3. produc

PRODUCCIÓN DE ENZIMAS

MICROBIANAS

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son biocatalizadores pero también pueden considerarse como aditivos altamente específicos para aplicaciones en alimentos.

EL MICROORGANISMO

Selección del microorganismo adecuado para el desarrollo de un sistema de producción de enzimas.

1. El microorganismo no debe ser patógeno, ni estar asociado con la producción de toxinas.

Staphylococcus aureusSalmonella Escherichia coli

EL MICROORGANISMO

2. Se prefiere que la enzima sea producida extracelularmente.

En los procesos de recuperación un extracto crudo de una enzima intracelular, contiene al menos 1500 enzimas y proteínas mientras que el de una enzima extracelular contiene solo unas cuantas.

EL MICROORGANISMO

3. La enzima debe ser producida con altos rendimientos.

El desarrollo del microorganismo implica algún tipo de mutación clásica con rayos UV o bien agentes nitrogenados.

EL MICROORGANISMO

4. El costo de producción debe ser razonable. Implica que el microorganismo pueda crecer

rápidamente, en sustratos grado industrial, consumiéndolos totalmente y con pocos requerimientos específicos.

Se prefiere a las enzimas constitutivas con respecto a las que requieren algún tipo de inductor en el medio

EL MICROORGANISMO

5. La selección del microorganismo puede hacerse igualmente en términos de las características deseadas para la enzima.

Ejemplo: la selección de microorganismos termofílicos con objeto de obtener enzimas termoestables.

MECANISMOS DE BIOSÍNTESIS

Para el control de síntesis de enzimas, las células microbianas disponen de los mecanismos de inducción y represión.

1. Enzimas inducibles.

Requieren de una sustancia, generalmente el sustrato de la enzima, como inductor.

Algunos ejemplos de enzimas inducibles.ENZIMA MICROORGANISMO INDUCTOR

Dextransacarasa Leuconostoc mesenteroides

Sacarosa

Dextranasa Penicillium funiculosum Dextranas

α-amilasa Bacillus subtilis Dipalmitato de isomaltosaAlmidónMaltosa

Naringinasa Aspergillus niger Naringina

Pululanasa Klebsiella pneumoniae Maltosa

Invertasa Pullularia pullulans Monopalmitato de sacarosa

Glucosa isomerasa Bacillus coagulans Xilosa

Pectinasa Aspergillus niger Pectina

Tirosinasa Neurospora crassa D-tirosina,L-tirosina



2. Mecanismos de represión. Represión catabólica. Inhibe la síntesis de

enzimas (inducibles) por intermediarios producidos en el rápido catabolismo de la fuente de carbono.

Retrorepresión, Reprime la síntesis de enzimas mediante la presencia de productos finales de biosíntesis.

Ejemplos de algunas enzimas sujetas a represión catabólica

ENZIMA MICROORGANISMO REPRESOR

Invertasa Neurospora crassa Glucosa-fructosa

Lactasa Eschericchia coli Glucosa

Dextransacarasa Leuconostoc mesenteroides Sacarosa

Celobiasa Tricodema viride Celobiosa

Glucosa isomerasa Streptomyces phaechromogenes Glucosa

Proteasas Bacillus subtilis Glucosa

Catalasa Rhodotorula mucilaginosa Glucosa

α-amilasa Bacillus stearothermophilus Fructosa



3. Mejoramiento genético. Una vez conocidos los mecanismos para la

producción de una enzima, se podrá mejorar la productividad a través de procesos de mutación y selección o bien mediante el adecuado manejo del medio ambiente.


ENZIMAS INDUCIBLESObtención de mutantes con necesidades reducidas o nulas de inductor

Estrategias en la sobreproducción de enzimas microbianas.

ENZIMAS SUJETAS A AUTORETROREPRESIÓNEvitar la presencia de productos finales en el medio de cultivo.Evitar la acumulación de producto final mediante la adición de algún inhibidor de la ruta metabólica.

Eliminación de los productos finales (diálisis, ultrafiltración)

Obtención de mutantes no sujetos a represión por productos finales.

ENZIMAS SUJETAS A REPRESIÓN CATABÓLICAEvitar el uso de la fuente de carbono que ocasiona la represión, sustituyéndola por otra de más lenta asimilación.Limitar el crecimiento del microorganismo: cultivo o fermentación retroalimentada.

Obtención de mutantes resistentes a la represión catabólica.


4. Actividad enzimática.

Cuando el producto de la fermentación es una enzima, la producción se cuantifica en términos de la actividad catalítica disponible.

“unidad de actividad” la cantidad de enzima que transforma 1 micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas.

La cinética se describe mediante el modelo de Michaelis Menten:

vi = Vmáx

Km + S

S


ENZIMAS METODOLOGIAProteasas Capacidad para coagular la leche.

Liberación de algún aminoácido específico soluble en ácido tricloroacético (tirosina)Acción sobre películas fotográficas (cualitativas).

α-amilasas Pérdida de la capacidad de formación de complejos coloridos entre yodo y amilosa.Disminución de la viscosidad inicial.Incremento del poder reductor.

Pectinasas Capacidad de clarificar jugo de manzana.Disminución de la viscosidad inicial.Incremento en el poder reductor.Disminución del precipitado alcohólico del medio de reacción.

Celulasas Disminución de la viscosidad inicial.Incremento en el poder reductor.Solubilización de papel.

Algunos ejemplos de definición de actividad enzimática basada en una consecuencia de la acción de la enzima.

En términos generales las fermentaciones pueden llevarse a cabo de dos formas: en cultivo semisólido o en cultivo sumergido.

1. Técnicas de fermentación en cultivo semisólido.Comúnmente llamado “fermentación semisólida” o sistema Koji.

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS PROCESOS DE FERMENTACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS

MICROBIANAS.

Ventajas. Resulta en altas productividades por

unidad de volumen de fermentación. Menores consumos energéticos. Baja contaminación por aguas

residuales.

Desventajas: Difícil control en las condiciones ambientales que

influyen en la producción (gradientes y variaciones de pH, temperatura, humedad, etc.)

Dificultades para la esterilización, así como el ser frecuentemente limitada por fenómenos de transferencia de masa.


MICROBIANAS.

NOTA: El salvado de trigo, es el

sustrato mas utilizado por su alto contenido de nutrimentos, así como su estructura física.

ENZIMA MICROORGANISMO SUSTRATO

Amiloglucósidas Rhizopus sp. Salvado de trigo

α-amilasa Aspergillus oryzaeAspergillus niger

Salvado de trigoArroz

Celulasas Trichoderma viride Salvado de trigo

Proteasas Aspergillus nigerAspergillus oryzae

Salvado de trigo

Pectinasas Aspergillus soyae Salvado de trigo

Algunos ejemplos de enzimas producidas por cultivos semisólidos.


MICROBIANAS.

2. El cultivo sumergido.

Los procesos de fermentación en cultivo sumergido, son aquellos en los que nutrimento y microorganismo se encuentran en fase acuosa.


MICROBIANAS.

Ventajas: La homogeneidad que es posible

establecer en el cultivo.

No existen gradientes de temperatura, pH o de concentración de nutrimentos en el sistema.

Temperatura y pH de fermentación.

Generalmente, la T y pH de óptimo crecimiento del m.o. productor, coinciden con los de producción de la enzima (sin embargo, la T de máximo crecimiento puede no ser la adecuada dada la estabilidad de una cierta enzima).

En términos de pH es necesario distinguir entre 4 valores, que no necesariamente coinciden:

1. El pH de máximo crecimiento del microorganismo productor.

2. El pH de máxima producción de la enzima.

3. El pH de máxima estabilidad de la enzima.

4. El pH de máxima actividad de la enzima.


MICROBIANAS.

El medio de cultivo.

Necesidad de inductores, selección de la fuente de carbono tomando en cuenta los mecanismos de represión catabólica, formulación de un medio con importante poder amortiguador, etc.

En el caso de algunas enzimas, se requiere de ciertos iones en el medio de fermentación para una eficiente producción.

En algunos casos estos iones juegan un papel importante en la actividad (metaloenzimas) y en otros en la estabilidad.


MICROBIANAS.

ENZIMA FUENTE DE CARBONO

MICROORGANISMO

α-amilasa Almidón Bacillus subtilis

Celulasas Celulosa Trichoderma viride

Dextranasa Dextrana Penicillium funiculosum

Glucoamilasa Almidón Aspergillus niger

Dextransacarasa Sacarosa Leuconostoc mesenteroides

Naringinasa Naringina Aspergillus niger

Lactasa Lactosa Kluyveromyces lactis

Levansacarasa Sacarosa Bacillus subtilis

Glucosa oxidasa Glucosa Aspergillus niger

Algunos ejemplos de medios de cultivo para la producción de enzimas, donde la fuente de carbono es sustrato de la enzima.


MICROBIANAS.


MICROBIANAS.

Se prefieren como fuente de carbono los almidones y desde luego las proteínas como fuente de nitrógeno.

Principales fuentes de nitrógeno empleadas en medios de cultivo para la producción de enzimas microbianas.

Fuentes inorgánicas Fuentes orgánicas no proteicasSulfato de Amonio Urea

Nitratos (potasio, calcio) Bases nitrogenadas

Fuentes proteicas microbianas

Extracto de levadura

Fuentes proteicas vegetales Fuentes proteicas animalesPasta de soya Caseína

Pasta de girasol Proteínas de suero de leche

Pasta de algodón Peptonas

Salvado de trigo Hidrolizado de pescado

Salvado de arroz Hidrolizado de carne

Agua de cocimiento de maíz

Diversos hidrolizados

Malta (cebada)

Principales fuentes de nitrógeno empleadas en medios de cultivo para la producción de enzimas microbianas.


MICROBIANAS.

Enzima Microorganismo Relación de producciónMedio + tensoactivo

Medio solo

Celulasa Thricoderma viride 20

Invertasa Pullularia pullulans 16

Dextranasa Penicillium funiculosum 2

Alternansacarasa Leuconostoc mesenteroides

2

Pululanasa Aerobacter aerogenes 1.5


MICROBIANAS.

Efecto de la adición de tensoactivos al medio de cultivo (Tween 80 al o.1%) en la producción de enzimas microbianas.

La adición de agentes surfactantes, específicamente el Tween 80 o el Triton, aumenta la producción de un gran número de enzimas extracelulares.

La aireación.

Los procesos fermentativos pueden dividirse en términos de requerimiento de oxígeno en:

1. Aerobios

2. Microaerobios

3. Anaerobios

4. Anaerobios estrictos

El KLa (coeficiente de transferencia de masa en la fase liquida) es el criterio con que se caracteriza y se escala una fermentación, debido a la baja solubilidad del O2 en el medio de fermentación.


MICROBIANAS.

Cinética de producción de enzimas.

No existe un modelo cinético gral. para la síntesis de enzimas microbianas.

El modelo mas utilizado es el desarrollado por Luedeking-Piret para el ácido láctico y extendido para otros productos de fermentación.

Donde se plantea que la velocidad de síntesis de producto es proporcional al crecimiento del microorganismo (primer término) y a la cantidad de células presentes en el medio (segundo término).


MICROBIANAS.

dP dX

dt dt= α + β X

OPERACIONES DE RECUPERACIÓN

Dentro de las operaciones de recuperación uno de los principales objetivos es eliminar agua al menor costo posible.

El grado de purificación depende del área de aplicación final del producto enzimático: alimentos, farmacia, industria textil, industria curtidora, industria papelera, etc., y de la forma en que va a ser aplicado (por ejemplo, diagnóstico, aditivo en alimentos, medicamento, catalizador en la industria, etc.).

Las principales etapas involucradas en la recuperación son:

1. Extracción

2. Ruptura celular

3. Separación de sólidos

4. Ultrafiltración

5. Precipitación

6. Extracción líquido-líquido

7. Cromatografía

8. Estabilización, secado y formulación

9. Evaluación del proceso de purificación


1. Extracción. En ciertos casos es posible extraer la enzima que se encuentra ligada a la pared celular o a alguna membrana, mediante:

Tratamientos específicos de autolisis.

Solventes. Isobutanol es el más indicado para enzimas ligadas a membranas.

Tratamiento enzimático de las células: lisozima, lipasas, fosfolipasas, proteasas, quitinasas o glucanasas pueden ser agregadas para degradar parcial o totalmente la pared celular.


2. Ruptura celular.

Existen diversas técnicas a nivel laboratorio pero solo 2 métodos mecánicos son empleados a gran escala:

I. El homogenizador de alta presión y

II. El molino de esferas de alta velocidad.

En ambos casos el fluido debe pasar varias veces por el equipo, dependiendo de la dureza de la célula, y de la ubicación de la enzima (periplasmáticas, citoplasmáticas, etc.).


Ruptura celular La optimización para obtener la máxima extracción, sin

que la enzima pierda actividad por calentamiento y sin reducir demasiado el tamaño de células (dificulta la separación), consiste en :

I. Determinar el número mínimo de pasos por el equipo,

II. Determinar la máxima concentración de alimentación, y

III. Determinar las condiciones de ruptura (tiempo de molido o presión).


3. Separación de sólidos.

La eliminación de células al final de la fermentación, la eliminación de residuos celulares después de la ruptura y la recuperación o eliminación de precipitados se efectúa por centrifugación o por filtración.

La selección del equipo depende de varios factores:I. El tamaño de partícula,

II. La diferencia de densidades entre las fases a separar

III. La viscosidad del medio

IV. La aglomeración y características pegajosas del precipitado.


4. Ultrafiltración.Clasificación en términos de tamaño:


Técnica Separación de moléculas Ósmosis inversa peso molecular inferior a 200 Uso de membranas

sujetas a presiones de hasta 2000 psi.

Ultrafiltración peso molecular entre 400 y 50000.

Uso de membranas y fibras porosas sujetas a presiones no mayores a 25 psi

Microfiltración Micropartículas que van desde virus hasta levaduras

Filtración tradicional

Ultrafiltración. Se basa en el diseño de membranas o fibras con una estructura de poros pequeños (50 a 500nm) por lo que moléculas pequeñas podrán atravesar, mientras que las grandes serán retenidas.

El sistema permite:

I. Concentrar al eliminar agua,

II. Dializar (las sales atraviesan las membranas y es posible sustituir continua o intermitentemente el agua filtrada)

III. Purificar parcialmente (las proteínas de peso molecular inferior al peso molecular de corte del sistema también serán eliminadas).

IV. Cambiar el sistema buffer durante el proceso de purificación.


Ventajas:

I. No cambia la fase de la enzima,

II. Puede operarse a bajas temperaturas,

III. No se agregan sustancias ajenas al sistema,

IV. Tiene bajos requerimientos energéticos,

V. Es fácilmente operada.

Desventajas:

VI. Mantenimiento y cuidado de las fibras o membranas.


Ultrafiltración.

5. Precipitación.

Los métodos para precipitar enzimas consisten en causar una reducción de la solubilidad, y son:

I. Adición de sales: Desalado (salting-out). Se precipita la enzima al disminuir su grado de hidratación.

II. Adición de solventes poco polares (modificación de la cte. dieléctrica). Se precipita la enzima al aumentar la atracción entre moléculas.

III. Precipitación isoeléctrica mediante ajuste del pH.


6. Extracción líquido-líquido.

La formación de dos fases líquidas puede ser inducida en función de la incompatibilidad de dos polímeros, que termodinámicamente no son estables disueltos en una misma fase.

La enzima migra a una de las fases lográndose una concentración-purificación.

Los polímeros usados son: polietilenglicol y dextranas o fosfatos.


7. Cromatografía. Es la técnica más potente de que se dispone para purificar enzimas y proteínas en general.

Clasificación de los métodos de acuerdo a la característica de la enzima.


TécnicaCarga Cromatografía de intercambio iónico

HPLC

Tamaño Cromatografía de permeación en gel

Estructura Cromatografía de adsorciónCromatografía hidrofóbicaCromatografía de apareamiento de ionesCromatografía de intercambio de ligandos

Caract. bioquímicas Cromatografía de afinidad

9. Estabilización, secado y formulación.

Las preparaciones enzimáticas son secadas generalmente. en secadores de espreas, mientras que cuando la actividad es inestable o la preparación de pequeños volúmenes y de manejo estéril, se emplea la liofilización.

En la formulación del producto es necesario tomar en cuenta varios factores en relación con la dosis de enzima en la aplicación final para facilitar su uso y evitar grandes diluciones.


Generalmente las preparaciones líquidas contienen:

I. Agentes estabilizantes (glicerol, sorbitol, polietilenglicol, etc.)

II. Agentes de preservación (benzoatos, sorbatos, etc.)

El material inerte consiste de:

I. Azúcar (glucosa, lactosa, etc.) ó

II. Sólidos de almidón (adicionados antes del secado tienen un

efecto protector sobre la enzima),

III. Sal (preparaciones de papaína para ablandamiento de carnes) ó

IV. Talco


Evaluación del proceso de purificación.

I. Rendimiento de la etapa. La cantidad o unidades de enzima que se recuperaron después de la operación.


Unidades o cantidad después de la operación

Unidades o cantidad antes de la operaciónY =

I. Pureza del producto. Requiere de la determinación de proteína y se reporta como actividad específica.


Donde:E = Actividad enzimática P = Proteína Ae = Actividad específica

E =unidades

ml de medioP =

mg de proteína

ml de medio

Ae = =E unidades

P mg de proteína

III. Factor de purificación. Definido como el numero de veces que la enzima fue purificada al efectuarse la operación de purificación.

IV. Factores económicos. La determinación de los parámetros anteriores permite establecer la factibilidad técnica de la operación de purificación.


Ae (antes de la operación)

Ae (después de la operación)

Factor de purificación o veces de purificación

=

Amilasas

ALGUNOS EJEMPLOS DE PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE ENZIMAS MICROBIANAS

Amilasa Microorganismo Usos o actividadα-amilasa. bacterias del género

Bacillus licuefacción o sacarificación

Son metaloenzimas que requieren

calcio.

β-amilasa. Bacillus polymyxa Producción de maltosa a partir de almidón

Amiloglucosidasa.

bacterias del género Aspergillus

Producción de glucosa a partir del extremo no reductor de amilosa y

amilopectina

Pululanasa. Cepas Aerobacteraerogenes

Hidrolizan pululano

Proteasas.

Tipos: Endoproteasas y exopeptidasas.

Microorganismos: todos aquellos que pueden crecer en un medio de cultivo con proteínas como fuente de nitrógeno. Los más empleados son Bacillus y Aspergillus.

Usos: En la industria quesera como sustituto de renina o cuajo microbiano. En la industria de alimentos para la síntesis de aspartamo.


Glucosa isomerasa.

Microorganismos: Bacillus coagulans, Streptomyces phaechromogenes, S. olivaceus, S. olivochomogenes, S. wedmerensis, S. albus, Arthobacter, Actinoplants misseuriensis.

Usos: Producción de jarabes fructosados a partir de jarabes glucosados.



Celulasas y β-glucanasas.

Tipos: Endoglucanasas, celobiohidrolasas y β-glucosidasa o celobiasa.

Microorganismos: Thricoderma reesei, Chaetomium thermophile, Sporotrichum thermophilicum (alta temperatura de operación), A. awamori, A. niger, A. phoemicis (alta actividad β-glucosidasa).

Usos: degradación de celulosa, las β-glucanasas se emplean en cervecería.

Pectinasas.

Se denomina a un complejo de enzimas que se clasifican de acuerdo con el sustrato (pectina o ácido péctico), del tipo de reacción (hidrólisis o transeliminación) y del mecanismo (endo, exo), incluyéndose además a la pectinesterasa.

Microorganismos: Aspergillus niger, produce una endo y una exopoligalacturonasa, una endo polimetril galacturonasa y una endo pectin liasa.


Lipasas.

Se reprime en presencia de mono y disacáridos en el medio así como glicerol.

La producción se incrementa al adicionar al medio lípidos (aceite de oliva, aceite de almidón) ácidos grasos (oleico) o lecitina.

Microorganismos: Mucor mihei, A. niger, Geotricum candidum, Candida cilindraceae, Pseudomons sp., Rhizopus oryzae y R. niveus.


Dextranasa.

Microorganismos: Penicillium funicilosum, P. lilaceum y Chaetonium gracilae.

Usos: Ingenios azucareros.

Inductor: Dextranas.

Invertasa.

β-fructofuranosidasas o α-glucosidasas.

Microorganismos: S. cerevisae, S. carlsbergensis.

Inductor: Sacarosa.


Lactasa.

También conocida como β-galactosidasa, hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa.

Microorganismos: Hongos y levaduras. A. oryzae y A. niger, kluyveromyces lactis, K. fragilis y Cándida pseudotropicallis.

Hongos. Producen enzimas extracelulares, con alta estabilidad térmica y pH de actividad (2.5-4.5), se utilizan sustratos como maltosa o salvado.

Levaduras. Producen enzimas Intracelulares, con baja estabilidad térmica, pH de actividad (6.0-7.0), se utiliza como inductor la lactosa.


Glucosa oxidasa.

Microorganismos: A. niger, Penicillium amagaskiense, P. vitae.

Usos: Se emplea en combinación con catalasa o peroxidasa.

Acil Tanino Hidrolasa.

Microorganismos: A. niger.

Usos: manufactura de té instantáneo.


3. produc

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