9. MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES DE LAS PROTEINAS

Vernica Gonzlez Nez Universidad de Salamanca

ESQUEMA. Modificaciones postraduccionales de las protenas1. Introduccin - Tipos de modificaciones postraduccionales en las protenas - Localizacin de las modificaciones postraduccionales - Funcin de las modificaciones postraduccionales 2. Modificaciones N- y C-terminales 3. Glicosilacin N-glicosilacin O-glicosilacin 4. Fosforilacin 5. Ubiquitinacin 6. Acilacin 7. Otras modificaciones postraduccionales

INTRODUCCIONSplicingalternativo Empleo depromotores alternativos Edicin delmRNA Sitios alternativos delinicio dela traduccin Sortear uncodon deSTOP

GenomaAprox.21000genesque codifican protenas

TranscriptomaAprox.105 transcritos

Modificaciones postraduccionales

ProteomaAprox.106 protenas

Las modificaciones postraduccionales

Modificacin postraduccional Modificaciones covalentes de la estructura de una protena Funcin: regular la funcionalidad localizacin celular interaccin con otras protenas >200 tipos: gran variabilidad presentes en el 80% de las protenas de eucariontes: alta frecuencia Secuencias consenso que determinan la existencia de una modificacin Prediccin bioinformtica

TIPOS DE MODIFICACIONES EN LAS PROTEINAS (I)Formacin de enlaces covalentes Puentes disulfuro entre Cys Unin de pequeas molculas fosforilacin grupos fosfato O- y N-glicosilacin monosacridos hidroxilacin grupos hidroxilo acilacin grupos acilo metilacin grupos metilo amidacin grupos amida Union de otras protenas: ubiquitinacin SUMOilacin

Tipos de modificaciones en las protenas (II)

Rotura de enlaces covalentes Proteolisis: escisin de un fragmento proteico y activacin de la protena Autoproteolisis Rotura de secuencias seal: peptidasas de la seal Proteolisis intramolecular neuropptidos hormonas (insulina) morfgenos (notch, shh) activacin de zimgenos cascada de coagulacin sangunea

Tipos de modificaciones en las protenas (III)Segn el aminocido modificado Extremo N-t: formilacin, acetilacin, acilacin, mistirilacin, glicosilacin Extremo C-t: metilacin, ADP-ribosilacin Arg: acetilacin, metilacin, ADP-ribosilacin Asn: N-glicosilacin, metilacin, desamidacin Asp: metilacin, hidroxilacin Cys: formacin de puentes disulfuro, de SelenoCys acilacin, prenilacin, unin de grupos prostticos (hemo) Glu: metilacin, carboxilacin, ADP-ribosilacin Gln: desamidacin

Tipos de modificaciones en las protenas (IV)

His: metilacin, fosforilacin, ADP-ribosilacin Lys: N-acetilacin, metilacin, oxidacin, hidroxilacin, ubiquitinacin Met: formacin de sulfxidos Phe: -hidroxilacin, O-glucosilacin Pro: hidroxilacin, O-glicosilacin Ser: fosforilacin, O-glicosilacin, acetilacin Thr: fosforilacin, O-glicosilacin, metilacin Trp: -hidroxilacin Tyr: fosforilacin, yodacin, adenilacin, sulfatacin, hidroxilacin

LOCALIZACION DE LAS MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES (I) Ncleo: acetilacin, fosforilacin (no exclusivas) Lisosoma: resto manosa-6P en protenas lisosomales Mitocondria: N-formilacin Aparato de Golgi: N- y O-glicosilacin, sulfatacin, palmitiolacin Retculo endoplasmtico (ER): N-glicosilacin, unin a fosfatidil-inositol Citosol: acetilacin, metilacin, fosforilacin Ribosoma: mistirilacin Membrana plasmtica: N- y O-glicosilacin, unin a fosfatidil-inositol Fluido extracelular: N- y O-glicosilacin, acetilacin, fosforilacin Matriz extracelular: N- y O-glicosilacin, fosforilacion, hidroxilacion, sulfatacin

Localizacin de las modificaciones postraduccionales (II)

H2N- M E P P T V T V S D

F S

M L K F P C D P I E T S W K Y Q K N L G D T W P F G L W S I G V E E D D M V V L T L S A L V V L E T C T Y C K T K K K W K V V A I H V S L A C V L Q F P I A I C I A I F I MV M V F I L V F S D H L P T V Y A T S V G F F V F A M N Y N M Y G W T P I V C I A L V F S C P A S L N P V S S L I W G L V G N T S I F T I I F A A V L V I T D A L A L L V L V V V L M L G Y C N T V C YM V A Y I Y I F V L V I N I S M M F G V V I L M I V L K D R D N R C L P R F A Y R L E T T F E T K A Y K N I R R T V K I S F T R F M K K C P A V R R R T L R V I R C L N E F H L R Q P V R A L D S G D N S K E K S F S K A HOOC- T P Q K I S E T K A C V S I P E R I V S R

S S E L K A V R G S S A V A I A V S I T A L Y

W N S L L G A P E E L F S S N H L F L P Y R E G G S

Una misma protena puede presentar mas de una modificacin postraduccional

FUNCION DE LAS MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES

Protein targetting Trfico intra intercelular. Por ejemplo, manosa-6P, ubiquitinacin

Estabilidad de la protena Sialo vs. asialoglicoprotenas, ubiquitinacin

Determinante clave para la actividad proteica Bolsillo de unin de receptores de membrana

Control de la actividad Fosforilacin / defosforilacin Proteolisis: activacin de caspasas, de factores de coagulacin Regulacin de la expresin gnica: acetilacin de histonas

IDENTIFICACION DE LAS MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES Secuencias consenso Prediccion bioinformtica Herramientas bioinformticas para predecir modificaciones postraduccionales Bases de datos & software: ExPASy the proteomic server, PFAM, SMART, ELM, UNI-PROT etc

Espectrometra de masas Especialmente en combinacin con 2D SDS-PAGE, digestiones y HPLC Incorporacin de grupos marcados radiactivamente, con Bpa, digoxigenina

Cross-reactividad con anticuerpos

MODIFICACIONES N- & C-TERMINALES (I)Eliminacin de la Met N-terminal muy comn MASRP + H2O M + ASRP

Eliminacin del pptido seal Por las enzimas peptidasas de la seal Gran utilidad en las predicciones bioinformticas del destino celular de una protena

Proinsulina humana MetAlaLeuTrpMetArgLeuLeuProLeuLeuAlaLeuLeuAlaLeuTrp GlyProAspProAlaAlaAla [ROTURADELPEPTIDOSEAL] PheVal

Modificaciones N- & C-terminales (II)

Acilacin N-terminal Acetilacin, formilacin (bacterias) o mistirilacin CH3-COOH + NH2-Prot CH3-CONH-Prot + H2O

Amidacin C-terminal Tras la proteolisis de la ltima Gly: muchos neuropptidos Prot-Gly-COOH + NH2-group Prot-CONH2 + Gly

GLICOSILACIONLa modificacin postraduccional ms importante y ms compleja Adicin de unidades glucdicas sobre cadenas laterales de Muy frecuente en protenas extracelulares de membrana plasmtica o secretadas Glucoprotenas: Pm de la cadena proteica > Pm de la parte glucdica vs. Proteoglucanos: Pm de la parte glucdica > Pm de la cadena proteica Monosacridos Glc, Gal, Man, NAcGlc, NAcGal, fucosa, acidos silicos Glicosil tansferasas Enzimas con alta especificidad de monosacrido estructura del aceptor sitio del enlace configuracin del enlace

Funciones de la GlicosilacinAumenta la solubilidad de la protena

Aumenta la vida media de las protenas secretadas proteccin contra proteasas y otras enzimas proteolticas Reconocimiento celular por protenas de membrana

Marcador especfico de tejidos

Desarrollo de tejidos y modificacin de seales extracelulares

Soporte estructural Proteoglucanos de la matriz extracelular

Glicosilacion de protenasLa glicosilacin tiene lugar fundamentalmente en el ER y Golgi El plegamiento de glicoprotenas requiere de chaperones del ER Lectinas: protenas que leen el cdigo glucdico e intervienen en el reconocimiento celular, sealizacin, adhesin y destino celular de las protenas Tipos de glicosilacin

Asn GalNAc Ser GlcNAc N-glicosilacin

O-glicosilacin

N-GLICOSILACION (I)Sobre Asn Secuencia consenso N-X-T/S/C; X Pro Tiene lugar en el ER Ncleo comn para todas las N-glicosilaciones: NAcGlc2Man3 Reconocido por las lectinas y por las N-glicanasas (PNGaseF) Man 1,6 prediccin bioinformtica

1,4

1,4

Man

1,3

Man Asn

Ncleo delas Nglicosilaciones NAcGlc2Man3

NAcGlc

NAcGlc

N-glicosilacin (II)

Modelos de glicosilacin Tipo rico en manosa Tipo complejo: NAcGlc, Gal, manosa, cido silico y fucosa Hbrido

Sntesis en varios pasos 1. Sntesis sobre de un intermediario sobre el dolicol-P de la membrana del ER 2. Transferencia sobre la protena que tenga la secuencia consenso

N-glicosilacin (III)Dolicol-P Lpido altamente hidrofbico compuesto por 20 isoprenos (C5) Localizado en la membrana del retculo endoplasmtico liso

n=15 19Estructura deldolicolP

Dadores de azcares activados y del dolicol UDP, GDP & dolicol-PP

N-glicosilacin (IV)1. Transferasas citoslicas Sntesis del ncleo del oligosacrido sobre el dolicol-P El grupo P del dolicol se sita en la cara citoslica de la membrana del ER Se transfieren 2 GlcNAc y 5 Man 2. Traslocacin del glicolpido a travs de la membrana del ER 3. Las transferasas del ER prosiguen con la glicosilacin Sntesis del oligosrido nuclear sobre el dolicol-P: (GlcNAc)2-(Man)9-(Glc)3 4. Transferencia del oligosacrido sobre un residuo de Asn (secuencia consenso) 5. Reciclaje del dolicol-P: dolicol-PP Enzima: fosfatasa dolicol-P + Pi

Importancia de la N-glicosilacin. EjemplosProtein targetting, intra- extracelular Receptor de asialoglicoportenas en el hgado sanguneo (turnover) Resto de Manosa-6P eliminacin del torrente

marcaje de protenas hacia los lisosomas

Interaccin parsito husped Unin de E. coli a las clulas epiteliales del tubo digestivo N. gonorrhoeae

Man6P

Interaccin vulo espermatozoide Glcidos de la zona pelucida con protena ZP3

O-GLICOSILACIONAusencia de secuencia consenso Adicin de residuos de GlcNAc Unin -O-N-acetilglucosamina sobre Ser Thr En el ncleo y en el citosol Enzimas: O-linked GlcNAc transferasas Adicin de residuos de GalNAc Sobre Ser Thr Estructura tipo mucina Tiene lugar en el Golgi N-acetil-galactosaminil-transferasas no prediccin bioinformtica

Ejemplo de O-glicosilacin Antgenos de los grupos sanguneos A, B, O

FOSFORILACIN (I)Formacin de un ster fosfrico Entre un grupo OH de la cadena lateral de Ser, Thr & Tyr y un grupo fosfato Fosfato donado por el ATP Alta frecuencia de aparicin 1 de cada 8 protenas esta fosforilada, muchas veces, en varios residuos Funcin Regulacin de la funcin proteica: al alterar la estructura y la actividad de una protena (aparicin de un grupo cargado negativamente)

FosfoSer

FosfoThr

FosfoTyr

Fosforilacin (II)Modificacin postraduccional rpida y reversible Acciones mediadas por proten kinasas vs. fosfatasas

Tipos de proten kinasas Ser/Thr proten kinasas PKA, PKC, CAM PK. Generalmente solubles Transduccin de seales, activacin de kinasas (cascadas de fosforilacin) Tyr proten kinasas Dominios TyrK en receptores de membrana para insulina y factores de crecimiento transfosforilacin, dimerizacin y activacin Proten kinasas multifuncionales

UBIQUITINACION (I)

Ubiquitina (Ub) Protena pequea de 76 (8.5 KDa) Presente en todos los organismos eucariontes Se une a otras protenas Enlace entre la Gly C-terminal de la Ub y el NH2 de una Lys de la protena diana Forma cadenas de poliubiquitina Marca las protenas para su degradacin en el proteasoma 26S

Ubiquitinacin (II)

Actualmente se admite que la ubiquitinacin puede tener funciones de sealizacin intracelular = protein targetting / trafficking - reciclaje vs. degradacin de receptores de m.p. que han sido internalizados - mecanismo de sealizacin = protein targetting

SUMOilacin Adicin de protenas similares a la ubiquitina Importancia en las casadas de sealizacin el control de la expresin gnica por modificacin de histonas

Ubiquitinacion (III)Proceso dependiente de ATP en el que participan 3 protenas E1: enzima activadora de la ubiquitina Ub-Gly + ATP Ub-C=O-AMP + PPi (PPi 2Pi)

Ub-C=O-AMP: Ubiquitinil acil adenilato Ub-C=O-AMP + E1-SH Ub-C=O-S-E1 + AMP

Formacin de un enlace tiosster E2: Protena transportadora de la ubiquitina Ub-C=O-S-E1 + E2 E3: ubiquitina ligasa E3 + Protena E3:Protena Protena-Ub + E2-SH + E3 Ub-C=O-S-E2 + E1-SH

Ub-C=O-S-E2 + E3:Protena

ACILACIN (I)Unin de restos lipdicos

Consecuencias - Generalmente se produce una prdida de Q+ - Aumento en la hidrofobicidad

Funcin - Interaccin de la protena con las membranas biolgicas - Anclaje de las protenas en las membranas

Mistirilacin (C14:0) Gly amidada N-terminal (Met-Gly-X-X-X-Ser/Thr), en Lys Cys

Acilacin (II)Palmitoilacin (C16:0) En residuos de Cys de la cara citoslica de la membrana plasmtica Formacin de un enlace tioster Importancia en GPCRs y protenas G

Cys

PalmitoilCoA Proteinaciltransferasa

Protena palmitoilada

Acilacin (III)Prenilacin Farnesilacin, geranil-geranilacin En Cys del dominio C-terminal Secuencias consenso: CxC, Cxxx, xCC Farnesilacin del oncogen ras con farnesil-PP Ras se une a la membrana plasmtica, permitiendo la transmisin de las seales de receptores de membrana al interior celular Ras + farnesil-PP Ras-farnesilado + PPi

Union GPI-anchor, a DAG o a CHO En un residuo de Gly C-terminal Caracterstico de protenas integrales de membrana La protena se sita en la cara extracelular de la membrana plasmtica

OTRAS MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES (I)Formacin de puentes disulfuro Entre dos residuos de Cys Inter- intramoleculares Funcion: La dimerizacin de cistenas = cistina contribuye al mantenimiento de la estructura 3D de las protenas Interconversin de puentes disulfuro por las Protenas disulfuro isomerasas es imprescindible que el puente disulfuro se forme entre las dos Cys correctas

Formacin deunpuente disulfuro entre dosCys

Otras modificaciones postraduccionales (II)Hidroxilacin 5-hidroxi-Lys, 4-hidroxi-Pro, Asn, Asp Presentes en el colgeno, hidroxilacin por la Prolil-hidroxilasa (proceso dependiente de vitamina C)

4hidroxiPro ADP-ribosilacin

5hidroxiLys

Introduccin de una molcula de ADP-ribosa (del NAD) sobre His, Arg & Glu Enzima: ADP-ribosil transferasa - Bacterianas: inactivacin de protenas del husped toxina colrica, toxina pertsica: sobre protenas G heterotrimericas toxina diftrica: sobre el factor EF-2 de la traduccin de protenas - Intracelulares: implicadas en la transduccin de seales ADP-ribosilacin de histonas control de la expresin gnica

Otras modificaciones postraduccionales (III)Metilacin alquilacin En Lys, Arg, His, Asn, Glu, Phe N-terminal & Cys C-terminal Funcin: generalmente produce la prdida de una Q+ en un grupo amino lateral 6-N-Me-Lys: presente en la miosina 6NmetilLys Acetilacin En Lys y en el extremo N-terminal Funcion: generalmente produce la prdida de una Q+ en un grupo amino lateral Ejemplo: Acetilacin de la histona H3 en Lys56 muy frecuente en genes transcripcionalmente activos permite el acceso del complejo remodelador de la cromatina

AcetilLys

Otras modificaciones postraduccionales (IV)Carboxilacin -carboxi-Glu: en los factores de coagulacin carboxilacin dependiente de vitamina K carboxiGlu Selenizacin con Se: Selenocistena, Selenometionina La Selenocistena est presente en el centro activo de enzimas, que catalizan procesos redox, como la glutation peroxidasa La Selenocistena viene codificada por un codon UGA (= STOP) en presencia de elementos SECIS en el RNA SelenoCys = the twenty first amino acid Selenocistena

Otras modificaciones postraduccionales (V)Sulfatacin Tyr, Ser, Thr Presente en proteoglucanos Enzima Sulfotransferasa Ejemplo: la sulfatacin de glicosamino-glicanos es clave para la activacin de factores de crecimiento Nitrosilacin Adicin de un grupo NO a un residuo de Cys formacin de un S-nitrosotiol

Importante para la activacin de metaloprotenasas inactivacin de protenas (caspasas) Unin de iones metlicos Forman parte del centro activo de muchas enzimas

Otras modificaciones postraduccionales (VI)

Unin de grupos prostticos Ejemplo: piridoxal-fosfato (PLP) - coenzima en todas las reacciones de aminotransferencia algunas reacciones de descarboxilacin reacciones de desaminacin de los aminocidos - acta como una base de Shiff

Desmosina Cross-link formado por 4 cadenas polipeptidicas distintas: 3 allicas + Lys Funcin clave en el mantenimiento de la matriz extracelular Presente en la elastina