A laboratórium lehetőségei a thrombotikus és prethrombotikus

állapotok diagnosztikájában

Katona Éva

DE OEC, Klinikai Kutató Központ

Epidemiológia:

CAD> stroke> VTE

A puerperium és a

postoperativ halálozásban

vezető szerep

Diagnosztika:

Az elmúlt évtizedben jelentősen megváltozott:

1. Szemléletváltás: MVT=PE VTE

2. Új non-invazív dg. lehetőségek: kompressziós UH és D-dimer

A PE betegek 79%-ának van kimutatható MVT-a

A DVT-s betegek 50% PE

USA, Minnesota, inception cohort of patients study: 1:1000

300,000 haláleset acut PE miatt / év / USA

Tapson VF. N Engl J Med 2008: 358: 1037-52.

A vénás thromboembolia rizikó tényezői

Öröklött faktorok

Antitrombin deficienciaProtein C deficienciaProtein S deficienciaFaktor V LeidenAPC rezisztenciaProtrombin gén mutációDiszfibrinogenémiaPlazminogén deficiencia

Szerzett faktorok

Csökkent mobilitásElőrehaladott korTumorAkut betegségNagyobb műtétTraumaGerincagy sérülésTerhesség és postpartumPolycythemia veraAntifoszfolipid szindrómaOrális fogamzásgátlókHormonpótló terápiaHeparinokKemoterápiaElhízásCentrális véna katéterimmobilizálás

Feltételezett faktorok

Emelkedett lipoprotein (a) (?)Csökkent TFPI szint

(szöveti faktor útvonal inhibítor )Emelkedett homocystein,

faktor VIII, IX, XIfibrinogénTAFI

Tematika

1. Thrombosisok pathobiokémiája, pretrombotikus, trombotikus állapotok kimutatásának laboratóriumi lehetőségei

2. A VTE diagnosztikájának mai szemlélete,a laboratóriumi vizsgálatok helye, szerepe a diagnosztikában

Az alvadás intravascularis aktivációjának következményei

1/ Lokális: Thrombosis, thromboembolia

2/ Generalizált:Disszeminált intravasculáris coagulatio (DIC)

FPA, FPB

D-Dimer

Protrombin fragment 1+2+ ATIII

XIIXIIa

XIXIaCa2+

IX

VIII

IXaCa2+

PLTF

VIIaCa2+

VII+

TF, Ca2+

X

V

XaCa2+

PL

Protrombin Trombin

Fibrinogén Fibrin

Fibrin(kereszt-kötött)

XIIIaCa2+

XIII

Ca2+

Intrinsic út

Extrinsic út

Közös út

A véralvadás intravasculáris aktivációját jelző paraméterek

Direkt markerek1/ Protrombin fragment 1 + 22/ Trombin-antitrombin (TAT) komplex3/ Fibrinopeptid A (FPA)4/ Szolubilis fibrinIndirekt markerFibrin degradációs produktum (FbDP)beleértve a D-dimer

A protrombin aktivációja

S-S

Fragment 1+2 B lánc A lánc

Trombin

S-S

PretrombinFragment 1+2

Meizotrombin

S-S

A lánc

S-S

Protrombin

FXa hasítási hely

Protrombin fragment 1+2 A protrombin <1%-a aktiválódik trombinná, a keletkező trombin gyorsan neutralizálódik (AT-III).

A mintavétel kritikus, ajánlatos heparin, vagy trombin gátló (PPACK= Phe-Arg-Pro-klorometilketon).

Szendvics ELISA Dade-Behring Enzygnost F1+2

(Pelzer, Thromb Haemost, 1991)

Poliklonális kötő (elfogó) antitest: a fragment 1+2 C-terminális 14 aminosava ellen, mely az intakt protrombinnal nem reagál.

Poliklonális jelző antitest: protrombin ellenes, peroxidázzal jelzett.

Ref. tart.: 0,32-1,20 nmol/L

Alkalmazásai:• Acut MVT, DIC, AMI, stroke, diagnosztikája• Antikoaguláns terápia monitorozása • APC rezisztenciában, PS deficienciában,• ösztrogén terápia mellett, OAC szedésekor

az alvadás aktivációjának követésére

(Thromb Res 1995, Br J Haematol 1991, Thromb Haemost 1993, Blood 1992)

Probléma: Relative bonyolult, időigényes, költségesGyors diagnosztikára nem alkalmas.

Trombin-antitrombin komplex (TAT) meghatározása

Trombin képződés esetén irreverzibilis TAT komplex keletkezik.

Szendvics ELISA (Dade-Behring)

Kötő antitest: trombin ellenes

Jelző antitest: antitrombin ellenes.Plazma minta -30 C-on tárolható.

Jellemzők:Jól reprodukálható teszt, időigényes, drága.VTE: kiváló szenzitivitás és specificitás

Fibrinogén-fibrin átalakulás

Fibrinogén

Fibrin monomer + 2FPA, +2FPB

Fibrin polimer

Keresztkötött fibrin

Trombin

FXIIIa

Fibrinopeptid A• 16 aminosav, a trombin hasítja le a fibrinogén A lánc N-terminális végéről.• Félélétideje a keringésben nagyon rövid, 3-5 perc. • A vérben nagyon kis koncentrációban (1,3 nmol/L)• A megfelelő antikoaguláció rendkívül fontos (PPACK vagy heparin-aprotinin).

Az FPA ellenes antitest keresztreagál a fibrinogénnel, amit bentonit abszopcióval előzetesen el kell távolítani.

A meghatározás RIA-val történik.ELISA létezik, de forgalmazása megszünt.

Szolubilis fibrin (monomer)A fibrin monomerek, oligomerek fibrinogénnel komplexet képeznek és ha a koncentrációjuk alacsony, oldatban maradnak.

Solubilis fibrin kimutatására szolgáló eljárások:1/ Szemikvantitatív agglutinációs teszt,2/ tPA-t aktiváló hatás mérése kromogén szubsztráttal,3/ Szendvics ELISA (elfogó antitest: fibrin specifikus

monoklonális antitest)

Szignifikánsan emelkedett VTE, DIC (Bos, TH, 1998)

Szemikvantitatív agglutinációs tesztszolubilis fibrin kimutatására

0, Rh- vvt.-k felületére fibrin monomereket kötnek.

1/ A liofilizált vvt.-ket feloldjuk és hozzámérjük a csőben előinkubált vizsgálandó plazmához.

2/ 10 perc inkubáció 37 C-on.3/ A mintát üveglapra öntjük és 6 percig folyamatosan

keverjük.4/ Vizsgáljuk az agglutináció mértékét.Értékelés: - nincs aggregáció

+ kis aggregátumok ++ nagy aggregátumok +++ teljes összecsapzódás.Nagy koncentráció esetén már a csőben megtörténhet az összecsapzódás.

tPA aktivációs tesztszolubilis fibrin kimutatására

A fibrin potenciálja a tPA indukálta plazminogén aktivációt. Solubilis fibrin jelenlétében több plazmin keletkezik, amit kromogén szubsztráttal mérünk.

1/ Plazminogén aktiváció:

2/ A keletkezett plazmin spektrofotometriás mérése

A plazmin inhibitort antitesttel gátolják.

plazminogén plazmintPA + fibrin S

R-pNA R + pNAplazmin

Fibrinogén/fibrin degradációsproduktumok (FDP) kimutatása

1/ Mindkettő együttes kimutatása2/ Csak fibrin degradációs termékek

(FbDP, D-dimer) kimutatása3/ Csak fibrinogén degradációs

termékek (FgDP) kimutatása

Alalcsony cc miatt csak immunológiai módszerek alkalmazhatók. Modern módszerek a kimutatást plazmából végzik, fibrinogénnel nincs kereszt-reakció (mAb).

A fibrin hasítása plazminnal

Y/DXX/DX/YY/D

A D-Dimer meghatározás indikációja

A fibrinolitikus rendszer aktiválódásának/működésének kimutatása. Minden olyan esetben, amikor a véralvadási rendszer aktivációja feltételezhető.

Fibrinolízissel járó állapotok, mint:DIC (disszeminált intravaszkuláris koaguláció)DVT (mélyvénás trombózis) kizárásaPE (pulmonáris embólia) kizárásatrauma, műtét utánbizonyos malignus (szolid) monitorozásaterhességi komplikációk megelőzése

D-dimer méréseD-dimer specifikus monoklonális antitestek segítségével (X fragment oligomereket is detektál)

a. Szemikvantitatív latex agglutináció(nem elég szenzitív)

b. ELISAés egyéb heterogén immunoassayk

c. Nefelometriás, turbidimetriás mikrolatex assay

D-dimer kvantitatívturbidimetriás mérése

Plazma minta + puffer+

Mikrolatex partikulák felületéhez kötött két D-dimer specifikus monoklonális antitest

Latex agglutináció

A turbiditás változás követése 540 nm-en

Kvantitatív D-dimer assay

Szenzitivitás megfelelőbb

A VTE diagnosztikában játszott szerepe még mindig nem egyértelmű

A különböző tesztekkel kapott eredmények összehasonlítása meglehetősen nehéz, a cut-offértékek különböznek. Oka: - különböző mAb-t alkalmaznak, melyek más-más

hosszúságú D-dimer tartalmú fragmenteket ismernek fel

- a kalibrátorok eltérőek

Stein et al. Ann Intern Med, 2004108 tanulmány metaanalízise:

Objektív vizsgálómódszerekkel igazolt VTEMVT prevalencia: 20-78%, PE prevalencia: 8-62%

Szenzitivitás:ELISA>kvantitatív LA >szemi kvant. LA

Specificitás:Kvantitatív LA >szemi kvant. LA >ELISA

A VTE-t nagy biztonsággal kizárják, azonban a dgmegerősítéséhez nem járulnak hozzá nagy mértékben.

Cut off 500 ng/mL-nél optimális.

Bounameaux és PerrierX.ETRO Advanced TeachingCourse on Thrombosis, Belgium, 2003

Cut off: 500 ng/mL-nél legjobb a szenzitivitás

Specifcitás: bár a D-dimer igen specifikus a fibrinkeletkezésére, a fibrin jelenlétének specificitása a VTE-re igen rossz (tumorok, gyulladás, necrosis). Ezért az 500 ng/mL feletti D-dimer értékek pozitív prediktív értéke alacsony.

Az álpozitív eredmények aránya idős betegeknél, hospitalizáltaknál magasabb.

Tanulságok:A kvantitatív, magas szenzitivitású D-dimer assaykmegfelelőek a VTE kizárására alacsony vagy közepesenmagas klinikai valószínűség mellett, Idős és hospitalizált beteg, magas VTE klinikai valószínűség esetén azonban nem.

A prethrombotikus állapotok diagnosztikájában érzékenysége nem kielégítő.

Kvantitatív D-dimer tesztek a nemzetközi gyakorlatban ECAT

45 db kód

Abbott Axsym D-Dimer....Trinity/Sigma Auto D-Dimer

EXERCISE 2007-4Number of participants: 600Number of responders: 538 (89.7%)

1 qualitative10 semi-quantitative527 quantitative

(32 outliers/1054 sample, 3.04%)

D-Dimer sample 1

semi-quantitative: <0.25 (4), 0.25-0.50 (4), 0.51-1.0 (2)

D-Dimer sample 2

semi-quantitative: 0.25-0.50 (4), 0.51-1.0 (3), 1.01-2.0 (1), 2.01-4.0 (2)

Teszt N Mean (mg/L, FEU/L*)

DVT Excluded/Not Excl.

CV

Trinity/ Biopool Auto Dimer

108 0.562

0.9/99.1

10.3%

Dade-Behring D-dimer plus

32 0.210

23.4/76.6

45.6%

Hemosil D-Dimer 124 0.705

0.8/99.2

25.0%

Vidas

D-Dimer Exclusion

39 1.710*

100

9.5%

Stago Di Test 27 1.680*

100

11.2%

Stago Liatest 19 1.770*

100

7.6%

Kvantitatív D-dimer tesztek a nemzetközi gyakorlatban NEQAS

567 beküldő centrum, 511 kvantitatív D-dimert mér, 7.4% szemi-kv.

VTE diagnosztikája I.eszköztár

1. Gold standard: phlebographia, pulmonalis angiographia (invazív, veszélyes, költséges)

2. Klinikai valószínűség megállapítása score rendszer alapján

(hasznosak, de önmagukban nem jobbak mint egy tapasztalt klinikus benyomása)

MVT

PE

PE

Revised Geneva score

Age >65 yr — 1Previous DVT or PE — 3Surgery or lower limb fracture in previous wk — 2Active cancer — 2Unilateral lower limb pain — 3Hemoptysis — 2Heart rate

75–94 beats/min — 395 beats/min — 5

Pain on leg palpation or unilateral edema — 4

Clinical probability

Low 0 -3Intermediate 4 - 10High 11

VTE diagnosztikája I.eszköztár

3. D-dimer

4. Vénás kompressziós UH: szenzitivitás 97%,

specificitás 98% tünetekkel járó MVT-ben,

A PE esetek 50%-ában megtalálja a MVT-t.

5. Ventillációs/perfúziós tüdőszcintigráfia:

+ prediktív érték kb. 90%

6. Spirál CT: protokolltól függően 50-99%

specificitás és szenzitivitás

7. Echocardiographia

VTE diagnosztikája II.a dg lehetőségek megítélésének szempontjai

1. A módszer technikai megítélése

2. Dg standarddal történő összehasonlítás (cut offérték megállapítása, szenzitivitás, specificitásmegítélése)

3. Klinikai tanulmányokban való alkalmazhatóság,hosszú távú (legalább 3 hónap) követés a dg után, a késői események kizárása

4. költséghatékonyság

VTE diagnosztikája III.diagnosztikus stratégia MVT

Perrier et al. Lancet 1999.

VTE diagnosztikája III.diagnosztikus stratégia PE

Perrier et al. Ann Intern Med 2001, Gottlieb et al. AJR 2003

A D-dimer és a kompressziós UH haszna a PE kizárásában életkorok szerint

Bounameaux és PerrierX.ETRO Advanced Teaching Course on Thrombosis, Belgium, 2003

Tapson VF. N Engl J Med 2008: 358: 1037-52.

Köszönöm a figyelmet!