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REVERSIBLE POLYMERISATE DES PSEUDOISOCYANINS 359

Uber die Bildung reversibler Polymerisate des Pseudoisocyanins durch polare, kettenförm ige H ochpolym ere (Heparin) I

Von W. A p p e l und G. S c h e ib e

Aus dem physikalisch-chemischen Institut der Technischen Hochschule München(Z. Naturforschg. 13 b , 359— 364 [1958] ; eingegangen am 11. März 1958)

Es wird gezeigt, daß Hochpolymere mit eng sitzenden negativen Gruppen (SO30 COO0 ) ver­dünnte wäßrige Lösungen von Pseudoisocyanin in die aggregierte Form mit der charakteristischen schmalen Absorptionsbande zu verwandeln vermögen. Untersucht wurden Heparin, Chondroitin­schwefelsäure, Hyaluronsäure und Polyäthylensulfosäure. Die verschiedenen Stoffe ergeben kleine Unterschiede in der Lage der polymeren Bande.

Im Zuge der W eiterführung unserer A rbeiten über M etachromasie und ihre physikalisch-chemischen G rundlagen untersuchten wir die Metachromasie- Effekte bei der E inw irkung von H eparin auf ver­dünnte, wäßrige Farbstoff lösungen. W ir wählten Farbstoffe aus der Klasse der M onom ethincyanine, insbesondere das /Vj/V'-Diäthylpseudoisocyaninjodid sowie das A cridinorange, da diese Farbstoffe in ge­nügend konzentrierten, wäßrigen Lösungen gut un ­tersuchte Ä nderungen ihrer A bsorptionsspektren zei­gen; der Schwerpunkt der A bsorptionsbanden ver­schiebt sich beim A cridinorange ( Z ä n k e r 1) nach dem kurzwelligen Bereich. Beim Pseudoisocyanin ( S c h e ib e 2) tritt eine neue, steile und sehr scharfe, sogenannte „reversible polym ere“ Bande auf. Diese „polym ere“ Bande tritt auch in Em ission auf, und zwar auch dann, wenn Licht gleicher W ellenlänge zur Anregung verwendet wird (Resonanzfluores­zenz) ; daneben treten noch weitere F luoreszenzban­den im langwelligeren Bereich auf. Zusammen mit den Ä nderungen in der L ichtabsorption tr itt auch eine G elatinierung der Lösung auf. Diese Effekte werden durch Alkoholzusatz oder Erw ärm en rever­sibel aufgehoben.

Die gleichen Erscheinungen zeigten sich, als wir verdünnte, w äßrige Lösungen der beiden genannten Farbstoffe m it H eparin-Lösung versetzten. Beim A cridinorange entsprechen die dabei auftretenden Ä nderungen des Absorptionsbildes denen, wie sie auch bei K onzentrations-Erhöhung beobachtbar sind. Über diese A rbeiten wurde bereits berich te t3. In der vorliegenden A rbeit soll über die Ergebnisse

1 V. Z ä n k e r , Z . physik. Chem. 2 0 0 , 250 [1952] ; G. S c h e ib eu. V. Z ä n k e r , Z . Physik 133, 244 [1952].

2 G. S c h e ib e u . Mitarbb., Kolloid-Z. 82, 1 [1938]; Z. angew.Chem. 5 2 , 631 [1939] ; Z. Elektrochem. 5 2 , 283 [1948] *;Z. Elektrochem. 6 0 , 566 [1956] *.

* In diesen Arbeiten Angabe weiterer Literatur.

unserer U ntersuchungen mit Pseudoisocyanin be­richtet werden.

Über gleichzeitig in diesem Zusam m enhang durch­geführte Untersuchungen über die metachromatische A nfärbbarkeit histologischer Gewebsschnitte durch Pseudoisocyanin wird an anderer Stelle berichtet werden 4.

I. Experim entelles

1. H e p a r i n eÜber die Chemie der Heparine und Heparinoide

wurde in der vorhergehenden Arbeit 3 ein kurzer Über­blick gegeben, so daß eine nochmalige Behandlung sich hier erübrigt. Über die Strukturformeln von a-Heparin nach W o l f r o m und Mitarbb. 5, von Chondroitinschwefel­säure und von Hyaluronsäure sei auf die Literatur ver­wiesen 5:1; diese Körper gehören zu den Mucopoly- sacchariden und besitzen — mit Ausnahme der Hyal­uronsäure — S 0 3H-Gruppen.

Die Wirksamkeit der Heparine wird in „Internatio­nalen Einheiten“ ausgedrückt:

1,0 mg = 130 I.E. und eine I.E. dann 7,8 y = 7,8 • 10-6 g der Internationalen Standardsubstanz.

2. F a r b s t o f fFür die quantitativen Messungen verwendeten wir

stets den gleichen Farbstoff, 7V,/V'-Diäthylpseudoiso- cyaninjodid; die Reinheit wurde mit Hilfe chromato­graphischer und elektrophoretischer Methoden über­prüft.

a ) P a p ie r Chrom atograph ieWir benützten die Rundfilter- und die aufsteigende

ein- und zweidimensionale Methodik. Lösungsmittel für die papierchromatographische Untersuchung von Mono- methincyaninfarbstoffen waren zunächst nicht bekannt.

3 W. A p p e l u . V. Z ä n k e r , Z . Naturforschg. 13 b, 126 [1958].4 G. S c h e ib e u . A . S c h a u e r , unveröffentlicht.5 H. L . W o l f r o m , R . M o n t g o m e r y , J. A. K a r a b in o s u . P. R a t h ­

g e b , J. Amer. chem. Soc. 72, 5796 [1950],5;l R . M a r b e t u . A. W in t e r s t e in , Helv. chim. Acta 34, 2315

[1951],

360 W. A P P E L UND G. SCHEIBE

Als geeignet erwiesen sich schließlich Mischungen von n-Butanol/Wasser/Eisessig oder n-Butanol/Wasser/Pyri- din in verschiedenen Verhältnissen sowie besonders Ge­mische aus Methyläthylketon/n-Butanol/Wasser/tert. Amylalkohol in den Verhältnissen (90) : (10) : (10 — 40 - 5 0 - 7 0 - 8 0 - 1 0 0 - 1 2 0 - 1 4 0 ) (v/v).

Systeme mit hohem Gehalt an Wasser, Methanol, Äthanol, Aceton, n- oder t-Propanol oder Glykoläthern („Cellosolven“) waren bei den gut wasserlöslichen Farbstoffen dieser Gruppe wenig brauchbar; für spe­zielle Trennungen eigneten sich Mischungen aus n- Butyl- und tert. Amylalkohol mit wenig oder gar kei­nem Wasserzusatz. Für Routineuntersuchungen des A^A^-Diäthylpseudoisocyaninäthyljodids benützten wir die SystemeÄthanol/Wasser/Eisessig 5 6 : 4 3 : 1 Rf = 0,80 — 0,85, Collidin/5-proz. NH3 gesättigt Rf = 0,42 — 0,45.

Die angegebenen Rf-Werte gelten für das Papier „Schleicher & Schüll 2043 b“ aufsteigend jeweils 15 Stdn. in der Laufrichtung des Papiers ohne weitere Vor- oder Nachbehandlung.

Der Farbstoff erwies sich papierchromatographisch als völlig einheitlich. Die Absorptionsspektren der Ori­ginallösungen und der Eluate der einheitlichen Farb­stoffzonen präparativer Chromatogramme waren iden­tisch.

b) PapierelektrophoreseZur Elektrophorese wurden die Geräte „Elphor H “

(horizontale Anordnung) und „Elphor Va“ (vertikale Anordnung) nach G r a s s m a n n und H a n n i g be­nutzt; das letztere Gerät erlaubte die Abtrennung des Farbstoffes aus einem un- oder vorgereinigten Reak­tionsgemisch in mikropräparativem Maßstab. Als Puf­fermischung diente das System Veronal/Veronal-Na (0,01-m., ph 8,6), die angelegten Spannungen lagen zwischen 100 V (Stromstärke etwa 4,0 mA) und 620 V (16 mA). Für weitere Untersuchungen wurden Span­nungen, Laufzeiten und Puffersysteme (pH-Werte und Konzentrationen) verändert.

Audi auf Grund der Papierelektrophorese wurde der Farbstoff als einheitlich erkannt.

Damit genügt das Ar,Ar -Diäthylpseudoisocyaninäthyl- jodid den strengsten Anforderungen, die man an die Reinheit einer Substanz stellen kann.

3. A b s o r p t i o n s s p e k t r e nDie ermittelten Absorptionsspektren werden in der

Darstellung log e als Funktion der Wellenzahl v bzw. der Wellenlänge X gebracht; sie wurden mit dem Zeiß- Spektrophotometer PMQ2 im Bereich von 400 — 600 m// aufgenommen. Gemessen wurden 10~4- und IO--5-/«. Lösungen mit und ohne NaCl-Zusatz (16 • 10-2 -m. ^ 0,95%, ^ physiologische Kochsalzlösung) mit stei­genden Zusätzen von Heparin sowie 16 * 10_2-m. NaCl- Lösungen mit konstantem Gehalt an Heparin [10 Inter­nationale Einheiten (I.E.) pro ml Lösung] und stei­genden Farbstoffkonzentrationen ( l ,0 -1 0 ~ 5-m. bis 1,0- 10'“4-m.).

Für die quantitativen Messungen wurde als Heparin „Liquemin Roche“ verwendet (5000 I.E. pro ml), das

in Form einer neutralen wäßrigen Lösung des Na-Sal- zes vorlag. Bei vergleichenden Untersuchungen mit den Heparinpräparaten der Fa. Nordmark „Vetren“ und dem sehr reinen Trockenpräparat der Fa. Farbwerke Hoechst * stimmten die Ergebnisse in allen Fällen überein.

II. Versuchsergebnisse

1. O h n e N a C l - Z u s a t z

Die M eßergebnisse einer 10“ 4-m. rein wäßrigen Lösung von Pseudoisocyanin (P .I.) mit Zusätzen von 0 — 0,02 — 0,05 — 0,1 — 0,2 I.E . Heparin pro ml sind in Abb. 1 wiedergegeben. Dabei gibt die Kurve ohne Zusatz das reine A bsorptionsspektrum des P .I. w ieder mit den beiden M axima bei 19 100 und 20 400 cm -1 und einer kurzwelligeren Inflexion. An der Stelle des M axim um s der polym eren Bande fällt die K urve steil und stetig ab.

Abb. 1. y-Isocyanindiäthyljodid, Konstant: 1,0• 10_ 4-ra. + Heparin in H20 .

* Wir danken der Fa. Farbwerke Hoechst für die freund­liche Überlassung dieser und anderer Präparate, der Fa. Hoffmann La-Roche für das Heparinpräparat Liquemin sowie insbesondere für die überlassene Literatur.

REVERSIBLE POLYMERISATE DES PSEUDOISOCYANINS 361

Bei einem Zusatz von 0,02 I.E . H eparin pro ml zeigt sich bei 17 500 cm -1 ein kleines, gut ausge­prägtes M aximum, das bereits die polymere Bande andeutet.

Der übrige K urvenverlauf unterscheidet sich nicht von dem der reinen Farbstofflösung. Bei einem Zu­satz von 0,05 I.E. H eparin pro ml ist die polymere Bande bereits deutlich verstärkt, steigt bei 0,1 I.E. pro ml noch weiter an und erreicht bei 0,2 I.E. pro ml einen noch höheren Extinktionsw ert, ohne daß die monomeren Banden gegenüber denen einer 10~4-m. rein wäßrigen P .I.-Lösung verschoben sind. Eine leichte E rniedrigung dieser Banden beruht ver­mutlich auf einer K onzentrationsabnahm e der m ono­meren Form , wobei die relativ geringe Menge der polymeren Form den K urvenverlauf des m onom eren P .I. nicht wesentlich zu beeinflussen vermag.

Abb. 2 zeigt den K urvenverlauf bei höheren Zu­sätzen bis zu 500 I.E . H eparin pro ml. Bei einem Zusatz von 0,7 I.E . pro ml ist die polym ere Bande bereits sehr stark ausgeprägt und liegt rund 15-mal höher als bei einem Zusatz von 0,02 I.E. Gleichzei­tig werden die beiden M axima der m onom eren B an­den soweit erniedrigt, daß die kurzwelligere Bande nur noch als Schulter in Erscheinung tritt. A ußer­dem tritt eine neue Schulter bei 18 600 cm -1 auf.

Bei einem Zusatz von 1,0 I.E . pro ml liegen die Verhältnisse gleich, die polym ere Bande ist nur noch unwesentlich erhöht. Bei Zusätzen von 5,0 I.E. pro ml treten wiederum neue Erscheinungen auf: die polymere Bande erreicht ein M aximum (rund 27-mal höher als dasjenige bei einem Zusatz von 0,02 I.E. pro ml) und zeigt eine deutliche kurzwel­lige Verschiebung um 150 cm -1 . Die beiden u r ­sprünglichen M axima sind völlig verschw unden; an die Stelle des langwelligeren derselben tritt sogar ein Minimum. Die zweite neu auftretende Schulter bei 18 600 cm -1 wird zu einem deutlichen M aximum ausgebaut. Genau an der Stelle des M inimums zwi­schen den beiden M axima der m onom eren Banden, tritt nunm ehr eine weitere Schulter bei 19 700 cm -1 auf.

Bei noch höheren Zusätzen von 50 und 500 I.E. H eparin pro ml treten keine wesentlichen V erände­rungen im A bsorptionsverlauf m ehr auf. Bei einem Zusatz von 500 I.E. wird das neu entstandene M axi­mum bei 18 600 cm -1 sehr gut ausgeprägt; eigen­artigerweise ist die Lage der polym eren Bande wieder die gleiche wie bei Lösungen m it geringen H eparin- Zusätzen, gegenüber diesen jedoch in ihrem A bsolut­wert erhöht.

600 500 X [m u ] ----- * - 100

Abb. 2. ^-Isocyanindiäthyljodid, Konstant: 10- 4-m. + Hepa- rin in H20 .

2. M i t N a C l - Z u s a t z

Als Lösungsmittel wurde 16 • 10-2 -m. NaCl-Lö- sung verwendet. Der H eparingehalt betrug konstant10,0 I.E . pro ml, die P .I.-K onzentration fiel in der Reihenfolge 1 0 - 8 — 6 — 5 — 4 — 2- und 1,0 *10- 5 - m olar.

Den A bsorptionsverlauf der Lösungen m it hohen P .I.-K onzentrationen zeigt Abb. 3. Die A bsorptions­kurven bei K onzentrationen von 10, 8 und 6 ,10~5-/n. und 10 I.E . H eparin pro ml zeigen in ih rer Lage das gleiche Bild wie Kurven mit 1 • 10 -5 -/n. P .I. und5 — 500 I.E. H eparin pro ml ohne NaCl-Zusatz (zum Vergleich Abb. 2 : 10-4 -m. P .I. rein w äßrig mit5 — 500 I.E . pro m l): eine steile und scharfe poly­m ere Bande bei 17 500 cm -1 , das zweite, neu au f­tretende M aximum bei 18 600 cm -1 und das breite, undeutlich schulterähnlich ausgeprägte Maximum um 19 700 cm -1 . Ferner ist der A bsorptionsverlauf

362 W. APPEL UND G. SCHEIBE

Abb. 3. t/;-Isocyanindiäthyljodid + Heparin, Konstant: 10 I.E. pro ml in 1 6 - 1 0 ^ 0,95%, ^ physiol. NaCl.

einer 2 • 10_5-m. P .I.-Lösung in NaCl aufgeführt, der trotz Gegenwart von 10 I.E . H eparin pro ml völlig dem K urvenverlauf einer NaCl-freien P.I.- Lösung ohne H eparin entspricht (s. un ten). Eine geringe E rhöhung der Absolutwerte der Banden durch NaCl-Zusatz allein wurde weiter noch nicht untersucht.

Abb. 4 zeigt den A bsorptionsverlauf von Lösungen mit kleineren P .I.-Konzentrationen. Bei 5 • 10_a-m. P.I. scheint ein Grenzwert erreicht zu sein: die poly­mere Bande ist noch sehr steil, zwar etwas ernied­rigt, aber imm er noch höher als bei Lösungen glei­cher K onzentration ohne NaCl-Zusatz. Das zweite Maximum bei 18 600 cm “ 1 ist gut m arkiert, eben­falls die Schulter bei 19 700 cm - 1 ; bei 20 400 cm -1 ist jedoch bereits eine Inflexion vorhanden, die zum langwelligen Maximum der monomeren Bande ge­hört. Bei einer K onzentration von 4 • 10~ a-/n. P .I. ist dagegen die polymere Bande fast völlig abge­sunken, wobei sich ihre Lage nicht verändert hat; auffallend ist dabei eine V erbreiterung der Bande, die nur langsam absinkt. Der übrige K urvenverlauf

600 500 X [m .f l] -------»■ m

v [cmr1] --►Abb. 4. 1/^Isocyanindiäthyljodid-f Heparin, Konstant: 10 I.E.

pro ml in 0,16-/n., ^ 0,95%, ^ physiol. NaCl.

hat sich dem einer reinen P.I.-Lösung angenähert und ist lediglich etwas erniedrigt. Bei K onzentratio­nen von 2 und 1 * 10~ 5-m. ist in der Lage der Ab­sorptionskurven kein Unterschied gegenüber denen reiner P .I.-Lösungen feststellbar, d. h. eine 10~5-m.,0,95% NaCl und 10 I.E . H eparin pro ml enthaltende P .I.-Lösung zeigt — mit Ausnahm e einer leichten E rhöhung der A bsolutwerte — dasselbe A bsorp­tionsverhalten wie eine solche ohne NaCl und ohne H eparin.

In Abb. 5 w ird der Einfluß einiger heparin-ähn­licher Substanzen auf das Absorptionsspektrum des P .I. in 1 ,0 ' 10~ 4-m. w äßrigen Lösungen ohne NaCl- Zusatz gezeigt. Zum Vergleich ist das O riginalspek­trum des reinen P .I. und das Spektrum einer Lösung m it 5,0 I.E . H eparin pro ml ( l , 0 ’ 10~4-m. P .I.) aufgeführt. Völlig identisch mit dem H eparin h in ­sichtlich der Beeinflussung des Spektrum s erweist sich ein vollsynthetisches Polyäthylen-sulfosaures Na (PÄ SN a) in K onzentrationen von 4 • 10-4 g pro ml, gewichtsm äßig entsprechend etwa 50 I.E. Heparin.

REVERSIBLE POLYMERISATE DES PSEUDOISOCYANINS 363

Abb. 5. Y'Tsoeyanindiäthyljodid. Konstant: 1,0-10 i -rn. H20 + Sulfosäuren bzw. Hyaluronsäure.

Das verwendete PÄ SN a-Präparat 1144/C * besaß nach D ia l e r und K e r b e r 6 ein Mol.-Gew. von 9000 (U ltrazentrifuge). Auch andere PÄ SN a-Präparate mit Mol.-Gew. zwischen 3000 und 29 500 zeigten qualitativ ähnliches Verhalten. Polyschwefelsäure- ester von X ylanen7 und Polyvinylalkoholen, von denen besonders letztere als M odellsubstanzen für synthetische H eparine von P a t a t 8 genau untersucht wurden, sind von uns bisher noch nicht geprüft worden.

Abweichend davon scheinen sich die mono- bzw. nicht sulfurierten H eparin-A naloga zu verhalten. W ie die Abb. 5 zeigt, bewirken Zusätze von 2 * 10~ 4 g Chondroitinschwefelsäure bzw. H yaluronsäure pro ml zwar ebenfalls die A usbildung der polym eren Bande, bei H yaluronsäure sogar in ähnlicher Höhe wie durch die entsprechende Menge (25 I.E .) H eparin. H ier ist aber keine nennenswerte Beeinflussung des Kurvenverlaufs der beiden m onom eren Banden zu

* Wir sind Herrn Prof. Dr. F. P a t a t für die großzügige Überlassung mehrerer PÄSNa-Präparate außerordentlich dankbar.

beobachten; quantitative Aussagen können bei allen drei P räparaten jedoch nicht gemacht werden, da die Einheitlichkeit dieser Substanzen als chemische In ­dividuen nicht genügend gesichert erscheint. Inwie­weit die Verschiebung des M aximums der polymeren Bande bei den einzelnen Substanzen bedeutungsvoll ist, m uß erst durch weitere Untersuchungen geklärt werden.

3. R e v e r s i b i l i t ä t d e r A s s o z i a t i o nDie Ergebnisse der Versuche mit NaCl lassen

darauf schließen, daß dieses unter gewissen Bedin­gungen die W irkung des H eparins aufzuheben ver­mag. So ist das Spektrum einer rein wäßrigen1,0 * 10“ 5-m. P .I.-Lösung in seiner Lage identisch dem einer Lösung m it 10 I.E. H eparin pro ml und NaCl (0,16-m .), obwohl ohne NaCl die Bildung der polym eren Bande und Verschiebung der monomeren Banden schon bei wesentlich geringeren K onzentra­tionen an Heparin erreicht wird. W ir nehm en an, daß bei genügend großem Überschuß von NaCl die Na®-Ionen m it den Farbstoffkationen in K onkurrenz um die Haftstellen am Heparin-M ol. treten, wodurch die A nlagerung der P .I.-Moll, verhindert w ird und die optischen V eränderungen ausbleiben. Zu einer vollen Reversibilität gehört auch eine sekundär ein­tretende V erdrängung einmal gebundener P.I.®- Ionen durch Na®-Ionen. Bei qualitativen Versuchen stellten wir nun fest, daß bei Zugabe von NaCl zu einer heparinhaltigen P .I.-Lösung bei verschie­dener K onzentration an H eparin und P .I. der As­soziierungseffekt völlig aufgehoben wird. Eine sol­che Lösung zeigt das gleiche Spektrum wie eine reine P .I.-Lösung. Dieselbe W irkung wie NaCl hat auch ein Protam in, ein niederm olekularer E iw eißkörper m it stark basischem C harakter, der durch das A uf­treten vieler Arginin- und Lysinreste verursacht wird. Die Protam ine vermögen also ebenfalls die W irkung des H eparins auf das Spektrum des P .I. aufzuheben. Dies entspricht einerseits unseren E r­gebnissen bei der Einwirkung von H eparin und Protam inen auf A crid inorange3, andererseits auch der pharm akologisch bekannten und benützten „Anti- do t“ -W irkung von Protam inen gegenüber H eparin in vitro und in vivo. Es bilden sich hier echte, z. T. schwerlösliche Salze (Salzbildung zwischen den £ — N H 2-Gruppen des Lysins bzw. G uanidogruppen

6 K . D ia l e r u . H. K e r b e r , Makromolek. Chem. 1 7 , 5 6 [ 1 9 5 5 ] .7 E. H u s e m a n n u . B. P f a n n e m ü l l e r , Z. Naturforschg. 1 0 b.

1 4 3 [ 1 9 5 5 ] ,8 F. P a t a t u . K . V o g l e r , Helv. chim. Acta 35, 1 2 8 [ 1 9 5 3 ] .

364 REVERSIBLE POLYMERISATE DES PSEUDOISOCYANINS

des A rginins und der SOsH-Gruppe des H eparins), „P ro tam inheparinate“ . H istam in dagegen vermag als schwächer basische Substanz (to — NH.,-Gruppen und Imidazol — NH-Gruppe) den Heparineffekt bei P .I. nicht aufzuheben; auch die Gegenwart von Histam in vor Zugabe des H eparins zur P.I.-Lösung beeinflußt die W irkung des H eparins nicht. Inwie­weit andere Salze, wie (NH4) 2S 0 4 oder MgCl2 im Sinn einer K onkurrenz wirken, wurde nicht unter­sucht. Diese Befunde sprechen für eine salzartige, polare Bindung zwischen H eparin und dem Pseudo- isocyanin.

Abschließend sei noch erwähnt, daß bei E inw ir­kung von H eparin auf eine verdünnte Lösung des PI-Jodids und selbst -Chlorids der Farbstoff einen schwerlöslichen Symplex bildet, der nach längerer Zeit ausfällt. Durch Alkoholzusatz wird die Ausbil­dung der polym eren Bande sofort unterdrückt, wenn­gleich etwas höhere A lkoholkonzentrationen notwen­dig zu sein scheinen, als bei der A ufhebung der rei­nen Konzentrationseffekte durch Alkohol bei 1 0 !- und 10~2-m. Lösungen des Pseudoisocyanins.

III. Auswertung der Ergebnisse

Aus den spektroskopischen Daten, d. h. den Ban­denveränderungen und der Ausbildung der poly­meren Bande bis zur Erreichung eines Endwertes kann versucht werden, quantitative Beziehungen zwischen H eparin und Pseudoisocyanin zu finden. Am geeignetsten erscheint h ierfür die 10 ” 4-m. P.I.- Lösung ohne NaCl-Zusatz, da hier der Endwert gut abgeschätzt werden kann.

Auf G rund der Kurven in Abb. 1 und 2 kann man annehm en, daß bei einer 10_4-m. Lösung der spektroskopische Endwert bei einer H eparinkonzen­tration von etwa 2 — 5 I.E. pro ml erreicht ist.

Das Mol.-Gew. des H eparins beträgt 12 0 0 0 9; dabei entsprechen 1,0 I.E. etwa 7,8 • 10~6 g Sub­stanz. Die L o s c h m i d t sehe Zahl wird mit rund6.0 • 1023 eingesetzt.

1 Mol H eparin* ( = 12 000 g) enthält also 6 ,0 'I O 23 Molekeln.1 I.E. 7 ,8 - 10“ 6 g) enthält 3,9 • 1014 Mo­lekeln. 2 — 5 I.E. enthalten somit rund 8 bis 20 • 1014 Molekeln.

9 A. W in t e r s t e in , Sympos. sur les macromolecules, Cente-naire de l’institut national Genevois Vol. hors serie 1954,S. 93.

* Nach älteren Angaben 16 000 (R. J e n s e n , O. S n el l m a n n u .B. S y l v e n , J . biol. Chemistry 174. 265 [1948]).

Da eine 10~ 4-/n. P .I.-Lösung 10~ 4 * 6,0 • 1023 Moll, im L iter enthält, sind pro ml dieser Lösung 10-3 . 10-4 . 6?o . 1023 Moll enthalten.

1,0 ml einer 10_4-m. P.I.-Lösung m it einem Zu­satz von 2 — 5 I.E . H eparin pro ml enthält also:

8 — 20 • 1014 Moll. H eparin und6,0 • 1016 Moll. Pseudoisocyanin.

D araus ergib t sich, daß auf je ein Mol. Heparin jeweils 30 — 75 Moll. P .I. treffen. Aus der Summen­formel des H eparins und dessen Mol.-Gew. läßt sich errechnen, daß das H eparin rund 50 SOsH-Gruppen im Mol. enthält.

Es treßen also auf 1 M ol. H eparin m it rund 5 0 S O .-G r u p p e n etw a 3 0 — 75 (M itte l 5 2 ) Moll. P seudoisocyan in .

W ir fanden diese quantitativen Beziehungen be­reits bei unseren. Arbeiten mit A cridinorange. Dort trafen auf 1 Mol. H eparin m it rund 50 S 0 3H-Grup- pen etwa 43 Moll. A cridinorange. D ort wird auch über eine A rbeit von W e r l e und A m a n n 10 berichtet, bei denen ein B indungsverhältnis von Heparin und H istam in gefunden wurde, derart, daß auf ein Mol. H eparin m it rund 50 S 0 3H-Gruppen etwa 22 Moll, der (zweisäurigen) Base H istam in trafen.

Die D eutung, daß an den Stellen der H eparinm ol., an denen die S 0 3H- bzw. S 0 3Na-Gruppen, also elek- tronegative und hydrophile Substituentengruppen sitzen, die ebenfalls hydrophilen, aber elektroposi- tiven Farbstoffionen angelagert bzw. gebunden wer­den, scheint dam it wahrscheinlich zu werden. Diese Ansam m lung der Farbstoffkationen an den negati­ven Stellen der H eparinm ol. und gleichzeitig damit die A usbildung der polym eren Bande erfolgt so­lange, bis alle diese Stellen besetzt sind. Die poly­mere Bande erreicht dann ihr M aximum, gleichzeitig verschwinden die beiden monomeren Banden, mit Ausnahm e bei der H yaluronsäure.

Über Versuche, die stöchiometrischen Verhältnisse noch genauer zu erfassen, wird in Bälde berichtet werden. Ebenso über Schlüsse, die die beschriebenen Versuche über die sterische K onfiguration der As- soziate der Farbstoffe e r la u b e n 11.

Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t danken wir sehr für die Unterstützung unserer Arbei­ten.

10 E. W e r l e u . R. A m a n n , Klin. Wschr. 34, 624 [1956].11 Uber analoges Verhalten des Pseudoisocyanins bei der Ad­

sorption an Glimmer vgl. G. S c h e ib e u . Mitarb., Natur­wissenschaften 25, 474 [1937] ; T. S k e r l a k , Kolloid-Z. 95. 265 [1941]; W. H o p p e , Kolloid-Z. 109. 21 [1944].