การพัฒนาเครื่องหมาย issr เพื่อใช้...
TRANSCRIPT
การพฒนาเครองหมาย ISSR เพอใชตรวจสอบความหลากหลายทางพนธกรรมของไมสกในพนท 5 ลมน า ทางภาคเหนอ
นางสาวกานตรตน สขปาน ภาควชาชววทยาปาไม สาขาวทยาศาสตรชวภาพปาไม คณะวนศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร
OUTLINE
บทน ำ
วตถประสงค
อปกรณและวธกำร
ผลและวจำรณ
สรปและขอเสนอแนะ
ความหลากหลายทางพนธกรรม (Genetic diversity) ความหลากหลายระดบสารพนธกรรม ทเปนองคประกอบภายในสงมชวตชนดหนง ซงบงชถงความแตกตางในรหสพนธกรรม ทควบคมกลไกการท างานของสงมชวตนน ตามสภาวะแวดลอมทแตกตางกนไป
บทน ำ
วธการตรวจสอบความหลากหลายทางพนธกรรมในระดบ DNA ม 2 วธ เครองหมายดเอนเอ (DNA marker) การหาล าดบนวคลโอไทด (DNA Sequencing)
บทน ำ(ตอ)
บทน ำ (ตอ) กำรตรวจสอบควำมหลำกหลำยทำง
พนธกรรม จ ำเปนทจะตองทรำบลกษณะทำงพนธกรรมของสงมชวต โดยใชเครองหมำยดเอนเอ (DNA Marker)
เครองหมำยดเอนเอ(DNA Markers) เปนเครองหมำยบงชควำมเปนเอกลกษณของสงมชวตของพชแตละชนดแตละสำยพนธ โดยมกำรจดเรยงตวของนวคลโอไทดในโมเลกลของดเอนเอทเปนเอกลกษณ เปนควำมแตกตำงหรอโพลมอรฟซม (polymorphisms)
DNA
DNA marker
diversity parameter
บทน ำ (ตอ)
เครองหมำยไอเอสเอสเอำร (inter-simple sequence repeat; ISSR ) เปนกำรประยกตใชเทคนค PCR ในกำรตรวจสอบดเอนเอ โดยใชไพรเมอรเพยง ชนดเดยวเปนกำรตรวจสอบครงละหลำยต ำแหนง
ขอด: คอใชระยะเวลาท าทสน และมราคาถก จงถกน าไปใชเพอการศกษาเกยวกบดเอนเออยางแพรหลาย
ISSR
บทน ำ (ตอ)
ตวอยางการใชเครองหมายดเอนเอบงชความหลากหลายทางพนธกรรม
ความหลากหลายทางพนธกรรม : ประชากร B > ประชากร A > ประชากร C
ก ำหนดให ปรำกฏแถบดเอนเอ
เปน “1” ไมปรำกฏแถบ ดเอนเอเปน “0”
0
1
1 2 3 4 5 500 400 300 200 100
1 1
1 0
0 1
1 1
1 1
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
การประเมนความหลากหลายทางพนธกรรม Gene diversity (h)
P = ความถของแอลลลท 1 q = ความถของแอลลลท 2
Shannon’s Information Index (I)
บทน ำ(ตอ)
H = 1- p 2 - q 2
I = - ∑ Pi ln Pi
Pi = สดสวนความมากมายของจ านวนยนท I เมอเทยบกบจ านวนยนทงหมด (N)
บทน ำ •สก (Tectona grandis Linn.f.) อยในวงศ Lamiaceae •ถนก ำเนด: ถนก ำเนดของสกอยในตอนใตของ ประเทศอนเดย พมำ อนโดนเซย ลำว และไทย ส ำหรบในประเทศไทยนน พบกระจำยไดทวไปตำมปำ เบญจพรรณทำงภำคเหนอและบำงสวนของภำคกลำง
บทน ำ (ตอ)
กำรใชประโยชน :กำรกอสรำงบำนเรอน ตอเรอ แกะสลก
เครองมอกสกรรม
เพอพฒนำเครองหมำย ไอเอสเอสอำร (Inner-Simple Sequence Repeat, ISSR)เพอใชในกำรตรวจสอบควำมหลำกหลำยทำงพนธกรรมของสก
วตถประสงค
ตวอยำงสกทใชศกษำ
เกบตวอยำงจำกพนทลมน ำ
ทง 5 แหลง แหลงละ 30-36 ตวอยำง
รวมทงหมด 163 ตวอยำง
อปกรณและวธกำร
ลมน าวง
ลมน ายม
ลมน าสาละวน
ลมน าปง
ลมน านาน
อปกรณและวธกำร(ตอ)
สกดดเอนเอ (DNA extraction)
ตรวจสอบคณภำพดเอนเอ
คดเลอกไพรเมอรทเหมำะสม
ใชไพรเมอรทคดเลอกไดเพมปรมำณ ดเอนเอดวยเทคนคPCR ของตวอยำงทงหมด
ท ำกำรนบแถบดเอนเอ
วเครำะหผลและประเมนควำมหลำกหลำยทำงพนธกรรมเบองตนของสก
กำรสกดดเอนเอโดยวธ Modified CTAB
อปกรณและวธกำร(ตอ)
+ ไนโตรเจนเหลว Sobital buffer
CTAB buffer
Chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1)
isopropanol 70% ethanol
TE buffer RNase
กำรตรวจสอบคณภำพดเอนเอ
อปกรณและวธกำร(ตอ)
0.8% Agrarose gel TAE buffer 6x loading buffer
Ethidium bromide DNA
ท ำกำรคดเลอกไพรเมอรและเพมปรมำณดเอนเอดวยเทคนค PCR โดยใชเครองหมำย ISSR เพอใชตรวจสอบควำมหลำกหลำยทำงพนธกรรมของสก สมตวอยำงสก จำก 5 แหลงแหลงละ 2 ตวอยำงมำเปนตวแทน
ท ำกำรคดเลอกไพรเมอรจำกทงหมด 24 ไพรเมอร
อปกรณและวธกำร(ตอ)
ขนตอน PCR สวนผสม ปรมำตร
น ำกลน GM Primer DNA รวม
6.7 ml 7.5 ml 0.6 ml 1.0 ml 15 ml
กำรตรวจสอบผลของดเอนเอ
อปกรณและวธกำร(ตอ)
1.5% Agrarose gel
TBE buffer
100 bp DNA Ladder
Ethidium bromide
อปกรณและวธกำร(ตอ)
สกดดเอนเอ (DNA extraction)
ตรวจสอบคณภำพดเอนเอ
คดเลอกไพรเมอรทเหมำะสม
ใชไพรเมอรทคดเลอกไดเพมปรมำณ ดเอนเอดวยเทคนคPCR ของตวอยำงทงหมด ท ำกำรนบแถบดเอนเอ
วเครำะหผลและประเมนควำมหลำกหลำยทำงพนธกรรมเบองตนของสก
ประเมนควำมหลำกหลำยทำงพนธกรรม
Gene diversity (h)
Shannon’s Information Index
โดยใชโปรแกรม Popgene
ประเมนควำมสมพนธแตละพนท โดยใชโปรแกรม TFPGA
อปกรณและวธกำร(ตอ)
ดชนควำมคลำยคลง (similarity index) S = 2Nab/Na + Nb
ผลกำรสกดดเอนเอดวยวธ Modified CTAB
ผลและวจำรณ
ผลการคดเลอกไพรเมอรและเพมปรมาณดเอนเอ
ผลและวจำรณ(ตอ)
รปแบบลำยพมพดเอนเอทไดจำกำรเพมปรมำณดวยเทคนค ISSR ดวยไพรเมอร P-52
สำละวน ยม ปง วง นำน
รปแบบลำยพมพดเอนเอทไดจำกำรเพมปรมำณดวยเทคนค ISSR ดวยไพรเมอร P-04
สำละวน ยม ปง วง นำน
ไพรเมอร ขนำดของแถบ ดเอนเอ
จ ำนวน polymorphic band
จ ำนวน monomorphic
รวม
04 08 10 49 51 52 54 59 61 รวม
700-2000 350-1200 500-2000 350-2100 600-1200 350-2000 800-2000 250-850
500-2000
5 6 6 6 1 10 7 5 8 54
2 1 2 3 2 0 0 1 0
11
7 7 8 9 3 10 7 6 8 65
ผลและวจำรณ(ตอ)
ผลการประเมนความหลากหลายทางพนธกรรมดวยโปรแกรม popgene
ผลและวจำรณ(ตอ)
ประชำกร จ ำนวน polymorphic band %polymorphic
สำละวน 52 80
ยม 42 64.62
ปง 42 64.62
วง 38 58.46
นำน 39 60
ผลและวจำรณ(ตอ)
คาความสมพนธของแตละประชากร
ผลและวจำรณ(ตอ)
สำละวน ยม ปง วง นำน
สาละวน - 0.9744 0.9585 0.9592 0.9617
ยม 0.0259 - 0.9621 0.9797 0.9779
ปง 0.0423 0.0386 - 0.9660 0.9676
วง 0.0417 0.0205 0.0346 - 0.9713
นาน 0.0391 0.0223 0.0330 0.0292 -
ความสมพนธของแตละพนท โดยใชโปรแกรม TFPGA
ผลและวจำรณ(ตอ)
ในการวางแผนจดการดานการอนรกษ ควรมการเพมจ านวนตวอยาง เพอความสมบรณ
การสกดดเอนเอดวยวธการ Modified CTAB มปรมาณดเอนเอ สามารถน าไปใชเพอตรวจสอบความหลากหลายทางพนธกรรมของสกได
จากการคดเลอกไพรเมอร พบวามไพรเมอรทเหมาะสมจ านวน 9 ไพรเมอร ไดแก P04, P08, P10, P49, P51, P52, P54, P59, P61
ลมน าสาละวนมคา H= 0.2631, I =0.3956 ซงเปนพนททมคาความหลากหลายสงสด และลมน าวงมคา H= 0.1776, I =0.2699 มความหลากหลายนอยทสด
ประชากรลมน ายมกบลมน าวงมความความคลายคลงกนมากทสด และประชากรลมน าสาละวนกบปงมความคลายคลงกนนอยทสด โดยมคาเทากบ 0.9797 และ 0.9585 ตามล าดบ
ควรมการเพมจ านวนตวอยาง เพอความถกตองของขอมลในการวางแผนจดการดานการอนรกษตอไป
สรปและขอเสนอแนะ
อำจำรยสธร ดวงใจ อำจำรยทปรกษำโครงงำนและสนบสนนคำใชจำยทงหมด
คณตรภพ ทพยศกด คณมำนพ ผพฒน และกรมอทยำนแหงชำต สตวปำ และ พนธพชทใหควำมอนเครำะหตวอยำงทใชในกำรศกษำครงน
อำจำรยชำครต ณ ตะกวทง อำจำรยทแนะน ำกำรใชโปรแกรมกำรวเครำะหขอมล
นำงสำวสลลลำ บญเทยม ทสกดดเอนตวอยำงทใชศกษำ
ภำควชำชววทยำปำไม
เพอนๆวนศำสตร
บดำ มำรดำ และครอบครว
ขอขอบพระคณ