บทท 3 อปกรณและวธการวจย

อปกรณ

1. เครองแกวตางๆ 2. โกรงบดสาร 3. มด 4. เขยงพลาสตก 5. อลมเนยมฟอยล 6. ถงน าแขง 7. ปเปต 8. ผาขาวบาง 9. ตส าหรบรมกาซขนาด 30 x 50 x 33.33 ลกบาศกเซนตเมตร คดเปนปรมาตร 50 ลตร 10. ตดดควน 11. กลองกระดาษลกฟกบรรจผลล าไย

เครองมอ

1. เครองวดความเปนกรด-ดาง (pH meter) รน GC842 ยหอ Schott 2. เครองกวนสารเคมดวยแทงแมเหลก (magnetic stirrer) รน LD-846 ยหอ LABINCO

3. เครองเหวยงตกตะกอนความเรวสง (high speed centrifuge) รน ICE MULTI RF refrigerated ยหอ Thermo

4. เครองวดการดดกลนแสง (visible spectrophotometer) รน Spectronic Helios Epsilonยหอ Thermo

5. เครองชงละเอยด 4 ต าแหนง (analytical balance) รน Summit ยหอ Denver 6. เครองเขยา (rotamixer) รน KS 130 Basic ยหอ IKA 7. เครองเขยา (rotamixer) รน MS 1 ยหอ IKA 8. ตเยนอณหภม 5 องศาเซลเซยส (refrigerator) ยหอ Perani 9. เครองวดปรมาณของแขงทงหมดทละลายน าได (pocket refractometer) รน Pocket

PAL-1 ยหอ ATAGO 10. เครองวดส (chroma meter) รน Miniscan ยหอ Hunter lab

16

สารเคมทใชในการทดลอง 1. การรมผลล าไย

- โซเดยมคลอไรต (sodium chlorite, NaClO2) (Ajax Finechem, Australia) - กรดไฮโดรคลอรก (hydrochloric acid, HCl) (Merck, Germany) - ผงก ามะถน (sulfur powder, S)

2. การสกดและวเคราะหกจกรรมของเอนไซม PPO และ POD - โพแทสเซยมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต (potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4)

(Merck, Germany) - ไดโพแทสเซยมไฮโดรเจนฟอสเฟต (di-potassium hydrogen phosphate, K2HPO4)

(Merck, Germany) - โพแทสเซยมคลอไรด (potassium chloride, KCl) (Merck, Germany) - โพลไวนลโพลไพโรลโดน (polyvinylpolypyroridone, PVPP) (Sigma Aldrich, USA) - แคตคอล (catechol, C6H6O4) (Fluka, USA) - กรดอะซตรก (acetic acid, C2H4O2) (Merck, Germany) - โซเดยมอะซเตต (sodium acetate trihydrate, C2H3O2Na•3H2O) (Merck, Germany) - กวอะคอล (guaiacol, C6H4(OH)(OCH3)) (Fluka, USA) - ไฮโดรเจนเปอรออกไซด (hydrogen peroxide, H2O2) (Carlo Erba Reagent, Italy) - ฟอลนซโอแคลตรเอเจนต (Folin-Ciocalteu reagent) (Merck, Germany) - คอปเปอรซลเฟต (copper sulphate, CuSO4•H2O) (Ajax Finechem, Australia) - โซเดยมไฮดรอกไซด (sodium hydroxide, NaOH) (Merck, Germany) - โพแทสเซยมทารเทรต (potassium tartrate, COOK(CHOH)2COOK•1/2H2O) (Carlo Erba

Reagent, Italy) - โซเดยมคารบอเนต (sodium carbonate, Na2CO3) (Merck, Germany)

3. การวเคราะหปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมด - เอทานอล (ethanol, C2H5OH) (Lab-Scan, Thailand) - ฟอลนซโอแคลตรเอเจนต (Folin-Ciocalteu reagent) (Merck, Germany) - กรดแกลลก (gallic acid monohydrate, C7H6O5•H2O) (Fluka, USA) - โซเดยมคารบอเนต (sodium carbonate, Na2CO3) (Merck, Germany)

17

พชทดลอง ผลล าไยสดพนธดอ (Dimocarpus longan Lour. cv. Daw) จากสวนล าไยของเกษตรกรในจงหวดล าพนและจงหวดเชยงใหม การเตรยมผลล าไย เกบเกยวผลล าไยพนธดอทเจรญเตบโตเตมทอายประมาณ 180 วนหลงดอกบาน จากสวนของเกษตรกรในจงหวดล าพนและเชยงใหม บรรจลงในกลองกระดาษแลวขนสงทางรถยนตมายงหองปฏบตการเทคโนโลยหลงการเกบเกยวและสรรวทยาของพช ภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม ภายในเวลา 1 ชวโมง จากนนน าผลมาตดกานผลทยาวใหเหลอกานบรเวณเหนอขวผลประมาณ 0.5 เซนตเมตร แลวคดเลอกผลทมขนาดใกลเคยงกน ไมมการเขาท าลายของโรคและแมลงเพอใชในการทดลอง การเตรยมและรมกาซคลอรนไดออกไซดและกาซซลเฟอรไดออกไซด 1. การเตรยมและรมกาซคลอรนไดออกไซด การเตรยมกาซคลอรนไดออกไซด ใชสวนผสมระหวางกรดไฮโดรคลอรกกบโซเดยมคลอไรต โดยเตรยมในตส าหรบรมกาซทมผลล าไยทเตรยมไวบรรจในตะกรา ปดฝาต รมทนทเพอปองกนกาซแพรออกจากตรม 2. การเตรยมและรมกาซซลเฟอรไดออกไซด การเตรยมกาซซลเฟอรไดออกไซด โดยใชผงก ามะถนมาเผาไฟเพอใหเกดกาซซลเฟอรไดออกไซด ซงในการรมกาซซลเฟอรไดออกไซดนนคอนขางอนตราย อกทงยงตองมการก าจดกาซซลเฟอรไดออกไซดภายหลงการใชแลว ดงนนในการทดลองครงนจงน าผลล าไยทเตรยมไว (ผลล าไยจากสวนเดยวกนกบชดทรมดวยกาซคลอรนไดออกไซด) ไปท าการรมกาซซลเฟอรไดออกไซดทหองรมภายในโรงรมกาซซลเฟอรไดออกไซดเพอการสงออก จงหวดล าพน ซงมสารเคมและอปกรณตางๆ ทมความปลอดภย ตลอดจนมระบบก าจดกาซซลเฟอรไดออกไซด โดยระดบความเขมขนของกาซซลเฟอรไดออกไซดทใชคอ 12,000 มลลกรม/ลตร ซงเปนระดบความเขมขนทซงชง (2535) และสถาบนอาหาร (2541) แนะน าไว และนยมใชอยในปจจบน

18

การวางแผนการทดลอง วางแผนการทดลองแบบสมสมบรณ (completely randomized design, CRD) โดยแบงการ

ทดลองออกเปน 2 การทดลอง คอ การทดลองท 1 ศกษาผลของการรมดวยกาซคลอรนไดออกไซดตอการเกดสน าตาล กจกรรมของเอนไซม PPO และ POD ปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมดของเปลอกผล และคณภาพผลของล าไยพนธดอระหวางการเกบรกษาทอณหภมหอง และการทดลองท 2 ศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพในการลดการเกดสน าตาลของเปลอกผลล าไยพนธดอระหวางการรมผลดวยกาซคลอรนไดออกไซดและการรมผลดวยกาซซลเฟอรไดออกไซดในระหวางการเกบรกษาทอณหภมหอง การทดลองท 1 ศกษาผลของการรมดวยกาซคลอรนไดออกไซดตอการเกดสน าตาล กจกรรมของเอนไซม PPO และ POD ปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมดของเปลอกผล และคณภาพผลของล าไยพนธดอระหวางการเกบรกษาทอณหภมหอง น าผลล าไยทเตรยมไวมารมดวยกาซคลอรนไดออกไซด 4 ระดบความเขมขน เปนเวลา 10 นาท ซงสามารถแบงออกเปน 5 ชดการทดลองดงน

ชดการทดลองท 1 ไมผานการรมกาซ (ชดควบคม) ชดการทดลองท 2 รมดวยกาซคลอรนไดออกไซดความเขมขน 2.5 มลลกรม/ลตร ชดการทดลองท 3 รมดวยกาซคลอรนไดออกไซดความเขมขน 5 มลลกรม/ลตร ชดการทดลองท 4 รมดวยกาซคลอรนไดออกไซดความเขมขน 10 มลลกรม/ลตร ชดการทดลองท 5 รมดวยกาซคลอรนไดออกไซดความเขมขน 25 มลลกรม/ลตร ภายหลงการรมน าผลมาผงทอณหภมหองเปนเวลา 30 นาท เพอใหกาซคลอรนไดออกไซด

ระเหยออก บรรจผลลงในกลองกระดาษและเกบรกษาท 25 องศาเซลเซยส ความชนสมพทธ 85±5% เปนเวลา 7 วน ทงนในแตละชดการทดลอง ทดลอง 3 ซ าๆ ละ 10 ผล ใชผลรวมทงหมด 240 ผล ในวนท 0 (วดผลทนทภายหลงการรมกาซเรยบรอยแลว), 1, 2, 3, 4, 5, 6 และ 7 สมผลมาวเคราะหการเปลยนแปลงทางชวเคมในเรองตอไปน การวเคราะหดชนการเกดสน าตาลของเปลอกผล

น าผลท าการประเมนการเกดสน าตาลของเปลอกผลล าไยดวยสายตา โดยดดแปลงจากวธ Jiang and Li (2001) แลวบนทกเปนระดบคะแนนของพนททเกดสน าตาลทเปลอกผล โดยก าหนดคะแนน 1-5 ดงน

19

คะแนน 1 = ไมเกดสน าตาลทเปลอกผลเลย คะแนน 2 = เกดสน าตาลทเปลอกผล 1-10 เปอรเซนตของพนทเปลอกผล คะแนน 3 = เกดสน าตาลทเปลอกผล 11-25 เปอรเซนตของพนทเปลอกผล คะแนน 4 = เกดสน าตาลทเปลอกผล 26-50 เปอรเซนตของพนทเปลอกผล คะแนน 5 = เกดสน าตาลทเปลอกผลมากกวา 50 เปอรเซนตของพนทเปลอกผล ดชนการเกดสน าตาลของเปลอกผล = ผลรวมระดบคะแนนของแตละผล จ านวนผลทงหมด โดยดชนการเกดสน าตาลของเปลอกผลมากกวา 3 ถอวาไมยอมรบส าหรบการวางจ าหนาย

การวเคราะหสเปลอกผล น าผลมาก าหนดบรเวณแกมผล 2 ขางเพอท าการวดส แลวใชเครองวดสท าการวดสของ

เปลอกผล คาทไดแสดงในรปของคา L* b* และ h° คา L* (L* value) เปนคาแสดงถงความสวางของผล ถาคา L* เขาใกล 0 หมายถง ผลมส

คล ามาก ถาคา L* เขาใกล 100 หมายถง ผลมความสวาง โดยคา L* มคา 0 ถง 100 คา b* (b* value) เปนคาแสดงถงความมสเหลองและสน าเงนของผล ถาคา b* เปนบวก

หมายถง ผลมสเหลอง ถาคา b* เปนลบ หมายถง ผลมสน าเงน โดยคา b* มคา -60 ถง +60 คา h° (hue angle) เปนคาทแสดงสทแทจรงของผล เปนการแสดงมมตกกระทบของคา a*

(คา a* เปนบวก หมายถง ผลมสแดง ถาคา a* เปนลบ หมายถง ผลมสเขยว โดยคา a* มคา -60 ถง +60) ค านวณในรปขององศา ค านวณไดจากสมการ h° = arctan (b*/a*) โดยคา h° มคาตงแต 0-360 องศา การวเคราะหกจกรรมของเอนไซมโพลฟนอลออกซเดส (polyphenol oxidase, PPO) และเปอรออกซเดส (peroxidase, POD) ของเปลอกผล

น าเปลอกผลล าไยมาวเคราะหกจกรรมของเอนไซม PPO และ POD มขนตอนดงน 1. การสกดเอนไซมทง 2 ชนด โดยดดแปลงจากวธการของ Huang et al. (1990) ท าการสกดเอนไซมทงสองชนดภายใตอณหภม 4 องศาเซลเซยส โดยน าตวอยางเนอเยอเปลอกผลล าไยทหนละเอยดหนก 2 กรม บดสกดดวย 0.05 M โพแทสเซยมฟอสเฟตบฟเฟอร

20

(potassium phosphate buffer) (pH 6.2), 1 M โพแทสเซยมคลอไรด และ 2% โพลไวนลโพลไพโรลโดน จากนนน าสารผสมทไดจากการบดไปเหวยงตกตะกอนดวยความเรว 13,500 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท น าเฉพาะของเหลวใส (supernatant) ซงเปนสารสกดหยาบเอนไซม (crude enzyme) ไปใชในการวเคราะหกจกรรมของเอนไซมทง 2 ชนดตอไป 2. การวเคราะหกจกรรมของเอนไซม PPO ดดแปลงจากวธการของ Jiang and Fu (1998) น าสารสกดหยาบเอนไซมทไดปรมาตร 0.5 มลลลตร ใสลงในหลอดทดลองทม 0.05 M โพแทสเซยมฟอสเฟตบฟเฟอร (pH 7.5) ปรมาตร 1.3 มลลลตร และ 0.2 M แคตคอล ปรมาตร 0.2 มลลลตร ผสมใหเขากนแลววางไวทอณหภมหองนาน 5 นาท แลวน าสารละลายผสมทไดนไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 420 นาโนเมตรเมตร 3. การวเคราะหกจกรรมของเอนไซม POD ดดแปลงจากวธการของ Nagle and Harrd (1975) เตรยมสารละลายทใชในการวเคราะหปรมาตร 2.5 มลลลตร ซงประกอบดวย 0.01 M โซเดยมอะซเทตบฟเฟอร (sodium acetate buffer) (pH 6.0) ปรมาตร 2.3 มลลลตร, 0.1% กวอะคอล ปรมาตร 0.05 มลลลตร และ 0.1% ไฮโดรเจนเปอรออกไซด ปรมาตร 0.1 มลลลตร จากนนเตมสารสกดหยาบเอนไซมทเจอจางลง 20 เทา ปรมาตร 0.05 มลลลตร ลงในหลอดทดลองทมสารวเคราะหดงกลาว ผสมใหเขากน แลววางไวทอณหภมหองนาน 5 นาท แลวน าสารละลายผสมทไดนไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 470 นาโนเมตรเมตร 4. การวเคราะหปรมาณโปรตน ดดแปลงจากวธการของ Lowry et al. (1951)

น าสารสกดหยาบเอนไซมทเจอจางลง 10 เทา ปรมาตร 0.5 มลลลตร เตมลงในหลอดทดลองทมสารละลายอลคาไลนคอปเปอร (alkaline copper solution) (สารละลายนประกอบดวย 4% โซเดยมคารบอเนต : 0.2 N โซเดยมไฮดรอกไซด : 1% คอปเปอรซลเฟต : 2% โพแทสเซยมทารเทรต ในอตราสวน 5 : 5 : 0.1 : 0.1) ปรมาตร 2.5 มลลลตร ผสมใหเขากนแลววางไวทอณหภมหองเปนเวลา 15 นาท จากนนเตม 50% ฟอลนซโอแคลตรเอเจนต ปรมาตร 0.25 มลลลตร ลงในหลอดทดลองดงกลาว ผสมใหเขากนแลววางไวทอณหภมหองเปนเวลา 30 นาท แลวน าไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 750 นาโนเมตรเมตร น าคาการดดกลนแสงทวดไดไปค านวณหาปรมาณโปรตนมหนวยเปน มลลกรม ตอ 1 กรมน าหนกสด (mg/g fresh weight) โดยใชสตรค านวณดงน

21

ปรมาณโปรตน (mg/ g fresh weight) = 50y เมอ y คอ คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 750 นาโนเมตร

กจกรรมของเอนไซม 1 หนวย (unit) มคาเทากบปรมาณเอนไซมทสามารถเรงปฏกรยา การเปลยนสารตงตนใหเปนผลตภณฑ โดยท าใหมคาดดกลนแสงเพมขน 0.01 หนวยตอนาท ภายใตสภาวะทก าหนด การวเคราะหปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมดของเปลอกผล น าเปลอกผลล าไยมาวเคราะหปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมด ดดแปลงจากวธการของ Singleton and Rossi (1965) ม 2 ขนตอนดงน 1. การสกดสารประกอบฟนอลทงหมด ท าการสกดสารประกอบฟนอลทงหมดภายใตอณหภม 4 องศาเซลเซยสโดยน าตวอยางเนอเยอเปลอกผลล าไยทหนละเอยดหนก 2 กรม บดสกดดวย 80% เอทานอล ปรมาตร 20 มลลลตรจากนนน าสารผสมทไดจากการบดไปเหวยงตกตะกอนดวยความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท น าเฉพาะสวนของเหลวใส (supernatant) ซงเปนสารสกดหยาบ (crude extract) ไปใชวเคราะหปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมดตอไป 2. การวเคราะหปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมด

น าสารสกดหยาบทไดปรมาตร 0.4 มลลลตรใสลงในหลอดทดลองทมสารละลาย 10% ฟอลนซโอแคลตรเอเจนต ปรมาตร 2 มลลลตร วางไวทอณหภมหองนาน 8 นาท จากนนเตม 7.5% โซเดยมคารบอเนต ปรมาตร 1.6 มลลลตร ลงในหลอดทดลองผสมใหเขากน วางไวทอณหภมหองนาน 2 ชวโมง แลวน าสารละลายผสมทไดนไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 765 นาโนเมตรเมตร น าคาการดดกลนแสงทวดไดไปค านวณหาปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมด มหนวยเปน มลลกรม ตอ 100 กรมน าหนกสด (mg/100 g fresh weight) โดยใชสตรค านวณดงน

ปรมาณสารประกอบฟนอลทงหมด (mg/100 g fresh weight) = 1,000y เมอ y คอ คาการดดกลนแสงทความยาวคลน 765 นาโนเมตร

22

การวเคราะหคณภาพผล 1. การเกดโรคของผล ดดแปลงจากวธการของ Thavong et al. (2010)

โดยพจารณาจากการปรากฏใหเหนของเชอราทผลล าไยทกผลในแตละชดการทดลอง ประเมนดวยการใหคะแนนตามระดบอาการทปรากฏ โดยแบงเปนระดบคะแนนตางๆ ดงน

คะแนน 0 = ไมเกดโรคเลย คะแนน 1 = เกดโรคประมาณ 1-10 เปอรเซนตของทงผล คะแนน 2 = เกดโรคประมาณ 11-30 เปอรเซนตของทงผล คะแนน 3 = เกดโรคประมาณ 31-70 เปอรเซนตของทงผล คะแนน 4 = เกดโรคประมาณ 71-100 เปอรเซนตของทงผล ดชนการเกดโรค = ผลรวมระดบคะแนนของแตละผล จ านวนผลทงหมด

2. การสญเสยน าหนกผล ดดแปลงจากวธการของ Chitbanchong et al. (2009) น าผลมาท าการชงน าหนกผลแตละผลทกๆ วน จนครบ 7 วน บนทกน าหนกผล แลวน ามาค านวณหาเปอรเซนตการสญเสยน าหนกผล 3. ปรมาณของแขงทงหมดทละลายน าไดของเนอผล (total soluble solid, TSS) น าน าคนเนอผลมาวดปรมาณของแขงทงหมดทละลายน าได โดยใชเครองวดปรมาณของแขงทงหมดทละลายน าได คาทไดมหนวยเปนองศาบรกซ (°Brix) 4. การยอมรบคณภาพผลของผบรโภค ดดแปลงจากวธการของ Apai (2010)

ใชผประเมนจ านวน 5 คน ท าการประเมนการยอมรบของผบรโภคตอคณภาพของผลล าไยในดาน สเปลอกผล, สเนอผล กลนและรสชาตเนอผล รวมทงการยอมรบคณภาพโดยรวมของผลล าไย โดยใชเกณฑการใหคะแนนเปนแบบ 9-point hedonic scale บนทกเปนคะแนนความชอบดงน ระดบคะแนน คณภาพการยอมรบของผบรโภค 9 ชอบมากทสด 8 ชอบมาก 7 ชอบปานกลาง 6 ชอบเลกนอย

23

5 เฉยๆ 4 ไมชอบเลกนอย 3 ไมชอบปานกลาง 2 ไมชอบมาก 1 ไมชอบมากทสด

โดยคะแนนการยอมรบของผบรโภคต ากวา 5 ถอวาไมเปนทยอมรบของผบรโภค การทดลองท 2 ศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพในการลดการเกดสน าตาลของเปลอกผลล าไยพนธดอระหวางการรมผลดวยกาซคลอรนไดออกไซดและการรมผลดวยกาซซลเฟอรไดออกไซด ในระหวางการเกบรกษาทอณหภมหอง

น าผลล าไยทเตรยมไวมารมดวยกาซคลอรนไดออกไซดและกาซซลเฟอรไดออกไซดซงสามารถแบงออกเปน 3 ชดการทดลองดงน

ชดการทดลองท 1 ไมผานการรมกาซใดๆ (ชดควบคม) ชดการทดลองท 2 รมดวยกาซคลอรนไดออกไซดความเขมขน 10 มลลกรม/ลตร ซงเปน

ระดบความเขมขนทดทสดทไดจากการทดลองท 1 เปนเวลา 10 นาท ชดการทดลองท 3 รมดวยกาซซลเฟอรไดออกไซดความเขมขน 12,000 มลลกรม/ลตร ซง

เปนระดบความเขมขนทซงชง (2535) และสถาบนอาหาร (2541) แนะน าไว เปนเวลา 60 นาท ภายหลงการรมน าผลมาผงทอณหภมหองเปนเวลา 30 นาท เพอใหกาซระเหยออกจนหมด

บรรจผลลงในกลองกระดาษและเกบรกษาท 25 องศาเซลเซยส ความชนสมพทธ 85±5% เปนเวลา 7 วน ในวนท 0 (วดผลทนทภายหลงการรมกาซเรยบรอยแลว), 1, 2, 3, 4, 5, 6 และ 7 สมผลมาวเคราะหการเปลยนแปลงทางชวเคมเชนเดยวกบการทดลองท 1 ทงนในแตละชดการทดลอง ทดลอง 3 ซ าๆ ละ 10 ผล ใชผลรวมทงหมด 240 ผล การประเมนวเคราะหผลการทดลอง

ท าการวเคราะหขอมลทางสถตของแตละการทดลองโดยใชโปรแกรมส าเรจรป SPSS (statistical packages for the social science) โดยวเคราะหความแปรปรวน (analysis of variance, ANOVA) และเปรยบเทยบคาเฉลยดวย LSD (least significant difference) ทระดบความเชอมน 95%

24

สถานทด าเนนการทดลอง หองปฏบตการเทคโนโลยหลงการเกบเกยวและสรรวทยาของพช ภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม ระยะเวลาในการด าเนนการทดลอง ตงแตเดอน มถนายน 2554 ถง เดอน พฤษภาคม 2555