ก

รายงานวจยฉบบสมบรณ

งบประมาณแผนดน (วช.) ประจ าป พ.ศ. 2557

เรอง

การเปลยนแปลงสรระเคมและกจกรรมเอนไซมยอยอาหารในรอบวงจรลอกคราบของปมา (Portunus pelagicus)

Physicochemical and digestive enzyme activities changes of blue swimming crab (Portunus pelagicus) over molt cycle.

ผศ.ดร.บญรตน ประทมชาต

ภาควชาวารชศาสตร คณะวทยาศาสตร

มหาวทยาลยบรพา

จงหวดชลบร

ข

บทคดยอ

น าปมาวยรนจากธรรมชาตขนาดความกวางกระดอง 8-9 เซนตเมตร น าหนก 50-60 กรม มาเลยงในถงไฟเบอรกลาสขนาด 500 ลตร โดยใชปรมาณน าทะเลความเคม 30 psu ใหปลาสดเปนอาหาร โดยให 10-15% ของน าหนกตวป วนละ 2 ครง แบงการทดลองออกเปน 8 การทดลองจากระยะลอกคราบทงสน 8 ระยะ ไดแก ระยะหลงลอกคราบใหม ๆ (Early post-molt, A stage) ระยะหลงลอกคราบ (Post-molt, B stage) ระยะคราบแขง (Intermolt, C1, C2 stages) และระยะกอนลอกคราบ (Premolt, D1, D2, D3 และ D4 stages) ท า 5 ซ า เกบเลอดและตบจากปมาทระยะลอกคราบตางๆ แลวน าไปวดปรมาณของธาตโซเดยม โปแตสเซยม แคลเซยม แมกนเซยม และคลอรน รวมทงตรวจสอบกจกรรมจ าเพาะของทรปซน ไคโมทรปซน โปรตเอส และ อะไมเลส

จากผลการทดลองพบวาความเขมขนของแรธาตทง 5 ชนดและกจกรรมจ าเพาะของเอนไซมยอยอาหารมการเปลยนแปลงไปตามวงจรการลอกคราบของปมา แรธาตสวนใหญมความเขมขนสงขนจากระยะหลงลอกคราบ (B stage) โดยเพมสงขน (p<0.05) อยางตอเนองจนถงระยะกอนลอกคราบ (D2 หรอ D3 stage) กอนลดลง (p<0.05) ทระยะกอนลอกคราบ (D4 stage) จนถงระยะลอกคราบใหม ๆ (A stage) กจกรรมจ าเพาะของโปรตเนสและทรปซนมคาเพมขนจากระยะ B-C1 จนสงสดทระยะ D1 (p<0.05) กจกรรมจ าเพาะของไคโมทรปซน มคาเพมขนจากระยะ A-C1 จนสงสดทระยะ C2 (p<0.05) และกจกรรมจ าเพาะของอะไมเลสมคาเพมขนตามล าดบจากระยะ B จนสงสดทระยะ D2 (p<0.05) โดยกจกรรมจ าเพาะเอนไซมทง 4 ชนด มคาลดลงต าสด (p<0.05) ทระยะ D4 รวมถงอตราสวนของกจกรรมจ าเพาะและทรปซนตอ ไคโมทรปซน (T/C ratio) มคาเพมขนอยางตอเนองจากระยะ B จนมคาสงสด (p<0.05) ทระยะ D4

ค

Abstract

Wild caught blue swimming crab Portunus pelagicus (8-9 cm in external carapace width and 50-60g body weight) were held in 500-L fiberglass tanks at 30 psu seawater. They were fed twice daily with fresh fish by ration of 10-15% of crab body weight. The experiment was divided into 8 treatments as followed 8 molting stages: Early post-molt (A stage), Postmolt (B stage), Intermolt (C1, C2 stages) and Premolt (D1, D2, D3 และ D4 stages). Five replications were operated. Hemolymph and hepatopancrease of crab samples at different molt stages were collected and further analyzed for concentrations of Na, K, Ca, Mg and Cl, including specific activity of trypsin, chymotrypsin, protease and amylase.

The results found that concentrations of 5 ions and specific activity of 4 enzymes changed over the molt cycle. The concentrations of ions in majority increased from postmolt (B stage) and continuously increased (p<0.05) though the premolt stage (D2 or D3 stage) thereafter to the lowest level (p<0.05) at D4 stage. Specific activities of trypsin and protease increased from B-C1 stage until the highest (p<0.05) at D1 stage. Chymotrypsin specific activity increased from A-C1 stages to the highest value (p<0.05) at C2 stage. Amylase specific activity gradually increased and was highest (p<0.05) at D2 stage. Specific activities of 4 enzymes showed the lowest level (p<0.05) at D4 stage. T/C ratio value increased gradually from B stage to the highest (p<0.05) at D4 stage.

ง

สารบญ

หนา บทคดยอภาษาไทย ..................................................................................................................... ข บทคดยอภาษาองกฤษ ................................................................................................................ ค สารบญ ....................................................................................................................................... ง สารบญรป ................................................................................................................................... จ บทน า .......................................................................................................................................... 1 เอกสารงานวจยทเกยวของ ......................................................................................................... 2 วธด าเนนการวจย ......................................................................................................................... 8 ผลการวจย .................................................................................................................................. .. 12 อภปราย ผลการทดลอง ............................................................................................................... … 15 สรปผลการทดลอง ...................................................................................................................... 17 เอกสารอางอง ............................................................................................................................. 18

จ

สารบญรป

รปท หนา

1 การเปลยนแปลงความเขมขนของ โซเดยม คลอรน และโพแทสเซยมในพลาสมาของปมา (P. pelagicus) ตลอดวงจรลอกคราบ

12

2 การเปลยนแปลงความเขมขนของแมกนเซยม และแคลเซยมในพลาสมาของปมา (P. pelagicus) ตลอดวงจรลอกคราบ

13

3 น าหนก กจกรรมจ าเพาะ (specific activities) ของ amylase (µmol maltose min–1 mg protein–1) total protease (U mg protein–1) trypsin และ chymotrypsin (µmol p-nitroaniline min–1 mg protein–1)และอตราสวนของ trypsin และchymotrypsin (T/C ratio) ของปมา (P. pelagicus) ทระยะลอกคราบ 8 ระยะ; early postmolt (A), postmolt (B), intermolt (C1), late intermolt (C2), early premolt (D1), mid premolt (D2), late premolt (D3), and very late premolt (D4).

14

1

บทน า

ปจจบนจ านวนประชากรในประเทศไทยมปรมาณเพมมากขน จงท าใหความตองการอาหารเพอการบรโภคเพมมากขนมากกวาในอดต โดยเฉพาะปมา (Portunus pelagicus) ทถอวาเปนสตวน าทมความส าคญทางเศรษฐกจ เพราะเปนสตวน าทหาไดงายพบอยทวไปในทะเลอาวไทย และอนดามน ท ารายไดใหแกชาวประมงมาชานาน แตในปจจบนมการท าประมงเกนอตรา (over fishing) ท าใหปรมาณปมา และทรพยากรประมงอนๆลดจ านวนลงอยางรวดเรว อกทงสภาพแวดลอมทเปลยนแปลงไป อนเนองมาจากภยธรรมชาตและมลพษในทะเล

เนองจากปญหาทเกดขนดงกลาวจงไดมการเลยงปมาขนเพอทดแทนการจบปมาจากธรรมชาตเพอน ามาบรโภค ซงระบบการเลยงปมาในปจจบนเรมมการเลยงแบบพฒนา (intensive culture) โดยเปนการน าลกปมาจากโรงเพาะฟกมาเลยงใหไดขนาดตามทตลาดตองการ ประเทศแถบเอเชยกมการเลยงปมาเชนกน เชนประเทศญปนซงมลกษณะการจดการฟารมเลยงปมา (Portunus sp.) แบบดงเดม (extensive farming) และการเลยงปมารวมกบสงมชวตอนๆ (polyculture) สวนในประเทศไทยกเรมมการน าปมามาเลยงเชนกน แตการเลยงปมาในประเทศไทยยงขาดขอมลพนฐานตางๆทจะน าไปประยกตใช เพอการเลยงใหไดผลผลตทดและแกปญหาตางๆทเกดขนอนเนองมาจากมการท าการศกษาคอนขางนอย แมวาเกษตรกรจะไดใชประสบการณและความช านาญเดมจากการเพาะเลยงกงกลาด า (Penaeus monodon) และกงขาว (Litopenaeus vannamei) เปนพนฐานแลวกตาม อตราการรอดตายของปมายงคงต าเนองจากปมามพฤตกรรมแตกตางจากกงทะเลดงกลาวมากโดยเฉพาะอยางยงชนดอาหารทปมาตองการ มระยะเวลาลอกคราบทยาวนานกวา อกทงมการสรางเปลอกภายหลงลอกคราบทนาน จงสงผลใหมพฤตกรรมการกนกนเองทรนแรง แมจะมการจดการทด ลดความหนาแนนและใหสงหลบซอน ไมสามารถแกปญหานได (บญรตน และสรยน, 2548) การศกษาการเปลยนแปลงไปทางสรระเคมภายในรางกายดวยการศกษาการเปลยนแปลงของแรธาตทส าคญ จะชวยท าใหเขาใจและสามารถเขาถงวธการหาการจดการทเหมาะสมได อาหารทเหมาะสมกบการเลยงปมานบวาเปนประเดนหนงทควรจะใหความส าคญเปนล าดบแรก เนองจากเมอไดรบชนดอาหารทมความเหมาะสมกอาจท าใหพฤตกรรมการกนกนเองของปมาลดลงและสามารถเพมอตราการรอดตายไดการน าสารอาหารไปใชเปนพลงงานส าหรบการลอกคราบ และเจรญเตบโตอยางมประสทธภาพนนกจกรรมของเอนไซมหลายชนดเปนตวแปรหนงทมความสมพนธกบอตราการเจรญเตบโตและคณภาพของอาหาร (Wormhoudt et al., 1992) จงนบวาการศกษากจกรรมของเอนไซมมความส าคญเนองจากสามารถอธบายความตองการชนดอาหารซงสมพนธกบวงจรการลอกคราบของปมาและสามารถคดเลอกชนดของวตถดบอาหารเพอการผลตอาหารส าเรจรปทเหมาะสมส าหรบการเลยงปมา ปมามการเจรญเตบโตดวยการลอกคราบ ความเขมขนของเลอดและกจกรรมของเอนไซมมการเปลยนแปลงไป ซงมผลตอกลไกการควบคมสรระเคมภายในรางกายเพอการเจรญเตบโตและกลไกการลอกคราบมผลกระทบตอระยะเวลาการลอกคราบและความส าเรจในการลอกคราบ จงไดท าการวจยการเปลยนแปลงความเขมขนของแรธาต 5 ชนด ไดแก แคลเซยม แมกนเซยม โซเดยม โปตสเซยม และคลอไรด รวมถงหลกพนฐานจากความรดานเอนไซมยอยอาหารเกยวกบรปแบบการเปลยนแปลงกจกรรมของเอนไซมยอยอาหารหลก (Pavasovic et al., 2004) ไดแก ทรปซน (trypsin) และไคโมทรบซน (chymotrypsin) ของปมาในรอบวงจรลอกคราบ จะไดชวยสรางความมนใจไดวาวตถดบอาหารทไดคดเลอกมาเพอผลตอาหารปมาดงนนหากมขอมลพนฐานเหลานแลวจะสามารถน าผลการวจยไปประยกตใชในการก าหนดสงแวดลอมและสตรอาหารทเหมาะสมตอการเลยงปมาไดตอไป

2

เอกสารงานวจยทเกยวของ 1. ระยะลอกคราบของปมา (Molting stage of blue swimming crab) การลอกคราบนอกจากจะเปนการเพมขนาดแลว ยงเปนการเปลยนแปลงลกษณะดวย ระยะเวลาในการลอกคราบครงหนงๆ จะหางกนเทาใดนนขนกบขนาด อาย และความสมบรณของปทะเล นอกจากนยงขนกบสภาวะแวดลอมทเหมาะสมดวย วงจรการลอกคราบของปมาขนาดโตเตมวยโดยทวไปแบงไดเปน 5 ระยะใหญคอ ระยะหลงการลอกคราบตอนตน หรอ ระยะ A (Early postmolt) ระยะหลงลอกคราบ หรอ ระยะ B (postmolt) ระยะคราบแขง หรอ ระยะ C (Intermolt) ระยะกอนลอกคราบ หรอ ระยะ D (Premolt) และระยะลอกคราบ หรอ ระยะ E (Ecdysis) ระยะการลอกคราบทมการจ าแนกไวนยงสามารถแบงยอยไดอกเปน 9 ระยะคอ ระยะ A, B, C1, C2, C3, D1, D2, D3 และ E เหมอนกนกบปทะเล (Pratoomchat et al., 2004) 2. การรกษาสมดลออสโมตกและไอออนก (Osmotic and Ionic Regulation)

ครสเตเชยนสามารถแสดงระบบ osmoregultion ไดหลายรปแบบ บางชนดเปน stenohaline คอทนทานตอการเปลยนแปลงความเคมน าไดในชวงแคบๆ บางชนดเปน euryhaline คอทนทานตอการเปลยนความเคมน าไดในชวงกวาง โดยความสมพนธระหวางคาออสโมลาลต (osmolality) ภายในรางกายกบน าภายนอก มกแสดงในรปของ osmoconformity เรยกสตวกลมนวา osmoconformer ซงแรงดนออสโมตก (osmotic pressure) ภายในจะเปลยนแปลงตามน าภายนอกตลอดชวงของความทนทานตอการเปลยนแปลงความเคมน า ความเขมขนของเลอด (hemolymph) และน าภายนอกจะมแรงดนออสโมตกเทากนทงสองดาน (isosmotic) ตวอยางสตวกลมนไดแก Pollicipes polymerus และ Porcellana platycheles สวนสตวกลม osmoregulator จะพยายามรกษาระดบความเขมขนออสโมตกภายในใหคอนขางคงท อาจจะมากกวาหรอนอยกวาน าภายนอกตลอดชวงของความทนทานตอการเปลยนแปลงความเคมน า ตวอยางสตวกลมนไดแก กง Panulirus longipes และ กง Crangon crangon เปนตน (Mantel และ Farmer, 1983)

3. การรกษาสมดลไอออน (Ionic Regulation) เปนททราบกนมานานแลววาไอออนทเปนองคประกอบของเลอดจะมความแตกตางกบน าภายนอก (Robertson, 1944, 1953, 1960 อางโดย Mantel และ Farmer, 1983) โดยไมค านงถงความสมพนธของระบบออสโมตก การเปรยบเทยบกนโดยตรงของไอออนทเปนองคประกอบในน าภายนอก , ในเลอด และในปสสาวะ มกจะท าใหเกดความผดพลาดไดเนองจากผลกระทบของโปรตนทมมากถง 10% ในเลอด มผลใหน าทเปนองคประกอบของของเหลวทง 3 แหลงไมเทากน

ความเขมขนของโซเดยมและคลอรนในเลอดมกจะใกลเคยงกบคาทจดสมดลเมอสตวอยในน าทะเล และศกยไฟฟาทเปนลบจ านวนเลกนอยมกจะถกน ามานบดวย ซงทจดสมดลนมกจะท าใหในเลอดมคาโซเดยมมากเกนจรง และมคลอรนนอยกวาคาจรงเมอเทยบกบน าภายนอก มกจะพบวาโปแตสเซยมในเลอดมความเขมขนมากกวาในน าภายนอก แมวาบางสวนอาจจะมาจากการปนเปอนโดยเซลลถามการน าเลอดทงหมดมาใชในการวเคราะห

การรกษาสมดลของไอออนทมประจ 2 หนวย (divalent ion) ยงมความซบซอนมากกวา บางสวนของแคลเซยมและแมกนเซยม จะเกดพนธะกบโปรตนหรอไอออนอนๆ และไมแสดงความเปนไอออน ตวอยางเชน ป Gecarcinus lateralis มแคลเซยมทงหมดในเลอด 22 mmol ในขณะทมเพยง 8.6 mmol

3

ในเลอดทผานการกรองอยางละเอยดเพอขจดโปรตนออกไป นนคอมแคลเซยมจบตวกบโปรตนอยถง 13.4 mmol (Skinner et al.,1965 อางโดย Mantel และ Farmer, 1983) แคลเซยมทเกดพนธะกบสารอนจะมประมาณ 10% ของแคลเซยมทงหมดในเลอดของ Emerita asiatica (Sitaramaiah และ Krishnan, 1966 อางโดย Mantel และ Farmer, 1983) อกทงใน crayfish Austropotamobius pallipesมแคลเซยมทอยในรปของไอออนนอยกวา 50% ในขณะทสวนอนๆ ไปเกดพนธะกบโปรตน ไอออนของสารอนทรยขนาดเลก หรอกบสารอนนทรย เชน SO4

2-, HCO3-, PO4

2-, และ CO32-(Greenaway, 1972 อางโดย Mantel และ

Farmer, 1983) สวนใน Orconectes limosus พบวามแคลเซยมทอยในรปไอออนอย 82% และแมกนเซยมกพบวามลกษณะเชนเดยวกน (Andrews, 1976 อางโดย Mantel และ Farmer, 1983)

divalent ion ทมการรกษาสมดลไวไดเปนอยางด คอ Mg2+ และ SO42-เมอสตวอยในน าทะเล ความ

เขมขนของแมกนเซยมไอออนจะอยระหวาง 20-80% ของความเขมขนในน าทะเล โดย มรายงานการศกษาทพบวาป Hyas, Lithodes และ Dromia มความเขมขนของแมกนเซยมในรางกายประมาณ 80% ของแมกนเซยมในน าทะเล หรอในป Uca sp. และป Ocypode quadrata มความเขมขนของแมกนเซยมในรางกายมากกวา 65% ของแมกนเซยมในน าทะเล สวนป grapsids พบวามความเขมขนของแมกนเซยมในรางกายประมาณ 20–30% ของน าทะเล ซงเหมอนกบในเดคาปอด (decapod) ทอาศยบนบกและกงบกชนดอนๆ (Robertson, 1960 อางโดย Mantel และ Farmer, 1983) 4. กลไกของระบบ Osmoregulation ในสตวครสเตเชยนในกลม euryhaline เชน ป C. maenas เปนปชนดทสามารถทนตอสภาพ สงแวดลอมทางดานความเคมน าทเปลยนแปลงไปไดซงสภาพนเรยกวา “hyperregulation” และ “hyporegulation” สตวเหลานมความสามารถทจะรกษาระดบความเขมขนของเลอดใหคงทในระหวางทสตวมการปรบตวตอความเคมน าทเปลยนแปลงไป เซลลจะมการตานตอ osmotic stress ซงจะมากเทาใดนนขนอยกบความสามารถในการควบคมความเขมขนในเลอด (Gilles และ Pequeux, 1981) ซงการควบคมระดบความเขมขนของเลอดภายในรางกายกบน าภายนอกนนมอย 2 รปแบบ ดงน 4.1 Hyperregulation สงมชวตทอาศยในน าจดหรอน าทะเลทมความเจอจางกวาเลอดของมน จะตองเผชญกบการแพรเขาของน าภายนอกรางกายและการสญเสยไอออนออกไปสสงแวดลอม แตกสามารถลดภาวะเหลานไดโดยการลดการน าน าและไอออนผานเขาออกโดยการลดขนาดของเยอเลอกผานใหมขนาดเล กลง ซงตามปกตแลวพวก osmoconformer จะมการยอมใหสารผานเขาออกไดมากกวาพวก osmoregulator และจะมการเปลยนแปลงการยอมใหสารผานเขาออกนอยเมอน าภายนอกมความเคมลดลง ใน congeneric amphipods ไดแก Gammarus duebeni, G. pulex, G. lacustris, G. zaddachiและ G. tigrinis จะลดการยอมใหโซเดยมผานเมออยในสภาวะทความเคมน าลดลง (Shaw และ Sutcliffe, 1961, Sutcliffe, 1967a,b, 1968 อางโดย Mantel และ Farmer, 1983 ) ใน moderate regulator เชน C. maenas (Shaw, 1961 อางโดย Mantel และ Farmer, 1983) แสดงใหเหนวามการเปลยนแปลงการยอมใหสารผานเขาออกนอย สวนในพวก strong regulator เชน Palaemonetes sp. พบวาอตราการสญเสยเกลอแรผานทางพนผวภายนอกจะลดลงเปนเวลาสนๆ เมอน าไปอยในน าความเคมต า สวนพวก hyperregulator จะลดการยอมใหน าผานเขาออกเมอตองเผชญกบน าความเคมต า

4

Rhithropanopeus harrisi ซงเปน hyperosmotic regulator ทน าความเคมต าและเปน isosmotic ทน าความเคมปกต พบวามการเปลยนแปลงของน าทผานเขาออกรางกายเพมขน 145% ตอชวโมง เมออยในน าความเคม 45% น าทะเล การแลกเปลยนโดยการแพรจะลดลงเหลอ 70% ตอชวโมง และเมออยในน าความเคม 1% น าทะเล การแลกเปลยนการแพรจะลดลงเหลอ 10% ตอชวโมง (Smith, 1967 อางโดย Mantel และ Farmer, 1983) และยงพบรปแบบเชนนในป U. pugilator และ C. sapidus (Hannan และ Euans, 1973, Robertson, 1982 อางโดย Mantel และ Farmer, 1983) ใน moderate hyperregulator เชน C. maenas ทมการยอมใหน าแพรผานเขาออกไดมากแสดงใหเหนวามการยอมใหน าผานลดลงเมอมการเปลยนแปลงความเคมน าจาก 263% ตอชวโมงในน าทะเลปกต เปน 176% ตอชวโมงในน าความเคม 40% น าทะเล รวมทง isopod S. serratumทอาศยในเขตน าขนน าลง มการลดการยอมใหน าผานเขาออกจาก 820% ตอชวโมง เมออยในน าทะเลเปน 200% ตอชวโมงในความเคม 50% น าทะเล ซงเกดขนภายใน 30 นาทเทานน และยงพบวาจะมการเปลยนแปลงเมอมการลดความเขมขนของโซเดยมและคลอรนในน าภายนอกดวย (Smith, 1970, Thuet, 1978 อางโดย Mantel และ Farmer, 1983) 4.2 Hyporegulation เมอสตวอยในน าทมความเคมสง สตวจะมการปรบตวโดยท าใหของเหลวในรางกายมความเขมขนต ากวาภายนอกเพราะทระดบความเคมน าสงจะมเกลอแรเขาสรางกายโดยมาพรอมกบน าปรมาณทมาก ดงนนสตวจะมปรบใหมความเขมขนทนอยลงโดยการขบเกลอแรออกและรกษาน าไวใหไดมากทสด ซงเปนการยากทจะวดการยอมใหผานของไอออนไดอยางแมนย า เพราะมกจะมการแลกเปลยนองคประกอบของไอออนทไหลออกจากรางกายอยตลอดเวลา ในสตวทมความสามารถอยางมากในการปรบระดบสมดลเกลอแรภายในรางกายจะแสดงภาวะ hyperosmotic เปนการกระตนการรบน าเขาภายในตว ซงจะแพรผานเขาสล าไสและจะพยายามรกษาเกลอแรไวภายในตวใหมากทสดเพอปรบสมดลเกลอแรภายในรางกายเมอสภาวะสงแวดลอมมความเขมขนเกลอแรต ากวาภายในตว (Passano, 1960) และในสตวทสามารถปรบสมดลเกลอแรไดไมดนกจะมคาออสโมลาลตต า ท าใหระบบการแพรผานเขาออกของแรธาตตางๆ ไมคอยสมบรณ ท าใหตองใชพลงงานอยางมากในการปรบสมดล (Smith, 1976, Mykles, 1980 อางโดย Passano, 1960) การปรบสมดลนจะเปนตวรกษาคาความดนออสโมตกภายในรางกายใหมความสมพนธกนอยางคงทกบสภาพแวดลอมภายนอก ซงกคอการปรบระดบคาความเขมขนภายในรางกายใหมคาสงหรอต ากวาสงแวดลอมภายนอกทอาศยอย การปรบสมดลดงกลาวเพอใหสงมชวตสามารถด ารงชวตอยไดเมอสงแวดลอมมการเปลยนแปลง จะพบไดในสงมชวตพวกครสเตเชยน ซงมรปแบบการปรบสมดลแตกตางกนออกไปในสงมชวตแตละชนด ครสเตเชยนทอาศยในน ากรอยสวนมากจะปรบสภาพสมดลเกลอแรภายในรางกายใหสงกวาน าภายนอก (hyperosmotic) ระดบความเขมขนของเกลอแรในเลอดจะสงกวาน าทอาศยอย สตวทอาศยในน าจด น าทะเล เชนกงน าจด กงทะเล (Caridea และ Penaeids) ป (Grapsid และ Xanthid) รวมทงสตวชนดอนๆ ทอาศยอยในน ากรอย พบวาเลอดจะอยในสภาวะ hyposmotic กบน าทะเลปกตและจะปรบสภาพเปนสภาวะ hyperosmotic เมออยในความเคมน าทต าลง การรกษาระดบ hyposmotic ในสภาพปกตของป (Grapsid) และกงบางชนดท าได 2 ทางคอ ทางแรกการดดน าจะเปนแบบคอยเปนคอยไป ทางท 2 การดมน าเขาไปโดยตรงเหมอนเชนปลากระดกแขงและในเวลาเดยวกนจะขบเกลอทมากเกนออกมาทางเหงอก (ประจวบ, 2537)

5

สวนใหญแลวสตวพวกครสเตเชยนทอาศยอยในน าเคมนน ในเลอดของสตวจะมชนดและปรมาณของอออนใกลเคยงกบของน าทะเล ซงสวนใหญแลวประกอบดวยโซเดยมและคลอรน และแรงดนออสโม ตกของเลอดกมาจากอออนสองตวนเชนกน นอกจากนนกมพวกอออนอนๆ บาง เชน แมกนเซยม ซลเฟต และแคลเซยมอออน เปนตน แตจะมอยในปรมาณทคอนขางนอย โดยเฉพาะแมกนเซยมในเลอดของครสเตเชยนจะมอยนอยกวาในน าทะเลมาก ถงแมองคประกอบของอออนรวมในเลอดกบในน าทะเลจะตางกนบาง แตมนกสามารถควบคมใหอยในภาวะสมดลได เมอมการเปลยนแปลงความเขมขนของอออนรวมในเลอดกง อนเนองมาจากการปรบตวทางดาน สรรวทยาตอการเปลยนแปลงความเคมของน าภายนอก อออนตวทมการเปลยนแปลงความเขมขนคอ โซเดยม และคลอรนอออน สวนอออนตวอนๆ นนจะมปรมาณคอนขางคงทหรอเปลยนแปลงนอยมาก (Parry, 1954 อางโดย ดารน, 2531) อออนรวมทมการเปลยนแปลงความเขมขนเมอความเคมเปลยนแปลง เปนอออนรวมทอยในของเหลวภายนอกเซลล (extracellular fluid) ซงไดแกเลอดนนเอง เลอดนจะหมนเวยนไปทวรางกายโดยการสบฉดของหวใจ ปรมาตรของของเหลวนจะมากหรอนอยขนอยกบวากงและปอยในระยะใดของกระบวนการลอกคราบ องคประกอบของของเหลวภายในตวจะคอนขางคงท สวนอวยวะทใชในการปรบสมดลของของเหลวในรางกายสตวเหลานม 3 แหงคอ green gland หรอ maxillary gland เปนอวยวะทคอยควบคมปรมาณเกลอ เหงอกควบคมอออนพวก monovalents เชน โซเดยม คลอรน และโปแตสเซยมอออน สวนล าไสเลกจะเปนตวควบคมปรมาณอออนพวก divalence เชน แคลเซยม แมกนเซยม และซลเฟตอออน เปนตน (Potts และ Parry, 1964) 5. การเปลยนแปลงไอออนในรอบวงจรการลอกคราบ (Ionic change over the molt cycle)

แรธาตมบทบาทหลายประการส าหรบสตวในกลมครสเตเชยนแรธาตเปนองคประกอบในเมทรกซเนอเยอทมความแขงแรง เชน เปลอกหรอโครงรางแขง เนอเยอทออนนม (เชน ซลเฟอรในโปรตน) เมทลโล -โปรตน (เชน สงกะสในคารบอกซเปปตเดต) โคแฟคเตอร และ/หรอ ต วกระตนในเอนไซมหลายชนด (เชน สงกะส และ แมงกานส) และฮโมซยนน (เชน คอปเปอร) สวนแรธาตทละลายงายกวา เชน แคลเซยม โซเดยม โปแตสเซยม แมกนเซยม คลอไรด และฟอสฟอรส จะท าหนาทเกยวของกบระบบสมดลเกลอแรและรกษาระดบความเปนกรดดางภายในรางกาย และความตางศกยของเมมเบรน ปมามการเจรญเตบโตดวยการลอกคราบ องคประกอบทางเคมของเลอดมการเปลยนแปลงไป ซงมผลตอกลไกการควบคมสรระเคมภายในรางกายเพอการเจรญเตบโตและกลไกการลอกคราบมผลกระทบตอระยะเวลาการลอกคราบและความส าเรจในการลอกคราบ การรกษาสมดลเกลอแรในวงจรการลอกคราบของสตวในกลมครสตราเชยนนน จะมการเพมความเขมขนของเลอดโดยการเพมปรมาณของแคลเซยม แมกนเซยม โซเดยม และคลอไรด โดยดงมาจากคราบเกาและจากน าภายนอก โดยทการสะสมจะเรมตนตงแตระยะหลงลอกคราบ (stage A) จนกระทงถงระยะกอนลอกคราบ (stage D1) (Mantel และ Farmer, 1985) ดงจะเหนไดจากการศกษาในสตวกลมครสเตเชยน เชน lobster (Hormarus americanus) กงขาว (Penaeus vannamei) และป Callinectes sapidus, Carcinus และ Scylla ทพบวาปรมาณแคลเซยม แมกนเซยม โซเดยม คลอไรด ฟอสฟอรส โปรตน กลโคส และออสโมลาลต (osmolality) จะมการเปลยนแปลงสมพนธกบวงจรการลอกคราบในเลอด ระยะหลงลอกคราบมกจะต ากวาระยะกอนลอกคราบ (Vigh and Dendinger 1982; Roer and Dillaman 1984;Cameron 1985; Mercaldo-Allen, 1991; Pratoomchat et al., 2002a, b) แคลเซยมอออนนบวาเปนอออนทมความส าคญมากในการควบคมกลไกในการสรางเปลอกโดยมทงการเคลอนยายจากเลอดไปสเปลอกและในทางกลบกน (Roer และ Dillaman, 1984; Mangum, 1992;

6

Ziegler, 1997; Pratoomchat et al., 2000) สารประกอบอนทรยกมบทบาทส าคญเชนเดยวกน (Hagerman, 1983)แตยงไมเคยพบการศกษาดงกลาวในปมา ซงการเปลยนแปลงทพบจากการวจยนจะสามารถทราบระดบทเหมาะสมและวกฤตส าหรบการควบคมสมดลแรธาต เพอทจะน าไปเปนขอมลพนฐานเพอก าหนดและควบคมปจจยดานสงแวดลอมเพอการเลยงปมาใหมประสทธภาพมากขนตอไป 6. การศกษาเอนไซมยอยอาหารของครสเตเชยน เอนไซมยอยอาหารของครสเตเชยนในเชงปรมาณ และคณภาพจะมความสมพนธกบระยะพฒนาการของครสเตเชยนวยออน (Van Wormhoudt et al., 1989) เชนในกงกลมพเนยด (Penaeid) พบวาเอนไซมอะไมเลสในระยะวยออนตอนตนจะมความเขมขนสงมาก จากนนความเขมขนจะต าลงเนองจากถกแทนทดวยเอนไซมโปรตเนสทระยะวยออนตอนกลาง และตอนปลาย เนองมาจากการปรบตวตอการเปลยนแปลงของอาหารทไดรบ เชน กงขาวแวนนาไม ทมสดสวนเอนไซมอะไมเลสตอทรปซนอยในระดบต าทระยะซเอย 1 จากนนจะเรมมสดสวนสงขนจนมคาสงสดทระยะซเอย 3 คงทไปจนถงระยะไมซส 3 (Mysis) และลดลงในระยะโพสลาวา (Post larva) นอกจากนกจกรรมของเอนไซมอะไมเลส และโปรตเนสของป Carcinus maenas ในชวงกอนลอกคราบตอนปลาย (Late Pre-molt) จะมกจกรรมต า (Ceccadi, 1997) ในขณะทกจกรรมของเอนไซม Nucleotide pyrophosphatase ของป Callinectes sapidus จะมคาสงสดในระยะกอนการลอกคราบตอนตน (Early Premolt stage) (Puyear, 1969) ในขณะท Vega-Villasante et al. (1995) พบวากจกรรมของเอนไซมโปรตเนสคอนขางคงทในระยะคราบแขง (Intermolt stage) ในขณะทเอนไซมอะไมเลส และไลเปสมคาสงขนในระยะกอนการลอกคราบ นอกจากความสมพนธของกจกรรมทเปลยนแปลงตามระยะการลอกคราบแลวยงพบวามความสมพนธกบการกนอาหารของครสเตเชยน ครสเตเชยนทกนเนอสวนใหญ จะมกจกรรมของเอนไซมโปรตเนสสงดงเชนการศกษาใน Midgut gland ของกงทะเลหลายชนด (Le Moullac et al., 1996; Fernandez-Gimenez et al., 2001; Johnston, 2003) ในขณะทครสเตเชยนทเปนพวกกนซากหรอผยอยสลาย จะมกจกรรมของเอนไซมโปรตเนสต าเชนในกงเครยฟช (Cherax quadricarinatus) เปนตน (Figueierdo et al., 2001) นอกจากนกจกรรมของเอนไซมยงขนอยกบปรมาณของอาหารทไดรบอกดวย (Anger, 2001) เชนเอนไซมโปรตเนส และแอลฟาอะไมเลสของครสเตเชยนจะมกจกรรมสงขนเมอมการเพมระดบของกลโคส หรอโปรตนในสตรอาหาร (Van Wormhoudt et al., 1992) โดยระดบทเหมาะสมของกลโคสและโปรตนคอ 5-10% และ 40-50% ตามล าดบ (Le Moullac et al., 1994) เอนไซมทรปซนเปนเอนไซมส าคญทมหนาทยอยโปรตนในครสเตเชยน ซงประกอบดวยไอโซไซม 6 ชนดมน าหนกโมเลกลประมาณ 25 kDa (Galgani et al., 1985) ไคโมทรปซนทสกดจากเฮปพาโตแพนเครยสของกงขาวแวนนาไมซงจดเปน Serine protease homologous ชนดเดยวกบสตวมกระดกสนหลง นอกจากนยงพบวาเมอมการเปลยนระดบของโปรตนในอาหารจะมผลท าใหกจกรรมของเอนไซมไคโมทรปซนสงขน คอเพมระดบของเคซนจาก 25% เปน 48%และยงพบวากจกรรมของเอนไซมไคโมทรปซนททดสอบกบเนอหมกจะมคาสงมากกวาการทดสอบกบเจลาตน (Gelatin) (Van wormhoudt et al.,1992) Cordova-Murueta et al. (2003) พบวาสภาวะทเหมาะสมของเอนไซมทรปซน และเอนไซมไคโมทรปซนในกงขาวแวนนาไมคออณหภม 37oC และ pH 7.5 ในขณะทศกษากจกรรมของเอนไซมยอยอาหารจากเฮปพาโตแพนเครยสของปทะเล (S. serrata) พบวาทอณหภม 50oC เปนอณหภมทเหมาะสมตอการท างานของเอนไซมโปรตเนสอะไมเลส เซลลเลสและไซลาเนสในขณะท pH 7 จะเปนสภาวะทเหมาะสมตอการท างานของเอนไซมโปรตเนส และอะไมเลส (Pavasovic et al., 2004) สอดคลองกบ Garcia-Carrenoet

7

al.(1997) พบวา pH ทเหมาะสมตอการท างานเอนไซมโปรตเนสของกง P. japonicusอยท 5.5-9สวนท pH 5.5 จะเปนสภาวะทเหมาะสมตอการท างานเอนไซมเซลลเลสและไซลาเนส Zwilling และ Neurath (1981) พบวาเอนไซมทรปซนในครสเตเชยนจะมกจกรรมเหมาะสมทชวง pH 7-9 โดยมน าหนกโมเลกลประมาณ 25 kDa และมการตอบสนองตอ Soybean trypsin inhibitor, Diisopropyl fluorophosphates และ Tosyl-lysyl-chloromethyl ketone กลาวคอเอนไซมในครสเตเชยนสวนใหญจะมกจกรรมทสภาวะเหมาะสมกบเปนกลางจนถงเบส เนองจากครสเตเชยนจะม Acidic isoelectric point ในขณะท Brockerhoff et al. (1970) ซงศกษาเอนไซมโปรตเนส 7 ชนดในลอบสเตอร (H. americanus) พบวามน าหนกโมเลกลอยในชวง 12.5-50.0kDa โดยมเอนไซมบางชนดจะมสภาวะpH ทเหมาะสมท pH 4 และ 8 ซงพบวาเอนไซมโปรตเนสในกง Astacus sp. มน าหนกโมเลกลเพยง 11 kDa ปรมาณอาหารทครสเตเชยนไดรบมผลโดยตรงกบความถของการกนอาหาร อตราการเจรญเตบโต และกจกรรมของเอนไซมยอยอาหาร กลาวไดวาในชวงทครสเตเชยนไดรบอาหารทเหมาะสมเพยงพอกบความตองการจะมอตราการเจรญเตบโตเพม และสงผลใหกจกรรมของเอนไซมเพมขนดวยทงนอาจเกยวของกบความถของการกนทมากขนนนเอง จนกระทงครสเตเชยนมอตราการเจรญเตบโตสงสดถงจดจดหนง กจกรรมของเอนไซมกจะมคาสงสดเชนกน จากนนอตราการเจรญเตบโตจะคงทตอไปเรอย ๆ แมวาจะมอตราการกนทมากขนเพราะปรมาณอาหารทเพมขนกตาม แตกลบพบวากจกรรมของเอนไซมจะลดลงเรอย ๆ และคงทเมออตราการกนคงทเนองจากปรมาณอาหารสงสดแลว (Anger, 2001) อตราการรอดตายของปมายงคงต าเนองจากปมามพฤตกรรมการกนกนเอง เนองจากปมามวงจรลอกคราบทยาวนาน อกทงใชเวลาของการสรางเปลอกภายหลงลอกคราบ จงสงผลใหมพฤตกรรมการกนกนเองทรนแรงขนอาหารทเหมาะสมกบการเลยงปมานบวาเปนประเดนหนงทควรจะใหความส าคญเปนล าดบแรก เนองจากเมอไดรบชนดอาหารทมความเหมาะสมกอาจท าใหพฤตกรรมการกนกนเองของปมาลดลงและสามารถเพมอตราการรอดตายไดการน าสารอาหารไปใชเปนพลงงานส าหรบการลอกคราบ และเจรญเตบโตอยางมประสทธภาพนน กจกรรมของเอนไซมหลายชนดเปนตวแปรหนงทมความสมพนธกบอตราการเจรญเตบโตและคณภาพของอาหารเชน เอนไซมอะไมเลสและโปรตเนส (Wormhoudt et al., 1992) เอนไซมทรปซนนบวาเปนเอนไซมทมความส าคญอกชนดหนงทเหนยวน าใหเกดการผลตเอนไซมส าคญหลายชนดโดยเฉพาะอยางยงเอนไซมไคโมทรปซนโดยเอนไซม 2 ชนดนมบทบาทส าคญในกระบวนการยอยโปรตน สงผลตอการเพมปรมาณกรดอะมโน และเพปไทด (Peptide) ในพลาสมา (Plasma) ซงมสวนส าคญตอการเจรญเตบโต (Torrissen et al., 1994) นอกจากนยงพบวากจกรรมจ าเพาะของเอนไซมทรปซนมความสมพนธกบการเจรญเตบโตของกงขาว (L. vannamei) ทเลยงดวยอาหารส าเรจรปทมการเปลยนแปลงระดบของเคซน (Casein) และแหลงโปรตน (Le Moullac et al., 1996) จงนบวาการศกษากจกรรมของเอนไซมมความส าคญเนองจากสามารถอธบายความตองการชนดอาหารซงสมพนธกบวงจรการลอกคราบของปมาและสามารถคดเลอกชนดของวตถดบอาหาร เพอการผลตอาหารส าเรจรปทเหมาะสมส าหรบการเลยงปมา

8

วธด าเนนการวจย

1. อปกรณ และสารเคมทใชในการทดลอง 1.1 อปกรณทางวทยาศาสตร

1.1.1 เครองวดคาการดดกลนแสง (Spectrophotometer) 1.1.2 เครองเหวยงตกตะกอนควบคมอณหภม (Centrifuge) 1.1.3 ตแชแขง -80 oC(Deep freeze refrigerator) 1.1.4 เครองวดความเปนกรด ดาง (pH Meter) 1.1.5 ปเปตอตโนมต (Autopipette) 1.1.6 โกรงแกว (Glass Homogenizer) 1.1.7 อางควบคมอณหภม (Water Bath) 1.1.8 หลอดแอพเพนดอรฟ (Appendorf Tube) 1.1.9 ตควบคมอณหภม (Incubator) 1.1.10 เครองผสมสารละลาย (Vortex mixer) 1.1.11 ตอบ (Hot air oven) 1.1.12 ตเผา (Muffle Fernance) 1.1.13 เครองวเคราะหไนโตรเจน (Kjeltec system) 1.1.14 เครองชง 4 ต าแหนง 1.1.15 เครองวเคราะหไขมน 1.1.16 โถดดความชน (Desiccators) 1.1.17 ถวยกระเบอง (Crucible) 1.1.18 Dialysis tube (MW cut off 10,000 Da) 1.1.19 Autopipette ขนาด 1,000 ไมโครลตร 1.1.20 Microcentrifuge 1.1.21 X – ray fluorescent Spectrophotometer ED 2000 1.1.22 เครองมอวดการดดกลนแสง 1.1.23 เครองเขยาสารละลาย (Vortex Mixer)

1.2 อปกรณ และสารเคมทางการเพาะเลยง 1.2.1 ปมา

1.2.2 เครองวดความเคม (Hand refractrometer) 1.2.3 คลอรนผง Ca (OCl)2 1.2.4 โพวโดนไอโอดน 1.2.5 ถงไฟเบอรกลาสปรมาตร 500 L 1.2.6 บอซเมนตขนาด 1 m3 และ 5 m3 1.2.7 หวทรายและสายอากาศ

1.3 สารเคมส าหรบการเตรยมบฟเฟอร pH ตาง ๆ 1.3.1 Glycine (C2H5NO2) 1.3.2 Hydrochloric acid (HCl)

9

1.3.3 Citric acid monohydrate (C6H8O7.H2O) 1.3.4 Disodium hydrogen phosphate (Na2 HPO4.2H2O) 1.3.5 Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4.2H2O) 1.3.6 Sodium carbonate (Na2CO3) 1.3.7 Sodium bicarbonate (NaHCO3) 1.3.8 Sodium hydroxide (NaOH) 1.3.9 Potassium chloride (KCl) 1.4 สารเคมส าหรบการศกษากจกรรมจ าเพาะของเอนไซม 1.4.1 N, α-Benzoyl-L-arginine -p-nitroanilide Hydrochloride (C12H22N6O4.HCl) 1.4.2 p-Nitroaniline (C6H6N2O2) 1.4.3 N-Succinyl- Ala-Ala-Pro-Phe p- Nitroanilide (C30H36N6O9) 1.4.4 N, N-Dimethylformamide (C3H7NO) 1.4.5 Tris-hydrochloride (C4H11NO3.HCl) 1.4.6 EDTA (C10H16N2O8) 1.4.7 3, 5-Dinitrosalicylic acid (DNS) 1.4.8 Starch solution 1.4.9 Azocasein solution 1.4.10 Trichloroacetic acid (TCA) 1.5 สารเคมส าหรบการวเคราะหปรมาณโปรตนและแรธาต 1.5.1 Bovine serum albumin (C8H21NOSi2) 1.5.2 Sodium carbonate (Na2CO3) 1.5.3 Sodium hydroxide (NaOH) 1.5.4 Copper sulphate (CuSO4 .5H2O) 1.5.5 Potassium sodium tartrate 1.5.6 Folin-Ciocalteau 1.5.7 30 % - Tri Sodium Citrate 2. สตวทใชในการทดลอง ปมาวยรนจากธรรมชาตขนาดความกวางกระดอง 8-9 เซนตเมตร น าหนก 50-60 กรม

3. สถานทท าการเพาะเลยง โรงเพาะเลยงภาควชาวารชศาสตร คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพาจงหวดชลบร

4. ระยะเวลาท าการทดลอง ท าการทดลองตงแตวนท 1 มกราคม พ.ศ. 2557 ถงวนท 30 เมษายน พ.ศ. 2558

10

5. การเลยงและการใหอาหารปมา

เลยงปมาในถงไฟเบอรกลาส โดยใชปรมาณน าทะเลความเคม30 psuในการเลยงประมาณ 100 ลตรซงน าจะทวมตวปประมาณ 10 เซนตเมตร วางสายอากาศบอละ 2 จดโดยเปดอากาศเตมท ทพนถงไฟเบอรกลาสจะเรยงดวยพวงเปลอกหอยแมลงภ ใหกระจายครอบคลมพนทเพอเปนทก าบง และลดการกระทบกระทงกนของปมา ท าการเลยงทงหมด 10 บอ การใหอาหารจะใชปลาขางเหลองหนเปนชนๆ ใหประมาณ 10-15% ของน าหนกตวป ใหอาหารวนละ 2 ครง เวลา 09.00 น และ 16.00 น ระหวางการเลยงปมา จะมการสมตวอยางน าเพอตรวจสอบคณภาพดวยชดวเคราะหคณภาพน าวดปรมาณออกซเจนทละลายในน า (D.O. meter) pH (pH meter) และเทอรโมมเตอรส าหรบวดอณหภม มการควบคม และรกษาระดบของคณภาพน าตลอดการเพาะเลยงดงนความเคมน ามคา 25-28 ppt pH มคา 7.5-8.3 แอมโมเนย< 0.5 ppm ไนไตรท <0.2 ppm ออกซเจนทละลายในน าสงกวา 5.7 ppm และอลคาไลนตมคา 90-120 ppm

6. การวางแผนการทดลอง การทดลองครงนไดแบงการทดลองออกเปน 8 การทดลองจากระยะลอกคราบทงสน 8 ระยะ

ไดแก ระยะหลงลอกคราบใหม ๆ (Early post-molt, A stage) ระยะหลงลอกคราบ (Post-molt, B stage) ระยะคราบแขง (Intermolt, C1, C2 stages) และระยะกอนลอกคราบ (Premolt, D1, D2, D3 และ D4 stages) (Pratoomchat และ Jindadam, 2007) ท าการตรวจสอบระยะลอกคราบทก 5-7 วน เมอพบวาปมาเขาสระยะทตองการจงท าการเกบตวอยางมาเพอเกบเลอดและเกบตบท าการทดลอง 5 ซ า 7.การเกบตวอยางเลอดปมา ท าการดดเลอดปมาโดยใชเขมฉดยา (Tuberculin ขนาด 1.0 ml ดวยเขมเบอร 26) แทงลงผาน Arthodial mambrane บรเวณโคนของรยางค (รยางคคท 1 หรอทเรยกวาโคนกามหนบ)น าเลอดเกบไวใน appendroff โดยผสม 10% tri-sodium citrate ซงเปนสารปองกนเลอดแขงตว (anticoagulant) ลงไปดวยในอตราสวน 1:1 (ใชเลอด 1 ml : 10%tri-sodium citrate 1 ml) เขยาใหเขากนแลวน าไปเกบในตแชเยนทอณหภม 4 องศาเซลเซยส 8. การเตรยมพลาสมาปมา

น าเลอดปมาทผสม 10% tri-sodium citrate ดงขอ 7 ไปปนเพอใหตกตะกอน (ควรทงใหเลอดในappendroff เปนของเหลวกอน)ดวยเครอง microcentrifuge เพอใหเมดเลอดตกตะกอนรวมตวกนทกนหลอดดวยแรงเหวยง 10,000 g ทอณหภม4 องศาเซลเซยส นานประมาณ 15 -20 นาท แลวดดของเหลวสวนบน (Supernatant) ซงกคอพลาสมาเกบไวใน appendroff ใหม

9. การวดปรมาณแรธาต

ใช autopipette ขนาด 1,000 ไมโครลตร ดดพลาสมาปน ามาใส cup โดยดานลางหมดวย prolene film แลวน าไปวดปรมาณของธาตโซเดยม คลอรน โปแตสเซยม แมกนเซยม แคลเซยม ดวยเครอง X-ray fluorescent spectrophotometer ED2000ตามวธการของ Pratoomchat et al. (2003) จะไดปรมาณของแรธาตตางๆ ดงกลาวขางตนมหนวยเปน mg/l แลวน ามาค านวณเปลยนใหเปนหนวย mmol/l

11

10. การเกบตวอยางตบ (hepatopancreas) และการสกดเอนไซมยอยอาหาร 10.1 สลบป แลวท าการผาตดปและน าตบออกมา แตในกรณทยงไมท าการสกดโดยทนทใหเกบ

รกษาไวทอณหภม -80oC เพอปองกนการเสอมสภาพของเอนไซมยอยอาหาร 10.2 น าตบมาบดใน 50 mM Tris buffer, pH 7.0 ทม 200 mM NaCl ในอตราสวน 1: 3 (W/V)

ทอณหภม 4 oC น าไปเขาเครองเหวยงท 15,000 g เปนเวลา 60 นาท ทอณหภม 4 oC 10.3 ดดเอาสวนทเปนของเหลวออกมาโดยระวงไมใหดดเอาสวนทเปนไขมนดานบนออกมาดวย

และน าของเหลวทไดไปเกบรกษาทอณหภม -80 oC จนกวาจะทดลองตอไป 10.4 ความเขมขนโปรตนของเอนไซมวเคราะหตามวธของ Lowry et al. (1951).

11 การวเคราะหกจกรรมเอนไซมจ าเพาะ

11.1 ทรปซนและไคโมทรปซน (Trypsin and chymotrypsin)

เอนไซม 10 µL กจกรรมจ าเพาะของทรปซนและไคโมทรปซน วดจากการเพมขนของ p-nitroaniline ดวยการใชbenzoyl-L-arginine-p-nitroanilide และN-succinyl-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilide ตามวธการของ Rungruangsak-Torrissen (2007) ใช 100 mM phosphate buffer pH 9 ทอณหภม 60 oC และ 40 oC, ตามล าดบ ส าหรบ trypsin และ chymotrypsin (Chamchuen et al., 2008) เจอจางเอนไซมทสกด1:2 (v/v) ดวยบฟเฟอรกอนใช วดเปนหนวย µmol p-nitroaniline produced min–1 mg protein–1

11.2 แอลฟาอะไมเลส (α Amylase) น าเอนไซม 5 µL กบสารละลายน าแปง 2% ปรมาตร 125 µL ในหลอดทดลองบมท pH 7 อณหภม 50oC นาน 10 นาท หยดปฏกรยาดวย Dinitrosalicylic acid (DNS) 250 µL แลวตมในน าเดอดเปนเวลา 5 นาท เมอเยนแลวจงเตมน ากลน 2 mL จงท าการวดคาการดดกลนแสงท 540 nm โดยเทยบความเขมขนกบกราฟมาตรฐานมอลโทส การรายงานเปน µmol moltose min-1 mg protein -1 วธดงกลาวดดแปลงจาก Bernfeld (1951) และ Chamchuen et al. (2008) 11.3 โปรตเอส (Protease) เอนไซม 5 µL ผสมกบสารละลาย Azocasein 125 µL ในหลอดทดลองบมไวนาน 15 นาทท pH 7 อณหภม 60oC นาน 15 นาท หยดปฏกรยาดวย 10% Trichloro acetic acid 1.2 mL เทใส Appendoff เขาเครองเหวยงท 10,000 g เปนเวลานาน 15 นาท ดด Supernatant ผสมกบ 1M NaOH 1.4 mL วดคาการดดกลนแสงท 440 nm รายงานคากจกรรมจ าเพาะของเอนไซมโปรตเนสเปน mmol Azocasien min-1 mg protein-1 วธดงกลาวดดแปลงจาก Vega-villasante et al. (1995) และ Chamchuen et al. (2008) 12. การวเคราะหขอมลทางสถต

ขอมลโซเดยม โปแตสเซยม แมกนเซยม แคลเซยม และคลอรน ในเลอดของปมา และกจกรรมจ าเพาะของเอนไซมของทรปซน ไคโมทรปซน โปรตเอส และอะไมเลสของปมาทง 8 ระยะลอกคราบมาท าวเคราะหหาความแปรปรวน (Analysis of variance) และน ามาหาคาความแตกตางระหวางกลมโดยใชวธ Duncan New’ Multiple Rang Test

12

ผลการวจย

จากผลการวจย ขอมลแรธาตทง 5 ชนด และกจกรรมจ าเพาะของเอนไซมทง 4 ชนด ของปมาทง 8 ระยะลอกคราบใหผลดงตอไปน

1. โซเดยม คลอรน และโพแทสเซยม

จากการทดลองพบวาปรมาณของธาตโซเดยมมความเขมขนสงขน (p<0.05) จากระยะลอกคราบ A-B ไป C1 และเพมขน (p>0.05) ตอเนองจนถงระยะ D2 โดยมคาสงขน (p<0.05) ในระยะ D3 กอนจะลดลง (p<0.05) ทระยะ D4 ตามล าดบ (รปท 1) สวนโพแทสเซยมมความเขมขนสงขน (p<0.05) จากระยะลอกคราบ A-B ไปท C1 คงทในระยะ C1-C2 กอนเพมขนอยางตอเนอง (p<0.05) ทระยะD1 ถง D3 กอนคาจะลดลง (p<0.05) ทระยะ D4 (รปท 1) โดยคลอรน กมลกษณะคลาย ๆ กน โดยมคาต าในระยะ A-B และมคาสงขนตามล าดบ (p>0.05) ทระยะ C1-D2 จนมคาสงขน (p<0.05) ทระยะ D3 กอนจะลดลง (p<0.05) อกครงทระยะ D4 เชนเดยวกน (รปท 1)

รปท 1 การเปลยนแปลงความเขมขนของ โซเดยม คลอรน และโพแทสเซยมในพลาสมาของปมา (P. pelagicus) ตลอดวงจรลอกคราบ 2. แมกนเซยม และแคลเซยม

จากการทดลองพบวาแมกนเซยมมคาคงทชวงระยะลอกคราบ A, B และ C1 และคาจะเพมขน (p<0.05) ทระยะ C2 และไมเปลยนแปลงชวง C2 ถง D1 จนสงขน (p<0.05) ชวง D2-D3 กอนจะลดลง (p<0.05) ทระยะ D4 (รปท 2) ขณะทแคลเซยมมคาคงทชวงระยะ A, B และคาจะเพมขน (p<0.05) ทระยะ C1 ถง C2-D1 และยงคงสงขน (p<0.05) ตอเนองชวง D2-D3 กอนจะลดลง (p<0.05) ทระยะ D4 (รปท 2)

0369121518

0200400600800

1000120014001600

A B C1 C2 D1 D2 D3 D4

K (m

mol

/l)

Na แ

ละ C

l (m

mol

/l)

ระยะลอกคราบ Na Cl K

a ab b

c c c

d d a

c b b b b

c bc a ab b b b b

c c

13

รปท 2 การเปลยนแปลงความเขมขนของแมกนเซยม และแคลเซยมในพลาสมาของปมา (P. pelagicus) ตลอดวงจรลอกคราบ 3. กจกรรมจ าเพาะของเอนไซม

จากการทดลองพบวาน าหนกปมามคาเพมขนชวง 35 วนของการเลยง ซงพบวาปมามน าหนกเพมขนจากระยะลอกคราบ A คอย ๆเพมขนสงสด (p<0.05) ทระยะ D3 (รปท 3ก) กจกรรมจ าเพาะของAmylase มคาเพมขนตามล าดบจากระยะ B จนสงสดทระยะ D2 (p<0.05) และลดลงต าสด (p<0.05) ทระยะ D4 (รปท 3ข) กจกรรมจ าเพาะของ Protease และTrypsin มคาเพมขนจากระยะ B-C1 จนสงสดทระยะ D1 (p<0.05) และลดลงหลงจากนจนต าสด (p<0.05) ทระยะ D4 (รปท 3ค และ 3ง) กจกรรมจ าเพาะของ Chymotrypsin มคาเพมขนจากระยะ A-C1 จนสงสดทระยะ C2 (p<0.05) และลดลงตามล าดบหลงจากนจนต าสด (p<0.05) ทระยะ D4 (รปท 3จ) รวมถง อตราสวนของกจกรรมจ าเพาะ Trypsin ตอ Chymotrypsin (T/C ratio) มคาเพมขนอยางตอเนองจากระยะ B จนมคาสงสด (p<0.05) ทระยะ D4 (รปท 3ฉ)

0

5

10

15

05

10152025303540

A B C1 C2 D1 D2 D3 D4

Ca (m

mol

/l)

Mg (m

mol

/l)

ระยะลอกคราบ Mg Ca

a a b c c

d

b e e a

c b bc bc

c c

14

0

20

40

60

80

100

A B C1 C2 D1 D2 D3 D4

To

tal w

eig

ht

(g)

a a b c d

e f g

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

A B C1 C2 D1 D2 D3 D4

Try

psin

a

b

c d

e f

g g

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

A B C1 C2 D1 D2 D3 D4

Am

yla

se

a

b bc c

d d d

e

0

5

10

15

20

25

A B C1 C2 D1 D2 D3 D4

To

tal p

rote

ase

ระยะลอกคราบ

a

b

c c c d d

e

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

A B C1 C2 D1 D2 D3 D4

Ch

ym

otr

yp

sin

a

b

c d d e

f g

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

A B C1 C2 D1 D2 D3 D4

T/C

rati

o

ระยะลอกคราบ

a

b b

c

d

e f f

รปท 3 น าหนก (ก) กจกรรมจ าเพาะ (specific activities) ของ amylase (µmol maltose min–1 mg protein–1) (ข), total protease (U mg protein–1) (ค), trypsin (ง) and chymotrypsin (µmol p-nitroaniline min–1 mg protein–1) (จ), และอตราสวนของ trypsin และchymotrypsin (T/C ratio) (ฉ) ของปมา (P. pelagicus) ทระยะลอกคราบ 8 ระยะ; early postmolt (A), postmolt (B), intermolt (C1), late intermolt (C2), early premolt (D1), mid premolt (D2), late premolt (D3), and very late premolt (D4).

กราฟแทงแสดง ± S.E. (n = 3–5) และอกษรภาษาองกฤษทตางกนบนแทงกราฟหมายถงมคาแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถต (p<0.05).

(ก)

(ฉ)

(จ)

(ง)

(ค)

(ข)

15

อภปรายผลการทดลอง

จากผลการวจย ขอมลการเปลยนแปลงของแรธาตทง 5 ชนด และกจกรรมจ าเพาะของเอนไซมทง 4 ชนด ของปมาทระยะลอกคราบ 8 ระยะ สามารถอภปรายผลไดดงน

1 การเปลยนแปลงปรมาณแรธาต

จากการทดลองพบวา ในระยะกอนลอกคราบตงแตระยะ D1 ถง D3 ความเขมขนแรธาตทกชนดมคาสงขนอยางตอเนอง เนองจากเปนระยะทปมานาจะมการสะสมสารอนทรยและอนนทรย โดยสวนหนงมาจากการดงสารอนทรยและอนนทรยทอยในเปลอกเขาสระบบเลอด ท าใหความเขมขนของเลอดมคาเพมขน (Telford, 1968; Vijayan และ Diwan, 1996) เปนการเพมความดนออสโมตก (osmotic pressure) (Passano, 1960; Roberton, 1960; Hagerman, 1973; Haegner และ Van Engel, 1975 อางโดย Mercaldo-Allen, 1991) โดยตอมาทระยะกอนลอกคราบ (D4 stage) ความเขมขนของแรธาตทง 5 ชนด มคาลดลง (p<0.05) อาจเนองมาจากการสราง hydrostatic pressure ซงจะมการน าน าเขาสรางกาย และในระหวางทลอกคราบเปลอกของปจะนมมาก โอกาสทน าจะซมผานเซลลเมมเบรน (membrane) ของเปลอกจงท าไดสะดวก ท าใหปรมาตรของเลอด (hemolymph volume) เพมขน สงผลใหองคประกอบของเลอดเจอจางอยางรวดเรว และลงลงอยางตอเนองทระยะหลงลอกคราบใหมๆ (A stage) (Mykles, 1980; Mantle และ Farmer, 1983; Charmantier et al., 1984 อางโดย Mercaldo-Allen, 1991) สอดคลองกบรายงานของ Drach (1960) อางโดย ประจวบ หล าอบล (2537) วา ปรมาณน าในรางกายของพวกป (Branchyuran) ในระยะ early postmolt มคาสงถง 86 % และ 76 % ในกง P. indicus และพบวาความเขมขนของแคลเซยมในเลอดป C. sapidus, C. maenas, C. magister (Roberton, 1960; Guderley; 1977 อางโดย Towle และ Mangum, 1985) และกง lobster H. americanus, H. vulgaris (Roberton, 1960; Lockwood, 1967; Glynn, 1968; Guderley, 1977; Greenaway, 1985 อางโดย Mercaldo-Allen, 1991) มความเขมขนลดลงอยางรวดเรวในระยะหลงลอกคราบ และระดบอนนทรยฟอสเฟตกมคามคาลดลงเชนกน (Travis, 1955b อางโดย Mercaldo- Allen, 1991) ซงจากการศกษาใน Lobster H. vulgaris พบวาระดบอนนทรยฟอสเฟตในเลอดในระยะหลงลอกคราบลดลงอยางรวดเรว เนองจากมการน าไปใชในการสรางเปลอกใหแขงขน (Glynn, 1968) เชนเดยวกบความเขมขนของโซเดยม และคลอไรด ในเลอดของ Lobster H. americanus ซงพบวามความเขมขนต าในระยะหลงลอกคราบ (Mercaldo-Allen, 1991) ซงนอกจากสารอนนทรยทไดกลาวไปแลว ยงพบวาโปรตนและกลโคสในกง P. duorarum (Bursey และ Lane, 1971) กง P. argus (Travis, 1955b อางโดย Bursey และ Lane, 1971) ป C. maenas (Robertson, 1960 อางโดย Bursey และ Lane, 1971) crayfish O. limosus (Andrews, 1967 อางโดย Bursey และ Lane, 1971) H. vulgaris (Djangmah, 1970 อางโดย Bursey และ Lane, 1971) และ lobster H. americanus (Mercaldo–Allen, 1991) ในระยะหลงลอกคราบลดลง เนองจากชวงดงกลาวมการใชโปรตนเพอการสรางโครงสรางเปลอกใหม ประกอบกบในระยะนสตวน าจะไมกนอาหาร กเปนผลใหทงสารอนนทรยและสารอนทรยมคาลงลดอกดวย โดยระยะหลงลอกคราบ (B stage) มระดบความเขมขนของแรธาตสวนใหญของปมามคามากกวาระยะหลงลอกคราบใหมๆเลกนอย แตมคาต ากวาในระยะลอกคราบ C1, C2, D1, D2 และ D3 เนองจาก

16

ชวงเวลาดงกลาวปมาจะท าการขบน าออกเพอรกษาระดบ osmotic pressure ขณะเดยวกนจะมการสะสมไอออนบางตวในเลอด (Greenaway, 1985) และมการดงแคลเซยมในน าทะเล กลามเนอ (muscle) มดกท แกลนด (midgut gland) โครงสรางเปลอก (exoskeleton) และตบ (hepatopancreas) มาไชเพอสรางเปลอกใหม (Vijayan และ Diwan, 1996; Pratoomchat et al., 2002a, b) อกทงปเรมกนอาหารแลว สงผลใหความเขมขนสงขนในระยะคราบแขง (intermolt stage, C1 และ C2) จากการน าเอาแรธาตตางๆไปใชในการสรางเปลอกทงจากการกนอาหารและการดดซมจากน าทเลยง (Mantel และ Farmer, 1983) โดยปมาจะมกลไกทเรมการละลาย (dissolution) แรธาตจากเปลอกเกาโดยมอตราเพมขนจากระยะกอนลอกคราบตอนตน (Premolt, D1 stage) จนถงระยะ D3 เพอสรางความดนออสโมตก (Passano, 1960; Roberton, 1960; Hagerman, 1973; Haegner และ Van Engel, 1975 อางโดย Mercaldo-Allen, 1991) กอนลดลงทระยะ D4 จากการน าน าเขารางกาย ซงคลายคลงกบพฤตกรรมทพบในสตวทะเลหลายชนด ไดแก lobster H. americanus (Mercaldo-Allen, 1991) กงทะเล P. indicus (Vijayan และ Diwan, 1996) กง P. duorarum (Bursey และ Lane, 1971) และปทะเล S. serrata (Chen และ Chia, 1997, Pratoomchat et al., 2002a,b) 2. กจกรรมจ าเพาะของเอนไซม

กจกรรมจ าเพาะของเอนไซมสวนใหญมความสมพนธกบระยะลอกคราบของปมา แตมเพยงกจกรรมจ าเพาะของทรปซนและ T/C ratio ทมความสมพนธกบการเจรญเตบโตในรอบวงจรการลอกคราบ ชใหเหนวากจกรรมจ าเพาะของทรปซนและ T/C ratio เปนปจจยทเหมาะสมส าหรบการศกษาดานการเจรญเตบโตดานน าหนกได ขณะทกจกรรมจ าเพาะของไคโมทรปซน ทรปซน และโปรตเอสใชเปนดชนชวดการกนอาหารได (Rungruangsak-Torrissen et al., 2009; Rungruangsak-Torrissen, 2012) และ/หรออตราการบรโภคโปรตน (protein consumption rate) (Rungruangsak-Torrissen et al., 2009; Rungruangsak-Torrissen, 2012) คาT/C ratio มคาสงชวงระยะ D4 สามารถอธบายไดวาปมการขยายตวของกระดองสงภายหลงลอกคราบ การลดลงของน าหนกปชวงกอนลอกคราบอาจจะมผลมาจากปกนอาหารลดลง รวมถงการสญเสยพลงงานไปกบการรกษาสมดลเกลอแร และตอเนองไปถงน าหนกหายไปภายหลงลอกคราบ การลดลงต าสดของกจกรรมจ าเพาะของอะไมเลสและโปรตเอสชวงกอนลอกคราบตอนปลาย (D4 stage) ซงคลายคลงกบทพบในป Carcinus maenas (Bauchau และ Mengeot, 1965) ขณะทพบคาสงสดทระยะ D1 และ D2 ซงคลายคลงกบทพบในกง Litopenaeus vannamei (Le Moullac, 1995) กจกรรมจ าเพาะของทรปซนและไคโมทรปซนในปมามคาสงทระยะ C2 และ D1 เมอปมอตราการกนสงสด

17

สรปผลการทดลอง

ความเขมขนของแรธาตทง 5 ชนดและกจกรรมจ าเพาะของเอนไซมยอยอาหารมการเปลยนแปลงไปตามวงจรการลอกคราบของปมา แรธาตสวนใหญมความเขมขนสงขนจากระยะหลงลอกคราบ (B stage) โดยเพมสงขนอยางตอเนองจนถงระยะกอนลอกคราบ (D2 หรอ D3 stages) กอนลดลงทระยะกอนลอกคราบ (D4 stage) จนถงระยะลอกคราบใหม ๆ (A stage) กจกรรมจ าเพาะของทรปซนและ T/C ratio มความสมพนธกบการเจรญเตบโตในรอบวงจรการลอกคราบของปมา การลดลงต าสดของกจกรรมจ าเพาะของอะไมเลสและโปรตเอสในระยะ D4 ขณะทพบคาสงสดทระยะ D1 และ D2 กจกรรมจ าเพาะของทรปซนและไคโมทรปซนในปมามคาสงทระยะ C2 และ D1 เมอปมอตราการกนสงสด

18

เอกสารอางอง

บญรตน ประทมชาต และสรยน ธญกจจานกจ. 2548. ผลของความเคมนา ชนดอาหาร และ สงหลบซอนตอการพฒนาการ การเจรญเตบโต และการรอดตายของการอนบาลลกปมา (Portunus pelagicus). ภาควชาวารชศาสตร คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยบรพา ชลบร กรงเทพมหานคร. ประจวบ หล าอบล.2537. สรรวทยาของกงทะเล . ภาควชาวทยาศาสตรทางทะเล, คณะประมง

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, 293 หนา. ดารน ชาญวชย.2531. การปรบตวของกงกลาดาวยรนตอการเปลยนแปลงระดบความเคม. ภาควชา

วทยาศาสตรทางทะเล คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย 31หนา Anger, K. 2001. The biology of decapod crustacean larvae. In Crustacean issues 14 . Vonk, R. (Ed.) (p. 41-325). The Netherlands, Krips, Meppel. Bauchau, A.G., Mengeot, J.C. 1965. Prote'ases et amylases de l'h'epatopancre'as des crabs au cours du cycle de mue et d'intermue. Annals Soc. R. de Zool. Belg. 95, 29-37. Bernfeld, P. 1951. Enzymes of starch degradation and synthesis. Advances in

Enzym. and Related Subjects of Biochem., 12, 379-384. Bursey C.R., Lane, C.E., 1971. Ionic and protein concentration changes during the molt

cycle of Penaeus duorarum. Comp. Biochem. Physiol. 40A, 155-162. Brockerhoff, H., Hoyle, R. J., Hwang, P. C. 1970. Digestive enzymes of the American lobster. (Homarus americanus). J Shellfish Res Board of Canada, 27, 1357-1370. Cameron, J. N., 1985. Post-moult calcification in the blue crab (Callinectes sapidus): Relationships between apparent net H+ excretion, calcium and bicarbonate. J Exp. Biol. 119, 275-285. Ceccadi, H. J. 1997. Anatomy and physiology of the digestive system. In Crustacean nutrition advances in world aquaculture.Vol. 6. D’ Abramo, L. R., Conklin, D. E., & Akiyama, D. M. (Eds.) (p. 261-291).The world aquaculture society, the United States of America. Chamchuen, P., Engkagul, A., Kovitvadhi, U., Rungruangsak – Torrissen, K., Pratoomchat, B. 2008. Temperature and pH characteristics of digestive enzyme in blue swimming crab larvae, (Portunus pelagicus). In The 9th National Grad Research Conference, Burapa University. Bangsaen Chonburi, Thailand. Cordova-Murueta, J. H., Garcia-Carreno, F. L., Navarrete-del-Toro, M. A. 2003. Digestive enzyme present in crustacean feces as a tool for biochemical, physiological, and ecological studied. J Exp. Mar. Biol. Ecol., 297, 43-56.

19

Fernandez-Gimenez, A. V., Garcia-Carreno, F. L., Navarrete del Torro, M. A., Fenucci, J. L. 2001. Digestive proteinases of red shrimp Pleoticus muelleri (Decapoda, Penaeoidea): partial characterisation and relationship with moulting. Comp. Biochem. Physiol.,130B, 331-338. Galgani, M. L., AQUACOP, 1988. Replacement of live unicellular algae by microparticulate diet during larval rearing of zoeal stages of some penaeid prawns. Aquaculture 69, 115–127. Garcia-Carreno, F. L., del Toro, N., Ezquerra, J. M. 1997. Digestive shrimp proteases for evaluation of protein digestibility in vitro: I. Effect of protease inhibitors in protein ingredients. J. Mar. Biotech., 5, 36-40. Gilles, R., Pequeux, A. 1981. Cell regulation in Crustacean : Relation between mechanism for controlling the osmolality of extracellular and intracellular fluids. J. Exp. Zool. 215 : 351–362. Glynn, J.P., 1968. Studies on the ionic, protein and phosphate changes associated with

the moult cycle of Homarus vulgaris. Comp. Biochem. Physiol. 26, 937-946. Greenaway, P. 1985. Calcium balance and moulting in the Crustacea. Biol Rev 60: 425- 454. Hagerman, L., 1983. Haemocyanin concentration of juvenile lobsters (Homarus gammarus) in relation to moulting cycle and feeding conditions. Mar. Biol. 77, 11-17. Johnston, D. J. 2003. Ontogenetic changes in digestive enzyme activity of the spiny lobster, Jasus edwardsii (Decapoda: Palinuridae). J. Mar. Biotech.,143 (6),1071- 1082. Le Moullac, G. 1995. Adaptation des enzymes digestives a` l’alimentation chez la crevette Penaeus vannamei (Crustacean, Decapoda). Th`ese Diplo^me de l’ Ecole Pratique des Hautes E'tudes (Oce'anologie), 122p. Le Moullac, G., Klein, B., Sellos, D., Van Wormhoudt, A. V. 1996. Adaptation of trypsin, chymotrypsin and amylase to casein level and protein source in Penaeus vannamei (crustacea, dacapoda). J Exp. Mar. Biol. and Ecol., 208, 107-125. Le Moullac, G., Van Wormhoudt, A., AQUACOP. 1994. Adaptation of digestive enzyme to dietary protein, carbohydrate and fiber levels and influence of protein and carbohydrate quality in Penaeus vannamei larvae (Crustacea, Decapod). Aqua. Living Res., 7, 203-210. Lowry, O. H., Rosenbrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. 1951. Protein measurement

with the folin phenol reagent. J Biol. Chem., 193, 265-275. Mantel, L.H., Farmer, L.L. 1983. Osmotic and ionic regulation. In: The Biology of crustacea. (vol.5):Internal anatomy and physiological regulation, Bliss, D.E. and Mantel, L.H. (eds), Academic Press, New York, pp.54-143

20

Mercaldo-Allen, R. 1991. Change in the blood chemistry of the American lobster Hormarus americanus, H. Milne Edwards, 1837, over the molt cycle. J Shellfish Res 10 (10): 147-156.

Passano, L.M. 1960. Molting and its control. In : The Physiology of Crustacea. Vol. 1, Waterman T.H. (ed), Academic Press, New York, pp. 437 – 536.

Potts, W.T.W., Parry, G. 1964. Osmotic and ionic regulation in animals: In: International series of monographs on pure and applied biology, Kerkut, G.A. (Ed.), Pergamon press, Oxford, pp.423.

Pavasovic, M., Richardson, N. A., Anderson, A. J., Mann, D., Mathera, P. B. 2004. Effect of pH, temperature and diet on digestive enzyme profile in the mud crab, Scylla serrata. Aquaculture 242, 641–654.

Pratoomchat, B.,Sawangwong, P., Pakkong, P. Machado, J. 2002a. Organic and inorganic variations in haemolymph, epidermal tissue and cuticle over the molt cycle in Scylla serarta (Decapoda). Comp Biochem and Physiol Part A, 131: 243-255. Pratoomchat, B., Sawangwong, P., Guedes, R., M.D.L.,Machado, J. 2002b. Cuticle ultrastructure changes in the crab Scylla serrata over the molt cycle. J Exp Zool, 293 (4): 414-426. Pratoomchat. B., Jindadam, W. 2007. Discrimination of molting stages in the blue swimming crab, Portunus pelagicus based on observable changes in external morphology. In: Sustainability on Marine Science Proceeding of CU/NRCT/JSPS" Queen Sirikit Convention Center, Thailand, May 2007, p1-11. Pratoomchat, B., Sawangwong, P., Machado, J. 2004. The identification of molt stage in Scylla serrata on cuticle morphology. Proceedings of Biomineralization (BIOM2001): formation, diversity, evolution and application, Kobayashi & Ozawa (Eds) Tokai Univ Press, 2004, p. 98-102. ISBN4-486-01370-9 Puyear, R.L. 1969. Molt cycle regulation of nucleotide pyrophosphatase in the hepatopancreas of the blue crab, Callinectes sapidus Rathbun. J Comp. Biochem. Physiol., 28, 159-168. Robertson, J.D. 1960. Osmotic and ionic regulation. In: The physiology of crustacea vol.1. Waterman, T.H. (Ed.), Academic Press, New York, pp. 317-339. Roer, R., Dillaman, R., 1984. The structure and calcification of the crustacean cuticle

Amer. Zool. 24: 893-909. Rungruangsak-Torrissen, K., Stien, L. H., Daae, B. S., Vågseth, T., Thorsheim, G. B., Tobin, D. Ritola, O. 2009. Different dietary levels of protein to lipid ratio affected digestive efficiency, skeletal growth, and muscle protein in rainbow trout families. Scholarly Research Exchange, vol. 2009, Article ID 709529, doi:10.3814/2009/709529.

21

Rungruangsak-Torrissen, K., Thongprajukaew, K., Sansuwan, K., Thapthimdaeng, P., Kovitvadhi, U., Seetaha, S., Choowongkomon, K., Beck, I.M., Arnøy, O.O. 2012. Ecological effects on food utilization, trypsin isozymes, and performance qualities of growth and maturation in Northeast Arctic cod (Gadus morhua L.). The Open Fish Sci. J. 5, 44–56.

Telford, M., 1968. Changes in blood sugur composition during the molt cycle of the lobster Homarus americanus. Comp Biochem Physiol 135, 574-584.

Torrissen, K. R., Lied, E., Espe, M. 1994. Differences in digestion and absorption of dietary protein in Atlantic salmon (Salmo salar L.) with genetically different trypsin isozymes. J Fish Biol., 45, 1087-1104.

Towle, D.W., Mangum, C.P., 1985, Ionic regulation and transport ATPase activities during the molt cycle in the blue crab Callinectes sapidus. J Crust. Biol. 5(2), 216-222. Van Wormhoudt, A., Favrel, P., Guillaume, J. 1989. Gastrin/cholecytokinin-like post- prandial variations: quantitative and qualitative changes in the hemolymph of penaeids (Crustacea, Decapoda). Comp. Biochem. Physiol, 159 B, 269-273. Van Wormhoudt, A., Le Chavallier, P., Sellos, D. 1992. Purification, biochemical

characterization and N-terminal sequence of a serine- protease with chymotrypsin and cillagenolytic activities in a tropical shrimp, Penaeus vannamei (Crustacean,Decapoda). Comp. Biochem Physiol., 103B, 675-680.

Vega-Villasante, F., Nolasco, H., Civera, R. 1995. The digestive enzymes of the Pacific brown shrimp Penaeus californeasis properties of protease activity in the whole digestive tract. Comp. Biochem. Physiol, 112B, 123-129. Vigh, D.A., Dendinger, J.E., 1982. Temporal relationships of postmolt deposition of calcium, magnesium, chitin and protein in the cuticle of the Atlantic blue crab, Callinectes sapidus Rathbun. Comp Biochem Physiol 72A (2), 365-369. Vijayan K.K., Diwan, A.D. 1996. Fluctuation in Ca, Mg and P Levels in The hemolymph,

muscle, midgut gland and exoskeleton during the molt cycle of the Indian White Prawns, Penaeus indicus (Decapod; Penaeidae) Comp. Biochem. Physiol. 114A (1):91-97

Zwilling, R. H., Neurath, H. 1981. Invertebrate proteases. In Methods in Enzymology, 80. Wood, W.A.,Kellog, S.T.(Eds.) (p. 633-664). Academic Press, San Diego, CA.