60936467 culturi in vitro

5/27/2018 60936467 Culturi in Vitro

1/75

INTRODUCERE N CULTURILE DE CELULE I ESUTURIVEGETALE

Sfritul mileniului doi se caracterizeaz printr-o puternic implicare a biotehnologiein viaa omului, n toate domeniile de activitate. Cu autorul metodelor biotehnologice s-aufcut progrese uriae n crearea de noi genotipuri de plante i rase de animale cu nsuirifavorabile i cu randamente sporite fa de materialul de la care s-a plecat.

!ezvoltarea biologiei moleculare din ultima umtate de secol s-a fcut, n principal,pe organisme simple ca mod de organizare "bacterii, drodii, alge, etc.#, organismeunicelulare. $dat cu abordarea organismelor pluricelulare trebuia verificat dac noiunileacumulate anterior erau valabile i dac e%istau i alte procese specifice modului comple% deorganizare. Cunoscndu-se comportamentul organismelor simple, cercettorii au nceput s segndeasc la cultura pe medii artificiale a unor poriuni de plante sau chiar celule. &roblemacare a aprut a fost aceea a meninerii viabilitii acestor celule, de la prelevarea de pe plantamam pn la trecerea pe mediu nutritiv artificial sau mai departe pn la regenerarea

"refacerea# unei noi plante.'ungerea la cultura in vitronu a fost aa de simpl cum s-a presupus fiind necesarmult timp i multe cercetri, la nceput fr succes, dar apoi totul s-a clarificat.

(n )**+, Sachs a fost cel care a elaborat teoria conform creia plantele i sintetizeazsubstanele ce determin formarea organelor, substane ce au o dispunere polar, iar primelencercri de culturi de esuturi au fost fcute n )+, de ctre aberland, din nefericire, frrezultatele dorite. &rimele rezultate privind cultura de celule i esuturi ncep s apar din anul)++, cnd /nudson reuete germinarea seminelor de orhidee in vitro iar 0obbins obine

prima cultur de esut de rdcin n condiii artificiale.&e baza conceptului de totipoten celular, conform cruia fiecare celul conine

informaia genetic necesar obinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, n

anul )1+ 2orel i 2artin au stabilit i au perfecionat o metodologie de cultivare pe mediiaseptice a e%plantelor meristematice caulinare, obinnd prin creterea in vitro a acestoraplante sntoase, libere de viroze, pornind de la plante mam contaminate cu diferite viroze.(n acest mod se produce material de plantat devirozat, cu o rat de multiplicare ntr-un ritmimposibil de imaginat prin utilizarea tehnicilor tradiionale de nmulire vegetativ, evitndu-se i degenerarea soiurilor din cauza infeciilor virale, transmisibile prin nmulire vegetativ.

(n anul )3+, dup muli ani de studii i ncercri, 2urashige i S4oog, au reuit selaboreze un mediu de cultur considerat ca fiind de baz , care 5 cu mici modificri 5 poate fiutilizat pentru aproape toate tipurile de culturi de esuturi.

0euita e%perienelor lui Co4ing n )3 privind izolarea enzimatic a protoplatilor dinmezofil foliar, a fcut posibil obinerea unor populaii mari de protoplati iar apoi producerea

de hibrizi somatici.'nul )33 este considerat drept nceputul etapei moderne a cercetrilor privind cultura

de e%plante vegetale in vitro. 'ceast etap s-a caracterizat, n primul rnd prin elaborarea detehnici eficiente n generarea, cultivarea i fuzionarea protoplatilor vegetali. Cu autorul

protoplatilor, odat cu descoperirea noilor tehnici "electrofuziune, vectori virali transmitoride gene izolate# s-au obinut plante rezistente la aciunea unor ageni stresani cum ar fi6

pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc.'tt pe continentul american ct i pe cel european sau asiatic, culturile in vitrosunt

folosite n special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat de multiplicareaspeciilor arboricole ornamentale i fructifere, dar i pentru realizarea de noi genotipuri saumai ales pentru regenerarea celor create prin inginerie genetic.


2/75

CAPITOLUL I

1.1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIIE, CARACTERIZARE IAPLICABILITATE

1.1.1 Definiie

(n sens general, prin cultura in vitro se nelege creterea pe medii artificiale, ncondiii de asepsie deplin i de factori ambientali bine controlai, a unor organe, pri deorgane, esuturi sau celule vegetale. 0euita culturii depinde de o multitudine de factori i estevizibil n momentul n care e%plantul crete.

7%plantul, numit i inocul, este poriunea de plant "organ, esut, celul# care sedesprinde de pe planta donor "planta mam#, i se inoculeaz n condiii sterile pe un mediuartificial de cultur. 7voluia e%plantului este diriat de operator n funcie de scopul urmrit.'cesta poate evolua formnd o nou plant "sau mai multe plante - neoplantule#, prin

stimularea dezvoltrii organelor aeriene "tulpina i frunzele# i a rdcinii, sau poate formacalus, prin stimularea nmulirii nedifereniate a celulelor.

7%plantul constituie unitatea vie ce conine n celule ntreaga informaie genetic aplantei mam i pe baza totipotenei este capabil de a regenera una sau mai multe planteidentice cu planta donor.

8otipotena, este nsuirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce i de aforma o plant identic cu planta mam. 8eoretic fiecare celul vie este totipotent, ns n

practic s-a observat c nu toate celulele au capacitatea de a-i e%prima acest caracter, datoritpe de o parte diferenierii celulare i mbtrnirii, iar pe de alt parte gradului mare despecializare al acelor celule.

'stfel, s-a demonstrat practic c, ntr-o plant matur, celulele specializate careconstituie esuturile, de e%emplu6 traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la carelipsete citoplasma i nucleul, nu sunt totipotente. 'cest aspect este e%plicat chiar prin faptulc ntreaga informaie genetic a celulei totipotente se afl n cromozomii din nucleu.

9a plantele cormofite, odat cu naintarea n vrst, o parte din celule i pierdcapacitatea de totipoten sau aceasta se reduce foarte mult. 0mn, ns, anumite zone n careactivitatea celulelor este intens, avnd loc diviziunea i formarea aproape continu de noicelule. 'ceste celule sunt mici n dimensiuni, poligonale, bogate n citoplasm, au vacuolmic i nucleu mare dispus central i prezint o membran celulozic, formnd esutul cudenumirea de meristem.

2eristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creterii n lungime i grosime

a plantelor, fiind dispuse terminal att n tulpin ct i n rdcini.1.1. C!"!#$e"i%$i#i&e #'&$'"i&(" in )i$"(

Spre deosebire de multiplicarea tradiional, unde se opereaz cu semine sau poriunimari de plant "marcote, butai, altoi#, la multiplicarea in vitrose folosesc e%plante mici, deordinul milimetrilor sau chiar microscopice "celule, protoplati#, e%plante care n condiiinormale de cultur nu ar reui s creasc opunnd rezisten agenilor patogeni isintetizndu-i singure substanele nutritive necesare.

!in acest motiv, pentru reuita culturii de celule i esuturi se cer respectateurmtoarele condiii6

-prepararea unui mediu de cretere care s asigure o bun nutriie heterotrof a e%plantului,prin asigurarea sursei de carbon organic uor accesibil e%plantelor:


3/75

-asigurarea i controlarea factorilor de mediu "temperatur, lumin, umiditate# n limiteleoptime pentru fiecare specie, soi i faz de cretere, n funcie de cerinele acestora i scopulurmrit:-stimularea creterii i diferenierii sau dediferenierii organelor prin utilizareacorespunztoare a substanelor stimulatoare de cretere:

-asigurarea unei asepsii depline pe tot flu%ul de producere a plantelor in vitro, prin dezinfeciamaterialului vegetal, sterilizarea mediului i a vaselor de cultur, precum i efectuarea tuturoroperaiilor n hota cu flu% de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare.

1.1.* D(+enii e !-&i#!"e ! #'&$'"i&(" in )i$"(

!atorit spectrului larg de probleme la care culturile in vitroau rspuns afirmativ, suntutilizate n prezent n agricultur, silvicultur, farmacie, industria alimentar, industria uoar,etc. (n agricultur, n general i n horticultur n special, culturile de esuturi i celule suntfolosite pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorareaspeciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei horticole, pentru obinerea de metabolii

secundari.'vantaele culturii in vitrosunt multiple, dintre care amintim6-asigur multiplicarea clonal rapid a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornind

de la cantiti mici de material vegetal. 8eoretic, se asigur o multiplicare e%ponenial, princare n circa 3 luni se pot obine ) milion de plante:

-se poate produce material sditor liber de viroze i micoplasme, material mai viguros,precoce i productiv:

-necesit spaii mici de cultur i se valorific bine spaiul din laborator prin cultura pevertical pe ;-1 nivele suprapuse:

-obinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte e%plante de esuturigenerative "cu n cromozomi#:

-d posibilitatea obinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi caren condiii normale sunt imposibil de obinut:

-selecia de plante rezistente la stres, boli i duntori:-se evit efectul sezonier de pepinier:-se pot obine semine artificiale:-se pot obine plante pe rdcini proprii evitnd astfel cheltuielile de altoire:-asigur multiplicarea clonal a portaltoilor care nu nrdcineaz n condiii normale

de cultur:-asigur pstrarea materialului n faza de plantul pn la primirea unor comenzi

ferme de multiplicare.

Cu toate aceste avantae, e%ist specii care nu rspund bine la cultura in vitroi care,deocamdat rmn s fie nmulite tradiional.7%ist ns i cteva impedimente n utilizarea acestei metode pentru nmulirea n

mas a plantelor, cum ar fi6-necesitatea unui laborator cu dotrile minime6 instalaii i aparate indispensabile

activitilor de micropropagare, care sunt costisitoare:-necesitatea unui personal specializat n multiplicarea clonal i manipularea in vitro:-utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi i puin accesibili tuturor unitilor de

producie:-nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu rspund

la metodele cunoscute de multiplicare:

-e%ist riscul apariiei i multiplicrii mutaiilor recesive, cu afectarea autenticitiisoiurilor:


4/75

-riscul apariiei germenilor genetici prin multiplicarea solitar numai a unor tipuri carese comport bine la acest tip de cultur, cu riscul srcirii bazei de germoplasm pentru unelespecii.

1. PROCESE ORFOFIZIOLOGICE LA NIVELUL

E/PLANTELOR CULTIVATEIN VITRO

7%plantele inoculate pe medii aseptice i vor relua activitatea metabolic, se vorintegra noilor condiii de via, i vor reamorsa procesele fiziologice vitale i vor ncepe unnou ciclu de via. (n dependen de mediul de cultur, de natura inoculilor, de seria deoperaiuni prin care au trecut prealabil ultimei inoculri, de condiiile de cultur i de scopulurmrit, dup dediferenierea celulelor i regenerarea de noi celule, evoluia acestora poate fidiriat.


5/75

!ediferenierea natural a celulelor poate fi observat n organele care se ramific saun cazul traumatizrii organelor i al generrii, la locul rnirii, de calus. &rocesul dededifereniere este comple% i se instaleaz n momentul n care celulele primesc un impulsinductiv, de obicei fitohormonal, impuls ce declaneaz transformri la nivel molecular.

(n cadrul unui esut nu toate celulele dedifereniaz, puine celule devin centrii

generatori de noi i noi celule suficiente pentru a asigura ndeplinirea fenomenelor derestituie. (n caz de traumatism organele din esuturile lezate beneficiaz de acumularea unorsubstane cu rol esenial n inducerea i stimularea proceselor de dedifereniere.

!eci, fitohormonii, condiiile de cultur, natura esuturilor implicate, starea lorfiziologic i vrsta plantelor donatoare constituie factori ce intervin n procesele deregenerare.

'ptitudinea celulelor de a se dediferenia este foarte inegal rspndit n corpulplantelor i chiar i n cadrul subunitilor structurale, morfofuncionale, care alctuiesc unorganism, e%istnd diferene mari n ceea ce privete capacitatea de a se dediferenia, la celuleaparinnd aceluiai organ sau chiar esut.

Celulele e%plantelor inoculate pe medii aseptice, pentru a putea s-i reorganizeze un

mod de via, trebuie sa sufere un proces de conversie din celule definitivate structural ifuncional n celule meristematice, apte de multiplicare.

'ptitudinea celulelor e%plantelor inoculate in vitro de a se dediferenia este foarteinegal rspndit la specii, organe i esuturi variate.

=azele de dedifereniere celular pot fi caracterizate astfel6).prima faza de dedifereniere6-amorsarea proceselor de dedifereniere:-producerea dediferenierii celulelor pn la dobndirea caracteristicilor citologice

specifice unui esut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate asemntoare ca aspecti structur cu cambiul.

+.a doua faz de dedifereniere6- dediferenierea n continuare a celulelor pn la stadiul de celule cu caracter de

meristem primar:-generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau meristemoizi "centre

organogene#, ori de embrioni somatici, iar din acestea regenerarea de plante:-generarea, prin proliferarea celulelor dedifereniate, a unui calus neorganizat,

structurat omogen. 9a nivelul acestui esut calusal se pot apoi forma meristemoizi sau centriembriogeni.

1..* Reene"!"e!

0egenerarea este capacitatea organismelor vii de a-i reface oricare parte le-a fostdistrus. &rin intermediul tehnicilor de cultivare in vitroa organelor, esuturilor sau celulelorvegetale se e%ploateaz la ma%im capacitatea regenerativ a celulelor e%plantelor, respectiv se

pune n valoare manifestarea integral a totipotenialitii celulare. 8eoretic, toate celulele viiale plantelor sunt totipotente. !in celule somatice sau obinut plante diploide, iar din celulegenerative, prin androgenez i ginogenez, sau regenerat plante haploide.

Ca i n cazul dediferenierii celulare, se poate spune c i n regenerare e%ist o marevariabilitate n ceea ce privete reactivitatea celular, capacitatea regenerativ este manifestatsau nu de ctre o celul vegetal sau de un grup de celule n funcie de numeroi factoriendogeni i e%ogeni. =actorii endogeni ce oac un rol esenial n regenerare sunt6 vrstacelulelor, gradul de difereniere, capacitatea de a se dediferenia, coninutul n hormoni, natura

balanei hormonale i echipamentul enzimatic. =actorii e%ogeni implicai n regenerare


6/75

sunt6traumele i natura acestora "stresul datorat introducerii unui e%plant n cultura in vitro#,precum i condiiile de mediu.

8otipotena este deinut de ctre fiecare celul a plantelor dar e%primarea sa aparinenumai anumitor tipuri de celule numite meristemoizi. 'cestea sunt celule competentemorfogenetic n a rspunde la variai stimuli i care, n condiii specifice, pot da natere la

tulpini, rdcini sau embrioni.>umrul celulelor dintr-o populaie cultivat in vitro care-i e%prim potenialulorganogen sau embriogen se afl sub controlul mai multor factori.

S-e#i!. 7%ist specii la care regenerarea are loc n special prin organogenez i speciicare regenereaz prin embriogenez, dar i specii care pot regenera att lstari ct i embrioniin vitro.

Gen($i-'&. S-a constatat c nu toate soiurile aparinnd unei specii cultivate aupotenial regenerativ. 'stfel, s-au evideniat genotipuri ?culturabile@, ce au permis oregenerare uoar din orice tip de esut, dar i genotipuri recalcitrante, la care stabilirea unui

protocol de regenerare s-a fcut cu mare dificultate i cu rezultate slabe.N!$'"! e2-&!n$'&'i. 9a unele specii "lucerna# toate tipurile de e%plante genereaz

calus regenerativ. 9a altele ns obinerea plantelor in vitroeste condiionat de utilizareaanumitor e%plante, de e%emplu la graminee numai embrionii imaturi, inflorescenele foartetinere i microsporii genereaz calusuri regenerative.

V3"%$! e2-&!n$e&(". Calusurile iniiate din esuturi tinere regenereaz mult mai binedect cele provenite din e%plante mature. (n embriogeneza somatic direct, e%primareatotipotenei depinde de stadiul de dezvoltare al e%plantelor. Sunt capabile sa parcurgembriogeneza direct celulele embrionare, celulele epidermei hipocotilului, celulele nucelei isinergidele.

'li factori care influeneaz regenerarea sunt6 starea fiziologic a plantei donor,compoziia mediului de cultur, vrsta culturii, temperatura, fotoperioada, intensitatea icalitatea luminii, stresul "biotic sau abiotic#.

1..4 ("f(ene5! in vitro

(ntruct la culturile in vitromorfogeneza prezint aspecte particulare, specifice acestuitip de cultur, vom adopta termenul de morfogenez n sens larg iar n acest conte%t, vomdescrie procesele de morfogenez sesizabile la nivelul e%plantelor cultivate in vitro, respectivorganogeneza i embriogeneza.

Aibliografia e%istent pn n prezent subliniaz dependena capacitii morfogeneticede natura e%plantelor: pe de alt parte sunt numeroase referiri bibliografice care evideniazrelaia care e%ist ntre genotip i competena morfogenetic a e%plantelor cultivate in vitro.

Basil ")*# a considerat ca factor decisiv n meninerea capacitii morfogenetice, stareafiziologic i de dezvoltare a e%plantului. !eci, adeseori, stadiul de dezvoltare al planteidonatoare condiioneaz regenerarea i reacia e%plantului , altfel spus un rspunsmorfogenetic corespunztor a fost obinut numai atunci cnd e%plantul a prezentat un anumitstadiu de dezvoltare. =olosirea unor e%plante mai tinere sau mai avansate n dezvoltare, fade cel optim, adeseori s-a soldat cu formarea unui calus nemorfogen.

2orfogeneza la culturile in vitroeste influenat, n mare msur de anumii factori6-coninutul endogen n fitohormoni i aportul e%ogen de regulatori de cretere:-srurile minerale prezente n mediul de cultur "mai ales natura sursei de azot#:-natura i concentraia glucidului din mediul de cultur:-prezena n substrat a unor compui organici, n special al unor aminoacizi:

-prezena, natura i concentraia gazelor "$+, C$+, C+# dizolvate n mediu saue%istente n atmosfera din recipientele de cultur:


7/75

-prezena n substrat a unor e%tracte comple%e, de origine biologic, sau a crbuneluiactiv:

-factorii fizici "lumina, temperatura#.!eci lumina, temperatura, potenialul osmotic al mediului, starea fizic a acestuia,

tipul vaselor de cultur sunt factori care pot influena n sens negativ morfogeneza.

>u se cunoate nc dac morfogeneza este influenat i n ce msur, de substaneleintroduse iniial n mediul de cultur sau de ctre comple%ul ionic, format n substrat, ca oconsecin a autoclavrii, sau n ce msur schimbrile intervenite n compoziia mediului,sub aciunea inoculilor, afecteaz morfogeneza.

).+..) $rganogeneza in vitro

$rganogeneza in vitroeste un proces foarte comple% care depinde care depinde de oserie ntreag de fenomene biologice, aflate n antecedena momentului e%plantrii esuturilor.&n n momentul e%plantrii esuturilor, celulele viitorului e%plant au parcurs, mpreun cusistemul crora le aparineau, anumite trepte ale ciclului vital, trepte n care diferitele cerine

fiziologice au fost satisfcute, mai mult sau mai puin. !intre aceste cerine amintim raportulendogen n fitohormoni i coninutul endocelular n nutrieni, ambele fiind dependente deiluminarea plantelor, de temperatura mediului ambiant, de aprovizionarea cu sruri minerale.!e modul n care au fost asigurate aceste cerine, prealabile e%plantrii, vor depinde, n maremsur, reacia e%plantelor, capacitatea regenerativ i mai ales organogeneza la nivelulinoculilor, derivai din acestea. 'spectele menionate au fost foarte clar relevate, mai ales ncazul studiilor de embriogenez somatic i de nrdcinare a tulpinilor recalcitrante n agenera rdcini adventive. !e e%emplu, pentru inducerea nrdcinrii tulpinilor de Sequoia

sempervirenssau a altor plante lemnoase, se impune un pretratament, de scurt durat, a lorcu soluie nutritiv, coninnd ) mgDl '


8/75

9umina poate e%ercita un efect pozitiv asupra rizogenezei dar numai la o intensitateslab sau n urma unei perioade scurte de aciune "3 luci mai puin de o orDzi#.8emperatura optim pentru rizogenez este aceea de +3 oC. Eneori, ns, se recomand

practicarea unei alternane ntre o temperatur sczut "1-)1 oC# i ridicat, n prezenaluminii, a au%inei i a unui mediu bogat n glucide.

(n cele mai multe cazuri, formarea rdcinilor este localizat polar. 0dcinile seformeaz la polul radicular al e%plantului, n timp ce generarea mugurilor este localizat lapolul foliar. 'portul de au%in, n concentraie ridicat, poate perturba polaritatea. (nconcentraii optime au%ina stimuleaz rizogeneza.

A.Caulogeneza in vitro

=ormarea de mugurai in vitro, denumit i caulogenez, respectiv formarea de centrivegetativi, este esenial atunci cnd se urmrete, de e%emplu, multiplicarea sau?reconstituirea@ unei noi plante ori a unui genotip, generat prin hibridare somatic.


9/75

calusului, se pierde n timp, pe msura practicrii unor subcultivri succesive "mai ales lagru#.

).+..+ 7mbriogeneza somatic

&rocesul de formare a embrionului, respectiv succesiunea fazelor de multiplicarecelular i de histogenez finalizate cu formarea unui embrion se numete embriogenez.


10/75

1..9 Vi$"ifi#!"e! %!' %$i#&(5i$!$e!

=enomenul de vitrificare sau sticlozitate este un proces de transparentizare a frunzelori tulpinilor i a fost semnalat la culturile de salat n ser "Gautheret, )*#. Se apreciaz c,n cazul acestui fenomen, n anumite condiii "cum ar fi e%ces de umiditate#, organele aeriene

ale plantelor devin translucide ca o consecin a infiltrrii apei n spaiile intercelulare,nlocuindu-se aerul din ele.(n condiii aseptice, plante vitroase pot s apar brusc. 7le sufer transformri

morfofiziologice, frunzele lor recurbndu-se, devenind translucide, sticloase, rugoase, uneoriondulate i casante, prezentnd o cretere malformat, hipertrofiat. 'spectul general estedegenerat.

Studiile amnunite asupra structurii frunzei au artat c frunza nu are celuleledifereniate n cele dou esuturi, palisadic i lacunar. 2eristemele lstarilor vitrificai suntmai mici dect la cei normali. Celulele sunt mult hidratate i conin clorofil mai puin.S-a constatat c prin adugarea crbunelui vegetal n mediul de cultur se elimin sau sereduce foarte mult procesul de vitrificare. !e asemenea ridicarea concentraiei de agar la )-

),)H reduce vitrificarea "$rli4oFs4a, )*1#. Concentraii mai mari de ,*H de agar duc nsla scderea ratei de multiplicare i de aceea este foarte dificil de mbinat cele dou aspecte.

CAPITOLUL II

.1 FENOENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREAUNEI CULTURIIN VITRO

8ehnicile de cultur in vitro folosite n cercetare sau pentru producerea de plante,pornesc de la aceeai premiz6 posibilitatea de a controla ntr-un mod optim factorii de mediu

"temperatur, lumin, compoziia mediului de cultur, p, umiditate# necesari fragmentuluide plant inoculat n condiii artificiale de mediu, n ncercarea de a analiza funciile salefiziologice sau de a-l conduce ntr-o anumit direcie, cum ar fi formarea de noi lstari"micropropagarea#.

8ehnicile de cultur in vitro, pe lng aspectul tehnologic, ne permit rezolvarea unuinumr de probleme6

-meninerea unui e%plant viabil i activ din punct de vedere vegetativ:-permiterea creterii normale a unui e%plant reprezentat de o structur organizat

"meristem, vrf de cretere sau mugure#:-inducerea proceselor de difereniere n cazul unor fragmente de calus pentru formarea

de organe sau embrioni somatici:

-inducerea proceselor de dedifereniere, n cazul unor e%plante formate din celuledifereniate "fragmente de tulpin, frunz, peiol, rdcin, etc.# rezultnd o nou organizaretisular:

-inducerea proceselor de diviziune celular, valabil tuturor cazurilor amintite mai sus.'ceste probleme au fost parial rezolvate odat cu identificarea regulatorilor de

cretere endogeni de tipul au%inelor "primul grup de fitohormoni recunoscut#, giberelinelor,citochininelor, pentru a numi doar cele trei clase principale de regulatori de cretere. 'cestesubstane par a determina orientarea dezvoltrii celulelor n cultura artificial, fapt pentru careli se acord prima atenie atunci cnd se ncearc e%plicarea unor fenomene fiziologice.


11/75

.1.1 Re'&!$("ii e #"e$e"e

7%istena hormonilor vegetali a fost bnuit nc de la nceputul secolului trecut.>umeroase lucrri tiinifice privitoare la aceste subiect au evideniat prezena lor, dar nu le-au putut identifica dect mult mai trziu. &rimii fitohormoni descoperii au fcut parte din

clasa au%inelor, n urul anului );, giberelinele i citochininele fiind descoperite mai trziu,n anii I1. 'ceste trei tipuri de regulatori de cretere e%ercit o aciune stimulativ asuprametabolismului celular. 7%ist i substane cu efecte inhibitoare asupra creterii i dezvoltriicelulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic, identificat n anul )31 i substanele fenoliceidentificate civa ani mai trziu. !e asemenea, etilena, un compus gazos, a fost recunoscutca regulator de cretere atunci cnd metodele de msurare a acesteia au permis detectarea san organele plantelor. 7tilena poate avea fie efect stimulator, fie efect inhibitor asupra

plantelor.'ceste substane sunt endogene, ceea ce nseamn c sunt sintetizate de plante. 7%ist

i fitoregulatori de cretere artificiali cu formule chimice asemntoare celor naturali,prezentnd o aciune fiziologic similar. 8oate aceste substane, sintetice sau naturale, sunt

numite regulatori de cretere i au anumite caracteristice comune6-acioneaz ntr-o concentraie foarte mic, n concentraie mare sunt to%ice, de aceea

unele dintre ele sunt folosite ca erbicide:-acioneaz numai n interaciune cu ali fitoregulatori, funcia lor fiind determinat de

balana hormonal stabilit ntre ei:-intervin ntr-un numr de fenomene fiziologice ce implic mai multe moduri de

aciune astfel nct noiunea de hormon "cu un efect rizogenic sau caulogenic specific# a fostabandonat.

$ diferen substanial ntre fitoregulatorii de cretere artificiali i cei naturali constn faptul c cei endogeni pot fi controlai de mecanismele metabolice ale celulelor fiindeliminai suficient de repede, pe cnd cei artificiali persist mult mai mult fiind deseori

preferai aplicaiilor practice.

.1.1.1 A'2ine&e

'u%inele au fost descoperite n urma unor e%perimente asupra coleoptilului laGramineae. >umele de au%ine provine din grecescul au%ein 5 a crete, determinnd elongareacelulelor "au%esis 5 cretere ce se refer n special la mrimea celulei dect la numrul decelule#.

7ste un compus ce are la baz nucleul indolic cu formula de baz C)$+> cunoscutsub numele de acid J- indolil acetic "=ig.)#.

=ig.) 'cidul J- indolil acetic'. &roprietile fiziologice ale au%inelor


12/75

'u%inele intervin n multe fenomene fiziologice, iar aciunile lor depind de concentraiilori de interaciunile cu ali regulatori de cretere. Studiind cteva din efectele lor s-a pututconcluziona c6

-e%ercit o aciune clar asupra elongrii celulare, aceste efect urmeaz creteriiplasticitii peretelui celular i penetrrii apei n celul. 'poi rezistena peretelui scade i

celula crete n lungime:-modific permeabilitatea membranei plasmatice, ceea ce duce la o descrcare de ioni deK, determinnd o cretere a aciditii responsabil de diminuarea rezistenei peretelui celulari o absorbie de ioni de /K:

-influeneaz n general metabolismul celular i n particular sinteza '0>-ului ribozomal"ribozomii particip la sinteza proteinelor#:

-stimuleaz diviziunea celulelor cu origine cambial "acest tip de aciune a determinatinsuccesele din primele ncercri de iniierea a culturilor in vitro#: 'cest efect este descris cahistogenic deoarece conduce la formarea unui numr de celule asemntoare, numite calus:

-acioneaz asupra sintezei etilenei ntr-o anumit concentraie, etilena intervine n schimbn reglarea nivelului de au%in cel puin la nivelul vaselor conductoare:

-acioneaz asupra tropismului plantelor i asupra corelaiei dintre organe, n particularasupra fenomenelor de dominan apical:

-determin ntrzierea cderii frunzelor i a fructelor:-au aciune rizogenic fiind folosite n special n micropropagarea speciilor ornamentale

destinate comerului de flori tiate:'ceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din aciunea singular a au%inei deoarece

concentraia optim este diferit pentru fiecare tip de aciune n parte i se schimb n funciede concentraia celorlali fitoregulatori.

2odul de aciune al au%inelor. >u se poate da un rspuns precis, dar cercetrile ndomeniu au evideniat e%istena unor receptori fie membranari, fie citoplasmatici specificiau%inei. &e baza acestei ipoteze au rezultat urmtoarele concluzii6

-n funcie de prezena sau absena unuia sau a celuilalt receptor apar diferene de reacien concordan cu originea celulei ce reacioneaz la acest fitohormon:

-n funcie de afinitatea receptorului pentru au%in unii sunt angrenai mai repede dectalii.

'u fost descoperii receptori i pentru alte tipuri de fitoregulatori de cretere, de aici sepoate e%tinde ideea e%istenei de receptori pentru toate tipurile de regulatori endogeni.

A. 'u%inele n plante

8oate plantele sintetizeaz au%ine, sintez modulat de stadiul de dezvoltare ale acestora.Sinteza au%inelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor i n florile i fructele tinere.'u%inele circul de la vrful spre baza organelor cu o polaritate puternic pronunat n

organele tinere, dar n cursul transportului lor sunt descompuse de au%in-o%idaze, ceea censeamn c au%inele sunt n concentraie mai mare n apropierea situsurilor de sintez.'stfel, au%inele sunt prezente ntr-o concentraie suficient n vrful plantelor n cretere, nmugurii florali sau foliari, pentru a asigura multiplicarea i elongarea celulelor.

C. 'u%inele sintetice

!e cnd au fost identificate au%inele, s-au sintetizat compui chimici similari acestora,

care au generat n celulele vegetale efecte similare au%inelor endogene, ceea ce confirm


13/75

e%istena receptorilor pentru au%ine. 2ai mult, fiind influenai mai puin de activitatea au%in-enzimelor , vor putea avea un efect prelungit n plante.

&rintre numeroasele substane folosite, cele mai importante sunt6-acidul.indolil butiric "'


14/75

=ig.; 'cidul giberelic

8oi aceti compui au un nucleu similar "nucleul giberelic# diferind doar prin calitatei poziia substituenilor n nucleu.

'. &roprietile fiziologice ale giberelinelor

&roprietile fiziologice ce urmeaz a fi descrise corespund acidului giberelic "G';#.>u toate giberelinele au activitate similar, unele sunt inactive sau doar forme intermediare,ceea ce le face dificil de studiat, iar mai mult, nu toate plantele posed aceleai gibereline.

&rincipalele proprieti ale acidului giberelic sunt6-acioneaz asupra elongrii internodurilor, uneori determinnd rezultate spectaculoase

"e%6 s-au obinut plante de varz cu tulpina de ; m#, dar nu asupra tuturor speciilor. !oarunele dintre varietile pitice ale unor specii pot atinge talii normale n urma aplicrii de G' ;,n general varietile pitice nu reacioneaz la efectul de elongare al acidului giberelic. 'cidulgiberelicacioneaz i asupra pedunculilor florali, mpiedic maturizarea timpurie "cu )1 pn

la + de zile la Cyclamen# sau alungirea inflorescenelor prea dezvoltate "e%6 la viele de viecu ciorchini deni, acidul giberelic a inhibat dezvoltarea racemelor la%e#:-n cultura in vitrogiberelinele acioneaz i la nivelul meristemelor, care, n absena

acestora, prezint un aspect globular:-stimuleaz metabolismul celular deoarece favorizeaz sinteza enzimelor hidrolitice.

S-a dovedit c la seminele de orz, acumularea L-amilazei, o enzim cu rol n transformareaamidonului n zaharuri solubile, este datorat acidului giberelic, care acioneaz direct saudup asocierea cu un receptor. Giberelinele acioneaz, de asemenea, n prezena au%inelor, isunt deseori stimulate de sinteza sau inhibarea sintezei au%in-o%idazelor:

-acioneaz asupra nfloririi, avnd ca efect fie inhibarea inducerii florale, cum ar ficazul pomilor fructiferi, sau stimuleaz nflorirea speciilor ce necesit temperaturi sczute

pentru a nflori, astfel nct n prezena giberelinelor aceste specii nfloresc i fr temperaturisczute "morcov#. 9a alte specii, ce necesit de asemenea temperaturi sczute pentru nflorire,prezena giberelinelor induce doar alungirea tulpinii fr formarea florilor "sfecl#. 'cestecontradicii n aparen au o e%plicaie simpl6 n plantele prezentate mai sus frigul acioneazdoar asupra creterii tulpinii, pe cnd n cellalt caz asupra procesului de nflorire. 'stfel,giberelinele, i e%ercit doar rolul de stimulatori ai elongaiei neinfluennd, n acest caz,

procesele fiziologice normale:-acioneaz asupra formrii fructelor partenocarpice la pr, mandarin, prun:-e%ercit o aciune comple% asupra germinrii seminelor sau pornirii n vegetaie a

mugurilor dorminzi, atunci cnd condiiile climaterice "temperaturi sczute# nu permit acestlucru, inducnd i ramificarea sau creterea ramurilor laHydrangea:

-n organogenez, aciunea giberelinelor poate fi antagonic. &ar a se opunefenomenului de dedifereniere, neputnd fi folosite in vitro n acest scop, acionnd ns


15/75

asupra meristemelor apicale sau a%ilare i asupra butonilor florali, prin stimularea creterii idezvoltrii acestora.

A. Giberelinele n plante

Giberelinele au fost descoperite att n plante ct i n ciuperci cu o distribuie inegal.Enele gibereline se pot ntlni doar n plante, altele doar n ciuperci i unele n ambele grupe"acizii giberelici ),;,,N,#. Enele plante posed doar un fel de gibereline, n alte specii se afli acioneaz mai multe tipuri de gibereline.

9ocurile de sintez a giberelinelor se afl la nivelul frunzelor foarte tinere, n muguriifoliari i florali, n lstarii activi, n vrful rdcinilor i n embrioni.

Giberelinele circul liber prin plant fr e%istena unei polariti fiind asociate deseorizaharurilor, eliberndu-se n situsurile int.

.1.1.* Ci$(#;inine&e

Citochininele au fost descoperite n timpul studiilor efectuate asupra esuturilorvegetale cultivate in vitro. S-a descoperit i acum este bine cunoscut faptul c adiia de laptede nuc de cocos n mediile artificiale de cultur are un efect favorabil asupra multiplicriicelulare i n lstrire. Cercetrile ce au ncercat s descopere factorul responsabil de acesteefecte au dus la izolarea unui comple% chimic activ de natur purinic, care nu a putut fiiniial identificat. 'ceste rezultate au dat posibilitatea continurii cercetrilor asupra purinelori n )13, S4oog a izolat, din '0> denaturat, o substan activ numit ?chinetina@.

Citochininele sunt nlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscui doi compuiendogeni6

-zeatina "=ig.#-izopenteniladenina, a crei compui sintetici sunt6 chinetina "/in 5=ig.# "3-

furfurilaminopurina# i benziladenina "A' "3-benzilaminopurina#.

a# b#=ig. Citochinine6 a# zeatina, b# 4inetina

Se mai folosesc i ali nlocuitori ai adeninelor, sintetici, liberi sau n asociere cuzaharuri.

'. &roprietile fiziologice ale citochininelor

Citochininele sunt foarte active n plante i asemeni celorlalte dou clase defitohormoni prezentate anterior au o serie de proprieti dintre care6

-au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. (n acest proces citochininele suntindispensabile, dar ineficiente fr aciunea au%inelor, cele dou complementndu-se reciproc.'u%inele favorizeaz duplicarea '!>, iar citochininele permit separarea cromozomilor:

-au un rol la fel de important n organogenez stimulnd formarea lstarilor, fiind nsantagonice rizogenezei:


16/75

-e%ercit un efect de stimulare a metabolismului celular, favoriznd sintezaproteinelor, prin rolul ce-l oac n compoziia '0>-ului de transfer i protend metaboliiide aciunea enzimelor hidrolitice. 'cest efect determin ntrzierea senescenei pn la

punctul n care frunzele mature tratate cu citochinine se comport asemntor celor tinere dinpunct de vedere metabolic:

-e%ercit un efect antagonic asupra dominanei apicale stimulnd lstrirea a%ilar:Citochininele prezint o importan deosebit n domeniul culturii in vitrodeoarece aupermis obinerea unor progrese importante n micropropagarea plantelor. &roprietilecitochininelor permit rezolvarea dificultilor enumerate mai sus, cum ar fi meninereaviabilitii celulelor vegetale, stimularea diviziunii celulare, orientarea celulelor sprededifereniere.

A. Citochininele n plante

&rima citochinin endogen a fost identificat n )3; n embrioni imaturi de porumb,de unde i numele de zeatin, urmat de izopentenil adenina "


17/75

'ciunea antagonic a etilenei pare a depinde de interaciunea dintre cele dou substane cepot controla sinteza, concentraia i circulaia lor.

'plicaiile practice ale etilenei, dificil de utilizat n starea sa gazoas, au fcutprogrese doar dup descoperirea acidului +-cloro-etan fosforic. 'cest produs, aplicat prinpulverizare penetreaz esuturile, unde se elibereaz etilena.

8oate prile plantelor sunt capabile s sintetizeze etilena, ns cantitatea cea mai marese sintetizeaz n fructe, apoi ntr-o concentraie mai mic n flori i organe rnite.

.1.1.6 In;i8i$("i !i #"e$e"ii

2ulte substane au efecte inhibitoare asupra creterii plantelor, printre substaneleendogene enumerndu-se compuii fenolici i acidul abscisic.

'.


18/75

-aciune favorabil asupra cderii frunzelor i fructelor:-determin creterea permeabilitii celulelor fa de ionii de potasiu, ceea ce poate

influena nchiderea stomatelor:-acioneaz asupra nfloririi. 'plicarea acidului abscisic la plantele de zi scurt

cultivate n condiii perfecte de periodism, poate inhiba complet nflorirea acestora "Volubilis#

sau inhiba parial "Cenopodium rubrum#, sau chiar stimula nflorirea "!lumbago#. (n cazul ncare plantele de zi scurt sunt supuse unor condiii de zi lung poate induce nflorirea unoradintre specii i inhibarea altora. 'plicat asupra plantelor de zi lung, acidul abscisic poateinhiba nflorirea atunci cnd plantele sunt supuse unor condiii normale de fotoperiodism"spanac, "olium temulentum#. 'ceste observaii pot conduce la supoziia c nopile lungifavorizeaz sinteza acidului abscisic, dar aceast supoziie este prea simpl pentru e%plicareamodului diferit de aciune a acidului abscisic.

'cidul abscisic este foarte puin folosit n culturile in vitro, i n funcie de speciilefolosite i de condiiile de cultur utilizate poate induce reacii foarte diferite i greu deinterpretat.

C(n#&'5ii

0egulatorii de cretere endogeni sunt prezeni n plante pe tot parcursul vieii acestora,dar prezena acestora nu este constant. Concentraiile lor se schimb n cursul diferitelorstagii fiziologice i sunt diferite pentru fiecare parte a plantei, pentru aceeai etap fiziologic.Bariaia continu n plante a coninutului n regulatori de cretere determin problemele legatede alegerea momentului de recoltare a e%plantului.

8ehnicile de cultur in vitropot fi controlate de echilibrul fitohormonal, dintre carecele mai importante sunt au%inele i citochininele.

0aportul citochinin5au%in influeneaz procesele fiziologice din e%plante,determinnd evoluia acestora n diferite sensuri n funcie de concentraia celor doifitohormoni. 'stfel, dup S4oog, comportamentul fiziologic al e%plantelor va fi6

-dac raportul au%ine 5 citochinine este mare, se induce rizogeneza:-dac raportul este subunitar se induce lstrirea, e%plantele tind spre o funcionare

caulogenic:-dac raportul este apropiat de unitate, e%plantele au tendina s genereze formaiuni

calusare.'ceast schem general este ntotdeauna valabil, chiar dac e%ist variaii n funcie

de tipul de e%plant i mai ales n funcie de specia luat n cultur. &e lng acetifitoregulatori principali e%ist i ali regulatori de cretere ce s-ar putea dovedi indispensabili,dar n cele mai multe cazuri acetia au doar rol stimulator sau favorizant i rareori esenial.

. ALEGEREA E/PLANTULUI

Celulele vegetale vii au capacitatea potenial de a intra n diviziune i de a reproduceun individ ntreg similar plantei donor. 'ceast capacitate denumit ?totipotena celular@,indic faptul c fiecare celul deine toate informaiile necesare regenerrii unei plante ntregi,

proprietate ce este tot mai mult e%ploatat n culturile in vitro.Chiar dac toate celulele au totipoten nu este uor, cel puin pentru moment, s se

foloseasc n practic aceast calitate, ns cu ct cercetrile avanseaz, cu att numrulacestora va crete.

7ste mai uor de ales un grup de celule, de e%emplu un e%plant, capabil s reacionezen condiii artificiale de cultur unde s evolueze spre multiplicare clonal mai mult sau mai

puin semnificativ n funcie de rspunsul obinut. 2icropropagarea face posibil obinerea


19/75

de plante identice din punct de vedere genetic cu planta mam, ns uneori este i surs devariabilitate genetic atunci cnd e%plantul este supus anumitor condiii.

(nainte de a decide criteriile de selecie ale unui e%plant este necesar cunoatereaevoluiei fiziologice ce va auta la nelegerea diferenelor dintre comportamentul celulelorunui segment de plant atunci cnd este detaat de planta mam.

..1 E$!-e&e fi5i(&(i#e !&e 'nei -&!n$e

(n conte%tul reproducerii se%uate se poate preciza, ntr-o manier simplist, c ciclulde via al unei plante se mparte n patru stadii principale.

'. 7mbriogeneza

7mbriogeneza ncepe cu fecundarea unei oosfere de ctre un anterozoid. $ul astfelformat este proteat de ovul unde ncepe s se divid. Celulele se organizeaz la nceput ntr-omas sferic "faza globular a embrionului#, apoi se dezvolt forme simetrice reprezentnd

cotiledoanele rudimentare "faza cordiform a embrionului dicotiledonat# dup care sedezvolt structurile cotiledonare, hipocotilul, gemula i radicula "stadiul de torpedou alembrionului#. !e la acest stadiu ncepe diferenierea celular. Specializarea celulelor este ncfoarte puin datorat unei funcionri programate i mai mult datorit unui program genetic cese va pstra i n celulele mature ce n anumite condiii se vor comporta similar unor celulegametice, dnd natere unor organe sau embrioni, de aceast dat somatici.

(n momentul de fa, nu se cunoate pe deplin mecanismul diferenierii celulare. Sepresupune c poziionarea celulelor n relaie cu celelalte celule, dar i cu mediul de cultur,determin un schimb de semnale biochimice, ce moduleaz funcionarea fiecrei celule.

(n conte%tul ipotezei mai sus menionate, diferenierea celular intervine ca urmare adou cauze6 pe de o parte, datorit ereditii genetice a celulei "fiecare celul are acelaiechipament informaional genetic#, n care acioneaz programul embriogenic, iar pe de alt

parte, datorit poziionrii specifice a celulei care va fi recunoscut de structurilemembranare. 'ceste structuri filtreaz informaiile i permit sau mpiedic circulaia unuiasau altui semnal capabil s modifice programul informaional spre un anumit tip de celul.

Sfritul acestei prime etape este marcat, n general, dup ce substanele suntdepozitate n albumen sau cotiledoane, de deshidratarea seminei, ce induce intrareaembrionului n starea de laten. Seminele pot fi apoi diseminate, putndu-se pstra i rezistacondiiilor nefavorabile din mediul nconurtor.

A. Stadiul vegetativ

Cnd condiiile e%terne sunt favorabile i starea de laten este ntrerupt seminelegermineaz i din embrion ia natere o nou plant. !e creterea plantelor sunt responsabiledou tipuri de meristeme6 meristemul caulinar ce determin creterea prii aeriene a plantei imeristemul radicular, ce determin creterea prii subterane a plantei.

2eristemul caulinar are o structur bine definit, fiind alctuit dintr-o parte e%tern,epiderma de dou sau trei straturi numit tunica, i o parte intern sau corpus. (ntr-o seciunetransversal se poate observa o parte apical unde celulele au o activitate mitotic redus,nconurat de un inel de celule aflate n diviziune activ, celule responsabile de cretereatulpinii. !iviziunea ncepe de la inelul iniial6 zona epidermal difereniaz n frunzerudimentare spre e%terior, iar spre interior n parenchim cortical i vase conductoare. Centrul

este umplut de meristemul medular. 2eristemul caulinar are o funcionare ritmic programatgenetic cu o precizie aflat, n primul rnd, n aranamentul filota%ic al frunzelor "distribuie


20/75

corespunztoare unei simetrii particulare fiecrei specii# i, n al doilea rnd, n formafrunzelor. Se remarc aici c florile ce permit identificarea i clasificarea plantelor se bazeazaproape e%clusiv pe caracterele morfologice.


21/75

'ceast diferen indic faptul c principalele corelaii implic, n general, informaiidespre ntietatea mugurilor, care e controlat mai degrab de fenomene de cretere relativedect de motenirea genetic.

Stadiul vegetativ dureaz, n funcie de specie, de la cteva sptmni la cteva luni pean, un an pentru plantele bienale sau mai muli ani pentru cele perene. (n ultimul caz, sistemul

vegetativ va fi construit pe parcursul mai multor sezoane, perioadele de cretere alternnd cucele de repaus. 'ceast succesiune, care reflect adaptarea plantei la climatul mediuluinconurtor, este determinat de stimulrile sau inhibrile reliefate ca rspuns la variaiilecondiiilor de mediu "temperatur, lumin, secet, umiditate, etc#. &lantele ce intr n perioadade laten i sisteaz creterea, substanele glucizidice nefolosite sunt pstrate n rezerve, iarfrunzele speciilor lemnoase cad, sau prile aeriene ale plantelor ierboase se usuc. 'tuncicnd revin condiiile favorabile "latena mugurilor este indus de obicei de temperaturilesczute# rencep creterile, formarea frunzelor i a prilor aeriene.

C. Stadiul reproductiv

Stadiul reproductiv este marcat de modificrile de ritm n funcionarea meristemuluicaulinar.


22/75

'ceast scurt prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul vieii uneiplante ne permite nelegerea importanei interaciunilor ce regleaz morfogeneza plantelor.'stfel, interaciunile pe distan scurt, predominant genetice, au loc la nivelul embrionilor ial meristemelor vegetative i regenerative. 'lt tip de interaciuni sunt interaciunile dintreorgane ce permit plantelor s recunoasc mediul nconurtor i variaiile ce intervin la nivelul

acestuia. &lanta va putea s se adapteze noilor condiii datorit schimbului de semnale subforma fitohormonilor sintetizai n anumite locusuri, circulnd n direcia unui punct int cerspunde la acel stimul. (n cursul deplasrii lor fitohormonii sunt controlai de sistemeleenzimatice e%istente n plante. 'ceste interaciuni sunt de aa natur nct de-a lungul unuiciclu de via al unei plante, echilibrul endogen dintre regulatorii de cretere evolueazcontinuu i reflect la un moment dat, nu doar starea prezent a mediului nconurtor alcelulei, ci i ultimele evenimente petrecute cu acea celul. !atorit acestui fapt, la recoltareaunui e%plant trebuie s se in seama de valoarea acestui echilibru, ce depinde de stadiulfiziologic i de vrsta plantei donor, dar i de organul de pe care se prelev, precum i demrimea i natura fragmentului e%cizat.

.. Se&e#i! e2-&!n$e&("


23/75

crete i este apoi nlturat fiind ulterior altoit pe alt portaltoi. !up mai multe altoiri altoiulncepe s prezinte caracterele uvenile, ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butire.

9a culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme. &rima frunzulice se formeaz are caractere uvenile "prima frunzuli a meristemului la vi de vie arecaracteristici similare celei dezvoltate din smn, de asemenea, i la orhidee meristemele

dezvolt, n cultura in vitro, protocorm identic cu cel obinut din smn#. 0euvenilizareaobservat este deseori obinut din prima subcultur, ns uneori sunt necesare mai multesubculturi pentru a obine aceste efect, n funcie de specie.

(ntoarcerea la stadiul uvenil poate fi datorat supresiei de informaii citoplasmaticesau datorit diminurii considerabile a acestora determinnd astfel posibilitatea regenerrii denoi celule. 2ecanismele e%acte ce determin aceste fenomen nu sunt nc pe deplincunoscute. Se pare c citochininele sunt implicate, cel puin parial, n acest proces, dar ele nuacioneaz singure.

Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci cndplantele donor sunt n stadiul reproductiv. Se pare c schimbrile ce apar n ritmul defuncionare al meristemelor este favorabil i determin n esuturi un echilibru optim culturiiin vitro.

Se pot obine culturi din esuturi prelevate de la plante aflate n stadiul de senescen,dar rezultatele sunt n general slabe sau incomplete.

..* Se&e#i! e2-&!n$e&("


24/75

).7%plantele ce au o structur rudimentar sau organizat, cum e cazul mugurilor,ape%urilor caulinare, meristemelor i ape%urilor florale, sunt cele mai utilizate pentru iniiereaunei culturi de esuturi, deoarece acestea sunt receptive i ridic cele mai puine probleme,genernd cu uurin, n condiiile unui mediu de cultur adecvat, structuri organizate "dee%emplu, organe#. !ac mediul de cultur nu este potrivit poate tulbura funciile e%plantului

i conduce la dediferenierea celulelor, genernd calus.Etilizarea acestui tip de e%plante este similar unei microbutiri i este tehnica celmai des folosit atunci cnd se urmrete micropropagarea pe scar larg a unei specii.


25/75

ultimul caz, au%inele prezente n mediu au ucat cel mai important rol, pe cnd n cazulfragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat n oc i fitohormonii endogeni.

Se pot fasona e%plante din diferite tipuri de esuturi6 epidermal, cortical, parenchimmedular, dar i rspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de esut este cel epidermal.Oesuturile corticale i cambiale prezint de asemenea rezultate bune, dar rmn deseori n

stadiul de calus. &arenchimul medular este esutul cel mai puin regenerant, aceste esuturi cero armonizare perfect ntre regulatorii de cretere, un e%emplu fiind dat de S4oog, care afolosit mduv de tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre au%ine i citochinine.

!in esuturi epidermale de cteva straturi grosime a fost posibil orientarea regenerriispre stadiul caulogenic "lstari#, rizogenic "rdcini#, calusogenic sau reproductiv. 'ceste%periment confirm ipoteza unei activiti crescute a fitohormonilor asupra e%plantelor dedimensiuni reduse.

Cel mai mic e%plant este constituit dintr-o singur celul, cum e cazul protoplatilorizolai mecanic sau enzimatic. &rotoplatii sunt capabili de a se divide i a reproduce plante,dar nun sunt capabili de inducerea meristemelor florale.

.* R=SPUNSUL E/PLANTELOR N CULTUR=

&rima problem ce trebuie rezolvat, atunci cnd se iniiaz o cultur in vitro estemeninerea viabilitii "pe lng problema asepsiei# e%plantului. !eseori se poate observa,dup fasonarea e%plantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor ce vin n contact directcu mediul de cultur, fenomen datorat o%idrii substanelor fenolice sintetizate n mediu,o%idare ce are efect to%ic asupra celulelor vegetale. 2ai mult, celulele moarte pot diminua sauanula schimburile dintre e%plant i mediul de cultur. >u toate speciile prezint fenomenul de

brunificare a e%plantelor, deoarece la aceste specii problema este parial rezolvat prin imersiae%plantelor ntr-o soluie antio%idant "soluie de acid ascorbic cu acid citric n proporie de

,1 H respectiv ,1H#, imediat dup fasonarea acestuia sau prin adiia n mediul de cultur aunor substane adsorbante sau deto%ificante, cum ar fi crbunele activ ") pn la gDl# saupolivinilpirolidon "1 pn la )gDl#.

$dat rezolvat aceast problem este necesar orientarea e%plantului, n funcie denatura sa, n direcia dorit de operator.

.*.1 E2-&!n$e #' %$"'#$'"0 "'i+en$!"0

7%plantele din aceast categorie pot fi cultivate prin dou metode.&rima metod const n inducerea creterii apicale prin adiia n mediul de cultur a

fitohormonilor din clasa au%inelor iDsau a giberelinelor, foarte rar se pot aduga icitochinine, ntotdeauna ntr-o doz foarte mic.

!up iniierea pe acest tip de mediu se observ apariia unor formaiuni calusare labaza e%plantelor. 7ste de dorit ca aceste e%plante s rmn de dimensiuni mici, deoarecedac acest calus crete n dimensiune, ceea ce deseori se ntmpl, indic e%istena unuidezechilibru ntre substanele minerale sau fitohormonii din mediul de cultur. !up formareacalusului, ce are rol protector "asemeni calusului format la o ran# se formeaz primafrunzuli, apoi prima rozet de frunze i mai trziu are loc elongarea tulpinii "a%ului

principal#. 'ceste etape morfogenice pot avea loc pe acelai tip de mediu la unele speciiornamentale "crizanteme, garoafe# sau pe dou medii succesive, la speciile lemnoase. &rimulmediu va iniia creterea, putnd fi utilizat ulterior i pentru propagarea fragmentelor cu unnod "microbutire#. 'l doilea mediu, mbogit cu au%ine "cel mai frecvent, acidul indolilacetic#, servete ca mediu de nrdcinare "#ctinidia, mr, numeroase specii lemnoase#.


26/75

' doua metod const n blocarea creterii ape%ului caulinar favoriznd regenerareai dezvoltarea lstarilor laterali "a%ilari#, caz n care mediul de cultur este adiionat cucitochinin "de la ) la )mgDl#. 9starii regenerai pot fi izolai i crescui pe mediu pentrucretere, fr hormoni sau cu acid giberelic n concentraie mic. (n unele cazuri este nevoiede al treilea mediu de cultur pentru nrdcinarea lstarilor, mediu adiionat n general cu

au%ine.Etilizarea acestui tip de e%plante este important deoarece asigur posibilitateaefecturii unui numr foarte mare de subculturi i, din punct de vedere genetic, un minim devariabilitate.

.*. E2-&!n$e #(n%$i$'i$e in ife"i$e $i-'"i e e%'$

'ceste e%plante sunt compuse din diferite celule asociate n esuturi fr o organizarestructural, putnd proveni din orice parte a sistemului vegetativ "tulpin, frunze, rdcini#sau generativ "a% floral, sepale, petale, stamine, polen, ovul, fruct#.

Celulele ce rspund la cultura in vitrotrebuie s treac prin procesul de dedifereniere,

adic sa se ntoarc la stadiul de celule nedifereniate. 'cest tip de reversie este mai uor deobinut la celulele vegetale i mai greu la cele animale.

$bservaiile asupra acestui tip de celule au evideniat cteva modificri ce intervin nprocesul dediferenierii6 se reduce volumul vacuolar, dispar moleculele specializate, nucleulse mrete, citoplasma devine mai dens. !up realizarea acestor modificri celulele ncep sse divid, stadiu denumit histogenez, uor de realizat prin adiia n mediul de cultur aau%inelor. (n al doilea stadiu, numit organogenez, citoplasma celular devine i mai dens,cu vacuole mici i nucleu voluminos. Celulele pstreaz capacitatea de a se divide, darcelulele fiice vor fi capabile s se organizeze ntr-o mas meristematic ce se va dezvolta ntr-un nou individ.

$bservnd un e%plant n cultur se observ formarea, mai nti, a unei formaiunicalusare cu rol protector. Celulele aflate n imediata apropiere a mediului sunt primele cencep s se divid i s se dediferenieze.

!ac celulele ce vin n contact cu mediul brunific, nu se mai formeaz calus i decitot e%plantul moare. Celulele ce rspund la cultura in vitroau o poziie precis, de e%emplu la

Begonia re$, celulele generatoare sunt cele subepidermale situate la baza periorilorglandulari. (n general celulele int, adic celulele ce rspund uor culturii pe mediu artificial,sunt cele epidermale, n special cele provenite din tunic, dar pot avea i alte origini. 'cestecelule se vor organiza ntr-un meristem, care va dezvolta ulterior o plantul ntreag cu tulpinii rdcini, cum este cazul laBegonia i Saintpaulia.

9a alte specii, cum ar fi!elargonium, se observ n primul stadiu formarea de calus

"calusogeneza#, unde celulele regenerante se divid activ, i doar n al doilea stadiu, ce poateavea loc pe acelai mediu de cultur sau pe alt mediu, se dezvolt meristemul ce va da naterenoii plantule. Cnd se formeaz meristemul prezint, n funcie de specie, acelai mod de a sedezvolta ca i e%plantele organizate, doar c se cere un mediu mai comple% pentru a asiguraelementele nutritive necesare dezvoltrii complete pn la stadiul de plantul.

'l doilea proces de organizare, mai puin frecvent, este acela n cursul cruia celulelese vor comporta ca un ou fertilizat, urmnd etapele embriogenezei. Bom vorbi astfel deembrioni sau embriogenez somatic. 'cest fenomen, descris pentru prima dat la celule demorcov, a fost descoperit la mai multe specii, att anuale ct i perene.

Ca o trstur general, inducerea embriogenezei depinde n cea mai mare msur decompoziia mediului de cultur, dar i de genotipul de la care se prelev celulele generatoare.

(n multe cazuri embriogeneza somatic, este precedat de formarea de calus, n acest cazizolarea celulelor nu mai este un factor decisiv "=ig #.


27/75

(n cursul dezvoltrii se observ cum celulele se divid i embrionii aung n stadiulglobular, apoi apare simetrie ntre forme i embrionul evolueaz spre stadiul cordiform i apointr-un embrion capabil s genereze o plantul "=ig )#.

&entru celulele capabile s genereze embrioni somatici sunt suficiente dou medii decultur. &rimul asigur formarea embrionilor, putnd servi i ca mediu de micropropagare, iar

al doilea va induce germinarea embrionilor.Eneori sunt necesare mai multe subcultivri pe medii fr hormoni pentru a inducegerminarea embrionilor somatici i creterea plantulelor, n timpul acestor subcultivri are locdiluia fitohormonilor la nivel celular permind astfel dezvoltarea normal a celulelor.

=ig. 7mbrioni somatici de morcov regenerai din calus

Etilizarea e%plantelor difereniate este foarte avantaoas deoarece sursa de e%planteeste nelimitat i rata de multiplicare poate atinge valori considerabile. (n funcie de rspuns,aceste e%plante prezint unele dezavantae la nivel genetic.

(n primul rnd, celulele ce dau natere noilor plantule sunt somatice i e%istprobabilitatea ca celule mutante s genereze embrioni din care s ia natere noi plante.

=ig.) 7mbrioni somatici de citrice6 a# n stadiul globular, b# n stadiul cordiform, c#genernd o plantul

(n al doilea rnd, cea mai mare rat de inducere a embriogenezei somatice are loc dincalus, caz n care, datorit ritmului intens de diviziune celular numeroase celule pot prezentamodificri la nivel genetic "modificri cromozomale de tipul poliploidiei sau aneuploidiei, saumodificri citoplasmatice#. 'ceast variabilitate poate fi suficient de mare i n unele cazuri a

fost chiar folosit pentru inducerea de mutani, prin stimularea formrii calusului pe mediiadecvate fitohormonal i chiar prin subculturi succesive ale calusului pentru creterea

a b c


28/75

probabilitii mutaiilor. !up fragmentarea calusurilor i inocularea lor pe medii pentruregenerare, s-a observat c printre plantulele neoformate unele prezentau modificrimorfologice evidente mai ales citoplasmatice. (n consecin, de fiecare dat cnd propagareaunei specii necesit trecerea prin stadiul de calus se impune verificarea calitii genetice a

plantelor obinute.

Ca o concluzie a celor spuse mai sus, cercetrile asupra culturilor ce au pornit de lae%plante difereniate au permis nelegerea modului de aciune al fitoregulatorilor de cretere,a cror echilibru n mediul de cultur este determinant pentru orientarea celulelor sfuncioneze ntr-un ritm ales de operator, innd cont de echilibrul endogenic. >u se tie nicin prezent care este modalitatea de a determina e%act concentraia i balana hormonal atuncicnd se apeleaz la fitoregulatori e%ogeni, dar pe de alt parte, acetia din urm permitcercettorilor manipularea materialului biologic n sensul dorit.'ceste cercetri, ce sunt nc incomplete, sunt baza de la care s-a pornit n realizarea multoraplicaii practice, unele dintre ele fiind acum parte din procesul de micropropagare ce anceput s fie tot mai mult folosit.

CAPITOLUL III

*.1 ORGANIZAREA UNUI LABORATOR DE CULTURI DECELULE I ESUTURI VEGETALE

(ncperile destinate cultivrii in vitro a e%plantelor vegetale trebuie s fie6 luminoase,lipsite de igrasie, s prezinte instalaii de iluminare, canalizare, curent electric, toate n

perfect stare de funcionare. $rice defeciune poate perturba desfurarea normal alucrrilor efectuate n acest laborator.

(n toate compartimentele laboratorului trebuie asigurat o curenie perfect, praful imurdria constituind surse de infecii. 8oate operaiunile, cum ar fi6 repartizarea mediilor decultur, prelevarea, dimensionarea i inocularea e%plantelor vegetale se realizeaz n condiiiaseptice.

$ condiie esenial n reuita unei culturi in vitroconst n realizarea unei asepsiiperfecte, att a materialului biologic ct i a mediului de cultur. (n cazul n care aceastasepsie nu este asigurat, n mediul de cultur pot aprea infecii microbiene i fungice ncirca +-1 zile de la inoculare, ceea ce duce la modificarea proprietilor substratului decultur, eliberarea de to%ine, modificarea p-ului i astfel dezvoltarea e%plantelor esteinhibat.

*.1.1 O"!ni5!"e! %-!ii&("


29/75

A. Z(n! ne%$e"i&0

).Spltorul!estinaie6 este ncperea n care are loc splarea sticlriei i recipientelor destinate

culturilor in vitro.

'ceast ncpere trebuie s fie organizat astfel6-s fie prevzut cu ciment pe os i cu canalizare n pardoseal:-splarea sticlriei se va face n bazine de capacitate corespunztoare, n funcie de

volumul de munc e%istent n laborator:-s fie dotat cu o chiuvet cu ap cald i rece, suporturi pentru uscarea sticlriei,

dulapuri pentru depozitarea sticlriei, couri pentru gunoi:-poate s fie dotat i cu un distilator pentru ap.2odul de splare6-se pregtete sticlria care urmeaz a fi splat:-se elimin resturile de mediu i resturile vegetale din vasele de cultur:-mediile de cultur cu agar se colecteaz i se arunc la gunoi:

-n cazul vaselor contaminate este obligatoriu ca acestea s fie autoclavate nainte de afi deschise pentru a se evita rspndirea infeciei n laborator:

-se pune sticlria la nmuiat n ap cald cu detergent, n bazinele destinate splrii:-se efectueaz splarea propriu-zis folosind perii utilizate n splarea sticlriei:-se cltete sticlrie n ap de robinet i apoi n dou reprize de ap distilat:-se aeaz sticlria pe suporturile speciale destinate uscrii acesteia.Se consider sticlria curat atunci cnd la suprafaa acesteia nu mai ader nici o

pictur de ap.

+.Camera pentru sterilizare!estinaie6 este locul n care se efectueaz sterilizarea mediilor de cultur, a apei

distilate i a vaselor de cultur.$rganizare6-trebuie s fie prevzut cu pardosea din ciment i instalaie de canalizare, sa fie

racordat la reeaua de gaze, conectat la curent electric i s posede o surs de ap:-este dotat cu autoclave pentru sterilizarea mediilor de cultur i a apei distilate:

trebuie s e%iste dou tipuri de autoclave6 unul conectat la reeaua de curent electric "fig. )# iarcellalt avnd ca surs de energie gazul metan: sterilizarea vaselor cu mediu de cultur serealizeaz n casolete metalice sau couri de srm:

-n unitile cu activitate mai redus sterilizarea mediilor de cultur i a apei distilatese poate face i n 4u4te:

-este dotat cu etuve pentru sterilizarea sticlriei.

;.Camera pentru prepararea mediilor de cultur!estinaie6 este ncperea n care se realizeaz prepararea mediilor de cultur.

$rganizare6-trebuie s fie spaioas i iluminat corespunztor:-trebuie s fie dotat cu instalaii de canalizare, curent electric, gaz, ap curent:-pardoseala trebuie s fie acoperit cu un material uor lavabil, iar mesele s fie

placate cu faian sau folie melaminat pentru a fi uor de ntreinut:-aceast ncpere va fi dotat cu etuve, pupinele pentru presterilizarea

instrumentarului, agitatoare magnetice, bi marine, p-metru "=ig.+#, frigider, congelator,


30/75

distilator "=ig.;#, balan tehnic i balan analitic "=ig.#, precum i un variat sortiment desticlrie.

.Camera de cretere!estinaie6 este destinat pstrrii inoculilor n condiii optime n vederea creterii i

dezvoltrii acestora.

$rganizare6-trebuie s fie perfect curat, faianat, bine izolat de mediul e%tern, dotat cuinstalaie de curent electric, sistem de climatizare:

-camera va fi ocupat cu rafturi pe care se aeaz vasele de cultur, avnd poliesituate la distane de -1 cm, fiecare poli avnd sistem de iluminare ce poate fi ntreruptseparat:

-iluminarea se realizeaz cu tuburi fluorescente, realiznd o intensitate luminoas de;- luci:

-fotoperioada n camera de cretere trebuie s fie, de regul, de )3 ore lumin i * orentuneric: studii recente "8eodorescu 'l. i colab., ),)1# reliefeaz c durata Pzilei@

poate fi redus fr probleme la )-)+ ore realizndu-se astfel importante economii de

energie:-nivelul temperaturii trebuie s fie, n general, ntre ++-+oC: n funcie de specie,

scopul urmrit i tipul de cultur aceasta poate varia ntre )1-;oC:-umiditatea din camera de cretere trebuie s fie cuprins ntre N-N1H: reducerea

umiditii sub aceste valori poate determina deshidratarea mediului de cultur cu consecinegrave asupra plantelor:

-pentru culturile pe mediu lichid, n camera de cretere trebuie sa e%iste unui sistem deagitare, pentru asigurarea o%igenrii esuturilor e%plantului inoculat.

B. Z(n! %$e"i&0

Camera steril!estinaie6 n aceast ncpere se e%ecut repartizarea mediului de cultur precum i

prelevarea, sterilizarea i inocularea e%plantelor sau subcultivarea materialului biologiccrescut in vitro.

$rganizare6-trebuie s fie ct mai izolat de restul ncperilor din zona nesteril pentru a

prentmpina vehicularea germenilor:-trebuie s fie prevzut cu instalaii de gaz, curent electric, dar fr ap curent i

canalizare:-pardoseala va fi placat cu gresie, iar pereii cu faian:

-cea mai important dotare din camera steril este hota cu flu% de aer steril: sunt doutipuri de hote 5 cu flu% de aer orizontal i flu% de aer vertical, ambele fiind dotate cu baterii defiltre ce permit reinerea particulelor mai mari de ,+ micrometri: ele trebuie s permit lucrula dou persoane concomitent: cele mai folosite sunt hotele cu flu% de aer orizontal:

-hota cu flu% de aer steril trebuie s posede sistem propriu de iluminare i posibilitateaatarii a )-+ becuri de gaz:

-nainte de nceperea lucrului cu cel puin + minute hota se pornete pentru a serealiza sterilizarea incintei de lucru: n acelai timp se pune n funciune lampa EB i se

pulverizeaz alcool n interiorul hotei:-alte dotri n camera steril sunt6 scaune rotative pentru personalul care lucreaz la

hot, dulapuri pentru sticlria steril, cuptor cu microunde, msue pentru depunerea vaselor

cu medii i a celorlalte materiale folosite n perioada de lucru:


31/75

-nainte de nceperea lucrului personalul se va spla pe mini n antecamer, iar ncamera steril se va clti cu alcool i va purta echipamentul specific6 halat alb, boneta imasc pe figur.

*.1. D($0"i&e ne#e%!"e


32/75

a bc

d e f

gh

i

=ig.)) !otrile necesare ntr-un laborator de culturi de celule i esuturi vegetalea# etuv: b# p-metru: c# microscop binocular: d# lup binocular: e# distilator: f# balan

analitic: g# centrifug: h# balan tehnic: i# autoclav


33/75

CAPITOLUL IV

4.1 CERINELE NUTRITIVE ALE ESUTURILOR VEGETALECULTIVATE N CONDIII ASEPTICE

4.1.1 ei'& e #'&$'"0

7%plantele vegetale pentru a putea tri, dup desprinderea de planta donator, au nevoiede condiii speciale de cultur, s fie proteate de agenii patogeni "asepsie total# i s aib casurs de hran o soluie nutritiv comple%, format din ap, sruri minerale, substaneorganice i fitohormoni. &entru meninerea e%plantelor la suprafa i pentru ca acestea s nufie asfi%iate, mediul de cultur se solidific cu un agent de solidificare. Soluia nutritivcomple% lichid sau solid se numete mediu de cultur sau substrat de cultur. 'cest mediude cultur trebuie sa fie steril i cu o compoziie comple% deoarece e%plantul nu arecapacitate de a se hrni autotrof, el triete heterotrof pe baza substanelor e%istente n mediu.

(n funcie de scopul urmrit, evoluia e%plantului poate fi diriat prin modificareacompoziiei mediului, obinndu-se calus sau regenerarea de noi plante prin stimulareaorganogenezei.

Compoziia mediului de cultur este specific pentru fiecare specie, soi i faz dedezvoltare, cerinele fiind diferite i n funcie de e%plantul folosit, momentul de prelevare izona din care s-a prelevat, chiar n cadrul aceluiai soi. (n prezent se cunosc i se utilizeaz oserie de medii de cultur ce poart numele celor care le-au creat6 Rhite, 2urashige-S4oog,

>itsch, Gamborg, eller "8abelul .)#.Compoziia mediului s-a stabilit att prin tatonri repetate cu diferite substane, ct i

prin studii ale sevei brute i elaborate la diferite specii, studii privind absorbia i desorbia,schimbul ionic care e%ist ntre plant i mediul nconurtor. (n prezent se cunosc destul de

bine modificrile pe care le sufer plantele cnd elementele chimice sunt n e%ces sau ndeficit. 8rebuie evitate pe ct posibil aceste stri de stres pentru plante att la cultura n cmp,ct mai ales la culturile in vitro.

4.1.1.1 C(+-(5ii! #;i+i#0

A. C(+-'ii !n("!ni#i i "(&'& &("

A-!'pa reprezint componentul esenial al vieii, al materiei vii. 7ste utilizat n tot

?flu%ul tehnologic@ de producere a plantelor in vitro, de la splarea materialului vegetal i avaselor de cultur, pn la utilizarea ei ca solvent pentru celelalte componente i elemente dediluie pn la concentraia dorit. &ierderea apei din esuturi provoac perturbri metabolicedirect proporionale cu cantitatea de ap pierdut. Stresul hidric este suportat de plante daceste de scurt durat i dac nu se atinge nivelul de veteire. (n aceast ultim faz plantelesunt capabile de rehidratarea esuturilor puse n condiii favorabile de umiditate, dac deficitulde ap se menine plantele mor.

9a culturile in vitroe%ist momente cnd e%plantele pot s-i piard turgescena prinpierderea apei, momente n care trebuie acordat atenia cuvenit, pentru asigurareasuccesului culturii.

Sterilizarea materialului vegetal este o etap critic din acest punct de vedere,deoarece soluiile utilizate sunt concentrate pentru distrugerea agenilor patogeni. 8rebuiecorelate foarte bine timpul de sterilizare i concentraia soluiilor utilizate n funcie de starea


34/75

de vegetaie a materialului vegetal, pentru evitarea pierderii apei prin e%osmoz. &relevareae%plantelor trebuie fcut repede, altfel datorit dimensiunilor mici pierd repede apa printranspiraie, prin rnile care sunt mari comparativ cu mrimea lui. 2anipulrile sub hottrebuie fcute destul de repede deoarece curentul de aer deshidrateaz relativ uor e%plantelecare stau descoperite.

&e timpul creterii e%plantelor n camera de cretere, vasele trebuie s fie nchisepentru a evita pierderea apei prin transpiraie, ce ar determina concentrarea mediului nelemente nutritive, ar provoca crparea mediului i ca atare slaba cretere a culturilor. &entrurespectarea strict a concentraiilor soluiilor stoc sau a mediului, apa trebuie distilat, decieliberat de ionii minerali pe care i conine. 9a splarea materialului vegetal dup sterilizarese folosete ap steril, sterilizare ce se face n autoclav odat cu sterilizarea mediului sauseparat.

S0"'"i&e !n("!ni#eSubstanele anorganice sunt introduse n mediu sub form de sruri. Cele mai utilizate

sunt6 azotaii, fosfaii, clorurile i sulfaii de Ca, /, 2g, 2n, 'l, =e, 2o, n, Cu, >a, etc.

'bsorbia elementelor din mediu se face sub form de ioni, utilizarea uneia sau alteia dinsruri este n funcie de cerinele fiecrei specii i de faza de vegetaie. (n funcie de cantitateade elemente ce se folosete n mediu, elementele se mpart n6

-macroelemente - utilizate n concentraii de ordinul milimolilor 5 C, $, , >, /, Ca,&, S, 2g:

-microelemente sau oligoelemente, utilizate n concentraii de micromoli.

T!8e&'& 4.1&rincipalele medii de cultur utilizate n culturi

in vitro"dup Street, )NN#C(n%$i$'eni 7e&&e" ?;i$e Ni$%#; '"!%;ie

S@((

G!+8("

Macroelement

+&

/Cl N1 31 - - ->a>$; 3 - - - -

2gS$% N+$ +1 N+ )*1 ;N +1>a+&$% +$ )+1 )3,1 - - )1

CaCl+% ++$ N1 - - )1CaCl+ - - )33 - -/>$; - * 1 ) +1

>a+S$ - + - - -">#+S$ - - - - );

>>$; - - N+ )31 -/+&$ - - 3* )N -Ca">$;#+ %

+$- ; - - -

Microelemente

=eS$% N+$ - - +N,* +N,* +N,*>a+7!8' %

++$- - ;N,; ;N,; -

2nS$% +$ - - - - ),2nS$% +$ ,) N, +1 ++,; -

/< ,) ,N1 - ,*; ,N1>iCl+% 3+$ ,; - - - -CoCl+% 3+$ - - - ,+1 ,+1nS$% N+$ ), ;, ), *,3 +,CuS$% 1+$ ,; - ,+1 ,+1 ,+1


35/75

;A$; ), ),1 ), 3,+ ;,=eCl;% 3+$ ), - - - ->a+2o$%

++$- - ,+1 ,+1 ,+1

'lCl; ,; - - - -=e"S$#; - +,1 - - -

C(n%$i$'eni("!ni#i


36/75

Bitaminele&lantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor, dar nu i

esuturile cultivate in vitro. S-a demonstrat e%perimental ca in vitro esuturile i plantulelerspund favorabil la adaosul e%ogen de vitamine n cantiti mici. 2aoritatea vitaminelor

sunt termolabile, sunt distruse la temperaturi ridicate, uneori cu ocazia autoclavrii, dar s-aobservat c i substanele reziduale au rol favorabil asupra culturii.&rincipalele vitamine utilizate n mediile de cultur sunt6-tiamina "vitamina A), aneurina#, se folosete n concentraii cuprinse ntre ,)-)

mgDl: stimuleaz creterea vegetativ, sporirea biomasei produs in vitro:-pirido%ina "vitamina A3#, ,)-) mgDl: precursor a unor coenzime, cataliznd reacii de

baza n metabolismul aminoacizilor:-riboflavina "vitamina A+#, ,)-) mgDl, rezistent la temperaturi ridicate "+*oC#:

inhibitor al creterii rdcinilor, rol n metabolismul celular:-acidul pantotenic "vitamina A1#, este mai puin utilizat ca atare: pantotenatul de calciu

se folosete n concentraii cuprinse ntre ,1-+,1 mgDl:

-cobalamina "vitamina A)+#, este mai rar folosit, stimuleaz sinteza nucleoproteidelor:-acidul nicotinic "vitamina A;, niacina#, ,1-1 mgDl, rezistent la temperaturi ridicate

"+;-+;NoC#: rol n metabolismul intermediar:-biotina "vitamina #, ,) mgDl: stimuleaz creterea esuturilor meristematice i

proliferarea celulelor:-acidul folic, ,) mgDl: efect stimulator asupra creterii esuturilor la lumin: la

ntuneric are efect to%ic:-acidul para-aminobenzoic, ) mgDl: stimuleaz biosinteza acidului pantotenic i a

biotinei:-acidul ascorbic "vitamina C#, )-) mgDl, prin autoclavare se distruge n bun parte:

este activator general al metabolismului celular:-vitamina 7 "tocoferolul#, mrete sensibilitatea celulelor la au%ine:-inozitolul "mio-inozitolul, mezo-inozitolul, he%ahidro%i-ciclohe%an#, )-) mgDl:

este considerat att vitamin ct i glucid: stimuleaz diviziunea celular.

=itoregulatorii=itohormonii, fitoregulatorii sau substanele regulatoare de cretere sunt substane

organice utilizate n cantiti mici cu rol de a stimula, inhiba sau controla procesele fiziologicede cretere i dezvoltare. 7%ist fitohormoni endogeni, sintetizai de plante i fitohormonie%ogeni sau de sintez.

Oesuturile in vitro nu sunt capabile s-i sintetizeze ntreaga cantitate de care au

nevoie, fiind necesar adugarea lor n mediul de cultur pentru a asigura o bun cretere ae%plantelor. Cei mai folosii fitohormoni n culturile in vitro sunt au%inele, citochininele igiberelinele.

A'2ine&e5 sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogenez alturi decitochinine. 'u%ina natural descoperit este '


37/75

-modific permeabilitatea membranelor plasmatice pentru ap i ioni:-rol important n dominana apical:-inhib formarea embrionilor somatici n suspensiile celulare:'u%inele sunt sintetizate n partea aerian a plantelor n muguri, frunze, fructele tinere

i bobocii florilor de unde circul n toat planta. Cel mai mult se folosesc '>' i +,! care

sunt mai stabile, nu se o%ideaz n prezena luminii. +,! este mult utilizat pentru inducereai creterea calusului i pentru rizogenez. 9a calus asigur friabilitate mare uurnd separareacalusului pentru cultura de suspensii celulare i n embriogeneza somatic.

Ci$(#;inine&esunt substane ce se gsesc n cantiti relativ ridicate n fructe, semine,etc., iar ca structur au la baz adenina i un nucleu purinic.

&rima citochinin izolat a fost chinetina, e%perimentat cu succes la culturile in vitro.9a scurt timp s-a sintetizat benzil aminopurina "A'. (n prezent se folosesc pentru culturilede esuturi patru citochinine dintre care dou naturale "+


38/75

-formeaz cu apa un gel care se topete la )oC i se solidific la 1 oC, rmnndsolid n condiii normale de cultur:

-nu este to%ic pentru plante i nu este asimilat de plante:-nu conine elemente minerale care s afecteze echilibrul dintre ioni n mediul de

cultur, fa de reeta de mediu folosit:

-nu reacioneaz cu constituenii mediului.Cantitatea de agar utilizat la litru de mediu difer n funcie de consistena dorit, ntre,1-)H.

Cu rol similar n solidificarea mediului de cultur se mai folosesc6-agaroza are un nalt grad de purificare i se folosete mai ales pentru cultura

protoplatilor i n prepararea gelului pentru electroforez:-acidul alginic se folosete pentru cultura protoplatilor, suspensiilor celulare i pentru

ncapsularea embrionilor somatici n vederea obinerii seminelor artificiale:-phQtagelul "Gelrite# produce un gel limpede. Se folosete n concentraii de ),1-+, H

i se gelifica la +N-;)oC. Se utilizeaz mai ales la speciile care necesit un p mai acid,asigurnd solidificarea mediului i n aceste condiii.

C. A&$e %'8%$!ne '$i&i5!$e

Aenin! are rol regulator n mediul de cultur, favorizeaz formarea muguriloradventivi, stimuleaz creterea i alungirea ape%urilor ct i rata de multiplicare. Se pare care o aciune sinergic cu a citochininelor putnd fi un precursor al acestora. !e regul sefolosete sub form de sulfat de adenin, n doz de -* mgDl.

C(+-'ii fen(&i#istimuleaz creterea calusului, favorizeaz nrdcinarea, creterealstarilor i a ratei de multiplicare. 're o aciune sinergic cu a au%inelor, n special cu '


39/75

4.1.1. C!"!#$e"i%$i#i&e fi5i#e !&e 'n'i +ei' e #'&$'"0

2etabolismul unui esut vegetal poate fi modificat integral n funcie de consistenamediului de cultur. 0dcini de cicoare cultivate pe hrtie de filtru mbibat cu mediu lichid

pot produce doar lstari vegetativi, n timp ce cultivate pe mediu solidificat cu agar pot genera

muguri florali. 'legerea tipului de mediu de cultur, lichid sau solid, prezint o importandeosebit.9a mediul solid, concentraia de agar-agar, precum i calitatea acestuia au un efect

distinct. 2asa calusului de cartof se dubleaz atunci cnd concentraia de agar-agar din mediucrete de la ,* la )H, iar microbutaii de anghinare prezint fenomenul de hiperhidricitate pemediu cu o concentraie de agar-agar de ,3H , ce dispare atunci cnd concentraia agaruluicrete la ),)H.

Concentraia optim de agar variaz n funcie de tipul de organ cultivat, de calitateaagarului folosit i de p-ul mediului. (n general, consistena mediului de cultur crete odatcu p-ul acestuia.

8recerea unor e%plante pe mediu lichid poate constitui o faz necesar n procesul de

micropropagare, ca n inducerii embriogenezei somatice la morcov din celule de calus nmediu lichid. (n cazul garoafelor, meristemele izolate sunt cultivate n mediu lichid cu agitare

pentru a induce lstrirea a%ilar multipl. Biteza de agitare a mediilor lichide este n generalsczut atunci cnd se cultiv organe "cca )rpm# i ridicat n cazul culturii de suspensiicelulare "cca ) -)1rpm#.

!ac n alte tipuri de culturi nu se acord o mare importan schimbului de gaze, laculturile in vitroschimbul de gaze cu e%teriorul prezint o mare importan pentru inoculi.Schimburile de gaze se realizeaz prin difuzie, diferenele de concentraie ntre gazele dininteriorul containerelor i cele din mediul ambiant e%terior, precum i variaiile detemperatur influennd aceste schimburi. $rganogeneza indirect la morcov este stimulat dereducerea concentraiei de o%igen, pe cnd nrdcinarea lstarilor a fost stimulat decreterea acesteia. 2ai multe e%perimente au dovedit c difuzia liber a o%igenului n esuturia afectat semnificativ capacitatea organogenic a acestora. 'lte studii au demonstrat cintervenirea unei modificri n schimburile de gaze dintre esuturile cultivate in vitroi mediua indus apariia unor modificri n morfologia plantulelor. !e aceea, este demn de luat nconsiderare i tipul de vas de cultur folosit pentru culturile de celule i esuturi, precum i decapacele utilizate6 capace cu burete, parafilm, folie de aluminiu, etc.

En alt factor important pentru mediul de cultur i implicit pentru plntueleregenerate in vitroeste p-ul. (n practic, austarea p-ului se face la 1,1-1,* n timpul

preparrii mediului de cultur. 8otui, n dese cazuri p-ul mediului scade n timpulautoclavrii sau chiar n timpul culturii ceea ce poate avea efecte nedorite asupra materialului

vegetal. Se tiu nc foarte puine despre efectele acestor variaii ale p-ului i despre cauzeledeterminante.

4. FACTORII FIZICI CARE INFLUENEAZ= CULTURILE DEESUTURI

&rincipalii factori ai mediului nconurtor sunt lumina i temperatura. Emiditatearelativ este irelevant atta timp ct n interiorul vaselor de cultur aceasta atinge valori deapro%imativ )H.

4..1 L'+in!

Cerinele fa de lumin pot fi divizate n mai muli parametri6


40/75

-intensitatea luminii pe unitatea de suprafa&e%primat n RDm+"unitatea lu% nu armai trebui folosit ca unitate de msur a intensitii luminoase, deoarece depinde defiziologia ochiului uman, ceea ce este total neadecvat necesitilor unei plante#:

-durata ilumin&rii, e%primat n oreDzi:-calitatea spectral&a luminii primite de plante.

&entru culturile de esuturi, fotosinteza nu este o activitate necesar atta timp ctenergia este furnizat sub forma carbohidrailor. 8otui, unele cercetri au evideniat cfotosinteza nu este eliminat n totalitate din culturile de esuturi vegetale, dar esteconsiderabil redus probabil datorit prezenei zaharurilor n mediu.

>umeroase studii au dovedit c lumina este indispensabil reglrii multor procesemorfogenetice.

'.u e%ist multe date cu privire la influena fotoperiodismului asupra morfogenezeiesuturilor in vitro, aa cum e%ist dovezi clare ale influenei acestui parametru asupra

plantelor donor, in vivo. Se pare c n medie, calitatea luminii "intensitatea T durata luminii#este important dezvoltrii armonioase a plantulelor n condiii aseptice de cultur.

(n practic, marea maoritate a camerelor de cretere au o durat a iluminrii de )3-)*oreDzi.

Cerinele fa de durata de iluminare, din camerele de cretere sunt diferite n funciede natura e%plantului, scopul urmrit dar i de specia la care se e%perimenteaz. 'stfel, lagru, n cazul culturii de antere, n vederea obinerii de produi androgenetici, s-a dovedit c,anterele cultivate n primele ase sptmni la ntuneric, vor forma un procent mai ridicat de

produi androgenetici. !up aceast perioad, culturile vor fi incubate n condiii normale defotoperioad cu )3 ore lumin i * ore ntuneric.

C.Calitatea luminii

>umeroase studii au evideniat c spectrul luminos influeneaz procesele fiziologicei morfologice ale celulelor cultivate in vitro. 9umina albastr "cca 3Nnm# sau violet "cca)nm# induce formarea de lstari din calus de tutun, iar cea roie "cca 33nm# inducerizogeneza. 'ceste rezultatele asemntoare altora indic faptul c procesele morfogenetice

par a fi reglate de pigmenii fotoreceptori, cum ar fitocromul. (n mod normal, lumina ?de zi@conine radiaii n principal albastre, iar lumina numit ?lumin alb@ conine radiaii roii, darnu se cunosc cu e%actitate curbele spectrale de emisie ale acestora. (n general, tuburilefluorescente albe aflate n comer sunt adecvate culturilor de esuturi.

(n ultimul timp au aprut n comer dou tipuri de tuburi fluorescente6 tuburi cu

?lumin cald@ i tuburi cu ?lumin rece@, astfel c, o combinaie ntre cele dou tipuri detuburi s-a dovedit a fi foarte potrivit pentru culturile incubate n camerele de cretere.


41/75

4.. Te+-e"!$'"!

(n general, temperatura folosit n camerele de cretere este de ++-+oC. 'cestetemperaturi sunt la pragul critic, deoarece n interiorul vaselor de cultur temperatura poate fi

cu + pn la oC mai mare dect n camera de cretere. &ractic, temperatura din camera decretere trebuie s fie cu +oC mai mic dect cea necesar speciei cultivate in vitro. Speciileprovenite din climatul temperat sunt obinuite la temperaturi mai sczute dect speciiletropicale, de aceea ar fi de dorit ca pentru speciile din zonele temperate s se setezetemperatura n camera de cretere la +U)oC , iar pentru cele tropicale la +1U)oC.

!e asemenea, temperatura n camera de cretere va fi diferit i n funcie de scopulurmrit n cultura in vitro. 'stfel, la cartof, s-a observat c o temperatur de cca )oC,influeneaz pozitiv formarea minituberculilor, n timp ce la gru, cultura de antere necesit otemperatur de cca +NoC.

!e aceea, se recomand ca fiecare unitate de cercetare s beneficieze de cel puin doucamere de cretere, n care temperatura s poat fi reglat n funcie de necesitile e%plantelor

i tipurilor de culturi e%istente.(n natur, plantele sunt supuse unor fluctuaii de temperatur, iar reproducerea lor n

camera de cretere ar fi fr ndoial avantaoas. 8otui, prea puine studii au fost fcute naceste sens pentru a putea trage o concluzie relevant.

CAPITOLUL V

6.1 ASEPSIA I ASEPSIZAREA

$ condiie esenial, n realizarea culturilor de celule i esuturi vegetale, este

asigurarea unei perfecte sterilizri, nu doar a mediului de cultur i a recipientelor, ci i atuturor celorlalte componente unei culturi in vitro, cum ar fi materialul biologic, instrumentardar i a suprafeelor n care se desfoar astfel de activiti.

Cile posibile de infecie trebuie e%cluse cu rigurozitate. Contaminarea cumicroorganisme a recipientelor, mediului de cultur i materialului biologic se poate producefoarte uor, att n faze incipiente, n momentul inoculrii, ct i n momentul repicriiculturilor: alteori infeciile se produc n mod pasiv, datorit ineficienei sistemului denchidere a vaselor de cultur, a manipulrii lor neatente, sau a dezvoltrii ntrziate a unorgermeni care au stat n stare latent n esuturile profunde ale inoculilor.

6.1.1 S$e"i&i5!"e! "e#i-ien$e&(" e #'&$'"0

(ntruct, o serie de microorganisme au spori rezisteni la temperaturi ridicate i ladiferii ageni sterilizani, se recomand presterilizarea prin cldur uscat, a sticlriei, netuve, prealabil introducerii mediului de cultur n recipiente. 'poi se va proceda la oresterilizare a recipientelor cu medii, prin cldur umed, respectiv, prin autoclavare.Sterilizarea prin cldur uscat se va face la )3 oC, timp de +-; ore, ntruct e%ist anumiteforme de bacterii termorezistente. !urata e%punerii sticlriei la temperatur ridicat depinde ide modul n care aceasta a fost splat, dac a fost sterilizat prin autoclavare, prealabildeschiderii flacoanelor infectate, precum i n dependen de gradul de infectare al atmosfereidin laborator. !ac ns se depete temperatur de sterilizare a sticlriei, peste )* oC se

poate produce degradarea calitii acesteia i eliberarea de compui to%ici n mediul decultur.

60936467 culturi in vitro

Documents

cultura in vitronu a

celule i esuturi ncep

roblemacare a aprut

plante vegetale in vitro

nanul 1 2orel i 2artin

rdcin n condiii artificiale

a fcut posibil obinerea

a presupus fiind necesarmult