2014 dna recombinan
DESCRIPTION
uyiuiiuuugugggjkgjgjjgjgjgjgjgjgjgjgjgjgjgjgjgjgjgjgjggjgjggjTRANSCRIPT
-
Teknologi dna rekombinan (GENETIC ENGINEERING)
DR.Restu Syamsul Hadi, MKes.
-
Awalnya manipulasi genetik secara tradisional seperti : pemuliaan selektif untuk meningkatkan nilai gizi tanaman
terlalu lambat
Pengenalan gen dari satu spesies yang berasal dari organisme ke organisme dari spesies yang berbeda (organisme transgenik)
Kloning gen untuk menentukan fungsinya Mengubah fenotip suatu organisme untuk meningkatkan sifat yang diinginkan
Rekayasa genetika dengan teknik molekuler Memungkinkan untuk menciptakan perubahan genetik lebih besar pada kecepatan yang jauh lebih cepat
Produksi bahan farmasi dalam jumlah besar
MENGAPA ILMUWAN MENGEMBANGKAN REKAYASA GENETIKA..?
-
Kelangsungan Hidup Manusia
Ditunjang Oleh
Teknologi
melalui
Bioteknologi
Bioteknologi Konvensional Bioteknologi Modern
Pengolahan Bahan Makanan Misalnya
Tempe Kecap Keju mikroprotein Kultur Jaringan
Rekayasa Genetik
-
Selective Breeding Tanaman atau hewan dengan karakteristik yang diinginkan paling banyak
digunakan untuk pemuliaan lebih lanjut
Hybridization (Crossbreeding) Menggabungkan strain yang berbeda spesies untuk menggabungkan
karakteristik terbaik dari keduanya. (burung dara + perkutut = sinom)
Recombinant DNA Technologies Transformasi
Teknik Dasar Rekayasa Genetika
-
Teknik perubahan genetik suatu organisme, atau keturunan, untuk menghilangkan karakteristik bahan yang tidak diinginkan atau untuk menghasilkan bahan yang baru yang diinginkan.
Penambahan, penghapusan, atau manipulasi sifat tunggal dalam organisme untuk menciptakan perubahan yang diinginkan
Definisi:
Apa Rekayasa Genetika?
-
Teknik Rekombinan meliputi:
-Teknik untuk mengisolasi DNA
-Teknik untuk memotong DNA.
-Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA.
-Teknik untuk memasukkan DNA kedalam sel hidup
sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan
dapat diekspresikan
Teknologi DNA Rekombinan
kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk
mengkombinasikan gen-gen secara buatan.
-
- Isolasi dan pemurnian DNA Isolasi DNA bakteri Isolasi DNA plasmid Pemurnian secara kimiawi dan enzimatis
- Berbagai jenis dan karakterisasi vektor vektor plasmid vektor yeast vektor bakteriofag
- Enzim restriksi dan ligase Jenis enzim restriksi Faktor yang berpengaruh terhadap enzim restriksi Faktor yang berpengaruh terhadap enzim ligase
-
Teknik Elektroforesis dan PCR Faktor yang berpengaruh dalam elektroforesis Faktor yang berpengaruh terhadap PCR
DNA sekuensing dan hibridisasi southern blot northern blot western blot
DNA rekombinan dan Transformasi Isolasi Restriksi Sel kompeten Transformasi
-
Rekayasa genetika, juga dikenal sebagai
teknologi DNA rekombinan, berarti mengubah gen dalam organisme hidup untuk menghasilkan Genetically Modified Organism (GMO) dengan genotipe baru
Berbagai jenis modifikasi genetik yang mungkin: memasukkan gen asing dari satu spesies menjadi
- spesies lain, - membentuk organisme transgenik; - mengubah gen yang ada sehingga produknya berubah, - mengubah ekspresi gen sehingga ditranslasikan lebih
sering atau tidak sama sekali
-
1. Isolasi gen
2. Insersi ke dalam host menggunakan vector
3. Perbanyak copy DNA sebanyak mungkin
4. Pemisahan produk gen yang dihasilkan
5. Ekstraksi produk gen yang diinginkan
Basic steps in genetic engineering
-
Menjadi petanda adanya ekspresi gen dan protein target dalam sel-sel hidup suatu organisme
Paling banyak digunakan adalah green fluorescent protein
(GFP) pertama kali diisolasi dari Victoria aequorea (ubur-ubur), dapat dilekatkan ke hampir semua protein dan yang menarik dan masih dapat menjadi fluorescent molecule.
Dapat digunakan untuk melokalisasi protein yang sebelumnya belum di-karakterisasi untuk memvisualisasikan dan melacak protein untuk lebih memahami peristiwa selular.
Dapat digunakan untuk melihat proses perkembangan
Fluorescent proteins are a useful tool in biotechnology
-
Tikus transgenik dapat digunakan untuk mempelajari sistem kekebalan tubuh dan penyakit genetik
Babi : Faktor VIII pada pembekuan darah, organ-organ untuk
transplantasi Hewan lain : hormon pertumbuhan IL-2 (kanker), albumin
Hewan Transgenik
-
Tanaman tahan hama
jagung (gen toksin dari Bacillus thuringiensis yang dapat membunuh serangga)
Tanaman tomat
Golden rice (beta-carotene)
Plant-based vaccines
Organisme rekombinan
-
Tanaman tahan hama
Jagung Bt (mengandung gen toksin dari Bacillus thuringiensis yang membunuh hama)
Golden rice (mengandung beta-carotene)
Tanaman sebagai vaksin
Genetically Modified Organisms
-
Genetic engineering of Bt-resistant corn (Bt-corn)
Bt-transgenic plants are resistant to insects, no need for spraying insecticide
Clone Bt toxin gene from bacteria and express in plants
Tanaman jagung tidak perlu lagi insektisida, serangga/ulat akan mati bila
memakan jagung
-
Contoh penerapan rekayasa genetika pada tanaman Golden Rice mengandung gen untuk menghasilkan vitamin A
Biji beras (endosperm) kekurangan senyawa essential seperti vitamin A dan precursornya (-carotene). Defisiensi Vitamin A dapat meyebabkan kebutaan dan penurunan sistem imun tubuh.
-
Rekayasa genetika manusia berarti mengubah gen dalam sel manusia yang hidup
Misalnya pada penderita penyakit paru-paru yang disebabkan oleh gen yang cacat dalam sel paru-paru. Dengan cara memperbaiki gen-gen memungkinkan akan sembuh .
Mengubah gen dalam sel hidup dengan menempatkan gen baru yang diinginkan ke virus yang diperbolehkan untuk masuk ke sel-sel manusia dan yang memasukkan gen baru ke dalam sel bersama dengan sebelumnya
HUMAN GENETIC ENGINEERING
-
HUMAN GENETIC ENGINEERING
-
Rekayasa genetika yang menargetkan gen di organ tertentu dan jaringan tubuh orang yang ada tanpa mempengaruhi gen dalam gamet (telur atau sperma).
Percobaan transfer gen somatik sedang menjalani uji klinis, dengan hasil yang beragam sampai saat ini. Suatu hari nanti mungkin akan dapat digunakan dengan efektif
"Somatic "genetic engineering
-
Rekayasa genetika yang menargetkan gen dalam gamet (telur, sperma, atau embrio sangat awal)
Perubahan yang mempengaruhi setiap sel dalam tubuh individu yang dihasilkan, dan diwariskan kepada semua generasi berikutnya
"Germ line" genetic engineering
[note: The term "somatic" comes from the Greek "soma" for "body." The term "germline" refers to the "germ" or "germinal" cells, the eggs and sperm.
-
Insulin (diabetics) Factor VIII (males w/hemophilia A) Factor IX (hemophilia B) Human growth hormone Erythropoietin (anemia) Angiostatin/endostatin(anti-cancer drugs) leptin
Produk DNA Recombinant untuk terapi pada manusia
-
Inserting gene in correct cells
Inserting gene so it is expressed correctly
Orientation
Regulation Controlling virus vector
Ethical issues
Kesulitan pada Rekayasa Genetika Manusia
-
Teknik KLONING GEN
-
Dari Bahasa Yunani - klon, ranting Kumpulan turunan suatu individu yang
dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi)
Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya
Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya
Kloning - definisi
-
Kloning DNA
Metoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan
memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon)
yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan
DNA yang kompleks.
-
Kloning Gen
Ketika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebut
Pada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)
-
Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut
Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut
Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut
Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan
Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.
Tujuan mengklon Gen
-
DNA kromosom
cDNA (complementary DNA) yang disintesis menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)
DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan
PCR
Sumber DNA untuk diklon
-
Enzim endonuklease restriksi
Enzim ligase
Vektors
Inang (Host)
Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam sel inang
Bahan / Alat untuk Mengklon
-
Memotong DNA Menggunakan enzim
endonuklease restriksi Ujung lengket (sticky ends)
Ujung tumpul (blunt ends)
Penamaan enzim EcoRI E = genus (Escherichia) co = species (coli) R = strain
I = # of enzyme
-
Penyambungan (pasting) DNA
Pembentukan ikatan-H pada ujung-ujung yang komplemen (sticky ends)
Ligase membentuk ikatan fosfodiester untuk merekatkan benang-benang DNA
-
Vektor untuk Mengklon
Diperlukan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu potongan
DNA ke dalam sel agar DNA tersebut
dapat disimpan dan diperbanyak di
dalam sel tersebut
-
Vektor untuk Mengklon
1 Vektor berupa plasmid
2 Vektor berupa bakteriofaga
3 Cosmid
4 BACs (Bacterial Artificial Chromosome)
& YAC (Yeast Artificial Chromosome)
-
DNA bukan kromosom (extrachromosomal DNA) yang secara alami dimiliki suatu jasad
Bentuknya benang ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkular
Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain
1. Plasmid
-
Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu
membawa potongan DNA lain ke dalam sel
bila memiliki:
Replikator (origin of replication)
Penanda (Marker) yang mudah diseleksi (misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)
Situs untuk mengklon (potongan DNA yang
memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi
sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di
dalam daerah replikator atau penanda
Vektor untuk Mengklon
-
Plasmid yang Dimiliki oleh
Escherichia coli
Berasal dari plasmid alami E. coli
Potongan DNA tambahan
Potongan DNA tambahan
-
Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk binatang lain
Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan
Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA asing disambung, akan dihasilkan "plasmid rekombinan"
Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai
Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)
-
1. Memiliki origin of replication dari inang yang
dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara
independen terhadap genom inang.
2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel
pembawa plasmid tersisipi DNA asing
ketahanan terhadap antibiotik ganda
penapisan biru-putih
3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple
cloning sites, MCS)
4. Mudah diisolasi dari sel inang.
Vektor berupa Plasmid
-
Multiple Cloning Site (MCS)
-
Vektor berupa Plasmid
-
Keunggulan:
Kecil, mudah pengerjaannya
Strategi seleksi mudah
Berguna untuk mengklon potongan DNA ukuran
kecil (< 10kbp)
Kelemahan:
Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan
DNA ukuran besar (> 10kbp)
Vektor berupa Plasmid
-
2. Bakteriofaga (l phage)
-
Lengan kiri:
Protein penyusun kepala
& ekor
Lengan kanan:
Sintesis DNA
Pengendalian
Lisis inang
Daerah yang dihilangkan:
integrasi & eksisi
Pengendalian
Vektor berupa bakteriofaga (l vectors)
-
Vektor berupa bakteriofaga (l vectors)
-
Keunggulan:
Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
ukuran besar (10 - 23 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Kelemahan:
Lebih sulit pengerjaannya
Vektor berupa Bakteriofaga
-
Keunggulan: Bermanfaat untuk mengklon potongan DNA
berukuran sangat besar (32 - 47 kbp)
Seleksi berdasar ukuran
Pengerjaan seperti plasmid
Kelemahan: Tidak terlalu mudah untuk mengerjakan
plasmid dengan ukuran sangat besar (~ 50 kbp)
3. Vektor Cosmid
-
Vektor Cosmid
-
Replikasi dimediasi oriS dan oriE
parA and parB mengendalikan agar hanya terdapat satu vektor dalam sel
Menggunakan penanda ketahanan terhadap KhloramfenikolR
4a. Vektor BAC
-
Dapat disisipi gen asing 200 - 2000 kbp dan dimasukkan ke dalam yeast
4b. Vecktor YAC
telomere telomere centromere
URA3 ARS HIS3
replication
origin
markers
large
inserts
-
Keunggulan: Dapat digunakan untuk mengklon potongan DNA dengan ukuran
sangat besar (100 - 2,000 kbp)
Penting digunakan dalam proyek penetapan urutan basa nukleotida total genom
Kelemahan: Tidak mudah mengerjakan molekul DNA dengan ukuran sangat
besar
BACs dan YACs
BACs : Bacterial Artificial Chromosomes
YACs : Yeast Artificial Chromosomes
-
Ukuran DNA yang disisipkan
Ukuran vektor
Situs enzim restriksi yang tersedia
Jumlah salinan (copy number)
Efisiensi kloning
Kemampuan untuk menapis DNA sisipan
Rencana penelitian selanjutnya
Memilih Vektor
-
Isolasi vektor kloning (plasmid bacterial) & DNA sumber gen
Pemotongan DNA sumber gen
& vektor kloning menggunakan
enzim restriksi yang sama
Penyisipan potongan DNA
sumber gen ke dalam vektor
kloning yang telah dipotong
menggunakan enzim restriksi
yang sama; potongan
disambung dengan bantuan
enzim DNA ligase
Cara Mengklon DNA (1)
-
Vektor kloning yang telah
tersisipi potongan DNA
dimasukkan ke dalam sel
inang (transformasi sel
inang)
Penapisan sel pengklon
(dan gen yang
dimasukkan)
Identifikasi sel pengklon
pembawa gen yang
dikehendaki
Cara Mengklon DNA (2)
-
Memasukkan plasmid (yang
merupakan vektor yang telah disisipi
gen) ke dalam sel inang
Transformasi Sel Inang
-
PRA-INKUBASI Sel E. coli calon penerima plasmid dipaparkan kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan ini memberikan cekaman kepada bakteri yang mengakibatkan membran sel dan dinding sel bakteri tersebut menjadi permeabel terhadap plasmid donor. Proses ini mengakibatkan E. coli menjadi kompeten" untuk menerima plasmid .
Transformasi
-
INKUBASI
Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E. coli kompeten.
Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang tidak ditambah plasmid digunakan sebagai kontrol.
Transformasi
-
KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK) Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun
kontrol) dipaparkan sejenak (90 detik) kepada suhu
42 oC. Langkah ini memaksimumkan masuknya
plasmid menembus membran dan dinding sel.
Transformasi
-
PENYEMBUHAN (RECOVERY) Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun
kontrol) ditumbuhkan dalam medium kaya nutrisi
untuk memberi kesempatan penyembuhan setelah
mengalami cekaman dan kejutan. Masa
penyembuhan biasanya berlangsung satu waktu
generasi (untuk E. coli berkisar antara 30 hingga 45 menit)
Transformasi
-
PENAPISAN (SCREENING) Sel kompeten yang telah mengalami penyembuhan
ditapis pada medium padat yang mengandung
senyawa penapis berdasarkan penanda yang dibawa
oleh plasmid.
Transformasi
-
Koloni E. coli yang membawa plasmid dengan penanda gen pendar
fluor (pGLO)
-
E. coli yang Membawa Plasmid pGlo
-
Medium pertumbuhan diberi antibiotik yang sesuai dengan sifat ketahanan yang digunakan sebagai penanda, misalnya Kanamisin
Bakteri di paruh cawan petri sebelah kanan memiliki plasmid dengan penanda ketahanan terhadap Kanamisin(Kanr), yang di sebelah kiri tidak memilikinya
Penapisan Klon
-
Manfaat
Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat dibidang ilmu
pengetahuan maupun dibidang terapan.
Contoh:
Bidang Kesehatan:
Insulin manusia
telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan
untuk mengobati penyakit diabetis.
Merekdagang: HumulinR
Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk
mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol).
Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi
secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri