1999. kawaina uami

PRODUCTOS NATURALES, VOL. IV: PERSPECTIVAS BIOTECNOLOGICASCOPYRIGHT © 1999 UAM-IZTAPALAPAISBN 970-654-441-0

EFECTO ANTICOAGULANTE DE LA ESTIRILPIRONA 4’-HIDROXI-DEHIDROKAVAINA AISLADA DE Brongniartia intermedia

J. Salinas Sánchez, R. Reyes Chilpa1, G.A. Magos Guerrero2

y M. Jimenez Estrada1

UAM-Xochimilco, Calzada del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, Del. Coyoacán 04960 México, D.F. 1Instituto de Química de la UNAM, Circuito Exterior, Ciudad Universitaria, Coyoacán 04510 México, D.F.

Tel. 56-22-44-30 e-mail: [email protected], [email protected] y 2Facultad de Medicina de la UNAM Ciudad Universitaria, Coyoacán 04510 México, D.F.

Las estirilpironas son productos naturales típicos de plantas pertenencientes a las Piperaceas y Lauraceas, pero eventualmente también se encuentran en Asteraceas y Leguminosas. Este tipo de compuestos poseen actividad ansiolítica, relajante, espasmolítica y anestésica local, también se ha demostrado que presentan actividad antiplaquetaria. Recientemente la industria farmacéutica empezó a producir fitofármacos ansiolíticos a partir del extracto seco de Piper methysticum. Esta especie es originaria de 0ceanía y posee una alta concentración de estirilpironas. El objetivo del presente estudio fue aislar estirilpironas de una leguminosa mexicana, así como evaluar su posible efecto anticoagulante. Del extracto metanólico de las raíces de Brongniartia intemedia se aislaron e identificaron cuatro compuestos por RMN1H, RMN13C, IR, UV y EM. Se obtuvo: una estirilpirona, 4´-hidroxi-dehidrokavaina, un derivado del ácido nervónico, el 3,5-diprenil-p-hidroxi-cinamato de metilo, dos esteroles, β-sitosterol y estigmasterol, así como dos compuestos aún no identificados. Las propiedades anticoagulantes de la 4´-hidroxi-dehidrokavaina no han sido evaluadas, por lo tanto se decidió estudiarlas in vivo con ratones (cepas CD-1 y takoni). La 4´-hidroxi-dehidrokavaina se administró vía subcutánea. La significancia estadística de los resultados fue evaluada utilizando la prueba U Mann-Whitney. La 4´-hidroxi-dehidrokavaina mostró un efecto anticoagulante a la dosis de 100 mg/kg sin que se manifestara algún efecto tóxico o letal. El efecto anticoagulante fue estadísticamente significativo en el segundo día después de la administración. Estos resultados se compararon con los mostrados por dos anticoagulantes utilizados en la terapéutica: warfarina y heparina. La actividad retardada de la 4´-hidroxi-dehidrokavaina fue semejante a la mostrada por la warfarina (31 mg/Kg) y fue diferente a la de la heparina (100 U.I.). Lo anterior sugiere que el mecanismo de acción de la 4´-hidroxi-dehidrokavaina podrá ser semejante al de la warfarina y podrá deberse a algunas semejanzas estructurales que comparten.

INTRODUCCIONEl género Brongniartia

(Leguminosae: Papilionoideae) comprende aproximadamente 65 especies, casi todas ellas endémicas de México. (Sousa y Delgado, 1993). Este género ha sido bien estudiado desde el

punto de vista taxonómico (Rydberg, 1923; Dorado, 1992) pero es practicamente desconocido desde el punto de vista químico y farmacológico. Los antecedentes etnobotánicos indican que diversas especies de éste género reciben tres usos principales: 1) En el

199

Estirilpirona 4’-hidroxi-dehidrokavaina aislada de Brongniartia intermedia, Salinas Sánchez et al., 1999.

tratamiento de enfermedades y parasitárias externas (piojos, pulgas, ácaros). 2). Como veneno para pescar y 3). En el tratamiento de mordeduras de serpientes (Reyes, et al. 1994).

Los estudios químicos indican la presencia de alcaloides, isoflavonoides, triterpenoides, derivados del ácido cinámico y estirilpironas. Brongniartia discolor, B. lupinoides, B. sousae y B. intermedia muestran un patrón típico de α-pironas con citisina, anagirina y baptifolina. En las hojas de las primeras tres especies fueron encontrados alcaloides tipo omosanina. Brongniartia flava y B. vazquezii no presentaron α-pironas; pero mostraron alcaloides tipo lupanina, lupaninas hidroxiladas y ésteres de alcaloides (Greinwald et al., 1996).

Reyes (1994) aisló de las raíces de Brongniartia podalyrioides los pterocarpanos, (-) -edunol, neorautenol, 3´- epineurautenol; así como otros isoflavonoides del tipo de los cumestanos, 3-aril-cumarinas, benzofuranos y una estirilpirona. De las hojas de B. intermedia se aislaron β-sitosterol, estigmasterol, taraxasterol, lupeol, edunol y pinitol, mientras que de las raíces se obtuvo neorautanano, edunol. 3,5-diprenil-p-hidroxi-cinamato de metilo, 3-prenil-4,5-(2´,2´-dimetilpirano) cinamato de metilo, brongniol y brongtimedol (Corona, 1993). Reyes (1994), aisló la 4´-hidroxi-dehidrokavaína de la raiz de Brongniartia podalyrioides (conocida como hierba de la víbora); sin embargo no se sabe si este tipo de compuestos pudiera estar presente en otras especies como B. intermedia.

A la fecha solo existen dos estudios farmacológicos sobre el género Brongniartia. Armendaris (1906), analizó una especie de Brongniartia sp. (garbancillo) del estado de Queretaro y

concluyó que el polvo de las hojas, raíz y extractos hidroalcóholicos, preparados por separado eran inócuos administrados a palomas y conejos. Reyes et al., (1994) estudiaron las propiedades farmacológicas del edunol, el cual neutralizó la toxicidad del veneno de la serpiente Bothrops atrox. El edunol (3.1 mg/kg) administrado vía intraperitonal (i.p) incrementó notoriamente la sobrevivencia de ratones envenenados previamente con la dosis letal media (DL50) del veneno.

Generalidades de las estirilpironas (=kava lactonas). Los derivados aromáticos de las α- pironas, especialmente las 6-substituídas, son constituyentes químicos típicos de Lauráceas y Piperáceas, siendo rara su presencia en otras familias vegetales (Hipólito, 1977). Sin embargo uno de estos compuestos, la 4´-hidroxi-dehidrokavaína (=4-metoxi-6-(p-hidroxi-estiril)-α- pirona) (figura 1) y derivados han sido aisladas de dos especies de las Asteraceae (Kaloga et al., 1983; Talapatra, et al., 1983).

Figura 1. Fórmula estructural de la 4´-hidroxi-dehidrokavaina (= 4-metoxi-6-

(p-hidroxi-estiril)- α- pirona)

Hipólito et al., (1977) aislaron la 4´-hidroxi-dehidrokavaína de la corteza de la raíz de Acosmium subelegans (Leguminosae, Lotoideae). Dicha

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especie es un árbol de las regiones del “Cerrado Brasileiro” conocida por el nombre popular de “perobinha” o “perobinha de campo”. En la misma época (1972) Romo et al., aislaron un glucósido de la corteza de Sweetia panamensis Benth, (Leguminosae, Papilionoideae) al cual denominaron “panamina”. Este compuesto por hidrólisis ácida produjo glucosa y una aglucona que correspondió a la 4´-hidroxi-dehidrokavaína (figura 1). También realizaron la conversión de esta sustancia en yangoina mediante metilación con sulfato de dimetilo. La síntesis de la yangoina había sido realizada previamente por Edwards y Mir (1967) utilizando el método de Bu´Lock y Smith (1960) por medio de condensación de p-metoxibenzaldehido con 4-metoxi-6-metil-α-pirona, en presencia de metoxido de magnesio en solución metanólica, seguida de la hidrólisis (con ácido sulfúrico diluído) del producto formado

Smith (1983) aisló kava lactonas con diferentes substituyentes en la posición C-6 de la especie Piper methysticum, originaria de Oceanía. El nombre común de esta especie es “Kava Kava”. Cabe destacar que dicha especie es de importancia médica y comercial. La primera descripción botánica la realizó Foster (1754-1794), quién además, describió la acción relajante de una bebida de kava kava que se obtiene de las raíces. Actualmente extractos de kava kava se comercializan como ansiolíticos por diferentes compañías farmacéuticas. La acción relajante de la bebida de kava kava es producida por las denominadas kava-lactonas (figura 2): kavaína, metisticina, desmetoxiyangonina yangonina, dihidrokavaína y dihidrometisticina (Hansel, 1964).

R R´Dihidrokavaína H HKavaína H HDesmetoxiyangonina H HTetrahidroyangonina OMe HYangonina OMe HDihidrometisticinMetisticin

OCH2OOCH2O

C5 C6 C7 C8

Figura 2. Kava lactonas de Piper methisticum

Uno de los fitofármacos formulados con estirilpironas es

Laikan de Laboratorios Farmasa S.A. de C.V. del grupo Schwabe, Alemania.

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R

R

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3


Su presentación es en cápsulas. Cada una contiene 100 mg del extracto seco de las raíces de la planta kava. Laikan es comercializado como un ansiolítico y se recomienda 1 cápsula tres veces al día. Otro fitofármaco es Antares 120 de Krewel Meuselbach, Alemania. Su presentación es en tabletas de 120 mg. También contiene el extracto seco de las raíces de kava pirona. Se ha demostrado que la absorción de las kava lactonas de un extracto de kava es mejor que las sustancias puras. Asi mismo se ha podido comprobar que las cuatro lactonas estudiadas, es decir, dihidrokavaina, kavaina, desmetoxiyangonina y yangonina, están biodisponibles en el tejido cerebral. Laikan posee acción relajante, espasmolítica, anestésico local y antiarrítmica sobre los músculos (Lehmann et al., 1996). En estudios

clínicos han demostrado tener un perfil de acción claramente ansiolítico sin signos de provocar adicción o dependencia en dosis terapéuticas (Bhate, 1988; Warnecke, 1986-1989).

Hsu, et al., (1993). aislaron dos estirilpironas de la especie Alpinis speciosa K. Schum (Zingiberaceae); la dihidro-5,6-dehidrokawaina (DDK) y la 5,6-dehidrokawaina (DK) (demetoxi-yangoina) (figura 3). Estas substancias demostraron en experimentos farmacológicos que inhiben la secreción gástrica en ratas (30-200 mg/kg). Otra actividad biológica de estos constituyentes fué el efecto antiplaquetario debido a la inhibición de la formación del tromboxano A2 (Teng, et al., 1990). También se reportó que producen analgesia por un mecanismo de acción diferente al de los opioides.

Figura 3. Fórmulas moleculares de la DK (5,6-dehidrokavaína) y de la DDK (dihidro-5,6-dehidrokavaína)

Es importante señalar que los datos etnobotánicos de la especie de Alpinis speciosa K. Schum (Zingiberaceae); indican que es empleada en China como remedio estomacal, también es usado en el tratamiento de vómito y dispepsia, como astringente, tónico y sedante. (Shih, et al., 1993).

En el presente estudio se describe el aislamiento de la estirilpirona 4´-

hidroxi-dehidrokavaina de la raíz de Brongniartia intermedia y en razón a las propiedades antiplaquetarias reportadas para la DDk y DK (fig. 3), se decidió evaluar la posible acción anticoagulante de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína en ratón, mediante el micro-metódo del capilar (Mandoki JJ, et al., 1983).

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METODOLOGIAEstudio químico (Instrumentación).

Los puntos de fusión se determinaron en un aparato Fisher Jonhs y no están corregidos, los espectros de UV se determinaron en un epectrofotómetro Perkin-Elmer modelo 552 en solución metanólica. Los espectros IR fueron determinados en un espectofotómetro Perkin-Elmer modelo 283-B y Nicolet FT-JR 5 SX, en KBr (pastilla). Los espectros de RMNP fueron determinados en espectrómetros analíticos Varian VXR 3005 (300 MHz) y Varian Gemini 200 (200 MHz) en solución de CDCl3, D2O y/o acetona deuterada, los desplazamientos químicos (δ) están dados en ppm referidos al tetrametilsilano (TMS) como patrón interno. Para la obtención de los espectros de masas se utilizó un espectrometro de masas Hewlett-Packard 5985-B.

Material Biológico. Brongniartia intermedia fué colectada en el estado de México, cerro del Tetzcutzingo, municipio de Texcoco, en junio de 1995. Sus raíces se maceraron por una semana a temperatura ambiente con metanol; posteriormente se concentró en un rotavapor y el disolvente se eliminó in vacuo.

Extracto metanólico. En la figura 4 se muestran las etapas principales para la obtención del compuesto I del extracto metanólico de las raices de B. intermedia.

Figura 4. Extracto metanólico de la raíz de B. intermedia (30g)

Maceración (30g) en acetato de etilo

La parte soluble se concentró (13.4 g)

Cromatografía en columna (silicagel 60, mezclas de diclorometano-acetona)

Metabolitos aislados

Fracción 2 (754 mg) Fracción 7-8 (700 mg) Fracciones 9-10, 11-12, 13

C. Columna C. Columna(Silica gel, diclorometano-hexano) (Silica gel, hexano-diclorometano)p.f. 252-254° 265-270° 261°

Subfracciones 7-8 (líquido viscoso) Subfracciones Sólido amarillo

3,5-diprenil-p-hidroxicinamato de metilo 30-36, 37-40, 41-52, 4-hidroxi-dehidrokawaina (II)

p.f. 138-140° 125-126° 270-273° (I) β-sitosterol (III) No identificados (V y VI) Stigmasterol (IV)

203


Estudio farmacológico. Las propiedades anticoagulantes de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína (I) aislada de B. intermedia se examinaron in vivo. Se utilizaron ratones machos (20-30 g) cepa CD-1 y takoni del bioterio de la Facultad de Medicina de la UNAM. Se emplearon Heparina y Warfarina como patrones positivos (Sigma Chem. Co.) y solución salina como control. Se utilizó Tween 80 y dimetilsulfóxido como vehículo. La vía de administración de las sustancias fue subcutánea (s.c). El

tiempo de coagulación se determinó siguiendo el método de Mandoki (1983), el cual emplea un dispositivo prísmatico, un cronómetro, una hoja de rasurar, capilares no heparinizados de 1.3 mm de diámetro por 75 mm de largo y un termómetro. Para saber si había diferencias entre los tratamientos se utilizó la prueba U Mann-Whitney, Rnk sum test, con un nivel de significancia de 0.05. Se realizaron 3 experimentos (tabla 1).

Tabla 1. Tratamientos utilizados para evaluar el efecto de la 4´-hidroxi-dehidrokavaina en la sangre del ratón

Tratamientos A B C

Peso (cepa) 20-26 g (CD-1) 25-30 g (takoni) 20-25 g (CD-1)

Nº de animales 4 4 4

Vía de administración

(s.c.) (s.c.) (s.c.)

Dosis administradas de 4

´-hidroxi-dehidrokavaina

31 mg/kg10 mg/kg3.1 mg/kg

100 mg/kg 100 mg/kg

Patrón positivo Heparina 100 U.I. Warfarina 10 mg/kg

Heparina 100 U.I.Warfarina 31

mg/kg

Grupo controlSolución salina más tween 80 al

2%

Solución salina más tween 80 al

4%

Solución salina más tween 80 al

5% y 4% de dimetilsulfoxido

Evaluación del tiempo de

coagulación a:15 min 15 min

24, 48 y 72 h15 min

24, 48 y 72 h

RESULTADOSEstudio químico. De las raíces de

B. intermedia (tabla 2) se aislaron e identificaron 4 compuestos químicos pertenecientes a tres grupos de metabolitos secundarios: estirilpironas, ácido nervónico y triterpenos. El primer

grupo esta compuesto por la 4´-hidroxi-dehidrokavaína (I). El segundo grupo por el 3,5-diprenil-p-hidroxicinamato de metilo (II) y el tercero por el β-sitosterol (III) y el estigmasterol (IV). En seguida se muestran los datos espectroscópicos

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y químicos que permiten proponer las estructuras respectivas de los componentes aislados.

4´-hidroxi-dehidrokavaína (1). C14H12O4, sólido amarillo, p.f. 265-270°. UV λmax [MeOH]nm (ε): 218 (21472), 283 (6283), 360 (27999). IR υmax [KBr]cm-1: 3401 y 3264 (OH); 1699 (C=O); 1633, 1608, 1550, 1443, 1406, 1260, 1154, 958, 822 (C=C). EM m/z (%): 244 [M+] (100), 243 [M+-H] (2), 216 [M+-CO] (28), 188 [ M+-C3H4O] (5), 173 [M+-C3H3O2] (25), 145 (6), 127 (3), 115 (3), 91 (4), 69 (7), 65 (2), 39 (2). El espectro de masas muestra el ion molecular en 244 (100%), el cual también es el pico base. Dicho peso molecular es congruente con la formula C14H12O4.

El espectro de RMNP (CDCl3–DMSO) mostró las siguientes señales: 3.77 (s) 3H (OMe); 9.55 (s) 1H (OH), en 5.43 (d) y 6.01 (d) (2H del anillo pirona, J=2.1 Hz), 7.21 (d) y 6.52 (d) (protones vinílicos, J=16 Hz), 7.33 (d) y 6.74 (d) (4H del anillo bencénico, sistema A2B2

J=8.5 Hz)

El espectro de RMN 13C mostró una señal en 170.7 ppm la cual fue asignada al carbonilo de la posición 2, dos señales en 162.8 y 158.7 ppm para los carbonos cuaternarios C-4 y C-6, respectivamente. Dos señales en 99.7 y 87.6 ppm se atribuyeron a los carbonos C-3 y C-5 y una señal en 55.6 que se asigno al metoxilo C-4. También mostró dos señales dobles en 115.5 y 128.7 ppm asignados a los carbonos C-11 -C-13 y C10-C-14 respectivamente.

Acetato de 4´-hidroxi-dehidrokavaína (Ia). C16H14O5, agujas largas ligeramente anaranjadas, p.f. 175-178°. UV λmax [ MeOH ]nm (ε): 254 (10582), 340 (18232). IR υmax [CHCl3] cm-1: 1762 (OCOCH3), 1711 (CO); 1641, 1604, 1555; 1455, 1406, 1371, 1153, (C=C). EM m/z (%): 286 [M+] (47), 267 [M+-] (1), 244 [M+-C2OH2] (100), 216 (37), 188 (5), 173 (21), 145 (4), 127 (3),115 (4), 91 (2), 69 (7), 43 (14).

El espectro de RMNP (CDCl3) mostró las siguientes señales: 2.31 ppm (s) 3H (OCOMe); y 3.83 (s) 3H (OMe); 5.5 (d) y 5.95 (d) (2H del anillo de la pirona, J=2.4 Hz), 7.47 (d) y 6.53 (d) 2H, protones etilénicos J=15.7 Hz), 7.5 (d) y 7.11 (d) (4H del anillo bencénico, sistema A2B2, J=8.5 Hz).

3,5-diprenil-p-hidroxicinamato de metilo (II). C20H26O3, aceite amarillo. IR (CHCl3) cm-1: 3443 (OH); 2929 (CH); 1702 (CO); 1633 (C=C); 1471 y 1439 (CH2); 1267 (C-O); 982 (aromático). EM m/z (%): 314 [M+] (72), 297 [M+-OH] (100), 259 [M+-C4H7] (61), 243 [M+-C3H3O2] (30), 211 (14), 203 (40), 183 (9), 167 (7), 149 (15), 115 (10), 91 (6), 69 (14), 41 (18).

El espectro de RMNP (CDCl3). 1.78 (s) 12H (4 metilos), 3.78 (s) 3H (OMe), 7.26 s (1H, H aromático), 7.17 (s) (1H, H aromático), 3.34 (d) (4H, metilenos bencílicos, J= 7.3 Hz), 5.32 (t) (2H, H vinílicos del isoprenilo, J=7.3 Hz), 7.6 (d) y 6.27 (d) (2H, sistema AB para los protones de una doble ligadura “trans” de la cadena del ester metílico, J= 16 Hz), 5.65 (1H, OH).

Tabla 2. Compuestos aislados de Brongniartia intermedia

Nombre Punto de fusión

Fórmula molecular

Estructura molecular PM

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4-hidroxi-dehidrokavaína*

(I)

265-270° C14 H12 O4 244

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O

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6

78

O

OMe

OH

2´

3´

6´

3

5´


Acetato de4-hidroxi-dehidro-kavaína

(a)

175-178° C16 H14 O5 286

3,5-diprenil-p-

hidroxi-cinamato de metilo

(II)

Líquido viscoso

C20 H26 O3

OH

C-OMe

O

314

β-sitosterol(III)

138-140°(mezcla)

C29H50O

HO

414

Estigmasterol(IV)

138-140°(mezcla)

C29H48O

HO

412

Pendiente (V)

125-126° C25H16O6 ? Pendiente 412

Pendiente (VI)

270-273° C20H24O3 ? Pendiente 310

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O

5

6

78

O

OMe

OCCH3

2´

3´

6´5´

3´

O


Figura 5. Efecto anticoagulante de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína en la sangre del ratón (Valores promedios de los tiempos de coagulación), Tratamiento A (cepa

CD-1)Estudio farmacológico.

Tratamiento A (cepa CD-1) los tiempos de coagulación de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína (I) a la dosis mas alta (31 mg/kg) comparados con el grupo control no mostraron diferencias significativas (prueba U Mann-Whitney, Rnk sum test). Sin embargo el efecto del compuesto I representó el 55% del tiempo de coagulación de la heparina. El efecto anticoagulante de la heparina fue estadísticamente significativo comparado con el grupo control (p=0.0004, d.e=70.5,X=419). En cuanto a las dosis de 10 y 3.1 mg/kg de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína no hubo ninguna diferencia significativa comparados con el grupo control (Figura 5).

Tratamiento B. (cepa takoni) no se observó alguna diferencia estadísticamente significativa en el 1°, 3° y 4° día comparando la 4´-hidroxi-dehidrokavaína y la warfarina con el grupo control. En el 2° día, solamente la warfarina tuvo diferencia estadísticamente significativa

(p=0.0093, X=265.5, d.e.= 76.6). Sin embargo se puede observar (grafica 2) que en el segundo día los tiempos de coagulación de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína y la warfarina son casi iguales, pero estadísticamente no existió diferencia alguna (Figura 6)

Tratamiento C. (cepa CD-1). La 4´-hidroxi-dehidrokavaína a la dosis mas alta (100 mg/kg) mostró un efecto anticoagulante estadísticamente significativo con respecto al control a partir del 2° día (p=0.0286 prueba U Mann-Whitney, Rnk sum Test). En el caso de la warfarina y heparina también mostraron diferencia significativa en el segundo día (p=0.0286 y p=0.0046 respectivamente). En la grafica 3 se observa que el efecto anticoagulante de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína fue superior al de la warfarina y heparina, sin embargo la dosis utilizada no es la misma para cada sustancia. En cuanto al 1°, 3° y 4° día la diferencia entre los grupos no fué estadísticamente significativa (Figura 7).

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Tratamientos

Seg

4´-hidroxi-dehidrokavaína 3.1 mg/kg

4´-hidroxi-dehidrokavaína 10 mg/kg

4´-hidroxi-dehidrokavaìna 31 mg/kg

Heparina 100 U.I.

Solución salina (control)


Figura 6. Efecto anticoagulante de la 4´-hidroxi-dehidrokavína en la sangre del raton (Valores promedios de los tiempos de coagulación), Tratamiento B

(cepa takoni)

Figura 7. Efecto anticoagulante de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína en la sangre del ratón (Valores promedios de los tiempos de coagulación) Tratamiento C (cepa

CD-1).

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0

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300

350

1 2 3 4Día

Seg

4´-hidroxi-dehidrokavaína 100 mg/kgWarfarina 31 mg/kgheparina 100 U.I.Solución salina (control)

0

100

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300

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500

600

1 2 3 4

Día

Seg

4´-hidroxi-dehidrokavaína

Warfarina 10 mg/kg

Solución salina (control)


ANALISIS Y DISCUSIONEn el extracto metanólico de las

raíces de B. intermedia se encontró la estirilpirona 4´-hidroxi-dehidrokavaína (I), un derivado del ácido nervónico el 3,5-diprenil-p-hidroxicinamato de metilo (II), una mezcla de los esteroles β-sitosterol (III) y estigmasterol (IV), así como dos compuestos más que no se identificaron (V y VI).

La 4-hidroxidehidrokavaína (I) se aisló como un sólido amarillo p.f. 265-270°, (reportado 270° Hipólito et al., 1977; 280-283° Romo et al., 1971). Sus espectros de I.R., U.V., E.M. y RMNP fueron similares a los previamente reportados por (Hipólito et al., 1977; Romo et al., 1971; Talapatra et al, 1982 y Kaloga et al., 1983). Este compuesto ya habìa sido aislado de Brongniartia podalyrioides (Reyes, 1994); sin embargo no se sabía si también estaba presente en B. intermedia. Es significativa su presencia en dos especies de Brongniartia ya que las estirilpironas son compuestos típicos de Lauráceas y Piperáceas (Hipólito et al., 1977; Smith, 1983; Talapatra et al., 1982 y Kaloga et al., 1983) siendo rara su presencia en otras familias vegetales como las Leguminosas y Asteraceas. Adicionalmente se preparó el acetato de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína (Ia) mediante reacción química con anhídrido acético y piridina. Sus espectros de I.R., U.V., E.M. y RMNP fueron similares a los reportados por (Hipólito et al., 1977; Romo et al., 1971).

El derivado del ácido nervónico 3,5-diprenil-p-hidroxicinamato de metilo (II) y la mezcla de esteroles; el β-sitosterol (III) y el estigmasterol (IV) ya habían sido aislados previamente por Corona (1993) de B. intermedia. Sus espectros de I.R., U.V., E.M. y RMNP fueron similares a los reportados por este mismo autor. Cabe señalar que Corona (1993) en su estudio fitoquímico

de B. intermedia no aisló a la estirilpirona 4-hidroxidehidrokavaína.

La evaluación farmacológica in vivo indicó que la 4´-hidroxi-dehidrokavaína a la dosis de 100 mg/Kg puede tener un efecto anticoagulante en el segundo día de administración (Figura 7). Su actividad anticoagulante retardada es similar a la de la warfarina. Desde el punto de vista químico la 4´-hidroxi-dehidrokavaína (I) y la warfarina así como otros anticoagulantes orales comparten características estructurales similares (anillo de alfa lactona); en cambio no existen semejanza alguna entre la heparina y la 4-hidroxidehidrokavaína (I).

La warfarina es un anticoagulante oral, su efecto in vivo es lento por inferir con la biosintesis de los factores de coagulación dependientes de la vitamina K. Se emplea terapéuticamente para disminuir la coagulación de la sangre con el objeto de prevenir trombosis venosa y otros padecimientos. También se utiliza como rodenticida (Goldstein, 1978). En contraste la heparina tiene un efecto rápido tanto in vivo como in vitro por inhibir la acción de uno a más factores de la coagulación (Katzung B.G, 1991; Goodman y Gilman´s, 1991). Los resultados de los ensayos de el efecto anticoagulante de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína (I) sugieren que ésta puede tener un mecanismo de acción semejante al de la warfarina y diferente al de la heparina. Es importante señalar que a la dosis de 100 mg/kg, la 4´-hidroxi-dehidrokavaína no presentó ningun efecto tóxico, ni letalidad en algunos de los ratones utilizados al cabo de 72 h.

Las estirilpironas DDK y DK aisladas de la especie Alpinis speciosa K. (Zingiberaceae) por Shih (1994), guardan estrecha relación estructural

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con la 4´-hidroxi-dehidrokavaína. Esta solo difiere de los compuestos citados por la presencia de un hidroxilo sobre el Carbono 4´. El efecto antiplaquetario de la DDK y DK es debido a la inhibición de la formación del tromboxano A2 (Teng et al., 1990) lo cual sugiere que posiblemente la 4´-hidroxi-dehidrokavaína también pueda tener este mecanismo de acción. Por otro lado, las Kava lactonas extraídas de Piper methysticum; kavaína, metisticina, desmetoxiyangonina y yangonina (Hansel, 1994) que poseen efecto ansiolítico son químicamente parecidas a la 4´-hidroxi-dehidrokavaína. En este caso también se podría suponer que esta tuviera un efecto relajante, pero se requiere demostrarlo experimentalmente.

El análisis de nuestros resultados nos lleva a concluir que aunque se observó el efecto anticoagulante de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína en el último ensayo (Figura 7), es necesario realizar otro ensayo con mayor número de animales y posiblemente aplicar otro tipo de método para determinar el tiempo de coagulación.

CONCLUSIONESSe aislaron e identificaron 4

compuestos químicos presentes en el extracto metanólico de las raíces de B. intermedia. Se encontró una estirilpirona 4´-hidroxi-dehidrokavaína (I); un derivado del ácido nervónico el 3,5-diprenil-p-hidroxicinamato de metilo (II); una mezcla de esteroles β-sitosterol (III) y stigmasterol (IV) y dos compuestos más que no se identificarón (V y VI). También se logró evaluar el efecto anticoagulante de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína (I). Se obtuvo por reacción química el 4´-acetil-dehidrokavaína (Ia).

La estirilpirona 4´-hidroxi-dehidrokavaína (I) aislada de B.

intermedia tuvo efecto anticoagulante a la dosis de 100 mg/kg. Su estructura molecular es semejante a las estirilpironas (Kava lactonas) previamente descritas: DDk (dihidro-5,6-dehidrokavaína), DK (5,6.dehidrokavaína). También guarda cierta semejanza estructural con un anticoagulante oral que es la warfarina, en especial por la función lactónica. El efecto anticoagulante de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína fué semejante al de la warfarina, un anticoagulante oral ya conocido terapéuticamente. La dosis de 100 mg/Kg de la 4´-hidroxi-dehidrokavaína administrada subcutaneamente no presentó tóxicidad, ni letalidad en los animales de experimentación al cabo de 72 h.

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