การทดสอบความเป นพิษต อเซลล...

นิพนธตนฉบับ ว กรมวิทย พ 2558 ฉบับพิเศษ 1 : 46-53

46 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทยฉบับพิเศษ 1 กรกฎาคม - กันยายน 2558

การทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงของภาชนะพลาสติกสําหรับบรรจุผลิตภัณฑเภสัช

ปราศจากเชื้อ โดยวิธี Agar Diff usion

ปวีณา เจริญสิทธิ์ ทวีทรัพย ชัยสมบูรณพันธ

*สํานักยาและวัตถุเสพติด กรมวิทยาศาสตรการแพทย ถ.ติวานนท อ.เมือง นนทบุรี 11000

Accepted for publication, 23 July 2015

บทคัดยอ ในการประเมินความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงของภาชนะพลาสติกสําหรับบรรจุผลิตภัณฑเภสัชปราศจากเชื้อ ตามวิธีที่กําหนดไวใน มอก. 531 จะใชเทคนิค Direct Contact แตวิธีนี้พบปญหาบางเมื่อทดสอบตัวอยางที่อยูในรูปแบบของถุงและขวด ดังนั้น เพื่อใหไดวิธีการทดสอบใหมที่เหมาะสม จึงไดทดสอบตัวอยางภาชนะพลาสติกจํานวน 34 ตัวอยางเปรียบเทียบวิธีตาม มอก. 531 กับวิธีใหม คือ เทคนิค Agar Diffusion โดยการเพาะเลี้ยงเซลลเนื้อเยื่อ L-929 ดวยอาหารเลี้ยงเซลล Eagle’s Minimum Essential Medium (MEM) ที่มี fetal bovine serum (FBS) รอยละ 5 จนเซลลโตเปนชั้นเดี่ยว จากนั้นเติมอาหาร MEM ที่มีวุ นรอยละ 1.5 และสียอม neutral red กอนวางช้ินตัวอยางบนช้ันวุน สังเกตการตายของเซลลในบริเวณดานใตและรอบๆ ชิ้นตัวอยาง การเปลี่ยนแปลงรูปราง และจํานวนของเซลลที่มีชีวิต ภายหลังการสัมผัสกับชิ้นตัวอยาง 24 ชั่วโมง โดยใชแผนพลาสติก USP Positive Bioreaction RS เปนตัวควบคุมเพื่อยืนยันผลบวก จากการทดสอบพบวา ทัง้ 2 วธิใีหผลไมแตกตางกนัอยางมนัียสาํคญัทางสถิติ (P>0.05) เทคนิค Agar Diffusion เหมาะสาํหรบัพลาสติกทั้งชนิด โพลิเอทิลีน โพลิโพรพิลีน โพลิไวนิลคลอไรด และพลาสติกชั้น ดังนั้นเทคนิค Agar Diffusion จึงเปนวิธีที่เหมาะสมที่จะนํามาใชแทนที่เทคนิค Direct Contact

การทดสอบความเปนพษิตอเซลลเนือ้เยือ่เพาะเลีย้ง ปวณีา เจรญิสทิธิ ์และทวทีรพัย ชยัสมบรูณพนัธของผลติภณัฑเภสชัปราศจากเช้ือ

47วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทยฉบับพิเศษ 1 กรกฎาคม - กันยายน 2558

บทนํา

ภาชนะพลาสติกบรรจุผลิตภัณฑเภสัชปราศจากเชื้อ เชน หลอดบรรจุยาฉีด (ampoule) ขวดบรรจุยาฉีด

(vial) ถงุพลาสตกิสาํหรบับรรจนุํา้เกลอื ถงุพลาสตกิสาํหรบับรรจโุลหติ เปนตน มทีัง้ทีท่าํจากแกวและพลาสตกิ ภาชนะ

บรรจุเภสัชภัณฑที่ทําจากแกวแมวาจะปองกันการซึมผานของกาซและไอนํ้าไดดี และสามารถทําใหปราศจากเช้ือและ

กําจัดสารกอไข โดยใชอุณหภูมิสูงได แตมีขอเสียคือ แตกงาย และอาจมีออกไซดของโลหะบางชนิดที่เปนสวนผสมของ

แกวหลุดออกมาปนเปอนกับเภสัชภัณฑที่บรรจุอยู ทําใหเภสัชภัณฑมีความเปนกรด-ดางสูงขึ้น ดังนั้นจึงมีการพัฒนา

ภาชนะบรรจผุลติภณัฑเภสชัท่ีทําจากพลาสตกิขึน้มา ซึง่มนีํา้หนกัเบา ไมแตกราว มคีวามยดืหยุน ผลติเปนรปูแบบตางๆ

ไดงาย วัตถุดิบที่ใชในการผลิตภาชนะพลาสติกสําหรับบรรจุเภสัชภัณฑไดแก โพลิเอทิลีน (PE) โพลิโพรพิลีน (PP)

โพลิไวนิล คลอไรด (PVC) และพลาสติกช้ัน(laminar) อยางไรก็ตาม พลาสติกที่นํามาผลิตเปนภาชนะบรรจุตอง

ไมทําปฏิกิริยากับเภสัชภัณฑที่บรรจุจนทําใหคุณภาพเปล่ียนแปลงไป และเกิดผลขางเคียงของตัวยา กลาวคือภาชนะ

พลาสตกินัน้ตองไมปลอยสารปนเปอนกบัเภสชัภณัฑในปรมิาณทีท่าํใหเกิดพษิเปนอันตรายตอสขุภาพ และตองไมดดูซมึ

โมเลกุลหรือไอออนของสารตางๆในเภสัชภัณฑ ดังนั้นจึงจําเปนตองทดสอบคุณสมบัติตางๆ ของภาชนะบรรจุวา

เหมาะกับเภสัชภัณฑที่จะบรรจุ(1-2)

ภาชนะพลาสตกิบรรจุผลิตภัณฑเภสชัปราศจากเชือ้ (มอก. 531)(3) เปนผลติภณัฑทีม่พีระราชกฤษฎกีากาํหนด

ใหตองเปนไปตามมาตรฐานทีก่าํหนด หรอืเปนมาตรฐานทีใ่ชบงัคบั กลาวคอื ภาชนะพลาสตกิทีบ่รรจเุภสชัภณัฑสาํหรบั

ฉดี ทัง้ปรมิาตรมากและปรมิาตรนอย ท้ังทีผ่ลติในประเทศ และนาํเขาเพือ่จาํหนายในประเทศ ตองไดรบัการการควบคมุ

คุณภาพตามขอกําหนดของสํานักงานมาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรม คือ ตองมีการตรวจคุณภาพทั้งทางฟสิกส เคมี

และชวีภาพกอน จึงจะสามารถนํามาบรรจุเภสชัภณัฑเพือ่จาํหนายได การทดสอบคุณลกัษณะทางชีวภาพม ี4 หวัขอ ไดแก

การทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง การทดสอบหาสารไพโรเจน การทดสอบการทําลายเม็ดเลือด และ

การทดสอบการซึมผานเขาออกของเชื้อจุลินทรีย

การทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง (Cytotoxicity Test) ตาม มอก. 531 นั้น เปน

การทดสอบโดยใชเทคนิค Direct Contact คือ วางช้ินตัวอยางลงในหลุมที่มีอาหารเลี้ยงเซลลโดยตรง วิธีนี้ยังมี

ขอจํากัดสําหรับพลาสติกชนิด high density และ low density เนื่องจาก พลาสติกนี้อาจจะไปกดทับใหเซลลตายได

หรืออาจจะลอยไปมาในหลุมทดสอบ จนอาจทําใหผลการทดสอบผิดพลาดได อีกทั้งภาชนะพลาสติกบรรจุผลิตภัณฑ

เภสัชปราศจากเชื้อในประเทศไทยมีทั้งในรูปแบบของขวด และในรูปแบบของถุง การทดสอบตามวิธีในมอก. 531

จงึอาจไมเหมาะสมกบัรปูแบบของตวัอยางในปจจบุนั ซึง่มกีารพฒันารปูรางลกัษณะและขนาดไปเปนอนัมาก จงึมคีวาม

จําเปนตองพัฒนาวิธีการทดสอบโดยใชเทคนิคใหม เพื่อใหไดผลการทดสอบที่ถูกตอง นาเชื่อถือ และเหมาะสมกับ

สภาพตัวอยางในปจจุบัน

การทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงในเภสัชตํารับและมาตรฐานตางๆ เชน United States

Pharmacopeia (USP)(4) American Society for Testing and Materials (ASTM)(5) และ ISO 10993, ISO

7405(6-7) สามารถแบงไดเปน 3 เทคนิคไดแก Elution, Direct Contact และ Agar Diffusion วิธีการทดสอบโดย

เทคนิค Elution จําเปนตองมีขั้นตอนการสกัดตัวอยางกอนนํามาทดสอบกับเซลลที่เลี้ยงเปน monolayer วิธีการ

ทดสอบโดยเทคนิค Agar Diffusion เปนวิธีที่นิยมใชทดสอบตัวอยางที่มีนํ้าหนักมาก เชน เครื่องมือแพทย วัสดุทาง

ทันตกรรม จุกยาง เปนตน(8-12) และสามารถทดสอบกับตัวอยางที่มีรูปรางตางๆ ได วิธีการทดสอบโดยใชเทคนิค

Direct Contact และ Agar Diffusion มีวิธีการทดสอบที่คลายกันและมีวิธีการประเมินผลที่เหมือนกัน คือ วิธี

Direct Contact เปนการทดสอบโดยวางชิ้นตัวอยางบนเซลลที่เลี้ยงเปน monolayer โดยตรง สวนวิธี Agar

Diffusion เปนการทดสอบโดยมีการเทช้ันวุนบนเซลลที่เลี้ยงเปน monolayer กอนที่จะวางช้ินตัวอยาง ดังนั้น

ในการวิจัยครั้งนี้ จึงศึกษาถึงความเปนไปไดในการนําวิธีการทดสอบแบบ Agar Diffusion มาใชแทนที่วิธีการทดสอบ

แบบเดิม คือ วิธี Direct Contact ของมาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรม

Cytotoxicity Testing of Plastic Parenteral Container ปวณีา เจรญิสทิธิ ์และทวทีรพัย ชยัสมบรูณพนัธ


วัสดุและวิธีการ

1. เครื่องมือ อุปกรณ และสารเคมี

1.1 ภาชนะพลาสตกิสําหรบับรรจุเภสชัภณัฑปราศจากเช้ือ ซึง่ถูกสงมาตรวจคุณลกัษณะทางชีวภาพ ในระหวาง

ปงบประมาณ 2553- 2555 จํานวนรวมทั้ิ้งสิ้น 34 ตัวอยาง

1.2 เซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง L-929 mammalian fibroblast cell (ATCC cell line CCL1, NCTC

clone 929)

1.3 เครื่องมือ ไดแก กลองจุลทรรศนชนิดอินเวอรท (inverted microscope) ตูอบเพาะเช้ือ แบบใช

คารบอนไดออกไซด ไมโครมิเตอร haemocytometer และ laminar flow cabinet

1.4 อุปกรณ ไดแก ขวดสําหรับเพาะเล้ียงเซลล (tissue culture flask) ถาดเล้ียงเซลลขนาด 6 หลุม

(6-well tissue culture petridish) ไมโครปเปต ปเปต เครื่องแกวตางๆ

1.5 สารเคมี ไดแก Phosphate Buffer Solution, Trypsin Solution (0.25 g/100 ml), สียอม

Trypan Blue, สารละลาย Neutral Red 50 µg/ml, 1% Sodium Bicarbonate Solution, Glutamine

Solution (29.2 g/100 ml)

1.6 อาหารเลี้ยงเซลลสําหรับการเจริญเติบโต Eagle’s Minimum Essential Medium (MEM) ที่มี

Fetal Bovine Serum 5%

1.7 อาหารเลี้ยงเซลลสําหรับการเจริญเติบโตที่มีวุน 1.5 % โดยการเตรียม MEM ใหมีความเขมขนเปน

2 เทา (2X) และมี Fetal Bovine Serum 10% และสารละลาย neutral red 2% นําไปอุนที่ 47 องศาเซลเซียส

ผสมกับวุน 3% ที่อุณหภูมิ 47 องศาเซลเซียส

1.8 วัสดุมาตรฐาน

- วัสดุควบคุมเพื่อยืนยันผลบวก (Positive Material Control) คือแผน USP Positive

Bioreaction RS

- วัสดุควบคุมเพื่อยืนยันผลลบ (Negative Material Control) คือแผน USP High-density

Polyethylene RS

2. การทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง

2.1 การเตรียมตัวอยาง

ตัดภาชนะพลาสติกตรงบริเวณที่โคงนอยที่สุดและมีเนื้อสมํ่าเสมอ ตัดชิ้นวัสดุควบคุมเพื่อยืนยันผลลบ และ

ชิ้นวัสดุควบคุมเพื่อยืนยันผลบวกใหมีพื้นที่ผิวไมนอยกวา 100 ตารางมิลลิเมตร ทําการฆาเชื้อโดยแชในแอลกอฮอล

70% เปนเวลาประมาณ 1 นาที

2.2 การเตรียมเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง

นําเซลลเน้ือเยื่อ L-929 ท่ีเพาะเลี้ยงไวในขวดสําหรับเพาะเลี้ยงเซลล ลางดวย Phosphate Buffer

Solution เติม Trypsin Solution เพื่อใหเซลลหลุดลอนจากพื้นผิวขวด แลวจึงเติมอาหารเลี้ยงเซลลสําหรับการเจริญ

เติบโต (อาหารเลี้ยงเซลล MEM ที่มี Fetal Bovine Serum 5%) ใหไดสารแขวนตะกอนของเซลลที่เปนเนื้อเดียวกัน

นาํสารแขวนตะกอนท่ีไดไปวัดความเขมขนของเซลล โดยนบัจาํนวนเซลลทีม่ชีีวติพรอมทัง้คาํนวณความเขมขนของเซลล

ในสารแขวนตะกอน โดยใชเครื่องมือนับเม็ดเลือด (Heamocytometer) จากนั้นเจือจางสารแขวนตะกอนของเซลลนี้

ดวยอาหารเลี้ยงเซลลสําหรับการเจริญเติบโต ใหไดความเขมขน 2 × 105 เซลลตอมิลลิลิตร นําสารแขวนตะกอนของ



เซลลที่เจือจางแลวเติมลงในถาดเลี้ยงเซลลขนาด 6 หลุมๆ ละ 3 มิลลิลิตร นําไปบมในตูอบเพาะเชื้อชนิดที่มี

คารบอนไดออกไซด 5% ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลาไมนอยกวา 1 วัน จนเซลลโตเปนชั้นเดี่ยว

(monolayer) อยางนอย 80% ของพื้นที่เลี้ยงเซลล

2.3 วิธีการทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง โดยเทคนิค Direct Contact

เมื่อเซลลโตเปนชั้นเดี่ยว ดูดอาหารเลี้ยงเซลลในถาดเลี้ยงเซลลแตละหลุมออก เติมอาหารเลี้ยงเซลลสําหรับ

การเจริญเติบโต หลุมละ 0.8 มิลลิลิตร วางชิ้นตัวอยางทดสอบ 2 หลุมๆ ละ 1 ชิ้น วางชิ้นวัสดุควบคุมเพื่อยืนยันผลบวก

2 หลุมๆ ละ 1 ชิ้น วางชิ้นวัสดุควบคุมเพื่อยืนยันผลลบ 1 หลุมๆ ละ 1 ชิ้น และอีกหลุมเปน blank จากนั้นนําถาดเลี้ยง

เซลลไปบมในตูอบเพาะเชื้อชนิดที่มีคารบอนไดออกไซด 5% ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เมื่อครบเวลา 24 ชั่วโมง

ดูความเปนพิษที่เกิดกับเซลล โดยดูลักษณะของเซลลและวงใส (zone) ดวยกลองจุลทรรศน บันทึกการตายของเซลล

การเปลีย่นแปลงรปูราง (morphological change) และความหนาแนนของเซลลทีม่ชีวีติ (cell density) แลวประเมินผล

(ตารางที่ 1) หลังจากนั้นทําการยึด (fix) และยอมสีเซลลใหติดบนถาดเลี้ยงเซลลดวยสารละลายฟอรมาลิน-

คริสทัลไวโอเลต การทดสอบจะถือวา ตัวอยางไมเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง เมื่อชิ้นตัวอยางมีความเปนพิษตอ

เซลลเนือ้เยือ่เพาะเลีย้งไมมากกวาระดบั 2 และการทดสอบจะมผีลเชือ่ถอืได เมือ่ blank และชิน้วสัดคุวบคมุเพือ่ยนืยนั

ผลลบไมเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง (ระดับ 0) และชิ้นวัสดุควบคุมเพื่อยืนยันผลบวกเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อ

เพาะเลี้ยงในระดับ 3 ขึ้นไป

2.4 วิธีการทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง โดยเทคนิค Agar Diffusion

เมื่อเซลลโตเปนชั้นเดี่ยว ดูดอาหารเลี้ยงเซลลในถาดเลี้ยงเซลลแตละหลุมออก และเติมอาหารเลี้ยงเซลล

สําหรับการเจริญเติบโต ที่มีวุน 1.5% หลุมละ 3 มิลลิลิตร รอใหแข็งในที่มืดเปนเวลา 20 นาที วางชิ้นตัวอยางทดสอบ

2 หลุมๆ ละ 1 ชิ้น วางชิ้นวัสดุควบคุมเพื่อยืนยันผลบวก 2 หลุมๆ ละ 1 ชิ้น วางชิ้นวัสดุควบคุมเพื่อยืนยันผลลบ

1 หลมุๆ ละ 1 ชิน้ และอกีหลมุเปน blank จากนัน้นาํถาดเลีย้งเซลลไปบมในตูอบเพาะเชือ้ชนดิทีม่คีารบอนไดออกไซด

5% ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เมื่อครบเวลา 24 ชั่วโมง ดูความเปนพิษที่เกิดกับเซลล โดยดูลักษณะของเซลลและ

วงใส ดวยกลองจุลทรรศน บันทึกการตายของเซลล การเปลี่ยนแปลงรูปราง และความหนาแนนของเซลลที่มีชีวิต แลว

ประเมินผลตาม (ตารางที่ 1)

0 ไมเปนพิษ (none) ไมพบวงใสรอบๆหรือภายใตชิ้นทดสอบ

1 เปนพิษนอยมาก (slightly) พบเซลลมีรูปรางผิดปกติภายใตชิ้นทดสอบ

2 เปนพิษนอย (mild) มีเซลลตายเปนวงจํากัดอยูในพื้นที่ใตชิ้นทดสอบ

3 เปนพิษปานกลาง (moderate) มีเซลลตายเปนวงใสแผขยายออกจากชิ้นทดสอบ

0.5 – 1.0 ซม.

4 เปนพิษรุนแรง (severe) มีเซลลตายเปนวงใสแผขยายออกจากชิ้นทดสอบ

มากกวา 1.0 ซม.

ตารางที่ 1 การประเมินระดับความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง

ระดับ ปฏิกิริยา สภาพของเซลลเนื้อเยื่อ

(grade) (reactivity) (Description of Reactivity Zone)



ผล

จากการทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงของภาชนะพลาสติกบรรจุผลิตภัณฑเภสัชปราศจาก

เชื้อที่ผลิตและนําเขามาในประเทศ ซึ่งถูกสงมาตรวจคุณลักษณะทางชีวภาพ ในระหวางป 2553 - 2555 จํานวน 34

ตัวอยาง โดยวิธีตาม มอก. 531 คือ เทคนิค Direct Contact และวิธีใหมคือ เทคนิค Agar Diffusion พบวา ทั้ง 2

วิธีใหผลการทดสอบที่ไมแตกตางกัน (ตารางที่ 2)

BOE-1, BOE-2, BOE-3, PE ขวด 0 0

BOE-4, BOE-6, BOE-7,

BOE-10, BOE-11,

BOE-12, BOE-13,

BOE-14

BOE-8, BOE-9 PE ขวด 1 0

BOE-5 PE ขวด 1 1

BOP-1, BOP-2, PP ขวด 0 0

BOP-3, BOP-4,

BOP-6, BOP-7,

BOP-9, BOP-10,

BOP-11, BOP-12,

BOP-13

BOP-5, BOP-8 PP ขวด 1 1

BAP-1, BAP-2, PP ถุง 0 0

BAP-3, BAP-4,

BAV-1 PVC ถุง 0 0

BAL-1, BAL-2 ชั้น ถุง 0 0

ตารางที่ 2 ผลการทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงของภาชนะพลาสติกสําหรับบรรจุผลิตภัณฑเภสัช

ปราศจากเชื้อเปรียบเทียบระหวาง เทคนิค Direct Contact และเทคนิค Agar Diffusion

ตัวอยาง ชนิดพลาสติก

รูปแบบ Direct Contact Agar Diffusion

Grade Grade

วิจารณ

เมื่อทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงของตัวอยางภาชนะพลาสติกบรรจุผลิตภัณฑเภสัช

ปราศจากเชื้อ จํานวน 34 ตัวอยาง ตามวิธีที่กําหนดใน มอก.หรือเทคนิค Direct Contact เปรียบเทียบกับเทคนิค

Agar Diffusion พบวา ทั้ง 2 วิธีใหผลไมแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญทางสถิติ (P>0.05) แมวาจะมีภาชนะพลาสติก



ชนิดขวดจํานวน 2 ตัวอยาง ที่ใหผลการทดสอบทั้ง 2 วิธี ที่ตางกันบาง ซึ่ง 2 ตัวอยางเปนภาชนะพลาสติกที่ทําจาก PE

โดยพบวา เทคนิค Direct Contact มีความเปนพิษมากกวาเทคนิค Agar Diffusion ทั้ง 2 ตัวอยาง ทั้งนี้อาจเนื่อง

มาจาก ภาชนะพลาสติกอาจเปนชนิด high density มีนํ้าหนักมาก เมื่อทําการทดสอบโดยเทคนิค Direct Contact

ชิ้นพลาสติกนี้จะไปกดทับทําใหเซลลใตชิ้นทดสอบตายได หรือภาชนะพลาสติกอาจเปนชนิด low density มีนํ้าหนัก

เบา เมื่อทําการทดสอบโดยเทคนิค Direct Contact ชิ้นพลาสติกนี้จะเคลื่อนที่ไปมาในหลุมทดสอบทําใหเซลลใตชิ้น

ทดสอบตายได หรืออาจเกิดจากสารพิษที่มีอยูในช้ินพลาสติกอาจไมละลายหรือถูกดูดซับไวในช้ันวุน มีผลทําใหความ

เขมขนของสารพิษลดลงเมื่อซึมผานชั้นวุนมาสัมผัสกับเซลล จึงพบความเปนพิษโดยเทคนิค Direct Contact มากกวา

เทคนิค Agar Diffusion(8) อยางไรก็ตามเมื่อทําการเปรียบเทียบขนาดวงใสของช้ินวัสดุควบคุมเพื่อยืนยันผลบวก

พบวาทั้ง 2 วิธีใหผลไมแตกตางกัน คือ มีขนาดวงใส 0.5 – 0.7 เซนติเมตร แสดงใหเห็นวา สารพิษที่หลุดลอดออกมา

สามารถละลายและซึมผานชั้นวุนลงมาสัมผัสกับเซลลได

จากการทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงของตัวอยางภาชนะพลาสติกบรรจุผลิตภัณฑเภสัช

ปราศจากเชื้อที่อยูในรูปถุง จํานวน 7 ตัวอยาง แมพบวา ทุกตัวอยางใหผลไมตางกัน แตเนื่องจากถุงมีความบางมากกวา

ขวด จึงมีโอกาสเกิดการเคลื่อนที่ของตัวอยางภายในหลุมทดสอบ เมื่อทําการทดสอบดวยเทคนิค Direct Contact

จําเปนตองระวังในเรื่องดังกลาวเปนอยางมาก ซึ่งจะมีผลทําใหเกิดการแปลผลที่ผิดได การนําเทคนิค Agar Diffusion

มาใชแทนที่จึงชวยแกปญหาดังกลาวได

เม่ือประเมินผลตามเกณฑท่ี มอก. กําหนด พบวา ทุกตัวอยางเขามาตรฐานทั้ง 2 วิธี ซึ่งสอดคลองกับ

การศึกษาของทวีทรัพยและคณะซึ่งรายงานถึงคุณภาพของภาชนะพลาสติกสําหรับบรรจุเภสัชภัณฑปราศจากเชื้อ

ในประเทศไทย(13) ท้ังนีเ้นือ่งจาก ตาํรายา USP ไดกาํหนดใหเมด็พลาสตกิทีน่าํมาใชในการผลติภาชนะพลาสตกิสาํหรบั

บรรจเุภสชัภณัฑตองผานการทดสอบคณุภาพและความปลอดภยักอน ถาไมผานกไ็มสามารถนาํมาใชในการผลติภาชนะ

พลาสติกบรรจุผลิตภัณฑเภสัชปราศจากเชื้อได(3)

การทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงที่กําหนดใน มอก. 531 เปนเทคนิค Direct Contact

วิธีนี้แมจะสามารถสกัดและทดสอบตัวอยางไดในเวลาเดียวกัน ทําใหสามารถประหยัดเวลาในการทดสอบ คือ เมื่อวาง

ชิ้นทดสอบลงในหลุมที่มีอาหารเลี้ยงเซลล อาหารเลี้ยงเซลลจะสกัดเอาสารพิษจากชิ้นตัวอยางออกมา และลงสัมผัสกับ

เซลลโดยตรง ทําใหชวยลดข้ันตอนในการสกัด สามารถใชตวัอยางทีม่ดีานเรยีบเพยีงแค 1 ดาน ก็สามารถนาํมาใชประเมนิ

ความเปนพิษได อยางไรก็ตาม วิธีนี้ไมเหมาะกับตัวอยางที่เปนโลหะหรือตัวอยางที่มีพื้นผิวไมเรียบ รวมทั้งตัวอยางท่ี

เปนพลาสติกชนิด high density หรือ low density เนื่องจาก ตัวอยางพลาสติกชนิด high density อาจทําใหเกิด

การกดทับบนเซลลเนื้อเยื่อทําใหเซลลตาย สวนตัวอยางพลาสติกชนิด low density อาจทําใหชิ้นตัวอยางเกิดการ

เคล่ือนที่ทําใหเซลลตายได ทั้งนี้การตายเกิดจากลักษณะทางกายภาพของตัวอยาง ไมไดเกิดจากสารพิษท่ีหลุดลอด

ออกมา ทําใหเกิดการแปลผลที่ผิดพลาดได(4, 8)

การทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงที่นํามาแทนที่วิธีเดิมเปนเทคนิค Agar Diffusion วิธีนี้

สามารถสกดัและทดสอบตวัอยางไดในเวลาเดยีวกนั ทาํใหสามารถประหยดัเวลาในการทดสอบ เชนเดยีวกนักบัเทคนคิ

Direct Contact วิธีนี้ยังสามารถทดสอบกับตัวอยางที่มีลักษณะทางกายภาพแตกตางกันไดและไมข้ึนกับ material

density เนื่องจากมีชั้นวุนรองรับนํ้าหนักไว หรือถาตัวอยางมีพื้นที่ผิวไมเรียบหรือมีขนาดเล็ก ก็สามารถนําตัวอยาง

มาสกัดและนําสารสกัดหยดลงบนกระดาษกรองกอนที่จะนํามาทดสอบได(6-8) ดังนั้นมาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรม

จึงนาจะมีการปรับเปลี่ยนวิธีการทดสอบจากเทคนิคเดิม คือ Direct Contact เปนเทคนิคใหม คือ Agar Diffusion

ซึ่งเปนเทคนิคที่เหมาะที่จะนํามาใชทดสอบกับภาชนะพลาสติกบรรจุผลิตภัณฑเภสัชปราศจากเช้ือในประเทศไทยที่มี

ทั้งในรูปแบบของขวด และในรูปแบบของถุง ซึ่งมีการผลิตมาจากวัตถุดิบทั้ง PE PP PVC และพลาสติกชั้นได



สรุป

วิธีการทดสอบความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงแบบ Agar Diffusion เปนวิธีที่มีความไว ใหผลการ

ทดสอบที่มีความนาเชื่อถือ สามารถทดสอบกับตัวอยางที่มีลักษณะทางกายภาพแตกตางกันซึ่งมีทั้งในรูปแบบของขวด

และในรูปแบบของถงุ นอกจากนี้ยังสามารถนําไปประยกุตใชกับมาตรฐานผลิตภณัฑอุตสาหกรรมอื่นๆ ทีเ่กี่ยวของ เชน

มอก. 1298 ภาชนะพลาสติกปราศจากเชื้อสําหรับบรรจุโลหิตและสวนประกอบของโลหิตไดอีกดวย

เอกสารอางอิง

1. Laschi A, Sehnal N, Alarcon A, Barcelo B, Caire-Maurisier F, Delaire M, et al. Container-content compatibility studies: a pharmaceutical team’s integrated approch. PDA J Pharm Sci Technol 2009; 63(4): 285-93.

2. ศุลีพร ศรีพัฒนะพิพัฒน. ภาชนะบรรจุสําหรับผลิตภัณฑเภสัช. สมอ สาร 2545; 28(319): 7-8. 3. มาตรฐานผลติภณัฑอตุสาหกรรม มอก. 531-2546. ภาชนะพลาสตกิสาํหรบับรรจผุลติภณัฑเภสชัปราศจากเชือ้. กรงุเทพฯ: สาํนกังาน

มาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรม หนา 14-16. 4. USP 35-NF 30: The United States Pharmacopeia. The National Formulary. 35th ed. Rockville: United

States Pharmacopeia Convention; 2012. p. 92-94, 472-479. 5. ASTM F 895-11. Standard test method for agar diffusion cell culture screening for cytotoxicity.

Pennsylvania: American Society for Testing and Materials (ASTM); 2011. 6. ISO 10993-5:2009. Biological evaluation of medical devices -- Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity.

Geneva: International Organization for Standardization (ISO); 2009. 7. ISO 7405:2008. Dentistry -- Evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry.

Geneva: International Organization for Standardization (ISO); 2008. 8. Guess WL, Rosenbluth SA, Schmidt B, Autian J. Agar diffusion method for toxicity screening of

plastics on cultured cell monolayers. J Pharm Sci 1965; 54(10): 1545-7. 9. Vidal MNP, Aiub C, Abrantes S, Zamith HPS. Evaluation of Brazilian medical devices using agar

diffusion cytotoxicity assay. Rev Bras Hematol Hemoter 2009; 31(2): 84-7. 10. สุวรรณา กอสุวรรณวงศ, ราชพร สีจันทร, ละอองทอง วัชราภัย. การประเมินพิษของสารยึดติดเนื้อฟนโดยวิธีอาการโอเวอรเลย.

วิทยาสารทันตแพทยศาสตร 2551; 58(3): 196-202. 11. Miranda RB, Fidel SR, Boller MA. L929 cell response to root perforation repair cements: an in vitro

cytotoxicity assay. Braz Dent J 2009; 20(1): 22-6. 12. Lonnroth EC. Toxicity of medical glove materials: a pilot study. Int J Occup Saf Ergon 2005; 11(2):

131-9. 13. ทวีทรัพย ชัยสมบูรณพันธ, ศิริวรรณ ชัยสมบูรณพันธ, ปวีณา ลีลาภัทรานุรักษ, อารียา ดิษรัฐกิจ. คุณภาพความปลอดภัยและ

ความเขากันไดทางชีววิทยาของพลาสติกที่ใชทางการแพทย. สารตํารายา 2546; 10(2): 33-43.



Cytotoxicity Testing of Plastic Parenteral Container by Agar Diff usion Technique

Paveena Charoensit Dawsupya Chaisomboonpan

Bureau of Drug and Narcotic Department of Medical Sciences Tiwanond Road. Nonthaburi 11000.

Thailand.

ABSTRACT Even though direct contact technique was used to screen the cytotoxicity of plastic parenteral containers according to TIS 531, some difficulties were encountered when samples having bag and bottle forms were found moving in the wells during testing. In order to be able to test all types of containers, agar diffusion technique was applied to evaluate 34 plastic parenteral containers paral-lel with direct contact technique. The L-929 cultures were grown to monolayer in Eagle’s Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS). After incubation, the agar layer (1.5%) supplemented with MEM in 5% FBS and neutral-red stain was added to replace the me-dium. The samples were cut and placed on the agar layer. After 24–hour exposure, the cell monolayers were observed for cell deaths beneath and surrounding the samples as well as changes in morphology and cell densities. In this study, USP Positive Bioreaction RS were used as positive material control. There were no statistical differences between both techniques (P>0.05). However, the agar diffusion technique was a useful method for screening plastic parenteral containers made from polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride and laminar. Therefore, it could be another useful method to be implemented for the cytotoxicity testing scheme in order to replace the direct contact technique.

Key words : Cytotoxicity testing, Plastic parenteral container, Agar diffusion technique

การทดสอบความเป นพิษต อเซลล...

Documents