5 sejt-s szvettenyszts.pdf

7/23/2019 5 Sejt-s szvettenyszts.pdf

1/14

A biotechnolgia termszettudomnyi alapjai 5. Sejt- s szvettenyszts

Hallgati eladsjegyzet 101

Sejt- s szvettenyszts

5.1. llati sejtek tenysztse

Az eddigi eladsok sorn csak mikroorganizmusokrl volt sz, csak a

mikrobatenyszetekkel foglalkoztunk. Az, hogy llati sejteket is lehet tenyszteni, a hepatitis

B vakcina gyrtsnak ismertetse sorn mr felmerlt, emltettk, hogy az egyik lehetsges

gyrtsi md a sejttenyszts. Az alapelv hasonl. Ahogyan egysejt organizmusokat lehet

letben tartani, szaportani, anyagtermelsre rbrni laboratriumban, st ipari krlmnyek

kztt, ezt ugyangy meg lehet tenni ezt a soksejt llnyek sejtjeivel is. E sejtektulajdonsgai s krnyezeti ignye azonban nagymrtkben eltr mikrobktl, emiatt

clszertenysztsket kln trgyalni.

Az llnyek hierarchikus szervezdse:

Sejt Szvet Szerv Szervrendszer

Sejt = A sejt az sszes ismert l organizmus szerkezeti s funkcionlis pt eleme. Ez a

legkisebb egysg, amelyet mg a termszetben lnvvel illetnek, mivel ez a legkisebb olyanegysg, amely mg anyagcserre s szaporodsra is kpes.

Szvet = Az azonos mdon differencildott, azonos funkcikkal rendelkez sejtek

egyttest nevezzk szvetnek. (Van hmszvet, izomszvet, idegszvet stb., melyek

funkcionlisan mshogyan differencildtak).

Szerv = Klnbz szvetek egyttese alkot egy szervet. (Itt mr tbb fle funkci van

egyttesen jelen, pl. a gyomorban van izomszvet, hmszvet stb.)

Szervrendszer = A szervek egyttese alkotja a szervrendszert. Pl.: emsztszervrendszer.

Hogyan alakul ki a tbbfle differencildott szvet?

Egyedfejlds:

embrionlis ssejt differencildott sejtek

Az emberi sejtek zigta korban mg nem differencildtak. Ekkor mg minden sejtnk

egyforma volt. Majd embrionlis korban fokozatosan (szedercsra llapotban mg nem, de


2/14



hlyagcsra llapotban mr igen) elkezdenek a sejtek differencildni. Ezt kveten az

embrionlis fejlds alatt kialakulnak azok a szvettpusok, melyeket aztn egsz letnkben

hasznlunk.

Trtneti ttekints, mrfldkvek:1830: Ekkorra tehet a sejtelmlet megjelense. Schleiden-Schwann: kidolgoztk a

sejtelmletet, miszerint minden llny sejtekbl ll, s aminek nincsen sejtje, az nem is

llny. (Egyedl a vrusoknak nincsenek sejtjeik, de ppen emiatt nehz eldnteni, hogy

egyltaln llnynek tekinthetk-e).

1855: Wirchow: minden sejt sejtbl lesz (omnis cellula e cellula) (Korbban azt hittk, hogy

llny keletkezhet lettelen anyagbl is, mivel nem tudtk rtelmezni azt a megfigyelst,

hogy rovarlrvk jelentek meg a boml szerves anyagokban.)

1885: Pasteur kortrsa Roux, csirkeembrikkal (tojsokkal) foglalkozott, gy jutott el amadrsejtek in vitro fenntartshoz.

1967: Van Wezel: a mikrokarrieres sejttenyszts kidolgozsa, a sejtek tenysztse apr

hordoz szemcsk felletn.

1970: rekombinns DNS technika alkalmazsa a mikroorganizmusokon kvl llati sejteknl

is. Sikerlt egy vektorral DNS-t bevinni s expresszltatni llati sejtbe.

1975: Khler s Milstein Nobel djas felfedezse: Ktfle emls (egr) sejt fzijval, n.

hibridmt tudott ltrehozni, mellyel immunfehrjket lehetett gyrtani.

A tenyszts alapjai:

Sejttenyszts: diszperglt sejtek fenntartsa in vitro krlmnyek kztt. Sejttenysztsrl

beszlnk akkor, amikor a sejteket egyesvel, elklntve neveljk. Az in vitro kifejezs

eredetileg azt jelenti, hogy vegben (vegednyben, lombikban), mai tudomnyos jelentse

viszont az, hogy nem az llnyben (in vivo), hanem laboratriumi krlmnyek kztt

mkdtetnek valamilyen folyamatot.

Szvettenyszts:Nem elklnlt sejteket szaportanak, hanem szvetet alkot sejtegyttest

tartanak fenn, gy, hogy az megrizze a sajtos szveti struktrjt s mkdseit. Pldul

amikor hmsejteket elklntve nevelnek, az nem igazn viselkedik hmsejtknt, az

sejttenyszet. Viszont az gsi srlsek kezelsnl gyakran nevelnek tpoldatban

lehntott hmszveti foltokat, amelyeket azutn visszaltetnek a meggett felletre - ez

szvettenyszts.

A trgy keretben csak a sejttenysztsrl lesz sz.

Hogy mkdik a sejttenyszts?

Egszen ms, mint a mikroorganizmusok. Ugyanazokat a fogalmakat hasznljk sok

esetben, de a szhasznlat sokszor ms technikt takar.


3/14



A sejtvonalak nagy rsze csak fellethez ktve nvekszik, valamilyen szilrd felletre

kitapadnak a sejtek. Az llati sejtek nagy tbbsge csak ilyen, fellethez ktd kultrban

szaporthat. A sejt fehrjkkel rragasztja magt a felletre, s osztdni kezd. Az j sejt

mellette tapad meg, s gy fokozatosan bebortjk a rendelkezsre ll felletet. A kialakul

sejtrteg csak egy sejtnyi vastagsg (monolayer), a sejtek nem nnek egymsra. Ennek okaaz, hogy ha a szomszd sejtek rintkeznek, akkor abba az irnyba nem nvekednek tovbb

(kontakt gtls). Ez ltalnos szablyszersg, de a rkos sejtekre nem vonatkozik, a

daganatos sejtek talakulsnak egyik feleme a kontaktgtls megsznse.

Van nhny sejtvonal, ami felleti ktds nlkl, szuszpenziban is szaporodik. Ez

csak nhny sejtvonal, de mivel ez hatalmas technolgiai elny a tbbihez kpest, a technol-

gik nagy tbbsge ezekre a vonalakra pl (CHO, BHK, VeRo, HeLa). A rvidtsek felol-

dsa:

CHO = Chinese hamster ovary, knai hrcsg petefszek sejtvonal.BHK =Baby hamster kidney, embrionlis hrcsg vese sejtvonal

VeRo =majom veseszvet

HeLa = Szemlynvbl, egy Henrietta Lacks nev hlgynek llt emlket, akinek a

ngygyszati tumorbl izolltk ezt a sejtvonalat.

Ezek a sejtvonalak szuszpenziban szaporthatk s gy fermentor-szer kszlkeket

lehet hasznlni.

Eddig emls sejteket soroltunk fel, de hasznlnak madrsejteket is (elssorban csirke

embribl), s sok helyen rovar sejteket is. A rovar sejtek robusztusabbak, mint azemlssejtek, kevsb rzkenyek a krnyezetre, de rendszertanilag elgg tvol llnak az

emlsktl. Ez egyrszt kedvez, mert a rovar sejt s emberi sejt kztt a vrustvitel

veszlye gyakorlatilag nulla. De a rendszertani s evolcis tvolsg miatt az anyagcserjk is

sokban eltr az emls sejtektl.

1. bra: Nvekedsi tpusok: felleti s szuszpenzis


4/14



A kp baloldaln monolayeres nvekeds lthat, a szablytalan alak sejtek (jl lthat

sejtmaggal), hzagmenetesen bebortjk a rendelkezsre ll felletet. A jobb oldali kp egy

szuszpenzis tenyszetet mutat, ahol a lekerekedett, gmbly sejtek lebegnek a

tpfolyadkban, s teljes felletkkel rintkeznek az oldattal.

Mire j a sejttenyszts?

1. Kutats: a tudomnyos vizsglatokat sokszor egyszerbb az egyes sejteken elvgezni, mint

az llnyeken. Vizsgljk a jellemz biokmiai utakat, klnbz szablyozsi

mechanizmusokat, genetikai jellemzket.

2. Termels:

- -Rekombinns fehrjk ellltsa, klnsen a glikolizlt fehrjk esetn (pl. interferonok,

hormonok, stb.)- Monoklonlis ellenanyagok termeltetse (hibridma sejtekkel)

- Vrusok szaportsra vakcinagyrts cljbl

- llatksrletek kiegsztse, rszleges helyettestse. Az llatvdelmi szemllet ersds-

vel tendenciv vlt, hogy minl kevesebb ksrleti llatot hasznljanak fel a klnfle

vizsglatok sorn. A sejttenyszts lehetv teszi, hogy a vizsglatok egy rszben ne egy

lllatot hasznljanak fel, hanem csak annak valamilyen szvett vagy sejtjt. Sok ilyen

vizsglatot vgeznek a gygyszer- s kozmetikai iparban.

Korltozott sejtosztds

A mikrobasejtektl eltren az emls sejtek nem kpesek vgtelen szm osztdsra.

Bizonyos szm osztds utn a tenyszet elregszik. Egyre hosszabb idtelik el kt osztds

kztt, majd az osztds teljesen lell. Ezt szeneszcencinak hvjk, melynek ktfle oka van:

1. A kromoszmavgek (telomrk) minden osztdsnl rvidlnek s idvel, mr nem

tudnak tovbb rvidlni.

2. Aktivldnak a szaporodsi sejtciklust szablyoz (s azt lellt) mechanizmusok,

amelyek bizonyos szm osztds utn megszntetik az osztdst.

Korbban volt sz arrl, hogy a nvnyeket egyetlen sejtbl vissza lehet nevelni, ez azllatoknl nem megy. Klnsen az sszetettebb llatoknl nem mkdik ez.

Az embereknl is nagyon sok gn vagy gncsoport mkdse mr a magzati differencilds

sorn vglegesen lezrul. Teht amikor kialakult egy bizonyos fejlettsgi fok, akkor egyes

gnek vgrvnyesen kikapcsoldnak, egyes sejtek tovbb nem osztdnak.

Emlkezetes a klnozssal ltrehozott Dolly brny esete, aminl egyetlen egy testi sejtbl

ltrehoztk egy birka tkletes klnjt. Fel is neveltk ezt az llatot, ltrejtt a felntt egyed,

mg szaportottk is, de Dolly sokkal gyorsabban regedett, s rvidebb letet lt, mint

fajtrsai.A tumor s a rovar sejtekre viszont a vgtelen osztdsi kpessg jellemz(immortality).


5/14



Milyen tpus sejteket lehet szaportani?

Szinte minden szveti sejt szaporthat, legnehezebben az izom s idegsejtek. Az rett

vrsejtek nem osztdnak (sem a fehr-, sem a vrsvrsejtek). A vrsejtek is osztdssal

jnnek ltre a vrkpz szervekben, de mire kikerlnek a vrramba, mr egy rsi

folyamaton mennek keresztl, s ennek sorn elvesztik szaporod kpessgket. A vrsvrsejtekben ekkor mr nincs is sejtmag, teht nem tudnak osztdni, a fehrvrsejteknek

megvan sejtmagjuk, de az lettartamuk egy-kt nap, s ez alatt nem szaporodnak.

Fibroblaszt (ktszvet): Ezek jl szaporodnak, mert genercis idejk kicsi, felleteken

gyorsan nnek, tlnvik az egyb szveteket

Epithelilis (hm) sejtek: A brnk alulrl felfel llandan megjul. A legals rtegben

megy vgbe a sejtosztds, de hm alkotja a nylkahrtykat is, ez bortja az emsztcsatorna

belsfellett is. Kitekints: a gyomor belsfellete kibrja a gyomorsavat is, de a fellete a

brhz hasonlan folyamatosan kopik. gy a gyomor bels fellete is a hmsejtekosztdsval folyamatosan megjul. Sokszor mondjk, azt, hogy az idsebb embereknek

gyenge a gyomra. Nluk ez a megjulsi folyamat lassabb, teht ha ersen fszeres tel,

vagy tmny szeszes ital fogyasztsa esetn lemardik a bels fellet, az nehezebben s

lassabban jul meg nluk.

A korai embrionlis eredetsejtek jl szaporodnak. Ezrt is hasznljk gyakran a csirke

embrit.

Rgcslk (pl. egr, patkny, hrcsg)sejtjei is jl szaporodnak.

Hogyan szaportjk ezeket a sejteket?

Megfeleltpoldatban.

A tpoldatnak lehetleg hasonltania kell a termszetes krnyezetre. A norml sejteket vr

veszi krl, illetve a sejtkzti folyadk. Ez nagyon sok komponensbl ll, ezeket mind bele

kell mrni a tpoldatba. Mg a mikrobknl elegend volt a cukor, a szjadara, s nhny

mtrgya, az llati sejteknl sokfle, tiszta s drga anyagra van szksg:

Sznforrs: glkz (mint a vrcukor), s glutamin!energia s N-forrs.

15 - 20 fle aminosav,

vitaminok,

koenzimek,

lipidek,

svnyi ionok (pontos sszettel, ozmzis nyoms a sejten belli s a sejten kvli

nyoms egyenslya)


6/14



A 2. brn egy finomvegyszer cg katalgusbl tvett sszettelt lthatunk. MEM =

Modified Eagle Medium = mdostott Eagle-fle tpoldat. Sokfle nagy tisztasg s emiatt

drga anyagbl ll ssze.

2. bra: Mdostott Eagle mdium (MEM)

Az llati sejttenyszts tpoldatai:

Szrum= a sejtmentestett vr. Az llati sejt nem csak a kis molekulj anyagokbl ignyli a

vrhez hasonl koncentrcit, hanem ignyli a vrfehrjk jelenltt is. Ezt nagyon nehz

szintetikus anyagokkal ptolni. Knytelenek vagyunk valdi vrszrumot hasznlni. jszltt

llatok (borj, csik) vrt hasznljk, pl. a borj vgsnl steril krlmnyek kztt

lecsapoljk a vrt, s az ebbl elvlasztott szrumot adjk tpfolyadkba.

Kitekints: mirt kell ehhez jszltt llat, amikor egy kifejlett marhban sokkal tbb a vr?Mert tisztbb a vrszruma. A felntt vrbe bele van rva az egsz krtrtnete. Benne van

az tlt sszes fertz betegsg immunfehrjje, az sszes kapott vdolts ltal ltrehozott

immunfehrjk, valamint a lappang vrusok s vrusfehrjk. Az jszltt llat vrben ezek

mg nem jelentek meg.

A szrum komponens nagyon drga (s nehezen reproduklhat, hiszen nincs kt egyforma

llat, mg testvrek esetben sincs tkletes azonossg). A kutatk sok erfesztst tesznek a

szrummentes tpoldatok kifejlesztsre, vannak is eredmnyek, de termelsi mretben kevs

technolgit valstottak meg szrummentes tpoldattal. A szrum kltsge mg alaboratriumi ksrleteket is nagyon megdrgtja.


7/14



A vrszrumok legfbb komponense az albumin (kb. 2/3), mellette mg legalbb 40 fehrjjt

lehet meg klnbztetni, s mindegyiknek van valamilyen funkcija a sejtek mkdsben.

Vannak ragaszt fehrjk, melyek odaktik a sejteket a felletre, vannak hormonok (pl.

inzulin) s vannak az osztdst serkent fehrjk is. Prblkoznak a fehrjk ptlsval, pl.

olcs poliszacharidokkal (dextrn), de ez inkbb csak az albumint tudja ptolni, a tbbikomponenst nem.

Milyen krlmnyek kztt lehet a sejteket szaportani?

Mivel nincs sejtfaluk, ezrt nagyon rzkenyek az ozmotikus s a mechanikai

hatsokra is. Ugyangy kell kezelni ezeket, mint a protoplasztokat. Nem lehet nagy nyrerej

keverst alkalmazni, mert az sztszaktja a sejteket. Olyannyira rzkenyek, hogy a

buborkok ltrejttnl s elpattansnl fellpramlsi hatsok is krt okozhatnak. Emiatt a

fermentoroknl hasznlt levegztetsi rendszer (tbuborkoltats, turbulens kevers) nem

alkalmazhat.

Szerencsre az oxign ignyk elg kicsi, krlbell szzszor kisebb, mint egy hasonl

mikroba tenyszet. Emiatt nem kell tbuborkoltatni a folyadkon a betpllt levegt, hanem

elegenda folyadkfelszn felett tramoltatni a steril levegt.

A kis oxign-igny lass anyagcsert jelez, lassabban szaporodnak, s lassabban hasznljk

fel a cukrot is. Nmelyik sejtvonal ignyli a szndioxid jelenltt is a lgtrben (2-5%). Ennek

magyarzata az, hogy a szervezetben azok a sejtek, amelyek tvol vannak a gyors s intenzv

gzcsertl, alacsony oxigntartalom s magas szndioxid tartalom jelenltben mkdnek,azaz termszetes krnyezetkben is magas az szndioxid szint.

Hmrsklet: emls sejteknl 37C, madrsejteknl 41C, rovarsejteknl 25-30 C. Az

emberek s a madarak lland testhmrskletek, de az evolci sorn kln ton jutottak el

az lland testhmrsklethez, ez okozza az eltrst. A rovarok vltoz testhmrskletek.

3. bra: Laboratriumi tenysztednyek (felleti tenysztshez)


8/14



A 3. brn lthat tenysztednyek als sima rszt hasznljk szaportsra, teht a

tpoldatot beoltjk a sejtekkel, melyek letapadnak a felletre s monolayerrel bortjk be az

edny als falt. A sejt rteg annyira vkony, hogy tltsz, szabad szemmel alig ltszik. Ha

egy kicsit megmozgatjk az ednyt, akkor lehet nmi opalizlst lehet ltni a felleten. Az

edny nyaka nem szimmetrikusan, kzpen helyezkedik el, hanem flfel eltolva. Amagasabban lv nyak miatt a folyadk nehezebben lttyenhet ki. Az ednyek klnbz

mretben, sterilezve kaphatk, anyaguk manyag, ltalban egyszeri hasznlat utn

eldobhatk. veg ednyeket nem szoktak hasznlni, mert az veg anyagbl klium s

ntrium ionok olddnak ki, s ezek a sejtek rzkenyek az alkli fmionokra.

4-5. bra: Laboratriumi tenysztednyek (felleti tenysztshez)

Az brn lthat, hogy itt is hasznlnak Petri csszket. A jobb oldali kpen lthat

elrendezs sok (6, 12, 24, 48, 96) kis Petri cssze egyttesnek foghat fel, ezeket tlcnak

nevezik. Sorozatvizsglatokra klnsen alkalmasak.

6. bra: Laboratriumi tenysztednyek (felleti tenysztshez)

A tptalaj szne azrt piros, mert adnak hozz egy indiktort, melynek az tulajdonsga, hogy a

pH vltozsra megvltoztatja a sznt. Ezzel az esetleges fertzseket lehet kimutatni.


9/14



Normlis nvekedsnl a kzeg semleges marad, az indiktor megtartja piros sznt. Ha a vi-

szont a tenyszet befertzdik, mert mikroba kerl bele, akkor az megsavanytja a folyadkot,

amitl az indiktor srga sznlesz. gy rnzsre szre lehet venni a mikrobilis fertzseket.

Nagyobb lptk szaportsnl minl nagyobb benhet felletre van szksg a kszlkek-

ben. Erre tbbfle szellemes megoldst is kitalltak.

7. bra: Multitray roller bottles

A 7. brn lthat megoldsok nagyobb felletek. A Multitray sok tlca egymsra helyezs-vel jtt ltre. A sarkokban lv csatornk s tlfolyk rendszere gy van kialaktva, hogy

sztszeds nlkl is minden tlca feltlthetvkony rtegben tpoldattal, ugyanakkor minde-

gyik fltt kialakul egy lgrteg is.

A forg palackok (roller bottles) pontosan henger alak ednyek, amelyek vzszintes helyzet-

ben grgkn fekszenek. A grgket motor hajtja, ami lassan (kb 1-2 perc alatt) megforgatja

az ednyt. Kevs tpoldat van benne (a trfogat 10-20 %-a), ami a forgats miatt folyamato-

san nedvesti a teljes belsfelletet. A sejtek gy benvik a teljes hengerpalstot. A folyadk-

bl kiemelkedmonolayer a krlforduls ideje alatt nem szrad ki, nem krosodik, st a le-vegvel rintkezve nagyon j a sejtek oxignelltsa.

Mikrokarieres tenyszts:

A fellet nvelsnek msik lehetsge a fajlagos fellet nvelse. Ha hordoznak nem sk

felletednyeket, hanem apr szemcsket vlasztunk, akkor ugyanakkora ednytrfogatban

sokszoros nagysg nvekedsi felletet biztosthatunk a sejteknek. A mikrokarrierknt (=

kicsi + hordoz) inert anyagokbl kszlt apr szemcsket alkalmaznak. Ezek nhny szz

m tmr

j

, azaz a sejtek mretnl egy nagysgrenddel nagyobb gmbcskk.


10/14



8. bra: Inokullsi/tapadsi fzis kialakult monolayer

A 8. bra bal oldaln a kezdeti llapot lthat, csak nhny sejt tapadt meg, mg a jobb olda-

lon mr a teljes bortottsg, a kialakult monolayer figyelhetmeg.

A mikrokarrierek alkalmazsa nagy ttrs volt sejttenyszts technolgijban (van Wezel

1967). Technolgiai paramterek:

- szemcsetmr: 100-300m,

- srsg: 1020-1050 kg/m3(lelepszik a folyadkban, de enyhe keverssel lebegsben

tarthat),

- A folyadk trfogatnak 8-15%-a hordoz,

-

Fellete: 0,5-1,5 m2/liter, ami 10-30 forg palacknak felel meg, = nagy produktivits

Elnyei:

- nagy felletet be lehet bevinni egy adott reaktortrfogatba

- viszonylag homogn krnyezet a sejtek szmra

- nincs szksg j reaktortpusokra (a mikroba-fermentorok kis talaktssal hasznl-

hatk)

A karrier gyngyket nem szoktk jra felhasznlni, mivel tlsgosan bonyolult lenne a rege-

nerlsuk.A mikrokarrieres tenyszts lpsei:

inokulum:forg palackbl a tenyszetet tripszinnel leoldjk (elbontja a ragaszt fehrjket).

tlagosan 5-6 sejt/szemcsnyi mennyisget visznk be.

A sejtek megtapadnak a gyngy felletn, elszaporodnak, egy rtegben nnek (kontaktgtls)

A nvekeds fgg:a sejtvonaltl, a mikrokarrierek jellemzitl, a sejt nvekedsi fzistl, a

mdium sszetteltl s a sejt/mikrokarrier szmarnytl

Nyrs:immobilizlt sejtek rzkenyebbek a nyrsra (az sszesrld szemcsk ledrzslhe-

tik a sejteket a felletrl), emiatt lekerektett, nagy tmrjkeverket alkalmaznak, kis for-

dulatszmmal. A leggyakoribb keversi megoldsok:


11/14



Spinner flask

Ezeket a kevers ednyeket 0,5 l-estl a

10 l-es rtartalomig hasznljk. A nagy,

kzps kupak als oldalra felhelyezve

lthatjuk a kevert. Mgneses meghajt-

s, alul a keresztrdban egy mgnes ta-

llhat. Az ednyt r kell helyezni egy

keverberendezsre, amelyben egy mg-

nes forog lassan krbe. A forg mgnes

viszi magval a keverelemet, ami lassan

kavarja a karriereket. A fehr hromszg-

let teflon lap a kevern a leleped

szemcsk felkavarst, ekzst vgzi.Az oldals nylsok arra szolglnak, hogy

a menet kzbeni beavatkozsokat (pl.:

mintavtel pipettval) ezeket t el lehes-

sen vgezni.

A tenysztseket steril krlmnyek k-

ztt hajtjk vgre, az edny minden rsze

sterilezhet.

A jobb oldali kpen gyengn ltszik, de akever ferde rdjnak vgn egy goly

alak keverelem van. Ennek a belsej-

ben tallhat a mgnes. Az edny alatt a

meghajt egysg egy mgnest keringet,

ez viszi krbe-krbe a gmb alak keve-

rt. Laborszlengben ezt a tpust bim-bam

kevernek is nevezik, mert a felptse

hasonlt a harang/harangnyelv kialakts-hoz.

8. bra: Spinner flask

Kevers reaktorok

A nagyobb, ipari berendezsekbe mr tengely-hajts kever berendezseket ptenek be.

Nagy tmrj, lekerektett formj, lass keverket hasznlnak. Az energiabevitel nagyon

kicsi, kevs oxign kell a sejteknek, teht nem a levegztetshez szksges a kevers, hanem

a cl csak a homogenizls s a sejtek/mikrokarrierek lebegsben tartsa.


12/14



9. bra: Keverk: lekerektett formk, hajcsavar forma, 25-250 rpm

Levegztets: felleti vagy indirekt levegztets, mert a buborkok itt is krosthatjk a

sejteket.

Felleti levegztets: a folyadk feletti levegtrfogatot bltik t. A folyadk felletn

keresztl beolddik annyi oxign a folyadkba, amennyi a sejteknek kell.

Indirekt levegztets:a folyadk nem rintkezik a levegvel, csak egy szilikon csfaln ke-

resztl. A szilikon csfal tulajdonkppen egy membrn, melyen az oxign jl thatol s t-

diffundl a folyadkba. Emlkeztet: Az oxign egy apolris molekula, a szilikon anyag szin-

tn apolris jelleg, azaz hasonl polarits anyagok. Ezrt az oxign hajlamos beleolddni a

szilikon anyagba s tdiffundlni rajta. A szilikon csbl tekercset formlnak, s ezt mertik

a folyadkba, a csben ramoltatjk a levegt.

A tpanyag bevitel alapjn:

A tpanyagbevitel szerint tbbfle szaportsi technikt alkalmazhatunk, ugyangy, mint amikrobk szaportsnl.

Szakaszos tenyszts: (batch): a folyamat legelejn az sszes tpanyagot bemrik

tpfolyadkba, beviszik az olttenyszetet, elindul a szaporods, termkkpzs, majd a vgn

megtrtnik a feldolgozs. Menet kzben tovbbi tpanyagot nem adnak hozz. Gyenge

produktivits, a sejtkoncetrci ~106sejt/ml. Idtartama ~1 ht.

Rtpllsos-szakaszos (fed-batch): a szakaszoshoz hasonlan indul, de menetkzbentbbszr is ptoljuk az elfogyasztott tpanyagokat. ltalban glkzt s aminosavakat adnak


13/14



hozz. A tbbszri rtplls miatt akr 3 htig is fenntarthat a folyamat, s ennek

megfelelen a produktivits is nagyobb.

Flfolytonos tenyszts (perfzis): Itt folytonos vagy kvzi-folytonos tpanyag betpllst

alkalmaznak s ugyanakkor a termket tartalmaz fermentlbl is elvesznek. Mivel a mikro-karrierek knnyen lepednek a kevers kikapcsolsa utn, fllrl a fermentl leszvhat,

egyszer elvlasztani, s belle a termket kinyerni. A hordozn lv sejtekre jra friss

tpoldatot tltenek. A sejtszm egy id utn mr nem nvekszik, hiszen a monolayer mr

kialakult, de az elrhetsejtszm egy nagysgrenddel is nagyobb lehet, elrheti a 107sejt/ml-t

is. Ha nagyobb a sejtsrsg, akkor nagyobb a megtermelt anyag (fehrje) mennyisge is.

Napi lefejtssel s rtpllssal akr 6 htig is fenntarthat egy termelsi folyamat.

sszessgben a termk is koncentrltabb, s a szksges reaktortrfogat a szakaszosnak csak

1%-a.A reaktor s mdszer kivlasztsa sokszor annak alapjn trtnik, hogy mennyi a szksges

termk mennyisge (pl.: ha egy betegnek egy adott hatanyagbl csak nhny g-ra van

szksge, akkor azt elg kis mennyisgben (forg palackban) gyrtani.

Sejtpreparls tenysztshez

Egy sejtvonalat ltrehozsnl, elindtsnl a kvetkezkppen jrnak el:

1.

A szvettenysztshez szksges oldatok elksztse.2. A tenyszts cljra felhasznland szvet elksztse, kioperlsa.

3. Enzimes sejtdisszocici: a szvetekben a sejtek ssze vannak tapadva, ezeket az

sszeragaszt fehrjk elbontsval szt kell vlasztani, kollagenz, tripszin s egyb protez

enzimek alkalmazsval (A kollagenz a kollagnt bontja, a tripszin az tbbfajta fehrjt is.)

4. A sejtszuszpenzi szrse, a sikeresen diszperglt sejtek s a megmaradt szvetdarabok

sztvlasztsra. (A nagyobb darabok eltvoltsa)

5. A sejtek centrifuglsa (a kisebb darabok eltvoltsa, a sejtek a centrifugacs aljra

lepednek, az aprbb trmelkek a fellsz folyadkban maradnak.

6. A lelepedett sejtek reszuszpendlsa friss tpfolyadkban.

Sejtbank ltrehozsa:

Ha lland genetikai tulajdonsg, stabil sejtvonallal szeretnnk dolgozni, akkor ltre kell

hoznunk egy sejtbankot. Sejtbankot gy hozhatunk ltre, hogy egy genetikailag homogn

llomnybl n. szubkultrkat ksztnk. Az egysges sejttenyszetet sok (akr szz)

adagra osztjuk, ezek egy rszt troljk/deponljk, msokat pedig kzvetlenl

tovbbtenysztsre, manipulcira vagy termelsre hasznljk fel.


14/14



Szubkultra: Egy genetikailag homogn tenyszetet tbb rsztenyszetre osztanak,

amelyeknek tovbbi felhasznlsa eltrlehet.

Ha van egy nagy felletnk, melyet benttek a genetikailag azonos sejtek, akkor az adott ed-

nyekben egy sejtvonal egyedei vannak, teht szubkultrkatt kszthetnk belle. Ha van pl.100 ilyen edny, akkor abbl 99-et lefagyasztanak cseppfolys nitrognbe (ez a sejtbank), s

csak eggyel dolgoznak. Ha ezzel valami baj trtnik, elregszik, akkor vissza tudnak nylni a

sejtbankba egy msikrt. gy nagyon sokig megrizhetjk a genetikailag homogn llo-

mnyt, mindig egyforma sejtekkel dolgozhatunk. Alapszably, hogy sosem szabad a tenyszet

egszt felhasznlni, hanem egy rszt mindig meg kell rizni sejtbankban.

A sejtvonalak eltartsa

Egy sejtvonal 10-100 tolts utn elregszik, szaporod kpessge cskken, majd aszaporods lell, nem lehet ket a vgtelensgig szaportani. (Egyedl a tumor sejteket lehet a

vgtelensgig fenntartani.) Ezrt gazdlkodni kell a szaportsi ciklusokkal. Clszer a

preparls utn kevs toltssal szmos szubkultrt kszteni, s ezek nagy rszt tartstani.

Ez az n. Master cell bank, amihez vissza lehet nylni, ha a hasznlatban lvtenyszetek

elregedtek, vagy befertzdtek.

Az egyes munkahelyeken (labor, zem) is ltrehoznak tartsan trolt szubkultrkat a kapott

sejtvonalakbl, amihez vissza lehet nylni a szaporod tenyszetek elvesztse esetn

(working cell bank).Vegynk pldaknt egy jonnan izollt sejtvonalat, aminek 100 osztdsra elegend a

szaporodsi potencilja. Ha az elsszaports utn elteszik a Master cell bankba, ekkor mg

van 99 osztdsi lehetsg, tovbbi tenysztshez. Ebbl egy szubkultrt tenysztve s jabb

szubkultrkra osztva ltrehozzk a working cell bank-ot. Ha a folyamatot gyesen

vgeztk el, akkor van mg mindig van 98 osztdsi lehetsg amit a laborban, zemben ki

lehet hasznlni. Egy nagyobb lptktenysztshez lpcszetes szaportst is alkalmazni kell,

ami a felhasznlhat osztdsok szmt meglehetsen cskkenti.

A Master cell bankot rendszeresen meg kell jtani s clszera tenyszeteket s az tolt-

sokat trzsknyvszeren nyilvntartani. Rgzteni kell minden egyes sejtvonalnak a sorst, t-

oltsait, hogy tudjuk, mekkora szaporodsi potencil maradt az egyes szubkultrknl.

Szem eltt kell tartanunk, hogy mg a baktriumok tbb milli ven t kpesek vltozatlanul

szaporodni, addig az llati sejtek egy bizonyos idutn elregednek.

5 sejt-s szvettenyszts.pdf

Documents