การปรับปรุงพันธุ โดยการจ...
TRANSCRIPT
การจดชดโครโมโซม
• การเหนยวน าใหเกดการเพมชดโครโมโซม(polyploidization)• การเหนยวน าใหเกด gynogenesis และ
androgenesis
การเหนยวน าใหเกด polyploid
• polyploid ในปลามอตราการรอดสง• triploid และ tetraploid• triploid --> monoploid (n) + diploid (2n) เปน
gamete ทไมมการลดชดโครโมโซม พบในปลาsalmon, ปลา rainbow trout
• tetraploid --> การแบงเซลลผดปกต หรอการปฏสนธระหวางไขและน าเชอทมโครโมโซม 2 ชดใชประโยชนในการผลตปลา triploid พบในปลาไซปรนดโลช (Misgurnus anguilicaudatus)
วตถประสงคในการท า polyploid
• สตวน าทเปน triploid อาจเจรญเตบโตดกวาdiploid เนองจากโครโมโซมมากขน อาจท าใหเซลลใหญขน• ท าใหสตวน าเปนหมน มการ gamete ไมสมบรณใชประโยชนในปลา salmonid, ปลานล, หอย
หลกการเหนยวน าใหเกด polyploid
• การ shock เพอใหไขเกบ polar body เพอผลตtriploid• การ shock เพอยบยงการแบงเซลลครงแรกของ
zygote (suppression of first cleavage) เพอผลตtetraploid
ปจจยทก าหนดความส าเรจในการเหนยวน า
• เวลาเรม shock --> เวลาทไขก าลงก าจด polarbody หรอ เมอ zygote ก าลงจะแบงเซลลครงแรก•อตราการฟก•อตราการเกด polyploid
• ระยะเวลาในการ shock• เวลาสน --> อตราฟกสง, อตราการเกด
polyploid ต า• เวลานาน --> อตราฟกต า, อตราการเกด
polyploid สง•อณหภม
วธการ shock และระดบการ shockทเหมาะสม
• การ shock ดวยความดนน า (hydrostatic pressureshock) 6000-8000 psi•แตกตางกนตามชนดของสตวน า•มประสทธภาพดในการยบยงการแบงเซลลแบบ mitosis•ความแปรปรวนต า
• การ shock ดวยอณหภม– sublethal temperature จะท าลาย spindle fiber ท าใหโครโมโซมเพมจ านวนขน– การ shock ดวยความเยนจะยบยงการแบงเซลลระยะ anaphase II มผลในชวงแคบ ใชในปลาเขตรอน เชน ปลาเฉา, ปลานล, ปลาดก– การ shock ดวยความรอนจะท าลาย spindle fiberใชไดดในปลาเขตหนาว และปลาเขตรอนบางชนด เชน ปลาหมอเทศ, ปลาไน, ปลากด
– ตองหาอณหภมและระยะเวลาทเหมาะสมส าหรบการ shock– ความแตกตางของอณหภม– มความแปรปรวนสง --> อณหภมกอนการฟก,ขนาดไขทเปลยนแปลงตามขนาดแมพนธและฤดกาล
• การ shock ดวยสารเคม– colchicine, cytochalasin-B, nitrous oxide และยาสลบหลายชนด– colchicine ยบยงการสราง spindle fiber– cytochalasin-B ยบยงการแบง cytoplasm นยมใชในหอย
• การ shock ดวยหลายวธรวมกน
ประสทธภาพของการ shock
• ความดน > อณหภม > สารเคม• ความดน มผลตอไขขนาดตาง ๆ เทากน• การ shock ดวยความรอนหรอความเยน ประสทธภาพขนกบชนดของสตวน า• สารเคมมประสทธภาพต า เนองจากสารตกคางภายหลงการ shock
• การวดปรมาตรของ nucleus ของเซลลเมดเลอดแดงหรอปรมาตรของเมดเลอดแดง– เซลลของ polyploid จะตองม nucleus ขนาดใหญขน และมปรมาณ DNA เพมขน
• การวดปรมาณ DNA ในเซลลโดยใชวธ flowcytometry– น าเลอดของสตวน าทตองการทดสอบมายอยดวย
RNAase เตมสารเรองแสง น าไปวดดวย flowcytometer เครองจะแสดงกราฟปรมาณ DNA
คณสมบตของสตวน า polyploid
• ขนาดตวไมแตกตางจากปลา diploid– ปลา triploid มขนาด nucleus 1.5-1.7 เทาของปลา diploid– ขนาดของเซลลเพมขน แตจ านวนเซลลลดลง
• การเจรญเตบโต– กอนวยเจรญพนธไมมความแตกตาง– ระยะวยเจรญพนธ triploid โตดกวา อตราแลกเนอดกวา เนองจากเปนหมน
• ปลา triploid เปนหมน– ยกเวน กลม salmonids และปลาตะเพยน– เพศผม testis เลกลง สามารถสราง sperm ได
การสรางประชากร triploid เพศเมยลวน
• ใชน าเชอจากปลาทไดจากการแปลงเพศจากเพศเมยเปนเพศผ• ใชไดกบปลาทมระบบการควบคมเพศแบบทเพศเมยสราง gamete เพยง genotype เดยว
การสรางประชากร triploid เพศผลวน
• เปลยนเพศปลาใหเปนเพศเมยโดยการใหฮอรโมนเพศเมย• น าปลาทไดผสมกบเพศผปกต ตรวจสอบอตราสวนเพศของลก
• ปลาเพศเมยตวใดใหลกเพศผตอเพศเมยใกลเคยง 1:2 หรอ 1:3 แสดงวาม genotype เปน XY• น าไขจากปลาเพศเมยทม genotype เปน XY มาผสมกบปลาเพศผปกต แลวน าไป shock จะไดปลา triploid ทม genotype เปน XXY หรอ XYYเปนเพศผลวน
Gynogenesis
• สารพนธกรรมของเชอตวผเสยคณสมบต(inactivation)• ไขทไดรบการผสมเพมจ านวนโครโมโซมเปน 2ชด• พบในปลา crucian carp, Carassius auratus
gibelio และปลาในสกล Poecilia และPoeciliopsis
หลกการเหนยวน า gynogenesis
• เหนยวน าไดครงแรกโดย Hertwig (1911)• ผสมไขกบเชอตวผทถกท าลายสารพนธกรรมแลว
(inactivated sperm)• เชอตวผจะกระตนใหไขเกดการแบงเซลล
meiosis II
• เมอสนสดการแบงเซลลไขจะก าจด polar bodyชดท 2 ออก เหลอเพยงโครโมโซม 1 ชด• ไขสามารถพฒนาเปนตวออนไดถงระยะตาง ๆแลวแตชนดปลา แตสวนใหญจะตายจากการมโครโมโซมชดเดยว เรยกวา haploid syndrome• การท าลายสารพนธกรรมของเชอตวผ (sperm
inactivation)• การเหนยวน าให zygote มโครโมโซม 2 ชด
(diploidization)
การท าลายสารพนธกรรมของเชอตวผ(sperm inactivation)
• ใชการฉายรงส ท าลายเฉพาะสารพนธกรรม ไมท าใหเซลลตาย• ท าใหเกดการจบกนของ pyrimidine ทอยบน DNAท าให DNA เสยสภาพ
• ผนง nucleus และเยอหม cytoplasm ของเชอตวผถกท าลาย ท าให nucleus ของเชอตวผถกยอยดวย enzyme ภายใน cytoplasm ของไข• gamma ray และ x ray• หาความเขมทเหมาะสมของรงสทใช• ความเขมทดทสด คอ ความเขมทใหลกปลาทมโครโมโซมหนงชดทงหมด และมอตราการฟกสงสด
• กราฟระหวางความเขมของรงสกบอตราการฟกเรยกวา Hertwig effect• การน า inactivated sperm มาผสมกบไข อาจท าใหเกดลกปลา diploid gynogenesis ได เพราะในไขปลาบางชนดมแนวโนมทไขจะไมก าจด polarbody ชดท 2 ดงนนในการท าควรมฉลากพนธกรรม (genetic marker) เพอยนยนผลการทดลอง
การใช genetic marker
• ใชไขจากแมปลาทม genotype เปน homologousของยนแฝง ซงเปนลกษณะทปรากฏชดเจน เชนลกษณะเผอกในปลาดก ลกษณะเกลด mirror ในปลาไน ถามเชอตวผมาผสมแลวลกปลาทไดมลกษณะเดน แสดงวาเกดจากการผสมกบเชอตวผสารพนธกรรมในเชอถกท าลายไมหมด
• ใชน าเชอจากปลาตางชนด น าเชอของปลาแตละชนดมประสทธภาพในการกระตนไมเทากน– ตองทราบวาเชอทน ามาใชสามารถผสมกบไขได– ลกผสมทไดควรตายกอนฟกเปนตว– หากเปนตวควรมลกษณะแตกตางจากลกปลา
gynogenesis อยางชดเจน
การเตรยมน าเชอเพอฉายรงส
• เจอจางน าเชอดวย เกลอแกง 0.85%, Ringer’ssolution, Hank’s solution• ultraviolet อ านาจทะลทะลวงต า ความเขมขนของน าเชอมผลตอระยะเวลาการฉายรงส
การคนสภาพของสารพนธกรรมโดยการกระตนดวยแสง (photoreactivation)
• การท าลายสารพนธกรรมเชอตวผดวย ultravioletถาปลอยใหไขไดรบแสงสวางภายหลงการผสมน าเชอฉายรงสกบไข จะท าใหสวนของสารพนธกรรมทถกท าลายแลวคนสภาพเดมได เรยกวาphotoreactivation
• เกดจากพนธะระหวางเบส pyrimidine ทเกดจากการฉายรงสถกท าลายดวย photoreactivationenzyme ซงมอยในไข enzyme จะท างานเมอมแสงสวาง (300-500 nm)
การเหนยวน าใหโครโมโซมเพมเปน 2 ชด(diploidization)
เหนยวน าโดยวธเดยวกบการเหนยวน าใหเกดpolyploid
การเหนยวน าท าได 2 ระยะ คอการเกบ polar bodyชดท 2 และ การยบยงการแบงเซลลครงแรกของzygote
• การเหนยวน าโดยการเกบ polar body ชดท 2เปนการยบยงขนตอนการแบงเซลลแบบ meiosisII แทงโครโมโซมมการแลกเปลยนชนสวนกบrecombinant chromosome ลกปลาทไดจะเปนheterozygous เรยกวา meiotic gynogenesis
• ถาเหนยวน าการเพมชดโครโมโซมในระยะกอนการแบงเซลล mitosis I ซงเปนระยะโครโมโซมจ าลองตวเองขนมา โดยไมมการแลกเปลยนทอนสวนของโครโมโซม โครโมโซมทเหมอนกนจะอยในเซลล ๆ เดยว ลกปลา gynogenesis ทเกดขนจะมยนทกต าแหนงอยในสภาพ homologousเรยกวา mitotic gynogenesis
ลกษณะของปลาทเกดจากการเหนยวน าgynogenesis
• ลกษณะทวไป เหมอนกบปลาทเปนแม• มระดบการผสมเลอดชดสง มกแสดงลกษณะดอยออกมามากวาลกปลาจากการผสมปกต• อตราการรอดต า ลกปลาพการคอนขางมาก• อตราการเจรญเตบโตต า
• เพศของลกปลา หากใชปลาทเพศเมยมการสรางเซลลสบพนธชนดเดยวจะไดลกปลาเพศเมยลวนเชน ปลาไน, ปลาเฉา, ปลาดกอย, coho salmon• หากการก าหนดเพศเปนแบบเพศเมยสรางเซลลสบพนธทม genotype ตางกน ลกปลาสวนใหญจะเปนเพศผ• แตเพศของลกปลาทไดอาจไดรบอทธพลจากสงแวดลอม เชน อณหภม และ modifying gene
การประยกตใชเทคนคการเหนยวน าgynogenesis
• การสรางประชากรปลาเพศเมยลวน (all-femalepopulation)– ใชกบปลาทมระบบก าหนดเพศแบบ XY และ
XO– ประโยชน– ปลาบางชนด ปลาเพศเมยโตดกวาปลาเพศผ– สรางปลาเพศผทมพนธกรรมเพศเมย
• การสรางปลาสายพนธแท• การสรางปลาโคลน (genetic clone)• การท าแผนทระหวางยน – centromere• การศกษาแบบแผนของพนธกรรมควบคมเพศ
การเหนยวน า androgenesis
• การทเชอตวผเจรญเปน zygote โดยไมเกดการปฏสนธกบไข• หลกการเดยวกบการเกด gynogenesis เพยงแตท าลายโครโมโซมของไขแทน• gamma ray และ x ray