eerste plasmidenisolatie deel I.

Globinegen Nanodrop RE-test

C26C6.7-13 28,54 ng/l Niet OK

C26C6.7-14 23,70 ng/l Niet OK

ZK637.13-24 19,10 ng/l Niet OK

ZK637.13-25 22,57 ng/l Niet OK

R102.9-3 31.03 ng/l OK

R102.9-6 26.79 ng/l OK

65

F19H6.2-10 25.05 ng/l Niet OK

R19-13 16,92 ng/l Niet OK

Aangezien er dus enkel een positieve uitkomst was voor globinegen R102.9 werd er voor de

drie overige globinegenen 2 nieuwe kolonies uitgekozen via het gelelektroforese resultaat van

de colony cracking. Voor het gen C26C6.7 werden dat kolonies 30 en 32, voor het gen

ZK637.13 kolonies 3 en 9 en tenslotte voor het gen F19H6.2 eveneens kolonies 3 en 9. Deze

keer werd de RE-test uitgevoerd met het restrictie enzym Eco RI. De verwachte aantal banden

en de bijbehorende groottes van deze bij een positief resultaat moesten de volgende zijn: voor

C26C6.7 werden acht banden verwacht met groottes 658bp, 671bp, 884bp, 1255bp, 1231bp,

1452bp, 2141bp en 3137bp (al zou dit in de praktijk waarschijnlijk vier banden zijn aangezien

sommige banden zo gelijkend zijn qua grootte dat ze als één band overkomen op de gel), voor

ZK637.13 werden drie banden verwacht met groottes 32bp, 1291bp en 5327bp) en als

resultaat van de RE-test van F19H6.2 werden slechts twee banden op de gel verwacht en dit

met groottes 3471bp en 4593bp. De resultaten hiervan zijn te vinden in tabel 14. Ook tijdens

deze tweede poging werd de RE-test voor één gen positief bevonden, de gel analyse van

F19H6.2 gaf het verwachte patroon.

Tabel 14: Plasmidenisolatie: Controle na eerste plasmidenisolatie deel II.


C26C6.7-30 5,89 ng/l Niet OK

C26C6.7-32 5,77 ng/l Niet OK

ZK637.13-3 6,12 ng/l Niet OK

ZK637.13-9 5,69 ng/l Niet OK

F19H6.2-3 5.25 ng/l OK

R19-9 4,72 ng/l Niet OK

Voor de genen C26C6.7 en ZK637.13 bleken dus geen enkele van de vier kolonies die we tot

nu toe hadden gecontroleerd het plasmide met het correcte construct te bevatten. En aangezien

we geen andere kandidaat-kolonies meer hadden uit de eerste colony cracking werd voor deze

twee genen een tweede colony cracking uitgevoerd op 32 nieuwe kolonies. Via het

66

bandenpatroon werden dan opnieuw 2 kolonies gekozen per gen om een plasmidenisolatie op

uit te voeren en deze vervolgens te controleren via Nanodrop en een RE test. Voor gen

C26C6.7 waren dit kolonies 37’ en 47’, terwijl kolonies 38 en 48’ gekozen werden voor

ZK637.13. En net zoals tijdens de vorige RE test werd het restrictie enzym Eco RI gebruikt,

hetzelfde patroon als bij de vorige test werd dus verwacht. De resultaten hiervan zijn te

vinden in tabel 15. Kolonie 38 die het plasmide met het construct van ZK637.13 in zich droeg

bleek het correcte RE patroon te vertonen en dus hoogstwaarschijnlijk het correcte construct

te bevatten.

Tabel 15: Plasmidenisolatie: Controle na eerste plasmidenisolatie deel III.


C26C6.7-37’ 12,37 ng/l Niet OK

C26C6.7-47’ 15,82 ng/l Niet OK

ZK637.13-38 11,33 ng/l OK

ZK637.13-48’ 8,71 ng/l Niet OK

Van de genen C26C6.7, ZK637.13, F19H6.2 en R102.9 waarmee we begonnen waren hadden

we na twee colony cracking’s en drie plasmidenisolaties en bijhorende Nanodrop en RE

analyses, kolonies van drie genen die het correcte construct bevatten, deze waren F19H6.2-3,

R102.9-3 en ZK637.13-38 (eveneens R102.9-6). Voor deze genen konden we nu overgaan tot

de tweede plasmidenisolatie. Deze isolatie was identiek aan de eerste, met het enige verschil

dat deze nu op grotere schaal gebeurde dan de eerste plasmidenisolatie. Een RE controle op

deze tweede plasmidenisolatie gebeurde niet meer, enkel een Nanodrop analyse, aangezien we

de concentratie aan DNA in de stalen later nog zouden nodig hebben. De resultaten hiervan

zijn te zien in tabel 16.

Tabel 16: Plasmidenisolatie: Nanodrop analyse na tweede plasmidenisolatie deel I.

Globinegen Nanodrop

F19H6.2-3 1236,8 ng/l

R102.9-3 1169,7 ng/l

ZK637.13-38 1045,9 ng/l

67

Een derde colony cracking voor de genen C26C6.7, C36E8.2 en F21A3.6 werd eveneens

gedaan, hiervan werden net zoals bij de voorgaande keren enkele kolonies geselecteerd om

een plasmidenisolatie op uit te voeren: C26C6.7-2, C26C6.7-4, C36E8.2-4, C36E8.2-6,

F21A3.6-6 en F21A3.6-9. De resultaten van de Nanodrop analyse en RE controle (met

EcoRI) zijn terug te vinden in tabel 17. Voor alle drie de genen C26C6.7, C36E8.2 en

ZK637.13 werden geen positieve resultaten gevonden bij de RE test.

Tabel 17: Plasmidenisolatie: Controle na eerste plasmidenisolatie deel IV.


C26C6.7-2 16,77 ng/l Niet OK

C26C6.7-4 13,26 ng/l Niet OK

C36E8.2-4 14,24 ng/l Niet OK

C36E8.2-6 13,57 ng/l Niet OK

F21A3.6-6 17.25 ng/l Niet OK

F21A3.6-9 14,11 ng/l Niet OK

Een vierde colony cracking werd uitgevoerd voor de genen C09H10.8, F56C4.3 en R01E6.6.

Hiervan werden 8 kolonies uitgekozen om een eerste plasmidenisolatie op uit te voeren:

C09H10.8-2, C09H10.8-6, F56C4.3-1, F56C4.3-2, F56C4.3-11, R01E6.6-1, R01E6.6-2 en

R01E6.6-12. Ook kreeg ik voor het globinegen C06E4.7 drie kolonies van mijn begeleider om

plasmidenisolatie op uit te voeren: C06E4.7-1, C06E4.7-2 en C06E4.7-3. De resultaten van de

controles hierbij zijn te vinden in tabel 18. De RE-test werd ook hier gedaan met het restrictie

enzyme EcoRI. Uit de gelelektroforese analyse van de RE-test bleken alle 3 de kolonies van

C06E4.7 en F56C4.3 en één kolonie van R01E6.6 het correcte contruct in de plasmide te

bevatten.

Tabel 18: Plasmidenisolatie: Controle na eerste plasmidenisolatie deel V.


C06E4.7-1 43,03 ng/l OK

C06E4.7-2 42,77 ng/l OK

C06E4.7-3 40,36 ng/l OK

68

C09H10.8-2 19,40 ng/l Niet OK

C09H10.8-6 25,79 ng/l Niet OK

F56C4.3-1 43,11 ng/l OK

F56C4.3-2 54,08 ng/l OK

F56C4.3-11 45,69 ng/l OK

R01E6.6-1 66.55 ng/l Niet OK

R01E6.6-2 46.42 ng/l OK

R01E6.6-12 55,81 ng/l Niet OK

Voor de genen C06E4.7, F56C4.3 en R01E6.6 konden we nu dus een tweede

plasmidenisolatie uitvoeren om zo tot de plasmiden met de correcte contructen te komen, die

we later in de C. elegans organismen zouden transformeren. De kolonies waarop we deze

tweede plasmidenisolatie deden waren C06E4.7-3, F56C4.3-2 en R01E6.6-2. De resultaten

van hun Nanodrop analyse zijn te vinden in tabel 19.

Tabel 19: Plasmidenisolatie: Nanodrop analyse na tweede plasmidenisolatie deel II.

Globinegen Nanodrop

C06E4.7-3 1043,2 ng/l

F56C4.3-2 1319,8 ng/l

R01E6.6-2 1828,3 ng/l

Tot slot deden we nog een zesde poging tot plasmidenisolatie. Deze maal voor het gen

C09H10.8, waarvoor we de kolonies C09H10.8-15 en C09H10.8-18 gebruikten alsook voor

het globinegen F49E2.4, waarvan ik twee stalen van kolonies kregen van mijn begeleider:

F49E2.4-10 en F49E2.4-11. De resultaten van deze plasmidenisolatie zijn te vinden in tabel

20.

69

Tabel 20: Plasmidenisolatie: Controle na eerste plasmidenisolatie deel VI.


C09H10.8-15 33,64 ng/l Niet OK

C09H10.8-18 25,29 ng/l Niet OK

F49E2.4-10 24,11 ng/l Niet OK

F49E2.4-11 58,36 ng/l OK

Voor F49E2.4-11 konden we nu dus eveneens nog een tweede plasmidenisolatie uitvoeren.

De resultaten van deze Nanodrop analyse zijn te vinden in tabel 21.

Tabel 21: Plasmidenisolatie: Nanodrop analyse na tweede plasmidenisolatie deel III.

Globinegen Nanodrop

F49E2.4-11 887,0 ng/l

Als laatste stap moesten we een restrictie enzym digest uitvoeren op de stalen na de tweede

plasmidenisolatie. Dit om open plasmiden te bekomen die later zouden kunnen recombineren

met het DNA binnen in de C. elegans individuen. Aangezien we hiervoor 11.25 mg nodig

hadden per staal konden we alles berekenen via de resultaten van de Nanodrop analyse. Dit

deden we dus voor de globinegenen C06E4.7, F19H6.2, F49E2.4, F56C4.3, R01E6.6, R102.9

en ZK637.13, alsook voor de genen T22C1.2, W01C9.5 en Y17G7B.6 waarvan ik de stalen,

waarop de RE digest moest gebeuren, kreeg van mijn begeleider.

Alles samen voerden we geslaagde plasmidenisolaties uit voor de globinegenen C06E4.7,

F19H6.2, F49E2.4, F56C4.3, R01E6.6, R102.9 en ZK637.13. Voor de genen C09H10.8,

C26C6.7, C36E8.2 en F21A3.6 werd echter geen positief resultaat waargenomen.


Zoals vermeld bestond het eerste deel erin om reporterconstructen te produceren van de

globinegenen van C. elegans. Dit deel bestond uit vier grote stappen, namelijk PCR Fusie,

klonering, transformatie en isolatie van de plasmiden. Eens de plasmiden geïsoleerd waren

70

konden we beginnen met de aanmaak van de transgene lijnen. Dit gebeurde door een C.

elegans populatie te transformeren met de aangemaakte plasmiden die het

globinegenconstruct bevatten. Deze transformatie werd door ons gedaan via de techniek van

microdeeltjes beschieting


Aangezien we tijdens de PCR Fusie plasmiden met globinegenconstructen hadden

aangemaakt, waren we klaar om deze in de unc-119 mutant Caenorhabditis elegans populatie

te transformeren door middel van microdeeltjes beschieting.

Tijdens een eerste beschieting werden plasmiden met constructen van de genen F19H6.2,

R102.9 en ZK637.13 gebruikt. Voor elk gen werden 2 petrischaaltjes vol C. elegans

organismen beschoten. Deze beschietingen gebeurden telkens volgens protocol en leken allen

geslaagd. Een detail dat de resultaten van deze stap (en dus ook van al het voorgaande) kan

doen mislukken is het vergeten van de deksels van de petrischaaltjes te halen tijdens de

beschietingen, voor positieve resultaten let men hierbij dus beter goed op.

Een tweede beschieting werd uitgevoerd met de globinegenen C06E4.7, F56C4.3, R01E6.6 en

T22C1.2. Eveneens werd tijdens deze tweede beschieting voor elk gen twee beschietingen

gedaan. Elk van deze leken geslaagd.

Tenslotte voerden we een derde en laatste beschieting uit voor de genen F49E2.4, W01C9.5

en Y17G7B.6 idem aan de twee voorgaande beschietingen.

4.2.2 Detectie transgene lijnen

Tenslotte als laatste stap, eens de populaties C. elegans beschoten waren met de plasmiden en

de tijd gegeven werden om in aantal te groeien, was de detectie van de transgene lijnen. Dit

kon relatief gemakkelijk gebeuren aangezien de transgene individuen terug het wild type

fenotype vertoonden. Ook konden we dit controleren met behulp van een

fluorescentiemicroscoop. Eerst werden van elke C. elegans populatie de individuen geïsoleerd

die het WT fenotype vertoonden onder de microscoop. Deze individuen werden op een

petrischaaltje gebracht om te laten voortplanten. Wanneer de F2 nakomelingen het WT

fenotype en fluorescentie vertoonden wisten we dat het construct stabiel getransformeerd was

in de C. elegans lijn.

71

Voor de genen C06E4.7, R01E6.6, R102.9 en T22C1.2 vonden we via

fluorescentiemicroscopie individuen die fluorescentie vertoonden en bijgevolg het construct

met de LAP-tag in verwerkt moesten bevatten (Figuur 18). Deze individuen isoleerden we op

nieuwe petriplaatjes en de nakomelingen screenden we opnieuw voor tekenen van

fluorescentie, zodoende zeker te zijn dat het construct stabiel werd doorgegeven aan de

volgende generatie en dus in de chromosomen was ingebouwd. Jammer genoeg bleek geen

enkele van de transgene C. elegans organismen een stabiele lijn voort te brengen.

Figuur 18: Detectie transgene lijnen: Voorbeeld van de kop van een transgeen C. elegans organisme (T22C1.2) .

72

5. Discussie


Zoals de resultaten aantonen is het maken van reportergenen voor de globinegenen van C.

elegans via Fusie PCR, gevolgd door klonering, transformatie naar E. coli en

plasmidenisolatie zeker mogelijk.

Weliswaar zijn er toch opmerkingen inzake het gebruik van deze methode. We hebben

duidelijk gemerkt dat Fusie PCR een zeer tijdsrovende manier was om tot een promotor-

LAPtag-gen construct te komen. Bij elke stap werden de resultaten steeds minder positief.

PCR 1 verliep bijna vlekkeloos, terwijl PCR 2 en zeker PCR 3 voor steeds meer

moeilijkheden zorgden. Hiervoor zien we vier redenen als oorzaak van de problemen die we

merkten tijdens het proces: amplificatie van atypisch DNA, het achterblijven van

restproducten na elke PCR, de grootte van de te vermenigvuldigen fragmenten DNA en het

feit dat bij het herhaaldelijk mislukken van één stap terug gekeerd moet worden naar de

vorige stap om nieuw startmateriaal te verkrijgen.

Een eerste oorzaak van het vaak mislukken van PCR’s tijdens fusie PCR is het feit dat tijdens

PCR’s ook andere stukken DNA kunnen worden geamplificeerd naast de gewenste regio. Dit

was te zien aan de atypische banden die werden waargenomen bij de controle via

gelelektroforese. Aangezien de volgende stap vertrok met het staal uit de vorige stap en dit

dus meestal geen zuiver DNA bevatte, gaven de volgende stappen telkens minder en minder

positieve resultaten.

Een tweede reden zijn de restproducten die achterblijven in het staal na een PCR zoals

bijvoorbeeld resterende primers. Deze kunnen moeilijkheden veroorzaken bij een volgende

PCR. Stel je voert PCR 3 uit met het PCR 2 staal als startmateriaal, maar hierin zitten nog

overblijvende primers van PCR 2 kan het zijn dat gewoon meer PCR 2 materiaal wordt

gevormd in de plaats van nieuw PCR 3 DNA.

De derde en waarschijnlijk voornaamste reden waarom PCR fusie voor redelijk wat

problemen zorgt in de praktijk is dat de stukken DNA die moeten geamplificeerd worden

steeds groter worden. Tijdens PCR 1 amplificeerden we vooral DNA fragmenten met een

73

grootte van ongeveer 3 kb, terwijl dit bij PCR 2 al ongeveer 5 kb werd en tijdens PCR 3

amplificeerden we fragmenten DNA van ongeveer 8 kb groot (Tabel 22). Ervaring leert dat

grotere stukken DNA moeilijker te amplificeren vallen via PCR. Hadden we bijvoorbeeld

DNA fragmenten van 8 kb groot geamplificeerd in PCR 1 gingen de resultaten daar naar alle

waarschijnlijkheid ook al veel slechter geweest zijn (mondelinge communicatie begeleider).

Tabel 22: PCR-fusie: Groottes van de DNA fragmenten die bij elke stap geamplificeerd werden (bij benadering voor PCR 2 en PCR 3).

Globinegen PCR 1 prom.regio PCR 1 genregio PCR 2 PCR 3

C06H2.5 2807 bp 1914 bp 3000 bp 5807 bp

C09H10.8 2891 bp 2548 bp 3600 bp 6491 bp

C18C4.1 2975 bp 6216 bp 7300 bp 10275 bp

C23H5.2 2998 bp 4181 bp 5200 bp 8198 bp

C26C6.7 1745 bp 4772 bp 5800 bp 7545 bp

C29F5.7 2825 bp 1226 bp 2300 bp 5125 bp

C36E8.2 3000 bp 3588 bp 4600 bp 7600 bp

C52A11.2 2788 bp 2248 bp 3300 bp 6088 bp

F46C8.7 3705 bp 2518 bp 3600 bp 7305 bp

F56C4.3 2987 bp 2841 bp 3900 bp 6887 bp

R01E6.6 2835 bp 4590 bp 5600 bp 8435 bp

R11H6.3 2814 bp 3842 bp 4900 bp 7714 bp

R90.5 3000 bp 5488 bp 6500 bp 9500 bp

T06A1.3 2943 bp 9037 bp 10100 bp 13043 bp

Y15E3A.2 2975 bp 3222 bp 4300 bp 7275 bp

Y75B7AL.1 3045 bp 4754 bp 5800 bp 8845 bp

ZK637.13 1107 bp 1886 bp 2900 bp 4007 bp

Daarbovenop is er ook het probleem dat, wanneer een stap niet lukt, het beginmateriaal (het

eindproduct van de vorige stap) uiteindelijk op raakt en men dus naar de vorige stap moet

74

terugkeren. Deze vier oorzaken leidden er volgens ons toe dat het proces van PCR fusie zo

moeizaam verliep.

De volgende stappen bij de aanmaak van de reportergenen gaf weliswaar minder problemen,

zeker de clonering en de transformatie naar E. coli cellen verliep telkens vlekkeloos.

Één probleem dat we nog hadden was dat we na de transformatie niet gelijk welke E. coli

kolonie konden gebruiken om een plasmidenisolatie op uit te voeren. In theorie kunnen op

nutriënt agar platen bewerkt met kanamycine, na de transformatie van het plasmide naar de E.

coli cellen, enkel die individuen overleven die het plasmide met het construct opgenomen

hebben, aangezien dit plasmide ook het gen draagt voor kanamycine resistentie. In de praktijk

echter werkt deze techniek niet perfect en krijg je vaak vals positieven. Hierdoor moesten we

dus eerst de kolonies aanduiden die effectief het plasmide bevatten. Één manier om dit te

doen zou via PCR geweest zijn, maar dit zou een tijdrovende onderneming geweest zijn. Een

andere, snelle methode die we gebruikten om deze vals positieven te onderscheiden van de

correcte kolonies was colony cracking. Maar ondanks de snelheid van deze methode, is ze

ook niet perfect. Zoals men kan zien via figuur 16 krijg je een reeks verschillende banden

voor de verschillende kolonies, waarbij je niet exact weet welke band de correcte kolonie

aanduid. Er is wel de wetenschap dat kolonies die het construct bevatten een band vertonen

die overeenstemt met een grotere grootte, maar zekerheid is er niet. Hierdoor moest

plasmidenisolatie enkele malen opnieuw worden gedaan op andere kolonies tot we

uiteindelijk de juiste kolonie hadden gevonden. Uiteindelijk bleek de methode wel

doeltreffend aangezien zelfs in het ergste geval al na enkele pogingen een plasmidenisolatie

werd uitgevoerd van een kolonie die het correcte plasmide bevatte.


We kozen om stabiele transgene C. elegans lijnen te maken door middel van microdeeltjes

beschieting. In tegenstelling tot micro-injectie, een methode die enkel tot extrachromosomale

kopijen ven het plasmide leidt, kan microdeeltjes beschieting wel leiden tot insertie van het

construct in het chromosomaal DNA van de C. elegans individuen om zo tot stabiele

transgene lijnen te komen. Een ander voordeel van deze techniek is dat het DNA slechts in

een klein aantal kopijen voorkomt in de organismen na beschieting, wat overexpressie

voorkomt. De beschietingen op zich zorgden in deze studie niet voor problemen en er werden

75

bij ons ook transgene (wild type) individuen opgemerkt. Echter bij deze individuen was er

geen zekerheid dat de constructen stabiel waren geïntegreerd. Pas wanneer deze individuen

geïsoleerd werden en konden voortplanten, kon men aan de hand van de nakomelingen zien of

het om een stabiele transgene C. elegans lijn ging. Hiervan echter was er van de beschoten

wormen uit dit onderzoek geen te vinden. Echter andere studies laten er geen twijfel over

bestaan dat deze techniek wel degelijk kan leiden tot positieve resultaten. Praitis et al. (2001)

en Berezikov et al. (2004) bijvoorbeeld waren wel in de mogelijkheid om stabiele transgene

C. elegans lijnen te bekomen. Weliswaar was hun studie veel omvangrijker en werden veel

meer beschietingen uitgevoerd, waardoor de kans op slagen uiteraard veel groter was. Zij

stelden beiden bovendien dat van de transgene lijnen er slechts 10% tot 50% geïntegreerd zijn

en aangezien wij slechts voor vier globinegenen transgene individuen hadden is het niet

onlogisch dat wij geen enkele stabiele lijn bekwamen, al was het procentueel zeker ook wel

mogelijk. Daarbovenop leidden latere pogingen in het labo eveneens tot stabiele transgene C.

elegans populaties (mondelinge communicatie begeleider). Een andere reden dan pech is er

niet om te verklaren waarom in deze studie geen enkele stabiele transgene C. elegans lijn

werd bekomen. Bij microdeeltjes beschieting is het een kwestie van kans dat het construct

effectief in het chromosoom wordt geïntegreerd en wij hadden het geluk blijkbaar niet aan

onze kant.

76

6. Conclusie

Ondanks dat het theoretisch mogelijk is om PCR fusie succesvol uit te voeren in drie dagen, is

dit in de praktijk meestal niet het geval. De ongekende optimale condities waarbij elke

specifieke PCR het best werkt, de vermenigvuldiging van niet gewenste DNA fragmenten, het

achterblijven van restproducten na elke PCR en de alsmaar groter wordende DNA regio’s die

moeten geamplificeerd worden, zorgen ervoor dat deze methode zeer tijdrovend wordt. Het

proces om de bekomen constructen in grote massa aan te maken via klonering, transformatie

naar E. coli en tenslotte de plasmidenisolatie is dan weer wel zeer efficiënt en gaat behoorlijk

snel. Buiten het feit dat na de transformatie naar de E. coli cellen veel vals positieven

voorkomen verliep alles zeer vlot. Het creëren tenslotte van stabiele transgene C. elegans

lijnen door middel van microdeeltjes beschieting met de door ons aangemaakte plasmiden

bleek niet succesvol. Ondanks dat we behoorlijk wat individuen aantroffen die fluorescentie

vertoonden, bleek geen enkele na isolatie en voorplanting een stabiele lijn voort te brengen,

allen bevatten dus slechts extrachromosomale kopijen van het plasmide. Microdeeltjes

beschieting is met andere woorden een techniek waar men geluk moet bij hebben om tot

stabiele transgene lijnen te komen.

In het algemeen kunnen we concluderen dat het mogelijk is om via fusie PCR, klonering,

transformatie in E. coli cellen, plasmidenisolatie en microdeeltjes beschieting stabiele

transgene C. elegans lijnen te bekomen. Alleen is het een zeer tijdsrovend karwei, waarbij de

laatste stap een echte loterij is en je vooral geluk moet hebben. Iets wat jammer genoeg niet

aan ons gegund was.

77

7. Summary

Globins are a protein family that is very widespread through all five kingdoms of life. There

commonality is that they all share the same structure, called the globin fold, which consists of

6 to 8 -helices separated by loops and a hydrophobic core in which a haem group can bind.

Still there are a lot of different types of globins: bacterial flavohemoglobins, Vitreoscilla

hemoglobins, plant symbiotic and non-symbiotic hemoglobins, animal hemoglobins, chimeric

hemoglobins and truncated hemoglobins. These proteins appear to have a large number of

functions, but a lot is still unknown about this big protein family.

Since the nematode Caenorhabditis elegans has a great number of globin genes in its genome

and it is a very good model organism it is perfect for globin research.

With this research we had as goal to create stable transgenic Caenorhabditis elegans lines for

some of the globin genes of this nematode. For this, we first had to make reporter constructs

for these globin genes. They existed out of 3 parts: the promoter region of the globin gene, the

actual globin gene and a LAP-tag in the form of green fluorescent protein (GFP). As method

of creating these three partial reporter constructs we used PCR fusion. Next we cloned the

reporter constructs in a vector to make plasmids that contained this reporter constructs, we

then transformed them to Escherichia coli cells to create a large number of these plasmids en

eventually filtered them in high concentration out of the E. coli cells through plasmid

isolation. At the end of the research we tried to insert the plasmids with the three partial

reporter constructs into the C. elegans genome by way of micropartical bombardement to

make stable transgenic C. elegans organisms. These individuals could then be isolated to

reproduce so we could see if they would create a stable transgenic line in which the plasmids

with the reporter constructs were passed on from generation to generation. Making of these

stable lines is important because they can be used for a lot of research, such as expression

analyses and localization of the globins or to identify interaction partners of these proteins.

The results of this research showed that we could make the three partial reporter constructs for

all of the 17 different globin genes that we started with by method of PCR fusion and for 10

of them we were able to produce them in large amount through cloning, transformation to E.

coli and plasmid isolation. Despite of the success of these steps it was a very time consuming

work that far from always went perfect. During the three steps of PCR fusion, PCR 1, 2 and 3,

for most of the genes we needed a lot of trials to succeed. Also when choosing the right

78

colonies for plasmid isolation after transformation to the E. coli cells there are a lot of

colonies that did not appear to have the plasmid containing the kanamycine resistance gene in

their cells. On the other hand, the creation of the stable transgenic C. elegans lines was not

successful at all. The micropartical bombardements went perfectly and fluorescent C. elegans

individuals were found, however none of them were stable and went on to produce a whole

line of transgenic C. elegans organisms. Apparently they all just had extra chromosomal

copy’s of the plasmid present in their cells instead of an inserted copy in their genome.

We believe that the problems that we encountered during PCR fusion were caused by five

reasons: the unknown conditions at which the PCR’s were supposed to be carried out, the

amplification of atypical DNA, the staying behind of rest products from a previous step, the

size of the DNA fragment that needed to be amplified and the fact that when a step repeatedly

failed we needed to go back to the previous step to create new start material. The first reason

was that we did not know the optimum conditions at which the PCR’s were supposed to be

carried out, the only thing we could do was start with standard conditions and adjust these

along the way. A second reason was that often there is also amplification of atypical DNA

regions next to the wanted DNA fragment during PCR and because the next step always starts

with the end product of the previous step this can interfere with the making of the desired

product. The third reason was that after each PCR, rest products such as primers remain in the

sample and because these samples are then used as start material for the next step they also

can interfere with the amplification of the desired DNA fragment. For example primers from

PCR 1 can amplify more of the PCR 1 DNA instead of the targeted PCR 2 DNA region. The

fourth reason for the problems that we encountered during fusion PCR was probably the most

significant. The larger the DNA fragment that needs to be amplified during PCR the more

difficult it is to get a positive result and since during PCR fusion the desired DNA regions

step by step grew in size the fragments became increasingly more difficult to amplify. As a

last reason there was also the fact that, since al the steps follow each other in series, each time

starting with the outcome sample of the previous step, when a step continuously failed

eventually the start material was all used up and we had to go back to the previous step to

make new start material. The problem with choosing the right colonies for plasmid isolation

after transformation to the E. coli cells was that there were a lot of false positives that

apparently were able to grow on a medium treated with the antibiotic kanamycine without

having the plasmid containing the kanamycine resistance gene in its cell. However since we

performed colony cracking to see if the colony’s contained in fact the plasmid, this was not a

79

major problem and this method was sufficient enough for the process of choosing the right

colonies.

At last the major problem that we encountered of not being able to get stable transgenic C.

elegans lines with reporter construct inserted in the genome using microparticle

bombardement was nothing else then bad luck. This method is able to producing these stable

lines, but only with a small chance of success.

In general we can conclude that it is possible to create stable transgenic C. elegans lines using

fusion PCR, cloning, transformation to E. coli cells, plasmid isolation and microparticle

bombardement. Only it is very time consuming and especially the last step is very dependent

of luck, something that apparently was not granted to us.

80

8. Dankwoord

Langs deze weg zou ik graag enkele mensen willen bedanken die er mede voor gezorgd

hebben dat deze masterproef tot een goed einde werd gebracht. Eerst en vooral zijn dat de

promotor van dit project: Professor Doctor Bart P. Braeckman en zijn voorganger: Jacques R.

Vanfleteren. Dank u voor de vrijheid die ik kreeg om gedurende deze masterproef mijn eigen

tempo te volgen en altijd klaar te staan met raad wanneer er onverwachte problemen opdoken.

Vervolgens zou ik ook graag mijn familie en in het bijzonder mijn ouders, zus, schoonbroer

en hun zoontje bedanken om mij zo lang en onvoorwaardelijk te blijven steunen en voor de

nodige stimulans te zorgen dit werk tot een goed einde te brengen. Ook kan ik onmogelijk het

voltallige team van het Vanfleterenlab vergeten, die mij fantastisch verwelkomd hebben in

hun midden en steeds behandeld hebben als zijnde een volwaardige collega, nooit eerder heb

ik mij ergens vanaf de eerste dag zo thuis gevoeld. Bedankt allen! Maar diegene die wellicht

de meeste eer verdient moet wel mijn begeleider Sasha De Henau zijn voor het grote geduld

dat hij met mij heeft gehad en de vriendelijkheid waarmee hij met mij samenwerkte. Een

betere begeleider kon ik mij onmogelijk wensen. Zelfs wanneer ik persoonlijk een halve dag

werk verknoeide, stond hij nog klaar met een schouderklopje en geruststellende woorden.

Geen vraag was hem eveneens te veel, al stelde ik om de twee minuten een nieuwe vraag,

steeds was hij bereid deze te beantwoorden. Sasha, een welgemeende dankjewel!

81

9. Referenties

Barnes W.M. (1977). Plasmid detection and sizing in single colony lysates. Science 195

(4276): 393-394.

Bashford D., Chothia C. & Lesk A.M. (1987). Determinants of a protein fold. Unique features

of the globin amino acid sequences. Journal of Molecular Biology 196: 199-216.

Bekker A., Holland H.D., Wang P.L., Rumble D., Stein H.J., Hannah J.L., Coetzee L.L. &

Beukes N.J. (2004). Dating the rise of atmospheric oxygen. Nature 427: 117-120.

Berezikov E., Bargmann C.I. & Plasterk R.H.A. (2004). Homologous gene targeting in

Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic Acids Research 32 (4): 1-7.

Burmester T., Gerlach G. & Hankeln T. (2007). Regulation and Role of Neuroglobin and

Cytoglobin under Hypoxia. Hypoxia and the Circulation 13: 169-180.

Burr A.H., Hunt P., Wagar D.R., Dewilde S., Blaxter M.L., Vanfleteren J.R. & Moens L.

(2000). A hemoglobin with an optical function. The Journal of Biological Chemistry 275:

4810-4815.

Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W. & Prasher D.C. (1994). Green fluorescent

protein as a marker for gene expression. Science 263: 802-805.

Evans T.C. (2006). Transformation and microinjection. WormBook: 1-15.

McGrath P.T., Rockman M.V., Zimmer M., Jang H., Macosko E.Z., Kruglyak L. &

Bargmann C.I. (2009). Quantitive Mapping of a Digenic Behavioral Trait Implicates

Globin Variation in C. elegans Sensory Behaviors. Neuron 61: 692-699.

Gerstein M., Sonnhammer E.L. & Chothia C. (1994). Volume changes in protein evolution.

Jounal of Molecular Biology 236: 1067-1078.

Geuens E., Dewilde S., Hoogewijs D., Pesce A., Nienhaus K., Nienhaus G.U., Olson J.,

Vanfleteren J., Bolognesi M. & Moens L. (2004). Nerve Globins in Invertebrates. Life 56

(11-12): 653-656.

Hankeln T., Ebner B., Fuchs C., Gerlach F., Haberkamp M., Laufs T.L., Roesner A., Schmidt

M., Weich B., Wystub S., Saaler-Reinhardt S., Reuss S., Bolognesi M., De Sanctis D.,

Marden M.C., Kiger L., Moens L., Dewilde S., Nevo E., Avivi A., Weber R.E., Fago A.

82

& Burmester T. (2005). Neuroglobin and cytoglobin in search of their role in the

vertebrate globin family. Jounal of Inorganic Biochemistry 99: 110-119.

Hardison R.C. (1996). A brief history of hemoglobins: plant, animal, protest, and bacteria.

Proceedings of the National Academy of Sciences U S A 93: 5675-5679.

Hartley J.L., Temple G.F. & Brasch M.A. (2000). DNA cloning using in vitro site-specific

recombination. Genome Research 10: 1788-1795.

Hobert O. (2002). PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for

expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques 32: 728-730.

Hoogewijs D., Geuens E., Dewilde S., Vierstraete A., Moens L., Vinogradov S. &

Vanfleteren J.R. (2007). Wide diversity in structure and expression profiles among

members of the Caenorhabditis elegans globin protein family. BMC Genomics 8 (365).

Kapp O.H., Moens L., Vanfleteren J., Trotman C.N., Suzuki T. & Vinogradov S.N. (1995).

Alignement of 700 globin sequences: extent of amino acid substitution and its correlation

with variation in volume. Proteine Science 4: 2179-2190.

Kendrew J.C. (1963). Myoglobin and the structure of proteins. Science 139: 1259-1266.

Kurtz D.M. (1991). Oxygen carriers in Blood and Tissues. Advances in Comparative and

Envirenmental Physiology 13.

Lecomte J.T.J., Vuletich D.A. & Lesk A.M. (2005). Structural divergence and distant

relationships in proteins: evolution of the globins. Current Opinion in Structural Biology

15: 1-12.

Persson A., Gross E., Laurant P., Busch K.E., Bretes H. & de Bono M. (2009). Natural

variation in a neural globin tunes oxygen sensing in wild Caenorhabditis elegans. Nature

doi:10.1038/nature07820.

Perutz M.F. (1979). Regulation of oxygen affinity of hemoglobin: influence of structure of the

on the heme iron. Annual Review of Biochemistry 48: 327-386.

Praitis V., Casey E., Collar D. & Austin J. (2001). Creatin of Low-Copy Integrated

Transgenic Lines in Caenorhabditis elegans. Genetics 157: 1217-1220.

83

Praitis V. (2005). Creation of Transgenic Lines Using Microparticle Bombardement Methods.

Methods in Molecular Biology 351: 93-107.

Royer W.E., Zhu J.H., Gorr T.A., Flores J.F., Knapp J.E. (2005). Allosteric Hemoglobin

Assembly: Diversity and Similarity. The Journal of Biological Chemistry 280 (30):

27477-27480.

Van Holde K.E. & Miller K.I. (1995). Hemocyaninins. Advanced Protein Chemistry 47: 1-81.

Vinogradov S.N., Hoogewijs D., Bailly X., Arrendondo-Peter R., Guertin M., Gough J.,

Dewilde S., Moens L. & Vanfleteren J. (2005) Three globin lineages belonging to two

structural classes in genomes from the three kingdoms of life. PNAS 102 (32): 11385-

11389.

Vinogradov S.N. & Moens L. (2008). Diversity of Globin Function: Enzymatic, Transport,

Storage, and Sensing. Journal of Biological Chemistry 283 (14): 8773-8777.

Wajcman H., Kiger L. & Marden M.C. (2009). Structure and function evolution in the

superfamily of globins. C. R. Biologies 332: 273-282.

Weber R.E. & Vinogradov S.N. (2001). Nonvertebrate Hemoglobins: Functions and

Molecular Adaptations. Physiological Reviews 81 (2): 569-605.

Wittenberg J.B., Bolognesi M., Wittenberg B.A. & Guertin M. (2002). Truncated

Hemoglobins: A New Family of Hemoglobins Widely Distributed in Bacteria,

Unicellular Eukaryotes and Plants. The Journal Of Biological Chemistry 277 (2): 871-

874.

Yang Y., Hong H., Lee I., Bai D., Yoo G. & Choi J. (2000). Detection of DNA Using a

Visible Dye, Nile Blue, in Electrophoresed Gels. Analytical Biochemistry 280: 322-324.

MultiSite Gateway®

Three-Fragment Vector Construction Kit: User Manual. (2008).

Invitrogen™.

http://www.ciwemb.edu/pages/firelab.html (06-03-2011)

http://www.wormbase.org/ (14-09-2010)

http://www.wormbook.org/ (23-11-2010)

aanmaak reporterconstructen en stabiele transgene lijnen ... · fyla platyhelminthes, nemertea,...

Documents