105

ภาคผนวก ก

การเตรยมสารเคม

1. การเตรยมสารละลายบฟเฟอร (Stool and Blanchard, 1990)1.1 สารละลายซเตรต บฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร (0.1 M citrate buffer)

สารละลาย A : สารละลายกรดซตรก 0.1 โมลาร (กรดซตรก 21.01 กรม ละลายใน นากลน 1 ลตร)

สารละลาย B : สารละลายโซเดยมซเตรต 0.1 โมลาร (โซเดยมซเตรต 29.41 กรมละลายในนากลน 1 ลตร)

ผสมสารละลาย A และ B ตามพเอชทตองการ ดงตาราง

pH 0.1 M citric acid (ml) 0.1 M tri-sodium citrate(ml)3.03.23.43.63.84.04.24.44.64.85.05.25.45.65.86.06.2

82.077.573.068.563.559.054.049.544.540.035.030.525.521.016.011.58.0

18.022.527.031.536.541.046.050.555.560.065.069.574.579.084.088.592.0

106

1.2 สารละลายอะซเตต บฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร ( 0.1 M acetat buffer)สารละลาย A : สารละลายกรดอะซตก 0.2 โมลาร (กรดอะซตก 11.55 มล.ในนากลน

1 ลตร)สารละลาย B : สารละลายโซเดยมอะซเตต 0.2 โมลาร (โซเดยมอะซเตต 27.22 กรม

ละลายในนากลน 1 ลตรผสมสารละลาย A และ B ตามพเอชทตองการ ดงตาราง ปรบปรมาตรเปน 100 มล.ดวยนากลน

pH 0.2 M acetic acid (ml) 0.2 M sodium acetate (ml)3.63.84.04.24.44.64.85.05.25.45.6

46.344.041.036.830.525.520.014.810.58.84.8

3.76.09.0

13.219.524.530.035.239.541.245.2

107

1.3 สารละลายทรส-มาลเอท บฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร (0.1 M tris-maleate buffer)สารละลาย A : สารละลายกรดทรส-มาลเอท 0.2 โมลาร (tris acid maleate) (tris

(hydroxymethyl) aminomethane 24.2 กรม + กรดมาลอก(maleic acid) 23.2 กรม หรอ maleic anhydride 19.6 กรม ละลายในนากลน 1 ลตร)

สารละลาย B : สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด 0.2 โมลาร (0.2 M NaOH)ผสมสารละลาย A ปรมาตร 50 มล. และสารละลาย B ตามพเอชทตองการ ปรบปรมาตรเปน 200 มล. ดวยนากลน

pH 0.1 M tris-maleate (ml)5.25.45.65.86.06.26.46.66.87.07.27.47.67.88.08.28.48.6

7.010.815.520.526.031.537.042.545.048.051.054.058.063.569.075.081.086.5

108

1.4 สารละลาย McIIvaine บฟเฟอร หรอ ซเตรต-ฟอสเฟต บฟเฟอร เขมขน0.1 โมลาร ( 0.1 M citrate phosphate buffer)สารละลาย A : สารละลายกรดซตรก 0.1 โมลาร (กรดซตรก 19.21 กรม ละลายใน

นากลน 1 ลตร)สารละลาย B : สารละลายไดโซเดยมฟอสเฟต 0.2 โมลาร (Na2HPO4, 7H2O 53.65

กรม หรอ Na2HPO4, 12H2O 71.7 กรม ละลายในนากลน ปรบปรมาตรเปน 1 ลตร)

ผสมสารละลาย Aและ B ตามพเอชทตองการ ดงตารางปรบปรมาตรเปน 100 มล. ดวยนากลน

pH 0.1 M citric acid (ml) 0.2 M sodium phosphate (ml)2.63.03.43.84.24.65.05.45.86.26.67.0

44.639.835.932.329.426.724.3222.219.716.913.66.5

5.410.214.117.720.623.325.727.830.333.136.443.6

109

1.5 สารละลายฟอสเฟต บฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร (0.1 M phosphate buffer)สารละลาย A : สารละลายโมโน โซเดยมฟอสเฟต 0.2 โมลาร (monobasic sodium

phosphate) ละลายโมโนโซเดยมฟอสเฟต 27.8 กรม ในนากลน 1 ลตรสารละลาย B : สารละลายไดโซเดยมฟอสเฟต 0.2 โมลาร (ละลาย Na2HPO4, 7H2O

53.65 กรม หรอ Na2HPO4, 12H2O 71.7 กรม ในนากลน เปน 1 ลตร)ผสมสารละลาย Aและ B ตามพเอชทตองการ ดงตารางปรบปรมาตรเปน 200 มล. ดวยนากลน

pH 0.2 M monosodium phosphate (ml) 0.2 M di-sodium phosphate(ml)

5.75.96.06.16.26.36.46.56.66.76.86.97.07.17.27.37.47.57.67.77.88.0

93.590.087.785.081.577.573.568.562.556.551.045.039.033.028.023.019.016.013.010.58.55.3

6.510.012.315.018.522.526.531.537.543.549.055.061.067.072.077.081.084.087.090.591.594.7

110

2. เกลอแอมโมเนยมซลเฟต

ตารางภาคผนวก 1 การเปลยนความเขมขนของเกลอแอมโมเนยมซลเฟตAmmonium sulfate concentration conversion table

111

ภาคผนวก ข

อาหารเลยงเชอ

1. การเตรยมอาหารเลยงเชอ (วรรณา ชฤทธ, สกญญา จนทะชม, นยทศน ภศรนยและ อรญ หนพงศกตตกล. 2539)

1.1 อาหาร De man Rogusa Sharpe (MRS)Proteose peptone No. 3 10.0 กรมBeef extract 10.0 กรมYeast extract 5.0 กรมDextrose 20.0 กรมTween 80 1.0 กรมAmmonium citrate 2.0 กรมSodium acetate 5.0 กรมMagnesium sulfate (MgSO4.7H2O) 0.1 กรมManganese sulfate (MnSO44H2O) 0.05 กรมDipotassium phosphate (K2HPO4) 2.0 กรมAgar 15.0 กรมDistilled water 1000.0 มล.วธเตรยมละลายสวนผสมโดยใชความรอน (ยกเวน agar) ปรบพเอชใหได 6.5 ดวย

โซเดยมคลอไรด 6 นอรมอล และ กรดไฮโดรคลอรก 6 นอรมอล จงใสวนลงไป หลอมใหละลายดวยความรอน นาไปฆาเชอดวยหมอนงความดน 15 ปอนด/ตารางนว 15 นาท

112

1.2 อาหาร Lauryl Sulfate Tryptone (LST) Broth (single strength medium)Tryptone 20.0 กรมLactose 5.0 กรมDipotassium phosphate (K2HPO4) 2.75 กรมPotassium di-hydrogent phosphate (KH2PO4) 2.75 กรมSodium chloride 5.0 กรม

Sodium lauryl sulphate 0.1 กรมDistilled water 1000.0 มล.

วธเตรยมละลายสวนผสมใหเขากนโดยใชความรอน ปรบพเอชใหได 6.8 ฆาเชอดวย

ความดนไอนา 15 ปอนด/ตารางนว 15 นาท

1.3 อาหาร EC (EC) brothPancreatic digest of casein 20.0 กรมBile salt mixture or Bile salts No.3 1.5 กรมLactose 5.0 กรมDipototassium phosphate 4.0 กรมPotassium phosphate 1.5 กรมSodium chloride 5.0 กรมDistilled water 1000.0 มล.

วธเตรยมละลายสวนผสมในนากลนปรบพเอชเปน 6.9+0.2 ถายอาหารใสหลอด

ปรมาตร 8 มล.ตอหลอด ภายในหลอดบรรจอาหารใส durham tube ดวย นาอาหารนงฆาเชอดวยความดนไอ 15 ปอนด/ตารางนว ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส นาน 15 นาท

113

1.4 อาหาร Plate Count Agar (PCA)Tryptone 5.0 กรมYeast extract 2.5 กรมGlucose 1.0 กรมAgar 15 กรมpH 7.1+0.1

วธเตรยมละลายสวนผสมในนากลน 1ลตร คนใหเขากน ตมจนสารละลายเดอด นง

ฆาเชอดวยความดนไอนา 15 ปอนด/ตารางนวเปนเวลา 15 นาท

1.5 อาหาร Potato Dextrose Agar (PDA)Potato 200 กรมDextrose 20.0 กรมAgar 15 กรม

วธเตรยม- มนฝรงปอกเปลอกออกใหหมด ชงนาหนกประมาณ 200 กรม ลางนาให

สะอาด- หนมนฝรงใหเปนชนสเหลยมจตรสขนาด 6 มล. พยายามหนใหไดขนาด

เทา ๆ กน- ตมมนฝรงในนากลนปรมาตร 400 มล. เมอนาเดอดใหหรไฟและตมตอไปจน

มนฝรงสก กรองเอาสวนนามนฝรงและเตมนากลนประมาณ 500 มล. เตมวนและนาตาลเดกโตส ละลายสวนผสมทงหมดดวยการตมใหเดอด ปรบปรมาตรอาหาร PDA ใหได 1 ลตรดวยนากลน นงฆาเชอดวยความดนไอนา 15 ปอนด/ตารางนวเปนเวลา 15 นาท

114

1.6 อาหาร Baird Parker Agar (BPA)Tryptone 10.0 กรมMeat extract 5.0 กรมYeast extract 1.0 กรมLithium chloride 5.0 กรมAgar 20.0 กรมDistilled water 1000.0 มล.

วธเตรยมละลายสวนผสมในนากลน 1 ลตร คนใหเขากนตมจนสารละลายเดอด

ปรบพเอชใหได 6.8 แบงใสขวด ๆ ละ 90 มล. นงฆาเชอดวยความดนไอนา 15 ปอนด/ตารางนวเปนเวลา 15 นาท แลวทงใหเยนลงประมาณ 50 องศาเซลเซยส เตม สารละลายตอไปน ซงสารเหลานฆาเชอโดยการกรองผานเครองกรองบกเตร

Glycine 20 % 6.3 มล.Potassium tellurite 1% 1.0 มล.Sodium pyruvate 20% 5.0 มล.Egg Yolk emulsion * 5.0 มล.

*เมอผสมแลวตองใชทนทวธเตรยม Egg Yolk emulsionลางไขใหสะอาด แชใน เมอควรก คลอไรด (mercuric chloride) รอยละ

0.1 เจาะไขดานปานเพอเอาไขขาวออกใหหมด เทไขแดงใส กระบอกตวงทนงฆาเชอแลว เตมโซเดยมคลอไรดรอยละ 0.85 ทนงฆาเชอแลวลงไปใหเทากบปรมาตรของไขแดง ใชปเปตคนใหเปนเนอเดยวกน

115

ภาคผนวก ค

การวเคราะห

1. การวเคราะหปรมาณโปรตน

1.1 การวเคราะหปรมาณโปรตน โดยวธ Lowry (Lowry, 1951)สารเคม

1. สารละลาย A: คอปเปอรซลเฟต (CuSo4 5H2O) รอยละ 12.สารละลาย B:โซเดยมโปแตสเซยมทารเทรต(sodium potassium

tartrate) รอยละ 13. สารละลาย C:โซเดยมคารบอเนต (Na2co3) รอยละ 2 ใน สารละลาย

โซเดยมไฮดรอกไซด 0.1 โมลาร4. สารละลาย D: นาสารละลาย Folin ciocalteu reagent มาทาใหเจอจาง

ดวยนากลน (1:1) กอนใชวธการ

1. เตรยมสารละลาย E โดยผสมสารละลาย A: สารละลาย B: สารละลาย Cในอตราสวน 1:1:98 (ปรมาตร : ปรมาตร : ปรมาตร) เตรยมใหมทกครงกอนใช

2.ใชสารตวอยางทตองการหาปรมาณโปรตน (โดยมคาโปรตนไมเกน 0.5 มก.) ปรมาตร 200 ไมโครลตร ใสในหลอดทดลอง

3. ปเปตสารละลาย E จานวน 2.5 มล. ผสมใหเขากนตงทอณหภมหอง 10 นาท

4. ปเปตสารละลาย C จานวน 0.25 มล. ลงในสารละลายผสมขอ 3 ผสมใหเขากนตงทอณหภมหองเปนเวลา 30 นาท

5. นาสารละลายไปวดคาดดกลนแสงท 750 นาโนเมตรโดยใช sample buffer เปน blank ทาตามขอ 1-4 และนาคาการดดกลนแสงทไดมาเปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐาน โดยใชโบวนซรมอลบมน เปนโปรตนมาตรฐาน

116

การเตรยมกราฟมาตรฐานโปรตน BSA1. ละลายโบวนซรมอลบมน 0.1 กรม ในนากลน 100 มล.จะได stock

solution มความเขมขน 1000 ไมโครกรม/มล.2. เจอจางสารละลายโบวนซรมอลบมน ใหไดความเขมขน 0 50 100 150

200 250 300 350 และ 400 ไมโครกรม/มล. มาปรบปรมาตรของแตละหลอดใหได 10 มล. ดวย sample buffer

3. วเคราะหปรมาณโปรตนของแตละความเขมขนตามวธ ขอ 3-54. นาขอมลทไดมาเขยนกราฟมาตรฐานระหวางคาการดดกลนแสงท

ความยาวคลน 750 นาโนเมตร กบความเขมขนของโบวนซรมอลบมน กราฟมาตรฐานโปรตนโบวนซรมอลบมนทความยาวคลน 750 นาโนเมตร

00.20.40.60.8

1

0 200 400 600 800 1000 BSA (ug/ml)

OD 75

0 nm

R 2= 0.9979Y = 0.001X

ภาพภาคผนวก 1 กราฟมาตรฐานโบวนซรมอลบมน ทความยาวคลน 750 นาโนเมตร

Standard curve of bovine serum albumin (BSA) at OD 750nm

117

1.2 การวเคราะหปรมาณโปรตน โดยวธ Bradfort (Bradfort, 1976)สารเคม

Dye reagent: ละลาย coomassie Brilliant Blue G 250 จานวน 0.1 กรมในเอทานอล รอยละ 95 ปรมาตร 50 มล. และกรดฟอสฟอรก รอยละ85 ปรมาตร 100มล. ปรบปรมาตรเปน 1 ลตรดวยนากลน

วธการ1. ปเปตสารละลายตวอยาง 40 ไมโครลตร ลงในหลอดทดลอง เตมสาร

ละลาย Dye reagent ปรมาตร 2 มล. ผสมใหเขากน ตงทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 5 นาท

2. นาสารละลายวดคาดดกลนแสงทความยาวคลน 590 นาโนเมตร3. นาสารละลายไปวดคาดดกลนแสงท 590 นาโนเมตร โดยใช Sample

buffer เปน blank ทาตามขอ 1 และนาคาการดดกลนแสงทไดมาเปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐาน โดยใชโบวนซรมอลบมน เปนโปรตนมาตรฐาน

00.20.40.60.8

1

0 200 400 600 800 1000 BSA (ug/ml)

OD 59

0 nm

R 2= 0.9847Y = 0.009X

ภาพภาคผนวก 2 กราฟมาตรฐานโบวนซรมอลบมน ทความยาวคลน 590 นาโนเมตรStandard curve of bovine serum albumin (BSA) at OD 590nm

118

2. การทดสอบกจกรรมยอยสลายโปรตน (proteolytic activity) ในเอนไซมและสารสกดเอนไซมจากพช Anson (Narahara et al.,1982 อางโดย Chen et al.,1998)

สารเคม1. สารละลายโซเดยมเคซนเนท (Na-caseinate) เตรยมไดจากละลาย

โซเดยมเคซนเนท 1 กรม ในนากลน 100 มล. กวนเบา ๆ ใหโซเดยมเคซเนทละลาย จะไดสารละลายสขาวขน

2. ละลายกรดไตรคลอโรอะซตกเขมขน (trichloroacetic acid,MW.163.39) 0.4 โมลาร เตรยมไดจากละลายกรดไตรคลอโรอะซตก 65.36 กรม ในนากลน 1 ลตร

3. สารละลายโซเดยมคารบอเนตเขมขน 0.5 โมลาร (Na2CO3 MW. 105.99)เตรยมไดจากละลายโซเดยมคารบอเนต 52.99 กรม ในนากลน 1 ลตร

4. สารละลาย McIIvaine บฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร พเอช 6.5 (ภาคผนวก ก)

5. สารละลาย Folin ciocalteu reagent ทาใหเจอจางดวยนากลน (1:1)กอนใช

วธการ1. ปเปตสารสกดเอนไซม 0.5 มล. ลงในสารละลายผสม (สารละลาย

เคซนรอยละ 1 ปรมาตร 1.5 มล.และ McIIvaine บฟเฟอรเขมขน 0.1 โมลาร พเอช 6.5ปรมาตร 1 มล.) ผสมใหเขากน บมทอณหภม 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง

2. ปเปตสารละลายกรดไตรคลอโรอะซตก เขมขน 0.4 โมลาร ปรมาตร 3มล. ลงในสารละลายผสมจากนนนาไปเหวยงแยกดวยความเรวรอบ 8,000 รอบ/วนาท5 นาท

3. ปเปตสวนใสทไดปรมาตร 1 มล. ผสมกบสารละลาย Folin reagent ปรมาตร 1 มล. และสารละลายโซเดยมคารบอเนตเขมขน 0.5 โมลาร ปรมาตร 5 มล.บมทอณหภม 30 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท วดคาดดกลนแสงท 660 นาโนเมตร

119

หนงหนวยของกจกรรมยอยสลายโปรตน (ยนต) คอปรมาตรเอนไซมททาใหเกดส เทากบ ไทโรซน 1 ไมโครกรม/ชวโมง ภายใตสภาวะทกาหนด

การเตรยมกราฟมาตรฐานไทโรซน1. ละลายไทโรซน 0.1 กรม ในนากลน 100 มล.จะได stock solution ม

ความเขมขน 1000 ไมโครกรม/มล.2. เจอจางสารละลายไทโรซน (stock solution) ใหไดความเขมขน 0 20 40

60 80 100 และ 120 ไมโครกรม/มล. มาปรบปรมาตรของแตละหลอดใหได 1000ไมโครลตร ดวย sample buffer

3. วเคราะหปรมาณไทโรซนของแตละความเขมขนดงวธการในขอ 34. นาขอมลทไดมาเขยนกราฟมาตรฐานระหวางคาการดดกลนแสงท

ความยาวคลน 660 นาโนเมตร กบความเขมขนของไทโรซน

0

0.05

0.1

0.15

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14Tyrosine (mg/ml)

OD 66

0 nm

R 2= 0.9917Y = 1.0253X

ภาพภาคผนวก 3 กราฟมาตรฐานไทโรซน ทความยาวคลน 660 นาโนเมตรStandard curve of tyrosine at OD 660 nm

120

3. การตรวจวเคราะหคณสมบตของผลตภณฑคอทเทจชส สเปรด

3.1 การตรวจวเคราะหคณสมบตทางเคมของผลตภณฑคอทเทจชส สเปรด3.1.1 การวเคราะหความชน ดวยวธ Gravimetric (AOAC, 1999)วธการ1. อบภาชนะสาหรบหาความชนในตอบทอณหภม 105 องศาเซลเซยส นาน 3

ชวโมง แลวนาออกจากตอบใสไวในโถดดความชน ปลอยทงไวจนกระทงอณหภมของภาชนะลดลงเทากบอณหภมหองแลวชงนาหนก

2. กระทาซาเชนขอ 1 จนไดผลแตกตางของนาหนกทชงทงสองครงตดตอกนไมเกน 1-3 มก.

3. สาหรบตวอยางนานม ปเปตตวอยางนานมทผสมเขากนด 3 มล. ปดฝาและชงนาหนก นาภาชนะหาความชนทไมมฝาวางในอางควบคมอณหภม (100 องศาเซลเซยส) นาน 30 นาท นาไปอบในตอบ (105 องศาเซลเซยส) นาน 2 ชวโมง นาออกจากตอบใสไวในโถดดความชน แลวชงนาหนกถวยหาความชน นาถวยหาความชนกลบไปอบตออก 1 ชวโมง และนาไปทาใหภาชนะหาความชนเยนในโถดดความชน กระทาซาเชนเดมจนไดผลตางของนาหนกทชงทงสองครงไมเกน 1-3 มก.

4. สาหรบตวอยางตะกอนโปรตนและเนยแขง สมตวอยางทบดละเอยดแลว ชงนาหนกใหไดนาหนกทแนนอน 1-3 มก. ลงในภาชนะหาความชน นาไปอบในตอบไฟฟาอณหภม (105 องศาเซลเซยส) นาน 5-6 ชวโมง นาออกจากตอบใสไวในโถดดความชน และชงนาหนกภาชนะพรอมตวอยาง จากนนนากลบไปเขาตอบอก และกระทาซาเชนเดมจนไดผลตางของนาหนกทชงทงสองครงไมเกน 1-3 มก.

การคานวณปรมาณความชน (รอยละ)=ผลตางของนาหนกตวอยางกอนอบและหลงอบ X100

นาหนกตวอยางกอนอบ

121

3.1.2 การวเคราะหปรมาณโปรตน ดวยวธ Kjeldahl (AOAC, 1999)สารเคม

1. กรดซลฟรกเขมขน2. สารเรงปฏกรยา ใชคอปเปอรซลเฟต (Cu2SO4) 1 สวนตอโปแตสเซยม

ซลเฟต (K2SO4) 9 สวน3. สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด (NaOH) เขมขนรอยละ 40 ชงสาร

โซเดยมไฮดรอกไซด 40 กรม ละลายในนากลนปรบปรมาตรเปน 100 มล.4. สารละลายกรดบอรก (H3BO3) เขมขนรอยละ 4 ละลายกรดบอรก 40

กรม ดวยนากลน ปรบปรมาตรใหได 1,000 มล.5. สารละลายกรดเกลอ เขมขน 0.02 นอรมอล6. อนดเคเตอร Fashiro indicator เตรยมเปน stock solution (ชงเมทธลน

บล (methylene blue) 0.2 กรม ละลายในเอทธานอล 200 มล. และชงเมทธลเรด (methyl red) 0.05 กรม ละลายในเอทธานอล 50 มล.) เวลาใชนามาผสมในอตราสวน stock solution 1 สวน ตอ เอทธานอล 1 สวนตอนากลน 2 สวน

วธการ1. ชงตวอยางนาหนกประมาณ 1 กรม (ทศนยม 4 ตาแหนง) ใหทราบ

นาหนกทแนนอน 1-2 กรม บนกระดาษกรอง ปราศจากไนโตรเจน (whatman เบอร 1) หอใหมดชดใสลงในขวดยอยโปรตน

2. เตมสารเรงปฏกรยา 5 กรม และกรดซลฟรกเขมขน 20 มล.3. นาไปยอยโดยชดยอยโปรตนทอณหภม 300 องศาเซลเซยส เปนเวลา

30 นาท และยอยท 400 องศาเซลเซยส จนไดสารละลายใส4. เตมนากลนรอนลงไปลางบรเวณคอขวดใหทวและใหความรอนตอไปจน

เกดควนของกรดซลฟรก แลวตงทงไวใหเยน5. จดอปกรณกลน ตอหลอดยอยในสวนของเครองกลนโปรตน และวาง

ขวดรปชมพ ทตาแหนงรบสารละลายของเครองกลน โดยใหปลายจมในสารละลายกรดบอรก โดยเตมอนดเคเตอร 2-3 หยด ทาการกลนโปรตนตามโปรแกรมทตงไว โดยใชสารละลายบอรก 5 มล. สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด 50 มล.กลนเปนเวลา 4 นาท

122

6. ไตเตรทของเหลวทกลนไดดวยสารละลายไฮโดรคลอรกมาตรฐาน จนกระทงสารละลายเปลยนจากสเขยวอมฟาเปนสชมพทจดยต

7. ทาแบลงกและตวอยางควบคมภายในเชนเดยวกบตวอยางปฏบตตามขอ1-8

8. บนทกขอมลและการคานวณผลในแบบบนทกการทดสอบหาปรมาณโปรตน / ไนโตรเจน ทงหมด

การคานวณปรมาณโปรตน (รอยละ) = (a-b) X N X1.4007 X6.25

Wโดยท a = ปรมาตรของสารละลายกรดเกลอทใชเปน มล.

B = ปรมาตรของสารละลายกรดเกลอทใชกบ blank เปน มล.N = ความเขมขนของสารละลายกรดเกลอเปนนอรมอลW = นาหนกตวอยางเปนกรม

1.4007 = นาหนกสมมลยของไนโตรเจน 6.25 = ตวเลขทเหมาะสม

3.1.3 การวเคราะหปรมาณไขมน โดยวธ Werner schmid (Egan et al.,1981)

สารเคม1. แอมโมเนย 0.882. สารละลายกรดไฮโดรคลอรก ( กรดไฮโดรคลอรกเขมขนตอนา 7:3)3. เอทานอลรอยละ 954. อเทอร5. ปโตรเลยมอเทอร

วธการ1. อบขวดกลมสาหรบหาไขมน ซงมขนาดความจ 250 มล.ในตอบไฟฟาทง

ใหเยนในโถดดความชน และชงนาหนกทแนนอน

123

2. ชงตวอยาง1-2 กรม (บนทกนาหนกทแนนอนตวอยางควรมไขมนประมาณ0.3-0.7 กรม) ลงในบกเกอรขนาด 100 มล.

3. หยดแอมโมเนย 1-2 หยด ใชแทงแกวบดตวอยางใหละเอยด เตมกรดไฮโดรคลอรก ปรมาตร 10 มล.

4. ปดดวยกระจกนาฬกา ใหความรอนและกวนสารละลายเปนครงคราว จนตวอยางละลายหมด คอยๆ ทาใหเยน

5. เตมเอทานอลรอยละ 95 ปรมาตร 10 มล. ผสมใหเขากน ตงใหเยน เทสารละลายตวอยางลงในกรวยแยก กลวตวอยางดวยอเทอร ปรมาตร 25 มล. เขยากรวยแยก แรงๆ เปนเวลา 1 นาท

6. เตมปโตรเลยมอเทอร ปรมาตร 25 มล. เขยาใหเขากนทงใหแยกชน ไขมนสารละลายสวนลางเกบไวในขวดกลมททราบนาหนกทแนนอน และนาสวนบนมาทาการสกดซาดวยอเทอรและปโตรเลยมอเทอร ตามขอ 6-7 อยางนอย 3 ครง

7. นาสารละลายตวอยางทรวมอยกบชนปโตรเลยมอเทอรในขวดกลมไปทาการระเหยปโตรเลยมอเทอร

8. นาขวดกนกลมไปอบทอณหภม 80-90 องศาเซลเซยส จนแหง ทงใหเยนในโถดดความชน

9. ชงนาหนก แลวอบซาครงละ 30 นาท จนกระทงผลตางของนาหนก 2 ครงตดตอกนไมเกน 1-3 มก.

การคานวณปรมาณไขมน (รอยละ) = นาหนกไขมนหลงอบ X 100

นาหนกตวอยางเรมตน

3.1.4 การวดคาพเอช (AOAC, 1999)วธการ

1. ชงตวอยาง 10 กรม ในบกเกอรขนาด 150 มล.แลวเตมนากลน 100 มล. โฮโมจไนสเปนเวลา 2 นาท

2. วดคาความเปนกรด-ดางดวยเครองวดพเอช

124

3.1.5 การวเคราะหปรมาณกรดแลกตก ดวยวธ Tritration (AOAC, 1999)สารเคม

สารละลายมาตรฐาน โซเดยมไฮดรอกไซด 0.1 โมลารวธการ

1. นาตวอยางทใชวดคาพเอช มากรองทนทผานกระดาษกรอง กลวลางดวยนากลนปรมาตร 20 มล.

2. นาสารทกรองไดไตเตรตกบสารละลายโซเดยมไฮดรอกไซดมาตรฐาน ใชฟนอฟทาลน (phenolphthalein) เปนอนดเคเตอรบนทกปรมาตรโซเดยมไฮดรอกไซดทใช โดยปรมาตรโซเดยมไฮดอรกไซดเขมขน 0.1 นอรมอล ปรมาตร 1 มล. เทากบกรดแลกตก 0.0090 กรม

3.1.6 ตรวจวดปรมาณแคลเซยม ดวยวธ Atomic Absorption Spectrophotometric (AOAC, 1999)

วธการ1. ลาง ถวยกระเบองเคลอบ เครองแกว และกลวดวยนากลนจากนนนาไป

แชในสารละลายกรดไนตรกรอยละ 10 เปนเวลา 1 คน และใชนา de-ionize ในการเตรยมสารละลายกรดไนตรกทใชกบเครอง Atomic Absorption Spectrophotometer

2. อบถวยกระเบองในตอบลมรอน 102 องศาเซลเซยส นาน 1-2 ชวโมง ชงตวอยางใหไดนาหนกทแนนอนประมาณ 1 กรม นาไปเผาบน hot plateในตควนจนหมดควน แลวจงนาเขาเตาเผาอณหภม 600 องศาเซลเซยส 4 ชวโมง นาถวยกระเบองออกมาใสในโถดดความชน นาออกจากตอบใสไวในโถดดความชน และชงนาหนกภาชนะพรอมตวอยาง จากนนนากลบไปเขาเผาอบอก 30 นาท และกระทาซาเชนเดมจนตวอยางในถวยกระเบองเปนเถาสขาว เมอเผาจนไดเถาสขาวแลวจงนาไปเกบในโถดดความชนจนกระทงนาไปวดกบเครอง Atomic Absorption Spectrophotometer

3. ละลายตวอยางดวยกรดไนตรกรอยละ 2 ปรบปรมาตรเปน 250 มล. นาสารละลายตวอยางฉดเขาเครอง Atomic Absorption Spectrophotometer โดยใช

125

แคลเซยมเปนมาตรฐาน ความเขมขน 0-8 ppm คานวณหาปรมาตรแคลเซยมหนวย มก.ตอมล.หรอ มก.ตอ กก.

การคานวณ ปรมาณแคลเซยม (มก./กก.) = คาทวดได X100 Xปรมาตรทปรบตวอยาง

นาหนกตวอยาง

3.2 การตรวจวเคราะหปรมาณจลนทรยของผลตภณฑคอทเทจชส สเปรด

3.2.1 การวเคราะหปรมาณแบคทเรยทงหมด โดยวธ Standard plate count เทคนคการ pour plate (AOAC, 1999)

อาหารเลยงเชอ1. อาหาร Plate Count Agar (PCA)2. เปปโตน (peptone water) รอยละ 0.1 ในหลอดทดลอง 9 มล. ในขวด

ฝาเกลยวปรมาตร 225 มล.วธการทดลอง

1. ชงอาหารหนก 25 กรม ใสลงในถงพลาสตกทนรอน เตมเปปโตนรอยละ0.1 จากขวดฝาเกลยวปรมาตร 225 มล. เขยาใหเขากนจะไดตวอยางทมความเจอจาง 10-1

2. ใชปเปตดดตวอยางเจอจาง 10-1 มา 1 มล. ใสลงในหลอดทมเปปโตนรอยละ 0.1 ปรมาตร 9 มล. เขยาใหเขากนหลายจะไดตวอยางทมกาลงเจอจาง 10-2

3. ทาใหตวอยางเจอจางตอไปเปน 10-3 และ 10-4 ตามลาดบ4. เขยาตวอยางทเจอจาง 10-4 อกหลาย ๆ ครง แลวใชปเปต 1 มล. ดด

ตวอยางลงในจานเพาะเลยง 3 จาน จานละ 1 มล.5. ทาเชนเดยวกบขอ 4 โดยใชปเปตอนเดมแตใชตวอยางทเจอจาง 10-3

6. ใชอาหารเลยงเชอทมวนอยเทลงในจากเพาะเลยง (ขอ 4 และ ขอ 5)ประมาณจานละ 15-20 มล. แกวงจานเพาะเลยงเบาๆ เพอใหตวอยางกบวนเขากนดตงทงไวใหวนแขง กลบจานเพาะเลยงและเกบจานเพาะเลยงไวทอณหภม 37 องศา

126

เซลเซยส 24-48 ชวโมง สาหรบตรวจวดเชอจลนทรยชนด mesophile bacteria และบมทอณหภม 4 –10 องศาเซลเซยส 7-10 วน สาหรบตรวจวดเชอจลนทรยชนดpsycophile bacteria

7. ตรวจนบจานวนโคโลนจากจานเพาะเชอทมจานวนโคโลนอยระหวาง 30-300 โคโลน และรายงานผลเปน จานวน Colony Forming Unit (CFU) ตอกรมตวอยาง

การคานวณ จานวน CFU ตอกรมตวอยางCFU = คาเฉลยของจานวนโคโลน X ระดบความเจอจาง

3.2.2 การวเคราะหปรมาณโคลฟอรมและอ-โคไล (AOAC, 1999)อาหารเลยงเชอPresumptive test

1. อาหาร LST (Lactose broth) พรอมหลอดดกจบแกส 9 มล2. เปปโตนรอยละ 0.1 ปรมาตร 90 มล.

Confirmed testอาหาร EC medium พรอมหลอดจบแกส

Completed test1. อาหาร EMB2. อาหาร Lactose broth พรอมหลอดจบแกส3. อาหาร Nutrient agar slant

วธการPresumptive test

1. ชงตวอยางในถงพลาสตกทนรอน 10 กรม เตมเปปโตนรอยละ 90 มล. ผสมตวอยางใหเขากนจะไดตวอยางทเจอจาง 10-1

2. ทาการเจอจางตวอยางไปจนกระทงไดความเขมขนของตวอยางท 10-2

และ10-3

3. ปเปตตวอยางท 10-3 10-2 และ 10-1 ปรมาตร 1 มล.ลงในหลอดอาหารLST ความเขมขนละ 3 หลอด ตามลาดบ เขยาตวอยางใหเขากบอาหาร บมทอณหภม

127

37 องศาเซลเซยส 24-48 ชวโมง ดแกสทหลอดดกจบแกส ถามแกสถอวาใหผลบวกบนทกผล แลวทา Confirmed test

Confirmed test1. หลงจากดผลใน 24 ชวโมง วามแกสเกดขนกหลอด สวนหลอดทยงไม

เกดแกสใหนากลบไปบมตออก 24 ชวโมง แลวนามาดผลใหม2. นาหลอดทมแกสทกหลอดมาเขยาเบา ๆ แลวถายเชอแตละหลอดลงใน

อาหาร EC medium หลอดตอหลอดแลวบมทอณหภม 44.5+0.2 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง

3. เมอครบ 24 ชวโมง ตรวจดผลหลอดทใหแกสแลวบนทกผลในตารางแลวเปดหาคา Most Probable Number (MPN)

Completed test1.ใช Loop ถายเชอจากหลอดอาหาร EC ทมแกสมา streak บนอาหาร

EMB แลวบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง2.เมอเชอขนบนอาหาร EMB แลวตรวจดวามโคโลนทมลกษณะเหมอน

อโคไลหรอไม (โคโลนอ-โคไล จะเปนมนวาวสเขยว ๆ คลายโลหะตด)3. ถายเชอจากอาหาร EMB ลงใน Lactose broth และ nutrient agar

slant แลวบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง4. วนรงขนดผลในอาหาร Lactose broth วามแกสหรอไม และยอมเชอ

จาก NA slant วาเปนแกรมลบแทงทไมมสปอร ถาจาก Lactose broth ใหแกสและยอมมรปรางเปนแกรมลบแทง แสดงวา completed test ใหผลบวกและบนทกผล

3.2.3 การวเคราะหปรมาณ Staphylococcus aureus โดยวธ Standardplate count เทคนคการ spread plate (AOAC, 1999)

อาหารเลยงเชอ1. อาหาร Baird Parker Agar (BPA)2. เปปโตน (peptone water) รอยละ 0.1 ในหลอดทดลอง 9 มล. ในขวด

ฝาเกลยวปรมาตร 225 มล.

128

วธการ1. ปเปตตวอยางทเจอจาง 10- 2 ปรมาตร 0.1 มล. ลงในจานอาหาร BP

2 จาน2. ทาเชนเดยวกบขอ 1 โดยใชปเปตอนเดมแตใชตวอยางทเจอจาง 10-1 3. จมแทงแกวสาหรบ spread ลงในแอลกอฮอล แลวนาแทงแกวมาผาน

เปลวไฟ ถอใหเยนลงประมาณอณหภมหอง เปดฝาจานใสอาหาร ทาการกระจายตวอยางทเหลอตอไปจนเสรจ

4. ตงทงไวประมาณ 10 นาท กลบจานเพาะเลยงและเกบจานเพาะเลยงไวท 37 องศาเซลเซยส 24 ชวโมง

5. ลกษณะโคโลนของ S aureus บนอาหาร BP โคโลนเรยบ นน สดา และทของโคโลนสขาว ม Clear zone รอบโคโลน

6. เลอกโคโลนทงหมดทคาดวาเปน S aureus มาทดลองโดยเขยเชอลงในอาหาร NB และบมเชอทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง

7. ปเปตเชอจากขอ 6 ใสหลอดทดลองปรมาตร 0.5 มล. เตมพลาสมาของกระตาย (rabbit plasma) 1 มล. เขยาใหสารผสมกน

8. บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส 6 ชวโมง ถาไมเกดการแขงตวของ พลาสมาบมตอจนครบ 24 ชวโมง ถาพลาสมาแขงตวแสดงวาผลเปนบวก

3.2.4 การวเคราะหปรมาณแบคทเรยทผลตกรด (lactic acid Bacteria)(AOAC, 1999)

อาหารเลยงเชอ1. อาหาร De Man Rogusa Sharpe (MRS)2. เปปโตน (peptone water) รอยละ 0.1 ในหลอดทดลอง 9 มล. ในขวด

ฝาเกลยวปรมาตร 225 มล.วธการ

1. ชงอาหารหนก 25 กรมใสลงในถงพลาสตกทนรอนเตมเปปโตนรอยละ 0.1 ปรมาตร 225 มล. เขยาใหเขากนจะไดตวอยางทมความเจอจาง 10-1

129

2. ใชปเปตดดตวอยางเจอจาง 10-1 มา 1 มล. ใสลงในหลอดทมเปปโตนรอยละ0.1 ปรมาตร 9 มล. เขยาใหเขากนจะไดตวอยางทมกาลงเจอจาง 10-2

3. ทาใหตวอยางเจอจางตอไปเปน 10-3 และ 10-4 ตามลาดบ4. เขยาตวอยางทเจอจาง 10-4 อกหลาย ๆ ครง แลวใชปเปต 1 มล. ดด

ตวอยางลงในจานเพาะเลยง 2 จาน จานละ 1 มล.5. ทาเชนเดยวกบขอ 4 โดยใชปเปตอนเดมแตใชตวอยางทเจอจาง 10-3

6. ใชอาหารเลยงเชอทมวนอยเทลงในจานเพาะเลยง (ขอ 4 และ ขอ 5) ประมาณจานละ 15-20 มล. แกวงจานเพาะเลยงเบา ๆ เพอใหตวอยางกบวนเขากนด ตงทงไวใหวนแขง กลบจานเพาะเลยงและเกบจานเพาะเลยงไวทอณหภม 37 องศาเซลเซยส 24 ชวโมง

7. ตรวจนบจานวนโคโลนจากจานเพาะเชอทมจานวนโคโลนอยระหวาง 30-300 โคโลน รายงานผลเปนจานวน CFU ตอกรมตวอยาง

3.2.5 การวเคราะหปรมาณยสตและรา (AOAC, 1999)อาหารเลยงเชอ

1. อาหาร Potato Dextrose Agar (PDA)2. เปปโตน (peptone water) รอยละ 0.1 ในหลอดทดลอง 9 มล. ในขวด

ฝาเกลยวปรมาตร 225 มล.วธการ

1. ชงอาหารหนก 25 กรม ใสลงในถงพลาสตกทนรอนเตมเปปโตนรอยละ 0.1ปรมาตร 225 มล. เขยาใหเขากนจะไดตวอยางทมความเจอจาง 10-1

2. ใชปเปตดดตวอยางเจอจาง 10-1 มา 1 มล. ใสลงในหลอดทมเปปโตนรอยละ0.1 ปรมาตร 9 มล. เขยาใหเขากนจะไดตวอยางทมกาลงเจอจาง 10-2

3. ทาใหตวอยางเจอจางตอไปเปน 10-3 และ 10-4 ตามลาดบ4. เขยาตวอยางทเจอจาง 10-4 อกหลาย ๆ ครง แลวใชปเปต 1 มล. ดด

ตวอยางลงในจานเพาะเลยง 2 จาน จานละ 1 มล.5. ทาเชนเดยวกบขอ 4 โดยใชปเปตอนเดมแตใชตวอยางทเจอจาง 10-3

130

6. ใชอาหารเลยงเชอทมวนอยเทลงในจานเพาะเลยง (ขอ 4 และ ขอ 5) ประมาณจานละ 15-20 มล. แกวงจานเพาะเลยงเบาๆ เพอใหตวอยางกบวนเขากนด ตงทงไวใหวนแขง กลบจานเพาะเลยงและเกบจานเพาะเลยงไวทอณหภม 37 องศาเซลเซยส 24 ชวโมง

7. ตรวจนบจานวนโคโลนจากจานเพาะเชอทมจานวนโคโลนอยระหวาง 30-300 โคโลน รายงานผลเปนจานวน CFU ตอกรมตวอยาง

3.3 ศกษาคณสมบตทางกายภาพของผลตภณฑคอทเทจชส สเปรด

3.3.1การวดความแขงและความนมของผลตภณฑคอทเทจชส สเปรดดวยเครอง Texture analyzer

วธการบรรจตวอยางครมคอทเทจชส สเปรด ในแกวทรงกระบอก ทมเสนผาน

ศนยกลาง 3 ซม.และพนทหนาตด 11 ซม.3 วดคาแรงท Probe กดลงไปในตวอยางและแรงทดง Probe ออกจากตวอยาง โดยใช cylinder probe ทมเสนผานศนยกลาง 6 มม. วดคาแรง (force) ความนม (softness) และความหนด (adhesive) ของผลตภณฑคอทเทจชส สเปรด โดยใชเครอง Texture analyzer

3.3.2 การวดคาสของผลตภณฑคอทเทจชส สเปรด ดวยเครองวดสวธการ

1. ทาการ calibrate เครองทกครงกอนใชงาน2. นาตวอยางผลตภณฑคอทเทจชส สเปรดใสในภาชนะพลาสตกสาหรบ

วดคาส ใชชอนพลาสตก เกลยตวอยางใหทวกนภาชนะพลาสตก ไมใหเกดชองวาง วางภาชนะพลาสตกลงบน port ขนาด 1.25 นว

3. ใชฝาครอบปดตวอยาง เพอไมใหมแสงรบกวนจากภายนอก4. เรมวดคาสโดยใชระบบสของ Hunter color วดคา L* a* และ b*เมอ L* แสดงถงคาความสวาง (lighness) มคาตงแต 0-100

a แสดงถงคาสแดง (+) หรอ สเขยว (-)b แสดงถงคาสเหลอง (+) หรอสนาเงน (-)

131

ภาคผนวก ง

การผลตคอทเทจชส สเปรด

การผลตคอทเทจชส สเปรด ดวยเอนไซมจากฟกเขยว ดดแปลงตามวธของ Walstra และคณะ (1999)

1. การเตรยมหวเชอ1. ถายเชอ Streptococcus lactis จากกลเซอรอล ปรมาตร 0.1 มล.ลงใน

อาหาร MRS Broth ปรมาตร 5 มล. บมท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมง จากนนถายเชอลงในอาหาร MRS Broth อก 2-3 ครง เพอใหไดจานวนเซลล 10 7-9

เซลล/มล. และนบจานวนโคโลนโดยวธการ pour plate2. ถายเชอ S. lactis ในอาหาร MRS Broth จากขอ 1 ปรมาณ 8 มล.ลงใน

อาหาร MRS Broth ปรมตร 100 มล. (หวเชอรอยละ 5) เขยาดวยความเรวรอบ 175-180 รอบ/วนาท ท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมงและนบจานวนโคโลนโดยวธการ pour plate ทระดบการเจอจาง 10-5-10-8 แลวนาไปบมท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 ชวโมงเพอทราบจานวนเซลลทแนนอน

3 ปเปตเชอ S. lactis ในอาหาร MRS Broth จากขอ 2 ลงในหลอดเหวยงแยกทปลอดเชอจานวน 4 หลอด หลอดละ 25 มล.นาไปเหวยงแยกทความเรวรอบ 8,000 รอบ/วนาท นาน 15 นาท ลางเซลลเชอดวยสารละลายปลอดเชอโซเดยมคลอไรด รอยละ 0.85 หลอดละ 5 มล. และเหวยงแยกอกครง นาตะกอนเซลลทไดใสในนานมพรองไขมนพาสเจอรไรสปรมาตร 2,000 มล.ทอณหภม 30 องศาเซลเซยส

132

2. การผลตคอทเทจชส สเปรด

.

ภาพภาคผนว

น

นา

พกใหมอณห

เตมหวเชอ

เตมเอนไซมจากฟ

บมทอณหภม 35

ตดตะกอนโปรตน

เพมอณหภมเปน 5

นานมดบ

ก 4 การผลตคอทเทจCottage cheese s

นมพรองไขมน

ภม 30 องศาเซลเซยส

S. lactis รอยละ 5

กเขยว 1.45 ยนต/นม 1 มล.

องศาเซลเซยส นาน 4 ชวโมง

นมเปนลกเตาขนาด 1ซม.X 1ซ

3 องศาเซลเซยสบมตออก 2 ช

)

เหวยงแยกไขม

ชส สเปรดpread production

พาสเจอรไรส 95

เกบทอณหภ

เตมสารรอยละ 5

ม

วโมง

คอท

ครม

องศาเซลเซยส 15 วนาท

พาสเจอรไรส 75 องศาเซลเซยส 15 วนาท

หลอเยน

ม 4 องศาเซลเซยส

โฮโมจไนสความเรวรอบ 11,000รอบ/วนาท นาน 5 นาท

ใหความคงตวของนาหนกครม

เทจชส สเปรด

ปนผสม

บมทอณหภม 32 องศาเซลเซยสนาน 1-1.5 ชวโมง

พก15 นาท

แยกตะกอนโปรตนออกจากเวย

ลางตะกอนโปรตนดวยนาเยน (ปลอดเชอ

ตะกอนโปรตน

เตมครมรอยละ 10 ของนาหนกตะกอน

133

3. คณสมบตของผลตภณฑคอทเทจชส สเปรด (United States department of agriculture, 2001)

3.1 คณสมบตทางกายภาพ- กลนรส (falvor) มกลนรสคลายกบนานมสด (fresh whole milk) หรอ

ครม (กรณทมครมเปนองคประกอบ) มกลนรส (flavor) และกลน (aroma) ของกรดแลกตกและไดอะซทล (diacetyl) ออนๆ อาจมการเตมกรดหรอกลนรสของเกลอ (salty flavor) ไมควรมลกษณะผงสขาว (chalky) กลนผลไม (fruity) ยสต (yeast)

- ลกษณะและเนอสมผส (body and texture) มลกษณะ meaty texture แตถามครมเปนองคประกอบเนอสมผสจะนมขน เนอสมผสควรเรยบ (smooth) นมเบา (velvety) ไมเปนเนอแปง (mealy) ไมรวน (crumble) ไมเปนลกษณะแปงเปยก (pasty)ไมเหนยว (sticky) ไมเปนนาแฉะ(watery) หรอ มลกษณะเปนเลน (slimy)

- สและลกษณะปรากฏ มสสะอาด สขาวครม มขนาดของตะกอนโปรตนสมาเสมอ

3.2 คณสมบตทางเคม - ปรมาณความชนไมเกนรอยละ 80 ของนาหนกเนยแขง- ปรมาณไขมนนอยกวารอยละ 0.5 ของนาหนกเนยแขง- พเอช ไมเกน 5.2

3.3 คณสมบตทางจลนทรย- โคลฟอรม ไมเกน 10 CFU/กรม- Psychrotrophie ไมเกน 100 CFU/กรม- ยสตและรา ไมเกน 10 CFU/กรม