1

1

Laboratorijska dijagnostika poremećaja hemostaze

2 Principi Screning testova u hemostazi

Prof Violeta Dopsaj

Farmaceutski fakultet Beograd, školska 2010/11

2

Preanalitički fakori u testovima hemostazeVakuum sistemi

Guidelines in NCCLS (National Committee for Clinical LaboratoryStandards): ‘Collection, Transport, and Processing of BloodSpecimens for Coagulation Assays’

1. Venepunkcija2. Špric/Igla/Epruveta (vakuum sistemi)3. Antikoagulans4. Transport uzorka5. Centrifugiranje6. Čuvanje uzoraka

3

Zatvoreni vakuum sistemiNema direktnog kontakta flebotomiste sa krvljuPrethodno tačno odreñena količina krvi (101 kPa -760 mmHg i 20ºC)Kontejneri od stakla/plastike,sterilni (različitog volumena)Epruvete sa aditivima (uglavnom antikoagulansi) sa 20 % praznog prostora (važno pravilno mešanje odmah nakon venepunkcije)Dozvoljeno odstupanje je ±10% od definisanog volumenaZatvarači guma/plastikad, boja zatvarača odgovara dodatom aditivuNalepnice- linija punjenja (definiše količinu krvi), oznaka aditiva, CE znak, ime proizvoñača, lot broj, rok upotrebe do odreñenog datumaIgle-unutrašnja površina od čelika obloñena silikonom (da spreči hemolizu, aktivaciju i adhezivnost trombocita)Izbor odgovarajuće igle - na osnovu izbora veneOznaka igle G ukazuje na njen dijametar: ↑G-↓prečnik19-23G : najčešće 21G, 18G-19G-hemostazaIgle ispod 20G-hematomi, iznad 23G-hemoliza

4

Posebni zahtevi za testove hemostaze1. VenepunkcijaNe koristiti prvu epruvetu zbog visoke koncentracije tkivnog faktora (ubod igle izaziva oštećenje endotela)Ne koristiti veliki špric (zbog mešanja sa antikoagulansom)Ne koristiti malu iglu (venska staza aktivira koagulaciju)Sprečiti kontaminaciju heparinom (iz katetera)Bez hemolize, mikro/makrokoagulacije uzorka

2. Špric/Igla/EpruvetaPlastična ili silikonizovana staklena epruveta (staklo aktivira koagulaciju zbog negativnog naelektrisanja)Vakutaineri se preporučuju iz bezbednosnih, higijenskih razloga ali pre svega zbog standardizacije (volumen antikoagulansa/volumen krvi)Epruvete puniti do obeleženog, preporučenog volumena

2

5

3. Antikoagulans0.109 M (3.2%) Na3 citrat-dihidrat (pufer limunske kiseline, pH~6)Antikoagulans/Krv: 1/9 (4.5 mL krvi i 0.5 mL antikoagulansa)Ne može se koristiti heparin, oksalat, EDTA

Podešavanje koncentracije citrata kada je hematokrit veći od 0.55Izračunavanje0.185 x (volumen krvi (mL)) x (1.0 – Hct) = potreban volumen citrata (mL)

PrimerHct pacijenta = 0.670.185 x (4.5) x (1.0 – 0.67) = 0.27 mLU vacutaineru od 5 mL: 0.5 – 0.27 = 0.23 mL antikoagulansa treba ukloniti iz epruvete

Više puta okrenuti epruvetu da bi se krv dobro promešala sa antikoagulansom

6

4. Transport uzorkaPlazmu treba odvojiti od krvnih ćelija za manje od 4hUzorke držati na temperaturi 18-25ºCPreporučeni limiti vremena za izvoñenje analiza (vreme čuvanja uzorka plazme na 18-25ºC) : PT 12h, aPTT (za pacijente bez terapije UFH) 8h, aPTT (za pacjente na UFH) 4h

5. CentrifugiranjeZa koagulacione testove koristi se PPP (platelet poor plasma), plazma

osloboñenja trombocita (plazma sme sadržati manje od 10 x 109/L trombocita)Dobijanje PPP postiže se centrifugiranjem uzorka na 1500g najmanje 15 minUzorak plazme sa više od 10 x109/L trombocita utiče na rezultate koagulacionih testova (Tr mogu sekretovati FV, FVIII i vWF)Tr oslobañaju i PF4 koji vezuje i neutrališe heparin in vitro (u epruveti), skraćujući aPTT

7

6. Čuvanje plazmeUkoliko test ne uradi u zadatom vremenu plazma se plastičnim nastavkom prenosi u plastičnu epruvetu i zamrzavaPreporučuje se zamrzavanje PPP plazme u tečnom azotu u malim porcijama (0.5 mL)Za čuvanje plazme do 1 meseca zamrzavanje na - 20º CZa duže čuvanje plazme (godinama) na - 70º COdmrzavanje plazme: brzo otapanje na 37º C (5 min), mešanje plazme i izvoñenje testa u roku od 1h

InterferencijeHemolizaJaka, vidljiva hemoliza aktivira trombocite i koagulaciju (odbaciti uzorak)Lipemija i ikterus utiču na rezultat kod optičkih koagulometara (koristiti mehanički koagulometar kod jako zamućenih uzoraka)

8

Biološka varijabilnost parametara hemostaze

Uticaj starosti: fibrinogen , AT , FV,VII,VIII,X , FXI XII Uticaj pola: Ne postoji razlika osim: FVIII viši kod žena, vreme krvarenja duže kod žena, FVII i VIII se povećavaju u menopauzi, FXI, XII, AT se povećavaju sa godinama kod ženaUticaj trudnoćeStanje hiperkoagulabilnosti: povećana aktivnosti faktora (fibrinogen, VII, VIII i X značajno povećani, FII, IX i XII povećani za 40-50% bazalne vrednosti), FXI i XIII sniženi progresivno do 60% bazalne vrednosti, smanjenje fibrinolize i antikoagulacije (PC i PS sniženi), skraćeno PT (zbog FVII), aPTT (zbog FVIII) i TT (zbog fibrinogena)

Na parametre hemostaze utiču i:Stres, Fizička aktivnost, Lekovi, kofein, Pušenje, MenstruacijaTrauma, Imobilizacija, Cirkadijalni ritam

3

9

Prokoagulantni faktori:

TrombocitiFaktori koagulacijeInhibitori fibrinolize

Antikoagulantni faktori:

EndotelInhibitori koagulacije

Fibrinoliza

Modern coagulation testing has become more than just the presence of coagulation factor

Jean M Thompson

Ključno u hemostazi:• generacija trombina vodi formiranju koaguluma• nastanak APC sprečava da koagulum postane

prevelik• nastanak plazmina rastvara koagulum

10

11

Koagulacioni testovi

1913.g Vreme koagulacije iz pune krvi (Lee-White)Prva laboratorijska procedura za procenu koagulacijeDanas se više ne koristi ali je ostao prvi in vitro koagulacioni test kojikoristi koagulacioni princip:Vreme potrebno od započinjanja koagulacije (inicijalizacija) do formiranja vidljivog koaguluma odražava stanje mehanizama koji učestvuju u koagulaciji (vreme koagulacije-clotting time)1953.g modifikacija metode Aktivirano vreme koagulacije (ACT-activated clotting time): dodatak aktivatora koagulacije u epruvetu ubrzava vreme koagulacijeACT se i danas koristi u praćenju terapije velikim dozama heparina(na pr u kardiološkim operacijama)

Modern coagulation testing has become more than just the presence of coagulation factor

Jean M Thompson

12

Testovi prve linije, Screening testovi (″″″″First line″″″″ tests):PT, aPTT, TT, FibStandardna klinička baterija screening testova Osnovni testovi koagulacije koji se često izvode bez dijagnoze i kliničkih indikacija poremećaja hemostaze (screening testovi)Screening testovi se prvenstveno koriste kao prvi, globalni testovi u ispitivanju hemostaze koji treba da ukažu u kom pravcu treba da ide dalje ispitivanje

Testovi druge linije (“Second line” tests)Zahtev za“Second-line” testom u zavisnosti je od rezulta “first-line” testovaTestovi mešanja (mixing studies)Odreñivanje faktora koagulacijeOdreñivanje inhibitora koagulacijeOdreñivanje markera fibrinolize

4

13

Zašto ne krvarimo?Primarna hemostazaOdbrana na ćelijskom nivou: trombociti i vWFSekundarna hemostazaKoagulacija se više ne deli na spoljašnji i unutrašnji put već na faze inicijalizacije i propagacije koagulacije (započinjanje i širenje)Konačan rezultat:generacija trombina i formiranje fibrinskog ugruškaZarastanje (reparacija)

odložena aktivacija fibrinolize

PodsećanjeNajveći broj faktora koagulacije su serin-proteaze, u zimogenom obliku koje se sintetišu u jetriFII, VII, IX i X, (PC i PS) su vitamin K zavisni faktori (bez γ-karboksilacije nema fiziološke aktivnosti, neaktivni faktori) Na endotelu nastaje vWF, trombomodulin, t-PA

14

PT - Protombinsko vreme

PT meri vreme potrebno za nastanak fibrina iz PPP (plazme osiromašenetrombocitima, tj plazme beztrombocita) nakon dodatkatkivnog tromboplastina i Ca2+

Meri “spoljašnji” i“zajednički” put koagulacijeFII,V, VII, X, fibrinogen

15

PT Reagens sadrži tromboplastin (tkivni faktor i fosfolipidi) i Ca2+

Različiti izvori tromboplastina:- humani, životinjski (zečji, goveñi), rekombinantni, i- iz različitih tkiva (mozak, placenta, pluća)Različita osetljivost različitih tromboplastina na deficijenciju faktora koagulacije iz spoljašnjeg puta (uzrok različitih rezultata kod istog pacijenta)Da bi mogli da se uporede različiti tromboplastini moraju se kalibrisati prema internacionalnom standarduISI (International Sensitivity Index)

INR (international normalized ratio)

ISIINR: PT pacijenta

PT kontrole16

Srednje normalno protrombinsko vreme – MNPT

OdreñivanjeNajmanje 20 plazmi odraslih osoba, oba pola, različite starostiOdrediti PT istim reagensom kao PT pacijentaIzračunati geometrijsku sredinu

MNPT = (X1 • X2 • ....Xn)1/n n = broj odreñivanja (20)

Protrombinski indeks (PR) = PT pacijenta (s) MNPT (s)

Sistem ISI/INRAparat - Reagens (test tromboplastin) – INR

Sa promenom reagensa (i lot-a) ili aparata ponoviti odreñivanje MNPT

5

17

Antikoagulantna terapija

Kada ?

•infarkt miokarda

•tromboza dubokih vena

• ugradnja valvula, stenta

•ostala stanja hiperkoagulabilnosti

Veliki rizik za nastanak tromboze

Stanja u kojima se davanjem terapije smanjuje tendencija za tromboziranjem i dovodi pacijenta u balansirano stanje blage hemoragije

18

Antikoagulantna terapija

Inicijalna fazaDirektna

antikoagulacija:bolus, kontinuiranainfuzija, injekcija

Heparin

Primena terapijeIndirektna

antikoagulacijaoralna terapija

Warfarin(COUMADIN)Acenocumarol(SINTRON)

19

Klinički aspekti farmakokinetike i farmakodinamike oralnih antikoagulansa

doza oralnog antikoagulansa

terapijski odgovor

•faktori spoljašnje sredine

• lekovi

• način ishrane

• različite bolesti

genetski faktori

• netačnosti u laboratorijskom testiranju

• nepridržavanje uputstava o primeni leka

• loša komunikacija pacijent - lekar

20

odgovarajuća doza

Praćenje efekata OAT

Mogući problemi?

Neophodna reproducibilnost rezultata PT iz iste ali i iz različitih laboratorija (Standardizacija rezultata preko INR)

kompliansa pacijenta

laboratorijsko praćenje

... bazirana na PT rezultatima! ali ...

6

21

Uticaj ISI Test reagensa na PT interval (s)

ISI = 1.0 PT interval = 12 s const

ISI = 1.3 PT interval nije constINR 2-3: 7.5 sINR 4-5: 6.5 sMale promene u (s) dovode dovelikih promena INR

ISI = 2.7INR 2-3: 2.5 sINR 4-5: 1.7 s

22

Izvori grešaka u INR sistemu

1. Greške u preanalitičkoj fazi2. INR se koristi samo kod pacijenata na stabilnoj OAT

(> 6 nedelja, dugotrajna terapija - long term)U prve 3 nedelje OAT (short term) INR sistem je neprecizanSD (PTs) short term > SD (PTs) long term

3. Rezidualni heparin može uticati na rezultat PT4. Česta i velika individualna varijacija u odgovoru na terapiju

(interakcije sa lekovima i hranom)5. Uticaj aparata na ISI tromboplastina i na INR

Problemi sa interpretacijom INR 1. Mala pouzdanost u rezultate INR na početku terapije2. Prisustvo bolesti jetre3. Neodgovarajući protrombinski indeks (neophodan MNPT)4. Neodgovarajući ISI dat od proizvoñača5. Uticaj koagulometra na ISI

23

Farmakokinetika OAT

7-14 DANA1,5-2 DANA4-5 DANALatentni period

12010-2440T1/2 u satima

Ž U ČR E G I B U B eliminacija

AT R J E Metabolizam

PREKO 90%PREKO 90%99%Vezivanje za albumin

FENPROKUMONACENOKUMAROLVARFARINPARAMETRI

24

Poluživot u plazmi vitamin K zavisnih F koagulacije

30Protein S

8 Protein C

50 – 60F II

6F VII

24F IX

36 – 40F X

Poluživot u satimaFAKTORI

7

25 26

Uticaj lakova: pojačan efekat OAT

• Antibiotici (posebno cefalosporini)

• Amiodaron

• Statini

• Gemfibrozil

• Salicilati i drugi NAIL

• Pentoksifilin

• Bolesti: jetre, bubrega, hipertireoza, srčana insuficijencija, hronična dijareja

27

• Hrana bogata vitaminom K

• Rifampicin, fenobarbiton

• Loratadin

• Magnezijum

• Estrogeni

Uticaj lekova: Smanjen efekat OAT

28

• Hemoragijske komplikacije proporcionalne produženju INR, zavise i od uzrasta, oštećenja organa, redovne kontrole INR

• Neophodna je dobra saradnja bolesnika, lekara, farmaceuta i biohemičara u praćenju terapijskog efekta OAL

• Posebna opreznost pri uvoñenju novog leka• Specijlizovane službe za praćenje bolesnika na OAL

Neželjene reakcije OAT

8

29

Bezbednost i sigurnost varfarina su direktno povezani sa održavanjem dobre antikoagulantne kontrole. Preporuka je da se nivo INR-a "cilja" u sredinu željenog terapijskog opsega (npr. 2,5 za opseg od 2,0-3,0 ili 3,0 za opseg od 2,5-3,5).

U cilju postizanja što dužeg "vremena u terapijskom opsegu" preporučuju se brojne metode doziranja:

1. kompjuterizovani sistemi bazirani na dozama OAL koje je pacijent prethodno koristio i faktorima specifičnim za pacijenta (godine, navike u ishrani, indikacija za terapiju...)

2. "antikoagulantne dnevne bolnice" ili "ambulante" sa treniranim i iskusnim osobljem.

3. Samotestiranje bolesnika korišćenjem komercijalnih "samočitača" koji koriste kapilarnu krv, u kombinaciji sa samodoziranjem

Terapija održavanja OAT

30

Antikoagulantna klinika

registracija

Uzorkovanje krvi

Odreñivanje PT

Kontrola OAT

Uput za laboratoriju

31

aPTT - Aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme

aPTT meri vreme potrebnoza nastanak fibrina iz PPP (plazme osiromašenetrombocitima, tj plazme beztrombocita) nakon dodatkaCaCl2Meri “unutrašnji” i“zajednički” put koagulacijeII, V, X, VIII, IX, XI, XII, PK and HMWK

Tromboplastin je aktivator koagulacije u prisustvu fosfolipida

32

aPTT Reagens sadrži:a) kontaktni aktivator-aktivator kontaktnih faktora koagulacije:elaginska kiselina (brzi, solubilni aktivator), kaolin, celit, silika-(SiO2, koloidna ili mikrosilika),više je osetljiva na FVIII deficijenciju

b) fosfolipide (zamenjuje fosfolipidnu površinu Tr in vivo)Dobijaju se ekstrakcijom iz humanih i životinjskih tkiva ili sintetskiIzvor:fosfolipidi soje, cefalin iz zečjeg mozga, humana placenta i biljni fosfolipidi, goveñi cefalinKoncentracija u reagensu: visoka (neosetljiv na LA) i niska (osetljiv na LA)Fosfolipidi sa nižim sadržajem fosfatidil-serina osetljiviji su na LAPrednosti sintetskih fosfolipida:- Stabilniji- Smanjena lot-lot varijabilnost (isti kvalitet nezavistan od tkiva)

9

33

Razlike izmeñu PT i aPTT testa: sastav reagenasa i delovanje

34

aPTT se koristi za:- sa PT testom kao globalni test u ispitivanju koagulacije- screening deficijencije faktora koagulacije iz unutrašnjeg puta- praćenje terapije nefrakcionisanim heparinom (UFH)- screening za prisustvo na lupus antikoagulans i ostalih inhibitora

koagulacijeU zavisnosti od sastava reagensa za aPTT (fosfolipida) postiže se različita osetljivost testa na:1. deficijenciju faktora koagulacije iz unutrašnjeg puta2. heparin3. prisustvo inhbitora (lupus antikoagulans)1. Koliko treba da bude snižena aktivnost faktora pa da je aPTT produžen?Za najveći broj fosfolipida kritična vrednost za IX, XI, XII je 20-30% aktivnosti faktoraNeki reagensi daju lažno negativan rezultat na 25-40% FVIII Kada je FVIII<10% svi reagensi daju produženje aPTT

35

aPPT osetljivost na deficijenciju faktora

100.90.1

200.80.2

300.70.3

400.60.4

500.50.5

600.40.6

800.20.8

Očekivana aktivnost(%)

Deficientna

plazma (mL)

Pool 100%

(mL)

36

2. Različita aPTT osetljivost na heparin

Terapijska doza heparina = produženje aPTT 1.5-2.5 x u odnosuna kontrolnu vrednost (u sec) jer se

na tim vrednostima smanjuje se rizik od nastanka tromboze- Različit individualni odgovor na istu dozu heparina- Različita osetljivost reagenasa na heparin3. Različita aPTT osetljivost na prisustvo lupus antikoagulansa= različito produženje aPTT

Produžen aPTT kod:- deficita faktora unutrašnjeg puta- prisustva inhibitora- terapije heparinom- prisustva lupus antikoagulansa- nedostatka FXII

Skraćen aPTT tokom akutne inflamacije zbog povećanog FVIII

10

37

aPTT - Aktivirano parcijalno tromboplastinsko vremeIzvoñenje

Dvostepeni test (“2 step” test)

1. korak

1 deo plazme pacijenta inkubira

se na 37°C 30 – 60 seconds

+ 1 deo APTT reagensa

Mešavina se inkubira na 37°C

3 do 5 minuta

2. korak:

+ 1 deo CaCl2

epruveta ili kiveta

1 deo

1 deo

1 deo

plazma

aPTT reag

CaCl2inkubira se3-5 min

Meri se Vreme (u sec) potrebno za formiranje fibrinskog ugruška nakon dodatka CaCl2 38

aPTT: izražavanje rezultata

aPTT pacijenta 2. R(indeks) =

aPTT kontrole

Šta sve može biti kontrola?Pul normalne plazmeLiofilizirana plazmaPlazma od 20 normalnih osoba (mediana)Gornja granica referentnog intervalaBazalna vrednost pacijenta

1. U sekundama (s)

39

Effect on aPTT of control plasma (therapeutic range 1.5-2.5)

35 45 55 65 75 85 95 105

aPTT sec.

Lyophilized plasma (31 sec.)

Median of 20 normal (34sec.)

Upper limit of normal range(37 sec.)

Basal value (27 sec.)

Calculated (0.3-0.7 U anti-Xa)

40

11

41

Praćenje aPTT kod UF heparina

Terapijski opseg 1.5 – 2.5 R što odgovara koncentraciji heparina:0.2-0.4 U/mL (titracija sa protaminom)0.3-0.7 U/mL (hromogeni anti-Xa)Zbog različite osetljivosti reagenasa na heparin preporuka je:Odrediti specifičan terapijski opseg u odnosu na kombinaciju reagens/instrument koristeći 30-40 plazmi pacijenata na terapiji sa UFHDoziranje UFHIntravenska primena:Bolus, pa sledi iv kontinuirana infuzijaPodešavanje doze u zavisnosti od aPTT-a ili nivoa antiXa

Nema konsenzusa oko standardizacije aPTT-aKoristiti standardni, fiksni aPTT terapijski oseg (1.5-2.5 R) iliKalibracija sistema reagens/koagulometar u korelaciji sa heparinom uterapijskom opsegu (0.3-0.7 IU/mL) 42

Korelacija vrednosti aPTT i heparinemije za različite reagense

43.532.521.51

1

0.75

0.5

0.25

0

x

y

x

y

Terapijski opseg: 1.45-2.11za Cephotest

43.532.521.51

0.625

0.5

0.375

0.25

0.125

0

Terapijski opseg:1.73 – 3.15za IL SP liquid

43

Pre početka lečenja obavezno odrediti:- PT i aPTT- broj trombocita- hematokrit i hemoglobinKontrola nakon postizanja terapijskog opsegaOdreñivanje aPTT svakih 24h , u isto vremeSvakodnevno kontrolisati: broj trombocita i hematokritAko je započeta terapija sa OAT kontrolisati PT (INR)Kada odreñivati koncentraciju heparina?u svim situacijama kada je aPTT nepouzdan (na pr ne postiže se terapijski opseg) ili je osnovna vrednost produžena- postojanje LA- istovremena primena oralnog antikoagulansa- rezistencija na heparin- nedostatak F XII- kod dece

44

Anti-Xa test

AT + Heparin [AT*Heparin]

[AT*Heparin] + FXa(excess) [AT-FXa] + Heparin + FXa(residual)

Chromogenic substrate

FXa(residual)Peptide + pNA

Razblažena plazma se inkubira sa FXa u viškuHromogeni suspstratMeri se rezidualna anti-Xa aktivvnostRezultat se izražava kao anti-Xa U/mLKalibraciona sa istim LMWH kao u terapiji pacijenta

12

45

Rezistencija na heparin- nedostatak antitrombina- ubrzana eliminacija heparina- povišena koncentracija heparin vezujućih proteina u plazmi- povišen nivo faktora VIII, fibrinogenaDugotrajna primena heparina kod- recidivantnih tromboza- maligniteta- imobilizacijeKomplikacije lečenja heparinomKrvarenjeHeparinom izazvana trombocitopenijaNekroza kožeOsteoporozaAlopecijaPorast transaminazaAnafilaktička reakcija 46

Laboratorijsko Praćenje Primene LMWH

Da li je potrebno???Ne! (dozira se prema TM) osim u slučaju:

- ekstremne gojaznosti- bubrežne insuficijencije- trudnoće- kod dece

U navedenim slučajevima primena LMWH se pratiodreñivanjem conc heparina preko anti-XaUzorak se uzima 4 h nakon s.c. aplikacije LMWHPreporučeni terapijski nivo: 0,6 – 1,0 U/ml anti Xa

47

TT - Trombinsko vreme

Meri vreme potrebno za nastanak fibrina posle dodatka goveñeg trombina (reagens) u PPPKonverzijom fibrinogena u fibrin odvajaju se fibrinopeptid A i B i nastaju fibrin polimeriTT odgovara koncentraciji fibrinogena u plazmi

Referentni interval se može izračunati u odnosu na normalnu plazmusa dozvoljenim odstupanjem od 2sTipičan referentni interval 15-20s 48

Uobičajeni uzroci produženog trombinskog vremena su:- hipofibrinogenemija (DIK, paraproteini, bolesti jetre)- povećana koncentracija FDP ( DIK, oboljenja jetre )- terapija heparinom- disfibrinogenemija ( nasledna, stečena)- hipoalbuminemija

Odreñivanje TT se koristi za:- praćenje fibrinolizne terapije- screening stanja hiperkoagulabilnosti- otkrivanje hipofibrinogenemije i disfibrinogenemije- razlikovanje izmeñu heparinom izazvanih lažnih produženja TT i

stvarnih hipofibrinogenemijaOdreñivanje fibrinogena Clauss-ovom metodom zasnovano je naistom principu ali je conc trombina 25x veća od koncentracijetrombina u reagensu za TT (oko 50 U/mL)

13

49

Batroksobinsko vreme BTBatroksobin je proteolitički enzim otrova zmije Bathrops atrox koji izaziva cepanje samo fibrinopeptida A iz fibrinogena i time indukuje koagulaciju Dijagnostički značaj

služi za odreñivanje TT kada eliminiše uticaj heparina u uzorku plazme kada je TT produžen (tada se dobija normalno BT a produženo TT)BT je produžen u prisustvu FDP, paraproteinaBT se koristi za:– praćenje fibrinolitičke terapije– dijagnoze afibrinogemije i disfibrinogemije,– korekciju produženog trombinskog vremena u prisustvu heparina (kod pacijenata koji primaju heparin)

Odreñivanje fibrinogena (vidi materijal od prošle god) 50

Interpretacija rezultata Testova prve linijeDijagnostički protokoli(I) Produzen PT a normalan aPTTKorak 1. Koji je Mogući Uzrok?•terapija oralnim antikoagulantnim lekovima•nedostatak vitamina K•bolesti jetre•deficijencija FVII (reñe)•prisustvo inhibtora FVII (reñe)•lupus antikoagulans (reñe)Korak 2. Da li je PT lažno produženo?Mogući Uzrok•Epruvete nedovoljno napunjene (ispod markera zapremine)•Kontaminacija iz intravaskularnog katetera (ukoliko se krv vadi iz iste ruke)Preporuka: Ponoviti uzorak nakon uklanjanja mogućeg uzroka laznogproduženja

51

Ukoliko je ponovljeni PT normalan izdati drugi rezultatUkoliko je ponovljeni PT produžen Korak 3

Korak 3: Da li pacijent prima OAT?Da. Da li je u terapijskom opsegu ili ne? Proveriti INRNe. Nedostatak vitamina K ili bolest jetre?Nedostatak vitamina KNedovoljan unos hranomterapija antibioticima (smanjena sintezu vit K od strane crevnihbakterija)Izvori Vitamina K: unošenje hranom i sinteza od strane crevnih bakterijaMalapsorpcija (smanjena apsorpcija liposolubilnih vitamina, pa i vit K)primarna bilijarna ciroza, holestatski hepatistis (holestaza), Vit K se apsorbuje u ileumu (bolesti creva na pr enteritis smanjuje apsorpciju)Lekovi i toksini (na pr rodenticidi) koji deluju kao OAT (inhibiraju delovanje Vit K) 52

Bolesti jetre

akutni hepatitis, ciroza, ugrožavaju sintetsku funkciju jetre pa je PT produženo (PT se koristi kao test za praćenje napredovanja bolesti jetre, na pr ciroze)Kako razlikovati produžen PT usled deficijencije Vit K od bolesti jetre?

Kod deficijencije Vit K davanje vitamina K dovodi do normalizacije PT dok kod bolesti jetre PT ostaje produženoMeñutim....I kod bolesti jetre zbog poremećaja u apsorpciji liposolubilnih vitamina može doći do deficijencije Vit K, pa davanjem Vit K dolazi do delimične korekcije PTUkoliko postoji sumnja na bolest jetre uraditi biohemijske testoveKorak 4. Ukoliko nije dokazan nijedan uzrok produženog PT uraditi Mix test za PTMix testovi su screening testovi za prisustvo inhibitora a izvode se ponavljanjem PT (i/ili aPTT) iz uzorka mix-a plazmi pacijenta i normalne plazme u jednakim delovima (1:1)

14

53

Mix Test za PT (PT iz mešavine plazmi) Uzorak: PPP pacijenta + normalna plasma=1:1

Mix test za PT

korekcija PT bez korekcije PT

-deficijencija FVII-oboljenja jetre-nedostatk Vit K

prisustvo inhibitora ili antitela na FVIIlupus antikoagulans (cesce)

Vremenski zavisni Mix tesovi za PTa)odmah i b)2h nakon mesanja plazmi

produzenje PTodmah

produzenje PTtek posle 2h

lupus antikoagulans inhibitor FVII

dalja dijagnostika 54

(II) Produzen aPTT i normalan PT

Korak 1. Koji je Mogući uzrok?

Lazno produzen aPTTKontaminacija heparinom (na pr krv iz intravenskog katetera)Bolesti jetreHemofilija A (deficijencija FVIII)Hemofilija B (deficijencija FIX)Deficijencija FXIDeficijencija FXII, ili drugih kontaktnih faktora (PK, HMWK)Prisustvo lupus antikoagulansaDiluciona koagulopatija neproporcionalna produzenom aPTTPrisustvo faktor inhibitora

55

Korak 2. Da li je aPTT lažno produžen?

Mogući uzrokEpruvete nedovoljno napunjene (ispod markera zapremine)Kontaminacija heparinom iz intravaskularnog katetera (ukoliko se krv uzima iz iste ruke)Dugo cuvanje uzoraka na sobnoj temperaturiKoagulacija uzorkapolicitemijaPreporuka: Ponoviti uzorak nakon uklanjanja mogućeg uzrokalaznog produzenja

Korak 3. Da li pacijent na terapiji heparinom?UFH? LMWH? Proveriti da li su vrednosti u terapijskom opsegu

56

Mix test za aPTT (aPTT iz mesavine plazmi)Uzorak: PPP pacijenta + normalna plasma=1:11. Nedostatak faktora iz unutrasnjeg puta2. Prisustvo inhibitora (faktor inhibitor, lupus antikoagulans

Mix test za aPTT

korekcija aPTT bez korekcije aPTT

Deficijencijafaktora izunutrasnjeg puta

prisustvo inhibitora faktoralupus antikoagulans

Vremenski zavisni Mix tesovi za aPTTa)odmah i b)2h nakon mesanja plazmi

produzenje aPTTodmah

produženje aPTT tek posle 2h

lupus antikoagulans inhibitor FVIII

dalja dijagnostika

HMWK, PK XII (bez krvarenja)VIII, IX, XI (krvarenja)vWF

15

57

Nañena deficijencija faktora iz unutrašnjeg putaKlinička slika hemoragijaFVIII Nedostatak FVIII (VIII:C/vWF:Ag)Hemofilija A i vW bolestjaka deficijencija <1%umerena 1-5%blaga deficijencija 6-30%

vW bolest hemofilijaaPTT produžen produženPT normalan normalanVIII:C snižen sniženVIII:Ag povišen normalanvreme krvarenja produženo normalnoodgovor na ristocetin bez agregacije Tr agregacija Tr

58

Nedostatak FIXKlinička slika blagog do ozbiljnog krvarenja (Hemofilija B)autozomno recesivno oboljenje (reñe od A)

Nedostatak HMWK, PK, FXIIBez krvarenjaHMWK, PK se ne odreñuju, odreñuje se FXII

Prisustvo inhibitora faktora VIIISpecifična At na FVIII mogu se javiti kod hemofiličara posle više infuzija koncentrata FVIIIkod bolesti vezivnog tkiva (SLE, reumatoidni artritis), u trudnoćiAko nije inhibitor na FVIII ispitati ostale inhibitore (FIX, XI,PK, HMWK)Prisustvo lupus antikoagulansa

59

(III) Produžen PT i produžen aPTTNedostatak faktora iz zajedničkog puta koagulacije (I, II, V, X)Lažno produžene vrednosti (proveriti preanalitiku)Terapija heparinomOATBolesti jetreDIKLupus antikoagulans

(IV) PT normalan, aPTT normalan, TT produženHeparinHipofibrinogenemijaAfibrinogenemijaDisfibrinogenemijaPrisustvo FDPPrisustvo paraproteina

60

(V)PT NormalnoaPTT NormalnoTT NormalnoFibrinogen NormalanBroj trombocita NormalanSvi “first-line” testovi normalni, ali pacijent nastavlja da krvari poslepovrede ili hiruške intervencije- uroñen ili stečen poremećaj funkcije trombocita- von Willebrandova bolest u kojoj faktor VIII nije toliko nizak da

izazove produženje APTT- blagi poremećaj koagulacije- nedostatak FXIII- vaskularni poremećaj hemostaze- krvarenje iz ozbiljno oštećenog krvnog suda ili iz krvnih sudova sa

normalnom hemostazom- poremećaji fibrinolize (nedostatak antiplazmina ili PAI-1)

16

61

(VI)PT ProduženoaPTT ProduženoTT ProduženoFibrinogen Normalan/povišen/sniženBroj trombocita Normalan

- prisustvo heparina ( TT je obično, nesrazmerno produženo )- hipo- i disfibrinogenemija- bolesti jetre- pojačana fibrinolizaAko su sva tri testa produžena uraditi batroksobinsko vreme,fibrinogen, FDP, D-dimer

62

(VI)PT NormalnoaPTT NormalnoTT NormalnoFibrinogen NormalanBroj trombocita Snižen

Ako je jedini poremećaj snižen broj trombocita, radi se ispitivanje kostne sržiNormalan broj i morfologija megakariocita u koštanoj srži, usmerava dalja ispitivanja na otkrivanje uzroka perifernog oštećenja trombocita (najčešće heparin i neki lekovi)

63

(VII)PT ProduženoAPTT ProduženoTT NormalnoFibrinogen Normalan/ povišen/ sniženBroj trombocita Snižen Ovakva kombinacija rezultata skrining testova se može naći:- posle obimnih transfuzija stare krvi ( na pr dugo čuvana) ili

koncentrata plazme- kod hroničnih bolesti jetreU oba slučaja, mešanjem ispitivane plazme sa normalnom, rezultatikoagulacionih testova će biti normalni, kao i koncentracijafibrinogenaAko prikazano stanje traje duže vreme, treba odrediti pojedinačnefaktore koagulacije

64

(VIII)PT ProduženoAPTT ProduženoTT ProduženoFibrinogen SniženBroj trombocita Snižen

- akutni DIK - akutna nekroza jetre sa DIK-omDijagnoza DIK-a se potvrñuje dodatnim testovima (D-dimer,fibrin-monomeri, FDP) u skor sistemu