CROMATINA

ADN de ØX174 Cromosomas eucarióticos en mitosis

ADN de EUCARIOTAS, PROCARIOTAS, VIRUS CONDENSADO POR ASOCIACIÓN CON PROTEÍNAS

La cromatina

Cromatina extraída con buffer de baja fuerza iónica. (perlas de un collar)

Cromatina extraída con buffer de fuerza iónica fisiológica (fibra condensada)

La cromatina

Micrografía electrónica de cromosoma en metafase sin histonas

Bucles de ADN

Armazón proteico de proteínas no histonas

CROMOSOMA EUCARIÓTICO - CROMATINADIFERENTES NIVELES DE COMPACTADO

6 veces compactado

40 veces compactado

> 1000 veces compactado

> 10000 veces compactado

CROMATINA - NUCLEOSOMAS

FIBRA DE 30 nm

FIBRA DE 10 nm

« collar de perlas »

Suspension de nucleos a baja fuerza ionica: lisis y liberación de fibras de cromatina de 30 nm

Nucleasa microcóccica

fuerza iónica

Tratamiento más drástico con nucleasa

microcóccica:

1) Se liberan mononucleosomas

2) Se liberan nucleosomas recortados

3) Se liberan cores de histonas

205

405

805605

Digestión suave con nucleasa microcóccica: se obtienen múltiplos de una determinada unidad de longitud: Repetición nucleosomal

PARTÍCULA NUCLEOSÓMICA CENTRAL

- 146 pb de ADN enrollados alrededor de la PARTÍCULA NUCLEOSÓMICA CENTRAL o CORE de histonas (2 vueltas)

- Tetrámero de H3 y H4

- 2 dímeros de H2A y H2B

OCTÁMERO

HISTONAS DEL CENTRALES o del CORE

- Proteínas pequeñas (11- 15 Kda)- Muy conservadas - Alta carga + (ricas en Lys y Arg)- Dominio “pliegue histónico” - 3 hélices- separadas por asas cortas no estructuradas- Colas N-terminales

¿Cómo se disponen los nucleosomas en la fibra de 11 nm?

2 factores favorecen la ubicación de un nucleosoma:

1) Facilidad para que se curve la doble hélice: secuencias ricas en AT en surco menor

2) Presencia de proteínas no histonas unidas al ADN con gran afinidad

- Longitud variable en el genoma

- Posicionamiento dinámico

Fibra de 30 nm:

Una vez que se forman los nucleosomas, la fibra de 10 nm se condensa en el siguiente nivel de compactado

2 modelos para la fibra de 30 nm:

SOLENOIDEZIGZAG

ADN ligador

ADN ligador

Ambos modelos serían correctos. Dependen de: Longitud del ADN entre nucleosomas.

197 pb favorecería la forma solenoide (H1 estabiliza estructura) (Cromatina inactiva). Menor longitud entre nucleosomas (sin H1, cromatina activa)

Histona H1 o ligadora- Proteína pequeña; un poco más grande que las del core

- Secuencia menos conservada

- Estructura típica

¿Dónde se ubica en el nucleosoma?

Modelos:

Protección de 20 pb adicionales de ADN de digestión con nucleasa microcóccica

Las colas N-terminales de las histonas intervienen en la formación de la fibra de 30 nm

Recordar : Las colas de las histonas son blanco de modificaciones

post-traduccionales

Compactado en la fibra de 30 nm, un cromosoma humano aún mediría 0.1 cm = 10 veces más grande que el núcleo celular!!

Niveles de mayor compactado (?) que varían en el ciclo celular en respuesta a señales del ciclo celular

Cromatina saliendo de un núcleo lisado en interfase Cromosoma

mitótico

MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES DE LAS HISTONAS DEL CORE

- Lisinas y Serinas de histonas del core sufren acetilación, metilación, fosforilación, ubiquitinación....

- Mutaciones causan alteraciones de la expresión:

Ej. H4: *dominio R (aa 17 a 29) : implicado en represión

*dominio A (aa 1 a 16) : implicado en activación

- Modo de acción:

1) modificación de la interacción con ADN (carga)

2) Lugares de unión para proteínas

Histonas modificadas en las colas

“Código de histonas”

Código de histonas

• No está claro si algo así existe• Aún si existiera, no es universal• Sin embargo, estudios de todo el genoma si detectan

patrones• Una modificación no conduce inevitablemente a un

resultado

• Secuencias MAR (Regionesde unión a la matriz); SAR (Regiones asociadas a andamiaje). Ricas en AT.

Favorecen la for mación y mantenimiento de un dominio trans cripcionalmente activo

• LCR (Locus control region): Elemento de regulación formado por un sitio o grupo de sitios de hipersensibilidad a la DNasa I

Relación entre dominio estructural y dominio funcional

Dominio funcional: Región de cromatina sensible a DNAsa I, alrededor de un gen o grupo de genes.Algunas MAR se encuentran en los límites de un dominio funcional, aunque no siempre.

EN VIRUS: ADN o ARN condensado dentro de las partículas virales por interacciones inespecíficas con proteínas de la cápside

VMT: ARN en hélice dentro de la cápside

CROMOSOMA EN PROCARIOTAS

Lisis: fibras en forma de bucles unidas a la envoltura rota de la célula. El ADN se une a proteínas básicas.

LISIS

E.coli

• Cromosomas circulares (la mayoría)

Célula de mamífero visualizada mediante microscopio óptico (contraste de fases)

A diferencia de lo que ocurre en las células procariotas, el núcleo permite un mecanismo

de regulación de la expresión génica más complejo

ARNm

pre−ribosomas

ARNt

pre−miRNA

ARNsn

Proteínas nucleares

Proteínas ribosómicas

snRNP

El núcleo en interfase

La envoltura nuclear separa el contenido del núcleo del citoplasma y proporciona un armazón estructural al núcleo.

Envoltura nuclear

• Es una membrana doble que rodea al núcleo.

• La membrana nuclear tiene poros por donde pasan algunas moléculas desde el núcleo al citoplasma y viceversa.

• Los poros nucleares son estructuras complejas que contienen por lo menos ocho subunidades proteicas con un canal pequeño en el centro.

                                          

Componentes de la envoltura nuclear

Lámina Nuclear

• Modelar y reforzar la Membrana Interna

• Reforzar los complejos de poro nuclear

• Fijar la cromatina a la Membrana Interna

• Red de proteínas fibrosas

Complejo del poro nuclear

Hay aproximadamente 2.000 complejos de poro en un núcleo

cyt. coaxial ring thin ring star ring spoke ring nuc. coaxial ring NPC basket

cytoplasm

outer nuclear membrane

perinuclear space

inner nuclear membrane

nucleoplasm

Bagley, S. et al

Transporte selectivo de proteínas a través del poro nuclear

Las proteínas que se dirigen al núcleo….

Histonas, ADN polimerasas, ARN polimerasas, factores de transcripción, etc.

…contienen una corta secuencia de aminoácidos: la señal de localización nuclear.

Las señales de localización nuclear son reconocidas por proteínas que funcionan como receptores de transporte nuclear.La mayoría son miembros de la familia de proteínas de la carioferina y funcionan como:Importinas (transportan macromoléculas al interior del núcleo)Kapa/Kapb1Esnurportina/Kapb1Kapb1Kapb2Importina 7/dímero Kapb1

Exportinas (exportan macromoléculas desde el núcleo al citoplasma)Crm1CASExportina-tExportina-4

Las pequeñas proteínas Ranunen GTP, se necesita para la traslocación a través del complejo del poro nuclear y determina la dirección del transporte.Ran es una GTPasa (superfamilia Ras)

2 formas: unida a GTP (principalmente en el nucleoplasma) unida a GDP (predonima en el citoplasma)

La transición entre las dos formas está mediada por 2 proteínas:

En el nucleoplasma:RanGEF (Factor intercambiador de guanina de Ran)

En el citoplasma:RanGAP (Proteína activadora de la Ran-GTPasa)

Existe una elevada concentración de Ran/GTP en el núcleo y una elevada concentración de Ran/GDP en el citoplasma. Se cree que este gradiente de Ran/GTP determina la direccionalidad del transporte nuclear.

RanGEF

RanGAP

Cytoplasm

Nucleoplasm

NTF2

Ran GTP

Ran GTP

Ran GDP

Ran GDP

PI

Exp

ort

GDP GTP

Distribución de Ran/GTP a través de la envoltura nuclear

Importe de Proteínas

Pasos:1- Unión Importina-Ran/GDP a Proteína2- Unión a filamentos citoplasmáticos del poro3- En el núcleo el GDP es cambiado a GTP y se libera la proteína4- Complejo Importina – Ran/GTP se exporta5- Regeneración del Ran/GDP

Exportación de Proteínas

Regulación del transporte de Proteínas

Transporte de ARN

pre-miRNA Exportin−5

snRNA cap, CRM1 (Exportin−1), PHAX

snRNP Importin−β

ribosomal subunits CRM1 (Exportin−1)

Transporte de ARN• Proceso activo, depende de Energía• Exportados como complejos ribonucleoproteínas (RNPs).• Proteínas del complejo poseen señales de exportación nuclear reconocidas

por receptores.• ARNr se asocian a proteínas ribosómicas y específicas. Las subunidades

nacientes se exportan.• Los ARNsn se exportan y luego se importan

Transporte de ARN mensajeroEn este caso, Ran no es necesaria

se utiliza una proteína heterodimérica exportadora de mRNA

¿Por qué se necesita de otro sistema de transporte para los ARNm?Antes de ser exportado deben ocurrir:

Adición del capuchón 5´Adición de la cola poli ACorte y empalme

El ARN inmaduro no debe ser enviado al citoplasmaPor lo tanto, la exportación de ARNm está ligada a:

– transcripción– procesamiento

¿Cómo se encuentra el ARNm en el núcleo?

Transporte de ARN mensajero

• El ARNm está asociado a:– Proteínas de unión a 5‘ cap

– Proteínas de unión a cola 3‘ poli−A – splicing factors

– Factores generales de unión a RNA (proteínas de unión a exones)

– Otros factores involucrados en el procesamiento de pre−mRNA

Transporte de ARN mensajero

El transporte se puede resumir en tres pasos:

1. Ensamblaje de complejos mRNP de exportación

- control de calidad

2. Translocación a través de NPC3. Desarmado de complejos mRNP de

exportación

Transporte de ARN mensajero

gene

mature mRNP

transcription

splicing

processing

attach Mex67

Cytoplasm

Nucleoplasm

mature mRNP

dissociate Mex67

translation

1. mRNP assembly

2. translocation

3. mRNP disassembly

Transporte de ARN mensajero

x

x x

AAAAAAAAAPab1

Pab1

Mex67p

Mex67pMex67p

Mtr2

Mtr2Mtr2

5‘•••5‘CBC

Dbp5

Ensamblaje

Estructura del núcleo de la célula

Organización interna del núcleo

Transcripción de ARNr: organizador nucleolar

Transcripción de ARNr: organizador nucleolar

Los organizadores nucleolares se encuentran en los satélites de los cromosomas acrocéntricos humanos

El ADN para el ARNr 5S se encuentra en una secuencia repetida en el cromosoma 1 y se transcribe por separado

En el nucléolo se distinguen….

F: FC: Centro fibrilarD: DFC: Componente fibrilar densoG: Componente granular

Organización Interna del núcleo

El núcleo eucariota contiene además de nucléolo una variedad de estructuras subnucleares dinámicas

Cuerpos de Cajal

- Proteína coilina- Ensamblaje de snRNP- Modificación de U snRNA- Procesamiento del extremo 3′

de mRNA de histonas- Regulación del ciclo celular- Ensamblaje de factores de

transcripción - Señalización en apoptosis

Organización Interna del núcleo

Cuerpos PML - Aumentan de 2 a 10 cuerpos hasta 50 en células

neoplásicas.- Proteína promielocítica + factores implicados en

regulación transcripcional (factores de transcripción).

- Función desconocida.- La proteína PML se une al receptor de ácido

retinoico en la leucemia PML, marcador tumoral.

Organización Interna del núcleo

Cuerpos PML y Cuerpos de Cajal se asocian

Organización Interna del núcleo

Cuerpos PML y Cuerpos de Cajal se asocianCoilina-GFP (fluorescencia verde en Cuerpos de Cajal) + Anticuerpo anti PML (Fluorescencia roja)

Cuerpos PML y Cuerpos de Cajal se asocian entre sí y con el locus U2

Organización Interna del núcleo

Anticuerpo anti Coilina (fluorescencia roja en Cuerpos de Cajal) + Anticuerpo anti PML (Fluorescencia azul) + sonda que hibrida con gen U2 (verde).

Organización Interna del núcleo

Organización de los cromosomas en el núcleo