บทท 1

บทนา

การตรวจพสจนพยานหลกฐานทางชวภาพในงานนตวทยาศาสตรนน นอกจากประเดนสาคญในการตรวจเพอทราบวาหลกฐานทางชวภาพทสงสยนนคออะไร เชน เปนเลอดหรอไม หรอเปนเสนขนหรอไม และพยานหลกฐานนนเปนของมนษยหรอสตว ถาเปนของมนษยจงทาการตรวจพสจนเพอยนยนเอกลกษณบคคลวาเปนของผใดตอไป แตในกรณทตรวจพบวาเปนชววตถของสตวนน ในบางกรณอาจถกลดความสาคญของวตถพยานชนนนลงหรออาจตดความสาคญของวตถพยานนนออกไปเลยกเปนได แตอยางไรกตามในบางคดทมสตวเขาไปเกยวของ เชน ถกสตวทาราย หรอกรณทมการกลาวอางของผตองสงสยวาเลอดทตดตามเสอผาตนนนเปนเลอดของสตว เปนตน ดงนการตรวจพสจนเพอระบชนดของสตวจงมความจาเปนอยางมากในการสบสวนสอบสวนของเจาหนาทตารวจ ทงการตรวจเพอระบชนดของสตวนยงสามารถปรบใชกบการตรวจอาหารวามการปลอมปนหรอไม โดยในปจจบนการตรวจดเอนเอนนเปนสงสาคญอยางยงในการตรวจเพอพสจนเอกลกษณ ทงนหากตองการระบชนดของสตวใหไดผลทแนนอน ควรวเคราะหจากสวนของดเอนเอทมความจาเพาะตอสตวชนดนนๆ โดยตาแหนงของดเอนเอทเปนเอกลกษณของสตวแตละชนดนน เปนสวนดเอนเอทอยบนยนไซโตโครมบ (Cytochrome b) ซงพบไดในไมโตคอนเดรยอนเปนสวนประกอบภายในเซลลททาหนาทใหพลงงานแกเซลล สวนของดเอนเอบนยนไซโตโครมบนเปนสวนดเอนเอทมขนาดเลกคอ ประมาณ 1140 เบสและสามารถพบไดทวไปในสตวทกชนดแตมความพเศษตรงทรหสของดเอนเอบรเวณนจะสรางโปรตนทมความจาเพาะสาหรบสตวในแตละชนด จงมความเหมาะสมทจะนามาใชวเคราะหเพอระบชนดของสตว สารพนธกรรม หรอ ดเอนเอ (Deoxyribonucleic Acid: DNA) เปนกรดนวคลอก (Nucleic

Acid) ททาหนาทเกบขอมลทางพนธกรรมของสงมชวต ดเอนเอสวนใหญอยในรปโครโมโซม (Chromosome) วางตวอยในสวนนวเคลยสภายในเซลลของสงมชวต ดเอนเอประกอบดวยหนวยยอยทเรยกวา นวคลโอไทด (Nucleotide) ซงเปนสารประกอบไนโตรจนสเบส (Nitrogenous

Base) แบงออกเปน 2 กลมคอ กลมพวรนเบส (Purine) ไดแก ไทมน (Thymine: T) ไซโทซน (Cytosine: C) และกลมไพรมดนเบส (Pyrimidine) ไดแก อะดนน (Adenine: A)

2  

กวนน (Guanine: G) โดยสารประกอบไนโตรจนสเบสนจะรวมตวกบนาตาลดออกซไรโบส (Deoxyribose Sugar) และกรดฟอสฟอรก (Phosphoric Acid) เปนนวคลโอไทดอยในดเอนเอ การเรยงลาดบของนวคลโอไทด ทง 4 ชนด สงผลตอการเกดความหลากหลาย และสรางความแตกตางในลาดบเบสบนสายดเอนเอ ซงจะมความจาเพาะในสงมชวตแตละชนด ดเอนเอไมโตคอนเดรย (Mitochondrial DNA หรอ mtDNA) เปนดเอนเอทอยในโครงสรางทเรยกวา ไมโตคอนเดรย (Mitochondrial) ซงเปนออรแกเนลลททาหนาทในการหายใจ และเปนแหลงพลงงานของเซลล โดยทาหนาทเปลยนพลงงานจากอาหารใหอยในรปทเซลลสามารถนาไปใชภายในเซลลได พบในเซลลของสงมชวตจาพวกยคารโอตค (Eukariotic) ทงพชและสตว โดยไมโตคอนเดรยมดเอนเอของตวเอง มการจาลองโมเลกลดเอนเอและสงเคราะหโปรตนไดเอง จโนมในไมโตคอนเดรยของสตวมขนาดคอนขางเลก ประมาณ 16-20 กโลเบส เชนของคนม 16,569 คเบส พชม 40-2,500 กโลเบส ซงมขนาดคอนขางใหญและมความแตกตางกนมาก จานวนไมโตคอนเดรยในเซลลจะมปรมาณแตกตางกนขนกบชนดและกจกรรมของเซลล โดยแตละเซลลอาจมจานวนไมโตคอนเดรยตงแตหลายรอยจนถงจานวนเปนหลกพน และในไมโตคอนเดรยแตละอนจะมดเอนเอ 5-10 โมเลกล รวมจานวนดเอนเอของไมโตคอนเดรยอาจมหลายพนโมเลกลตอเซลล คดเปนประมาณ 1 เปอรเซนตของดเอนเอทงหมดในเซลล [6] ทงนดเอนเอไมโตคอนเดรยมทมาจากการสบทอดจากบรรพบรษ ซงปกตแลวอาศยกฎของเมนเดล คอมาจากพอและแม แตเนองจากเปนดเอนเอทอยในสวนของไมโตคอนเดรยในไซโตพลาซม เซลลสบพนธของพอซงอยในรปของอสจนนเอาเฉพาะสวนหวของอสจซงมนวเคลยสอยเขาไปผสมกบไขของเพศแม แตสลดเอาสวนทเหลอซงมไมโตคอนเดรยอยเปนจานวนมากออกไป ดงนน เซลลของลกทไดจงมแตไมโตคอนเดรยทไดจากแมเทานน การถายทอดจากบรรพบรษสลกหลานจงไมเปนไปตามกฎของเมนเดล (Non-Mendelian Inheritance) แตเปนการถายทอดลกษณะจากเพศแมเทานน(Maternal

Inheritance) [1] ไซโตโครม บ (Cytochrome b) เปนหนงในไซโตโครม (Cytochromes) ทเกยวของกบการขนสงอเลกตรอนในโซการหายใจของไมโตคอนเดรย โดยไซโตโครมมหลายชนดใชตวอกษรเปนชอชนดของไซโตโครม เชน ไซโตโครมเอ ไซโตโครมบ หรอไซโตโครมซ เปนตน ไซโตโครมจะรบและสงอเลกตรอนจากไซโตโครมหนงไปยงอกไซโตโครมหนงจนถงออกซเจนเปนตวรบอเลกตรอนตวสดทายและไมสงตออเลกตรอนใหแกสารตวใด ออกซเจนทไดรบอเลกตรอนจะรวมกบโปรตอนทมอยในสารละลายภายในไมโตคอนเดรย กลายเปนนา ดเอนเอทอยในสวนของยนไซโตโครมบเปนสวนดเอนเอทมขนาดเลกและพบอยในสตวทกชนด แตมการสรางโปรตนทมความจาเพาะสาหรบสตวแตละชนด จงมการนาเอาดเอนเอในสวนของยน ไซโตโครม บ มาใชใน

3  

การตรวจสอบเพอระบชนดในสตว(Species Identification) เนองจากลาดบเบสของยนไซโตโครมบของสตวจะคอนขางอนรกษ จงสามารถออกแบบไพรเมอร(Primer)สาหรบเพมปรมาณดเอนเอสวนดงกลาวดวยวธ PCR ซงมรายงานการเพมปรมาณสวนของยนไซโตโครมบในสตวไดถง 221 ชนด เมอนาสวนทเพมปรมาณไดมาหาลาดบเบส จะมลาดบเบสทแตกตางกนไปตามชนด (Species Specific) [6]

ดวยเหตน จงไดมการนาประโยชนจากดเอนเอบนยนไซโตโครมบในไมโตคอนเดรยมาประยกตใชในการระบชนดของสตว หรอแมแตการระบวาเปนมนษย โดยดเอนเอในไมโตคอนเดรยยงสามารถใชไดดในกรณของตวอยางทมอายยาวนาน เชน ผม หรอ ขน โบราณวตถ ซงมกจะไมมดเอนเอในนวเคลยสเหลอเพยงพอทจะตรวจสอบได แตทงนการระบสารพนธกรรมดวยการวเคราะหยนไซโตโครมบในไมโตคอนเดรยสามารถใชกบการระบคณลกษณะทวไป หรอการระบกลมชน(Class Characteristics)ของสงมชวตเทานน กลาวคอ ใชระบชนดหรอประเภทของสงมชวต หรอ ของสงนนๆ เชน เปนไก หรอเปนมนษย เปนตน แตไมสามารถระบถงคณลกษณะเฉพาะ(Individual Characteristics) ซงบงบอกถงความเปนเอกลกษณ (Identity) ของสงๆนนไดวาไมใชสงอนแตเปนสงนนสงเดยวอนเดยว ดงนเพอประโยชนซงมงถงการตรวจวเคราะหในการนาไประบชนดของสตว เชน เปนสกรหรอไม ไมไดมงหาคาตอบวาเปนสกรตวนหรอไมนน การตรวจวเคราะหจากดเอนเอบนไซโตโครมบในไมโตคอนเดรยจงเปนการเพยงพอแลว การระบสารพนธกรรมหรอดเอนเอของสตวดวยยนไซโตโครมบในไมโตคอนเดรย สามารถนาไปปรบใชในทางนตวทยาศาสตรกรณทมขอพพาททางกฎหมายเกดขนในคดทเกยวของกบสตว เชน กรณพพาทเกยวกบอาหารทประกอบขนจากเนอสตว กรณทมการกลาวอางวาเลอดทพบในทเกดเหตเปนของสตว และในกรณทมการลกลอบลาสตวปา เปนตน ซงกรณตางๆทกลาวมานลวนจาเปนตองมหลกฐานยนยนในการกระทาความผด โดยเฉพาะวตถพยานนนเปนเพยงเศษชนสวนใดชนสวนหนงทไมสามารถระบชนดของสตวนนไดดวยวธทางกายภาพหรอดวยวธการทางชวเคม เชน เศษชนเนอ เศษผวหนง เศษกระดก เปนตน ปญหาสาคญของการตรวจพสจนเอกลกษณจากวตถพยานทางชวภาพอยางหนง คอ ตวอยางทไดมามกจะอยในสภาวะทกาหนดไมได บางครงอาจมปรมาณเพยงเลกนอย บางครงอาจมสงเจอปนหรอมาจากคนหลายคนปนกนอย บางครงอยในสภาพทเสอมสลายอยางมาก ทาใหตวอยางมปรมาณดเอนเอนอยหรออาจมสภาพทไมสมบรณ ดงนนจงตองนาตวอยางมาเพมปรมาณดเอนเอดวยเทคนค Polymerase Chain Reaction (PCR) เทคนคนสามารถเพมขยายดเอนเอใหมจานวนมากขนกวาเดมหลายลานเทา โดยการเพมปรมาณยนทสนใจในหลอดทดลอง จงเรยกอกชอหนงวา In vitro enzymatic gene amplification วธนมประโยชนในการตรวจหาชนสวนหรอเพม

4  

ชนสวนดเอนเอทตองการในสงสงตรวจ คนพบครงแรกโดย Kary Mullis และคณะ ในป 1983 โดยใชหลกการเลยนแบบธรรมชาตทวาโดยอาศยดเอนเอตนแบบเปนจดเรมตน และมเอนไซมพวก DNA polymerase ชวยทาใหสายดเอนเยาวออกไปโดยเลอกจบเอา นวคลโอไทดตวใดตวหนงใน 4 ชนด dATP, dGTP, dCTP ,dTTP เขามาตอเปนเบสคสมกบดเอนเอสายตนแบบ (template) สวนประกอบตางๆ ในการเพมปรมาณดเอนเอมดงนคอ ดเอนเอตนแบบ (template DNA), thermostable DNA polymerase, deoxynucleotice , triphosphate (dNTPs) ทง 4 ชนด , Oligonuclotide primer อยางนอย 1 ค และบพเฟอรทเหมาะสม ปรมาณดเอนเอจะเพมมากขนไดตองอาศยปฏกรยาทตอเนองหลายๆรอบ ซงแตละรอบจะประกอบดวย 3 ขนตอน คอ

1. ขนตอน denaturation 2. ขนตอน Primer annealing

3. ขนตอน Primer extension

ในกระบวนการ PCR ดเอนเอไพรเมอร 2 เสนจะจบกบเสนดเอนเอตนแบบในตาแหนงทหางจากกน ถงบรเวณหวและทายของชวงดเอนเอทตองการจะสรางขนใหม ไพรเมอรไฮบรไดซเขากบสายตรงขาม และเกดการสงเคราะหดเอนเอจากไพรเมอร ทาใหเตมชองวางระหวางไพรเมอรใหเตมบรเวณทอยระหวางไพรเมอรทงสองจะเพมเปนสองเทาในแตละรอบของการสงเคราะหดเอนเอ หลอดปฏกรยาจะถกปรบเปลยนอณหภมในเครองปรบเปลยนอณหภม (Thermal Cycler) ในการสงเคราะห 10 รอบ ดเอนเอจะถกขยาย 210 = 1024 เทา 20 รอบประมาณลานเทา และ 30 รอบประมาณพนลานเทา ในทางทฤษฎ ดเอนเอทปรมาณเปนนาโนแกรมสามารถขยายใหดเอนเอเปนกรมไดโดยการใช PCR 30 รอบ ดวยกระบวนการอตโนมต จงทาใหปรมาณดเอนเอเพมขนในเวลาไมกชวโมง PCR มประโยชนอยางมากในการทาสาเนาพนธกรรมหรอการโคลนนงดเอนเอเพราะทาการเพมจานวนยนกอนทจะโคลนนง PCR ทาใหไดลาดบเบสดเอนเอจาเพาะปรมาณมากทจะใชเปนตนแบบ PCR สามารถถกใชเพอเพมจานวนดเอนเอแมมอยในตวอยางในปรมาณเพยงเลกนอย PCR สามารถประยกตใชตรวจไมโครแซทเทลไลทดเอนเอซงใชระบเอกลกษณบคคลและพสจนความสมพนธทางสายเลอดซงสามารถตรวจไดจากตวอยางดเอนเอแมมปรมาณเพยงเลกนอย [11] วตถประสงคของการศกษา เพอศกษาและทดสอบวธการทมความจาเพาะเจาะจงในการระบสารพนธกรรมของสกรดวยการวเคราะหจากยนไซโตโครมบในไมโตคอนเดรย

5  

สมมตฐานของการศกษา หลงจากทาการศกษาจะไดวธการทมความจาเพาะเจาะจงและมประสทธภาพสาหรบการ

ระบสารพนธกรรมของสกรดวยการวเคราะหยนไซโตโครมบในไมโตคอนเดรย

ขอบเขตการวจย ขอบเขตประชากร - ตวอยางดเอนเอของของสกรทเลยงและจาหนายเพอการบรโภคโดยทวไปในเขต

ภาคเหนอตอนบนของประเทศไทยจานวน 70 ตวอยาง - ตวอยางดเอนเอของมนษย ไก วว และปลา จานวนชนดละ 18 ตวอยาง ขอบเขตการทดลอง

งานวจยนเปนการตรวจพสจนทราบดเอนเอของสกรทเลยงและจาหนายเพอการบรโภคโดยทวไปในเขตภาคเหนอตอนบนของประเทศไทย จงทาการออกแบบไพรเมอรตอลาดบดเอนเอของยนไซโตโครมบในไมโตคอนเดรยของสกรและศกษาผลจากการตรวจพสจนความจาเพาะของดเอนเอดวยการวเคราะหยนไซโตโครมบในไมโตคอนเดรย จากนนทาการสมเกบตวอยางสกรโดยเกบตวอยางเนอสกรจากรานคาเนอสกรจากตลาดสดทงในตวอาเภอเมองจงหวดเชยงใหมและอาเภอใกลเคยง รวมถงจงหวดลาพน นามาสกดดเอนเอจากชนเนอ แลวจงทาการเพมปรมาณดเอนเอโดยใชเทคนค PCR (Polymerase Chain Reaction) ตรวจสอบผลการเพมปรมาณดเอนเอดวย agarose gel electrophoresis โดยทาการตรวจสอบทงหมดจานวน 3 ครง กอนทาการตรวจสอบความจาเพาะของไพรเมอรทใชโดยทาการตรวจเปรยบเทยบกบดเอนเอของมนษยและดเอนเอของสตวชนดอนไดแก ไก วว ปลา เปนตน อยางละ 18 ตวอยางดวยวธการเดยวกนน นยามศพทเฉพาะ Cytochrome b Gene หมายถง ยนทอยในโครงสรางของเซลลทเรยกวา ไมโตคอนเดรย ทาหนาทเกยวกบหวงโซการหายใจภายในเซลล Polymerase Chain Reaction (PCR) หมายถง เทคนคทใชเพมปรมาณดเอนเอโดยอาศยหลกการสงเคราะหสายดเอนเอสายใหม (DNA replication) จากดเอนเอตนแบบในหลอดทดลองภายในระยะเวลาอนสนและไดดเอนเอสายใหมเกดขนเปนลานเทา

6  

Agarose gel electrophoresis หมายถง เทคนคทใชแยกสาร วเคราะห และเตรยมสารทมประจไฟฟา เชน กรดอะมโน โปรตน และ กรดนวคลอกใหบรสทธบนวนอะกาโรส โดยอาศยหลกการทวา เมอใหสนามไฟฟา สารทมประจไฟฟาจะเคลอนทไปยงขวทตรงขามกนดวย อตราเรวในการเคลอนท ซงขนกบปรมาณประจสทธบนโมเลกลของสาร รปรางและขนาดของโมเลกลของสารนน Base pair (bp) หมายถง คเบส เปนการจบคเบส A กบ T และ G กบ C ในดเอนเอเกลยวค การจบคอาจเกดขนไดในอารเอนเอในบางสถานการณ ประโยชนทจะไดรบจากการศกษา เชงทฤษฎและหรอเชงประยกต ทราบถงประสทธภาพของการตรวจเพอระบสารพนธกรรมของสกรดวยการวเคราะหยนไซโตโครมบในไมโตคอนเดรย เพอการนาไปประยกตใชในกรณตางๆเชน การนาไปตรวจสอบอาหารเพอประโยชนและสทธของผบรโภคตามกฎหมายคมครองผบรโภค ซงในปจจบนไดมการนาเอาเทคโนโลยการตรวจดเอนเอมาใชในการตรวจพสจนอาหาร ดงเชน การตรวจพสจนวาอาหารหรอผลตภณฑใดทมการผลตและจาหนายโดยมการแสดงฉลากไมถกตอง หรอการตรวจวเคราะหเพอพสจนวาเปนอาหารทมฉลากเพอลวงหรอพยายามลวงผอนใหเขาใจผดในเรองคณภาพหรอลกษณะพเศษอยางอน ตามทบญญตไวในพระราชบญญตคมครองผบรโภคและพระราชบญญตอาหาร เชนการตรวจผลตภณฑอาหารทระบบนฉลากวาเปนอาหารเจ หรอ ผลตภณฑทมตราฮาลาล จนถงกรณทผบรโภคเกดอาการแพจากการรบประทานอาหารทมการรบรองฉลากไมถกตอง เปนตน นอกจากนยงสามารถนาไปประยกตใชกบการสบสวนสอบสวนในทางคด เชน การพสจนวตถพยานในกรณทมชววตถเปอนหรอตดมากบวตถพยานใดๆ แลวตองการทราบวาเปนชววตถของสกรหรอไม เพอมดตวผตองสงสยหรอเพอประโยชนในการสบสวนสอบสวนหากมการกลาวอางของตวผตองสงสย ทงนยงเปนประโยชนในการเชอมโยงรปคดเพอชวยในการคลคลายคดใหงายขน และการนาไปประยกตใชในการตรวจสอบสายพนธของสตวปาทถกลกลอบทาลายในกรณทมการดาเนนคดทางกฎหมายเกยวกบปญหาการลกลอบทาลายสตวปา หรอการลกลอบสงออก หรอนาเขาสตวปาคมครอง เปนตน