IZOLAREA VIRUSURILOR IN CULTURI CELULARE

EFECTE CITOPATICE

1. Izolare virala in:Culturi de celuleOu de gaina embrionatAnimal de laborator

2. Detectia directa a :Particulelor virale EM , IEMAntigene virale ELISA, IFGenom viral PCR; Rt-PCR

3. Teste Serologice:a. Ac virus- specifici tip IgMb. seroconversia in ac virus- specifici tip IgGDireciile diagnosticului virusologic

Izolare virala in:

Culturi celulare

OGE

animal de laborator

Alegerea sistemului de izolare virala

AVANTAJEDEZAVANTAJEAnimalul de laboratorInfectie naturalaCost crescutOul de gaina embrionatCost scazutSusceptibilitate variabilaCulturi de celuleSensibilitate buna, disponibilitateSusceptibilitate variabila, Infectie nenaturala

Animal Facility from Stefan S. Nicolau Institute of Virology use

Techniplast Sealsafe technology

which combine the barrier at the cage level with a ventilation system controlled by a microprocessor and HEPA filter decontamination. The system confer a double protection barrier for the animals involved in experiments and human staff protection during quarantine period.

Definitie culturi celulare

Metodologia propagarii in vitro a unui fragment de tesut sau a unor celule dispersate obtinute din tesuturi cu ajutorul unor enzime proteolitice si introduse intr-un mediu nutritiv capabil sa le asigure homeostazia si proliferarea.

CLASIFICAREA CULTURILOR CELULARECULTURI DE ORGAN = mentinerea in vitro a unor fragmente de organ in vederea pastrarii arhitecturii si functiei intacte a celulelor. Corona, rhinovirusurile nu cultiva decat pe culturi de traheeCULTURI DE CELULE DISPERSATE = provin din disocierea tesuturilor intr-o suspensie de celule prin tratare enzimatica asociata cu agitare mecanica. Se clasifica dupa timpul de supravietuire in vitro:CULTURI PRIMARETULPINI CELULARELINII CELULARE

Culturi primareDirect din dispersia enzimatica a unui tesut proaspat recoltatFormeaza monostratCelulele tind sa mentina caracteristicile organului din care derivaPot apare proprietati de suprafata noi (devin susceptibile pentru infectii virale noi) ex: v. polio care nu creste in rinichiul de maimuta intact , dar creste si distrugeaceleasi celule renale separate si aderente la sticlaSe mentine in vitro timp limitat (3-5 pasaje)

Tulpinile celulareOmogene, durata de viata 50-60 de pasajeV. respiratorii cresc foarte bine pe tulpini derivate din piele, intestin si amigdaleCariotipul cromozomial este cel de origine diploidPot fi utilizate in producerea de vaccinuri virale si pentru diagnosticul virusologic

Liniile celularePopulatii de celule derivate dintesut normal sau malign ce pot fi subcultivate un timp nelimitatAu caracter heteroploid (numar variabil de cromozomi)Nu pot fi folosite in producerea de vaccinuri din cauza instabilitatii genomului.

Culturile de celule dispersatecomponente

Celule vii dispersate

Mediu nutritiv

reflecta tesutul de provenienta

TESUT EMBRIONAR

TESUT ADULT

TESUT TUMORAL

MRC-5 fibroblast (Prod. No. 84101801-1vl)

Hela epithelial (Prod. No. 93021013-1vl)

Celule dispersate

Mediu nutritivCulturile de celule dispersate componente

Sruri tamponate izotone Earle: 1)NaCl; 2) KCl; 3)MgSO4; 4)CaCl2; 5) NaH2PO4 6) D-glucoz; Sruri tamponate izotone Hanks: 1)NaCl; 2)KCl; 3)MgCl2 ; 4) MgSO4; 5) CaCl2; 6) KH2PO4; 6) Na2HPO4; 8) D-glucoz; Substante nutritive: Aminoacizi eseniali: 1) L-arginin; 2) L-cistin; 3) L-fenilalanin: 4) L-glutamin; 5) L-histidin; 6) L-izoleucin; 7) L-leucin; 8) L-lizin; 9) L-metionin; 10) L-tirozin; 11) L-treonin; 12) L-triptofan; 13) L-valin.

SER DE VIEL 2-10%, n funcie de tipul de cultur folosit: factori de cretere i factori de adeziune

Vitamine : 1) Colin HCl: 0,01g; 2) Acid folic: 0,01g; 3) Inozitol: 0,02 g; 4) Nicotinamid: 0,01 g; 5) D-pantotenat de calciu: 0,01 g; 6) Piridoxal HCl: 0,01 g; 7) Riboflavin: 0,001 g; 8) Tiamin HCl: 0,01 g.

Antibiotice si antifungice: penicilin i streptomicin // griseofulvina

SER DE VIEL 2-10%

pentru cultivarea celulelor renale de maimu si liniei celulare ICRM23 se adaug 2% ser de viel,

pentru cultivarea celulelor de embrion de gin i unele linii celulare (BSC, Vero, FL etc.), se adaug 5% ser de viel,

pentru cultivarea celulelor embrionare de hamster, rinichi de hamster, alte linii celulare (KB, HeLa, Hep, etc.) se adaug 10% ser de viel.

De importan deosebit este calitatea serului de viel utilizat, care trebuie testat n prealabil.

Condiii necesare pentru pstrarea n via a celulelor din cultura celular

pH adecvat

temperatur constant

atmosfer cu 10% CO2

condiii aseptice

ECHIPAMENTE

Diagram of microbiological safety cabinet airflow patterns

Obtinerea unei culturi celulare

-se prelev esutul surs n condiii aseptice

- se fragmenteaz esutul n buci, se spal cu soluie salin tamponat

- disocierea enzimatic a celulelor: tripsinizarea n soluie de tripsin 0,25%

-suspendarea celulelor n mediu nutritiv

-controlul viabilitii celulelor cu coloraie vital albastru de tripan

- repartizarea celulelor in volume egale n flacoane de culturi celulare

-incubare n poziie culcat

- urmrirea formrii culturii cu microscopul invers

Subcultivarea culturilor celulare

Dup 5-7 zile de la realizarea culturii se epuizeaz substanele nutritive, sursele de energie, se acidific mediul.

Pentru meninerea celulelor n via, acestea trebuie pasate, subcultivate.

Celulele se detaeaz de pe peretele flaconului cu soluie de tripsina siEDTA , se centrifugheaz, se spal cu soluie salina tamponata i se resuspendeaz n mediu nutritiv.

Se verific viabilitatea celulelor, se numr celulele i se ajusteaz la concentraia optim.

Se repartizeaz volume egale n flacoane de cultur celular.

Culturile primare pot fi subcultivate de cteva ori, 3-5x.

Tulpinile celulare pot fi subcultivate de mai multe ori, 50-60x.

Liniile celulare pot fi subcultivate la infinit.

Culturi provenite din celule

- normale: celulele se ataeaz de peretele flaconului, se multiplic pn acoper peretele flaconului, realizeaz o cultur monostrat

- tumorale: se multiplic i dup acoperirea suprafeei disponibile, cresc n mai multe straturi i n suspensie

CELULELE TRANSFORMATESunt linii celulare care au suferit o modificare stabila, spontana sau prin expunere la diferiti agenti (virali, chimici, radiatii), modificare care este mentinuta indefinit prin cultivare in vitro sau transplant in vivo.

Sunt morfologic distincte si se dispun dezordonatInoculate la animale produc tumoriMultiplica haotic: nu au inhibitie de contact, nu adera la substratul de izolareCerinte nutritive mici, se divid la concentratii mici de ser fetal de vitelPrezinta antigene de suprafata diferite de celulele normalePrezinta modificari cromozomiale, cariotip aneuploid

Inocularea virusurilor n culturile celulareSe arunca mediul nutritiv i se introduce suspensia viral. Incubare 1 or (adsorbtia virusurilor n celulele receptive).Se adaug mediu de ntreinere, se incubeaz.n 3-5 zile apar modificrile survenite n cultura celular.

Izolare:urmrirea efectelor citopatice = ECP

fara ECPECPVeroMA-104 Huh-7pCMKCOSMEK

EFECTE CITOPATICESINCITIAL: HIV, v rujeolos, VRSPICNOTIC LITIC: enterovirusuri INCLUZIONAR:Intranuclear acidofil: papovavirusuriIntranuclear bazofil: adenovirusuriIntracitoplasmatic acidofil: v rabic, v vaccinaMixt: v herpetice, v rujeolos

ECP SINCITIAL

EFECT CITOPATIC SINCITIAL(HIV)

SINCYTIA

INCLUZII CITOPLASMATICE (RABIE)Sus - neuron fara incluzii NegriJos neuron cu incluzii Negri (col HE)

INCLUZII INTRANUCLEARE (BOALA CU INCLUZII CMV)

HSV corpii Cowdry tip A

Infectia CU adenovirusurise multiplica in nucleu unde proteinele capsidare, produse in exces, formeaza incluziile intranucleare

reovirus

HPV

ECP picnotic litic

Robert Hooke's microscope (1665) - an engineered device used to study living systems.

An old pocket microscope

******************************