11Klinika hemija1 GvoeProf Violeta DopsajFarmaceutski fakultet Beograd2010/112Elementi u tragu: gvoe, bakar i cinkNedostatak dovodi do poremeaja u biohemijskim i funkcionalnim procesima pa se adekvatnim unosom moe spreiti deficijencijaStanja koja mogu dovesti do nedostatka elemenata utragu:- smanjen unos- poremeena apsorpcija- poveana ekskrecija- genetski poremeajiWHO daje preporuke za dnevni unos elemenata u tragu kao najmanju koliinu koju treba unositi u cilju odranja zdravljaFaze u metabolizmu Fe:- apsorpcija- transport- distribucija- izluivanje 3Opte preporuke za uzorkovanje i odreivanje elementa u tragu- niska koncentracija u biolokom materijalu (serum plazma)- ima ih svuda (treba spreiti kontaminaciju uzorka)Obezbediti apsolutnu istou epruveta za uzorkovanje (ukoliko nije vakutejner ili plastina epruveta, specijalno pranje epruveta), hemikalija, posua sa kojim se izvodi analiza (epruvete, pipete), dejonizovana vodaPreporukaKoristiti zatvoren sistem epruveta ili plastine epruvete za jednokratnu upotrebuPranje staklenih sudova i epruveta: preko noi u 6 mol/HCl, ispiranje 6 x sa vodomMetode za odreivanje i instrumenti moraju imati visoku analitiku osetljivost i specifinost, zbog ekstremno niske koncentracije koja se odreujeAtomska apsorpciona spektrofotometrija4Distribucija gvoa u organizmuNormalno, veoma male koliine Fe se nalaze u elijama, u plazmi, iostalim ekstracelularnim tenostimaFizioloki, organizam uva gvoe, tako da se manje od 0.1% telesnog Fe gubi dnevno (oko 1 mg), najvie deskvamacijom elija u GIT-u i urinarnom traktuFe ulazi u sastav:- hemoglobina (65-70%)- mioglobina (10%)- enzima (katalaze, peroksidaze, citohromi)- transferina- feritina i hemosiderina (20%)-kostna sr, slezina, jetraDistribucija Fe:mukarci: 50 mg/kg telesne mase (oko 4g)ene: 35 mg/kg telesne mase (2-3 g)25Dnevne potrebe u Fe (1-4 mg) zavise od:- godina- pola- fiziolokog statusaU menstrualnom ciklusu ena izgubi 20 - 40 mg Fe (dnevne potrebe 2 mg)Trudnoa, poroaj, dojenje troe proseno 900 mg (dnevne potrebe 3-4 mg)Postmenopauzalne ene i mukarci oko 1 mg dnevnoUnos gvoa hranomNamirnice ivotinjskog porekla: hemsko gvoeMeso, riba, jaja, iznutriceNamirnice biljnog porekla: Fe u feri oblikuitarice,spana, zeleno povreManja bioraspoloivost od hemskog Fe 6Osnovne Biohemijske funkcije gvoa1. Oksigenacija tkivaFe2+ ulazi u sastav hemoglobina i obezbeuje reverzibilno vezivanjeO2 u pluima i snabdevanje tkiva kiseonikomU tkivima hemoglobin vezuje za CO2 , oslobaa ga u pluimaAcidoza u tkivima (povean H+ i pCO2) ubrzava oslobaanje O2 Mioglobin vezuje O2 sa veim afinitetom od hemoglobina i olakava oslobaanje O22. Ulazi u sastav citohroma koji su odgovorni za prenos elektrona u respiratornom lancu, kroz oksido-redukcije Fe, stvarajui ATP3. ulazi u sastav katalaze i peroksidaze pretvarajui peroksid u vodu7Glavne faze u metabolizmu gvoa1. Apsorpcija Fe2. Transport i preuzimanje u elije3. Depo Fe4. Izluivanje Fe8Apsorpcija FeRDA preporuuje 10-20 mg Fe dnevnoSvega 5-10% unesenog Fe se apsorbuje uglavnom u duodenumuNeorgansko Fe koje se unosi hranom uglavnom je Fe3+, ali se mora prevesti u Fe2+pre ulaska u intestinumHCl u elucu i sastojci iz hrane (askorbinska kis., eeri, i amino-kiseline) sa Fe formiraju solubilne helate koji se lake apsorbujuSupstance koje formiraju nerastvorne komplekse sa Fe:- fosfati (iz jaja, sira, mleka)- oksalati (iz povra)- tanini (iz aja)Ovi sastojci hrane smanjuju apsorpciju FeOralni preparati Fe koji sadre Fe3+moraju se unositi najmanje 30 min pre jela da ne bi dolo do stvaranja nerastvornih kompleksaTzv hemsko Fe apsorbuje se kao ceo molekul39Izvori gvoaIz ivotinjskih namirnica: hemsko gvoe (Fe 2 + )- crveno meso, ribaIz biljnih namirnica: nehemsko gvoe (Fe3+)Dnevni unos gvoa hranom: 10-20 mgApsorpcija5-10 % : 1 mgProsena dnevna potreba u Fe: 1,7 mgMukarci i ene u postmenopauzi: 1 mgene u reproduktivnom periodu: 2mgTrudnice, dojilje: 3-4 mgMehanizmi apsorpcije na apikalnoj membrani enterocita:Hemsko gvoe: Fe2+Nehemsko gvoe: Fe3+Nehemsko gvoe: Fe2+10Apsorpcija Fe2+u intestinalnim elijama: hemsko gvoeHemsko gvoe: Fe u fero obliku u hemu1. Hbse dejstvom proteaze razlae na Hem + Globin2. Hem se apsorbuje kao ceo molekul i lako prolazi membranu- na apsorpciju hema ne utiu sastojci hrane- apsorpcija hema je aktivan proces uz uee nepoznatog transportera3. U enterocitima se iz porfirinskog prstena oslobaa Fe2+pod dejstvom hem-oksigenazeHem Fe2+Ovaj proces je je mnogo efikasniji u odnosu na nehemsko Fe jer na njega ne utiu sastojci hraneIzluivanje Fe je stalan i neregulisan proces , pa se ravnotea i metabolizam Fe kontrolie i regulie apsorpcijom11Apsorpcija nehemskog (Fe3+) u enterocitima1. Transport gvoa kroz apikalnu membranu intestinalnih epitelnih elijaRedukcija Fe3+:- pod dejstvom hrane (askorbinska kis)- feri-reduktazom iz mikrovilaTransporter dvovalentnih neorganskih jona: DMT1(i za Mn, Cu, Co, Zn, Cd i Pb)Apsorbovan Fe2+:- odlazi u depo kao feritin enterocita- odlazi u cirkulaciju2. Transport Fe2+kroz bazolateralnumembranu i oksidacija doFe3+Bazolateralni transporteri:- feroportin- hefestin (fero oksidaza koja sadri Cu)12Apsorpcija hemskog i nehemskog gvoa413Deponovano Fe u obliku feritina u enterocitima se mobilie po potrebi ali se se najveim delom gubi normalnom deskvamacijom mukoznih elijaPosle deskvamacije nove elije zamenjuju stare i proces apsorpcije se obnavljaKoji mehanizmi kontroliu transfer Fe iz intestinalnih elija u plazmu?Predmet velikog broja istraivanjaTreba spreiti preveliku apsorpciju Fe a odravatiadekvatno snabdevanje Fe prema trenutnim potrebamaGlavni faktor koji utie na apsorpciju Fe je stepen produkcije eritrocita u kostnoj sri (kada je potrebno apsorpcija se moe poveati vie od 3 puta)U deficijenciji Fe, trudnoi, ubrzanoj eritropoezi u nekim anemijama stimulisana je poveana apsorpcija FeObrnuto, unoenjem velike koliine Fe (na pr unoenjem suplemenata Fe, trovanje sa Fe) apsorpcija Fe se redukuje, da bi se spreila intoksikacija 14Apsorbovano Fe3+ u cirkulaciji se:- vezuje za apotransferin, prelazi u transferin koji ima 2 Fe3+- transferin u plazmi prenosi i oslobaa 2 Fe3+ u elijama- Fe3+ se u elijama kostne sri ugrauje u hemoglobin eritrocitaEritrociti ive 4 meseca u cirkulaciji a zatim se razgrauju u jetri, slezini i makrofagama (RES), Fe se vraa u plazmu gde se vezuje za transferin ili se deponuje u feritinuApsorpcija Fe je podeena tako da da obezbedi tekue potrebe organizmaTransport gvoaFe se transportuje od jednog do drugog organa vezan za plazma protein apotransferin (kompleks apotransferina-Fe predstavlja transferin)Normalno, u plazmi se nalazi oko 2.5 mg FeTransferinski ciklus obuhvata:- vezivanje Fe za apotransferin, nastaje transferin- transport Fe do elija, ulazak Fe u elija preko transferinskih receptora- vraanje apotransferina na povrinu elije 15Transferin- glikoprotein plazme, sintetie se u jetri, poluivot 8 dana- u organizmu polovina koliine transferina nalazi se u plazmi a druga polovina ekstravaskularnoTransferin predstavlja grupu od 20 razliitih izotransferina:99% transferina u plazmi sainjavaju penta-, tetra-, i trisijalo-forme1% transferina ini disijaloforma (10-15 puta se poveava u alkoholizmu); svi oblici imaju isti afinitet prema FeU normalnim fiziolokim uslovima vezuje 2 Fe3+ (20-50% je zasieno) Vezivanjem za transferin spreava se toksuno delovanje Fe u plazmiPoluivot Fe u plazmi je 60-120 minSintezu transferina stimuliu: nisko Fe, estrogeni, kortikosteroidiReferentni interval: 2-4 g/L- bez cirkadijalnog ritma, nema uticaja pola, godinaOdreivanje transferina: imunohemijski (nefelometrijski i turbidimetrijski)16Poviena koncentracija transferina:- anemija zbog nedostatka Fe- trudnoa, terapija estrogenimaSniena koncentracija transferina:- anemija hroninih bolesti- smanjena sintetska funkcija jetre (bolesti jetre, malignitet)- akutna inflamacija i infekcija (negativni reaktant akutne faze)- hipoproteinemija i gubitak proteina (opekotine, bolesti bubrega, malnutricija)Primarno, koncentracija transferina se odreuje kao indikator nutricionog statusaTransferin od 0.15 g/L dovoljan je za normalnu eritropoezuKako je normalno 1/3 transferina zasiena kao Fe3+Indirektno se koncentracija transferina moe odrediti preko :UIBC - rezervni, nezasieni kapacitet vezivanja FeTIBC - ukupni kapacitet vezivanja FeSaturacija transferina (TSf%)TS = 100 x ukupno serumsko Fe/TIBC517Preuzimanje Fe iz transferinaNajvei deo Fe (20-25 mg dnevno) potie od destrukcije eritrocita u slezini, gde hem-oksigenaza otvara porfirinski prsten i oslobaa FeMakrofage prenose najvei deo Fe u plazmu gde se vezuje u transferin, odlazi u kostnu sr za sintezu hemoglobinaNa ovaj nain RES stalno stare elije zamenjuje novimU makrofagama se nalazi i depo Fe, koji se puni kada se razgradnja povea tako da postane vea od podukcije Infekcija, inflamacija i malignitet onemoguavaju oslobaanje Fe iz makrofagapa se produkcija eritrocita smanjuje iako ga ima u makrofagamaelijski transferinski receptortransmembranski protein koji se nalazi na povrini svih elija kojima je neophodno Fe za rast2 tipa TfR1 i TfR218Distribucija TfR receptora- eritroidni prekurzori kotane sri(75 % ukupnih receptora)- jetra- placentaTfR je dimer: dve subjedinice vezane sa dva disulfidna mostaMonomer transferinskog receptora se sastoji od:1. aminoterminalnog citoplazmatskog dela (61 AK)intracelularna razmena peptidni deo- signal za endocitozu2. transmemranskog dela (28 AK)hidrofobne AKsignalni peptid za translokaciju kroz ER3. ekstracelularnog dela (671 AK)N - i O- sijalinizirani glikani- obezbeuje interakciju receptora i transferinaTfR je dimer: vezuje 2 molekula transferina (4 Fe3+)19Transferinski ciklussinteza hemoglobina20Solubilni transferinski receptor-sTfRrastvoljivi, cirkulisuci oblik receptoranema citoplazmatskog i transmembranskog delaSadri jednu receptorsku subjedinicu-monomerKliniki znaaj odreivanja sTfRKoliina rastvorljivog receptora u serumu proporcionalna je Fe u tkivu (odraava eritropoetsku aktivnost kotane sri)sTfR odraava status funkcionalnog FeDeficijencija gvoabroj receptora povien, poviena conc sTfRZajedno sa feritinom koristi se u proceni statusa FeZa razliku od feritina, nije pod uticajem inflamacije Odreivanje sTfRimunohemijski (nefelometrija, turbidimetrija, Elisa)621Deponovanje gvoaFe se u tkivima deponuje u 2 forme: feritin i hemosiderin1/3 rezerve Fe nalazi se u jetri, 1/3 u kotanoj sri, ostatak u slezini idrugim tkivima (tkivne makrofage)Feritin- polimer od 24 apoferitinske jedinice- apoferitin je u obliku proteinske koljke koja moe da vee do 4500 Fe3+ (25% teine), nastaju micele feri-oksida koje popunjavaju upljineFeritin se u razliitim tkivima nalazi u obliku razliitih izoferitinaIzoferitin se sastoji od kisele subjedinice H i bazne L (tkivno specifian sadraj H i L subjedinica u razliitim tkivima)Feritin u serumu sadri skoro iskljuivo bazne (L) jedinice (1 g/L serumskog feritina odgovara 8 mg deponovanog Fe)Na povrini 6 pora za oslobaanje i prolaz FeFeritin ima osobine pozitivnog reaktanta akutne faze 22Hemosiderin- nerastvorni kompleks nastao od feritina- delimino deproteinizovan i agregiran- granule dijametra 1-2 m koje se mogu videti svetlosnim mikroskopom nakon bojenja sa Prussian-blue- sadri vie Fe u odnosu na feritin, ali oslobaa Fe mnogo sporijeJedino je feritin efikasna rezerva gvoa iz koje se Fe brzo oslobaa i izlazi kroz pore na povrinu apoferitinaMetode za odreivanje feritinaimunohemijske (Elisa, turbidimetrija, nefelometrija)Feritin ne pokazuje cirkadijalni ritamReferentni intervalmukarci: 20-250 g/L; ene: 10-120 g/Lirok raspon vrednosti u oblasti cut-off-a (siva zona)Zbog osobine pozitivnog reaktanta akutne faze nikada se sa sigurnou ne moe iskljuiti koegzistirajua deficijencija Fe iako je conc feritina normalna (ukljuiti markere inflamacije-CRP, fib)23Kliniki znaaj odreivanja feritinaSnien feritin ( 200 g/L; muskarci > 300 g/L):- hemohromatoza, hemosideroza- inflamatorna oboljenja- akutne i hronine bolesti jetre- maligne bolesti- hipertireoidizam- hemolizna, megaloblastna, sideroblastna anemija, talasemijeIzluivanje gvoa- dnevni gubitak 1 mg- proces izluivanja nije kontrolisanGubitak Fe:- iz intestinalne mukoze deskvamacijom elija- menstrualnim krvarenjem- urinom minimalno- znojem24ene:- menstruacijom 6 mg meseno- u toku trudnoe dnevno 1,5 mg na fetus i placentu- porodjaj i laktacijaRegulacija homeostaze gvoaOrganizam strogo uva Fe s obzirom na znaaj Fe u mnogim biolokim procesimaNivo Fe u organizmu regulisan je pre svega na nivou apsorpcijeNovija istraivanja ukazuju na znaaj jetre zbog sinteze regulatornih proteinaHomeostaza Fe se ostvaruje sloenim mehanizmima:1. Na nivou organizma (sistemski):sinteza hepcidina i hereditarnog hemohromatoznog proteina (HFE)2. elijska regulacija na nivou sinteze proteina:- transkripcije- post-transkripcionih modifikacija- translacije 7251. Kontrolni mehanizmi preuzimanja gvoahepcidin i HFE imaju inhibitorni efekat na procese preuzimanja FeKontrolori su: apsorpcije Fe iz hrane (na nivou enterocita) preuzimanja transferinskog Fe od strane perifernih elijaLokalizovani su u kriptama enterocita i elijama RES-aHepcidinpeptid sastavljen od 25 AK, sintetie se u jetri, a izluuje urinomFeroportin je receptor za hepcidin (nalazi se na enterocitima, hepatocitima, makrofagama)Feroportin je kanal kroz koji joni Fe prelaze u plazmuHepcidin zatvara ovaj kanalHepcidin je negativni modulator oslobaanja Fe iz enterocita i makrofagaHepcidin se vezuje za transportni protein feroportin, posle ega se on uklanja i degradiraHepcidin je medijator u inflamaciji i odbrani od infekcije26Uloga hepcidina u homeostazi gvoa u organizmu27Uloga hepcidina u inflamacijiU inflamaciji se poveava sinteza hepcidina pod uticajem IL-6 (Fe ostajezarobljeno u enterocitima, makrofagama i hepatocitima)Sniena conc Fe u serumu i povien feritin (anemija hroninih bolesti)smatra se odbranom organizma od infekcije (smanjena raspoloivost Fe za mikroorganizme)Sinteza hepcidina se poveava u sluaju nagomilavanja Fe, a smanjuje u toku deficijencije Fe (negativni modulator oslobaanja Fe) 28HFEhereditarni hemohromatozni proteinOtkriven kod obolelih od nasledne hemohromatoze (mutacija na genu za HFE, C282Y), apsorbuju 2-3 puta vie Fe iz hrane , to dovodi do nagomilavanja Fe u srcu, jetri, pankreasuHFE ima ulogu u apsorpciji Fe u enterocitimaUloga HFE nije u potpunosti razjanjenaPretpostavka je da se HFE vezuje za TfR na istom mestu gde i transferin, i menja afinitet receptora za transferinMutirani HFE se ne vezuje adekvatno za TfR, ne gradi kompleks TfR-HFE i ne uestvuje u homeostazi gvoaRegulacija na nivou sinteze proteina koji uestvuju u homeostazi Fe1. Transportni proteini: DMT 1, feroportin2. Regulatorni proteini: Hepcidin, HFE3. Transferinski receptori: TfR4. Depo oblik Fe: Feritin829Ispitivanje statusa gvoa: Biohemijski Laboratorijski testovi1. transportni pul Fe (serumsko Fe,TIBC,saturacija transferina)3. depo pul (feritin)2. funkcionalni pul Fe(sTfR, hemoglobin)30Transportni pul gvoa: Fe, TIBC, saturacija transferina, transferinMetode za odreivanje gvoa u serumu, kapaciteta vezivanjagvozda i saturacije transferinaSerumsko gvoe podrazumeva Fe3+ vezano za transferin a ne cirkuliue Fe kao slobodan hemoglobin u plazmi Princip odreivanja serumskog gvoa- oslobaanje Fe iz veze sa transferinomsnienjempH seruma- redukcija Fe3+do Fe2+ (redukcija-na pr askorbinska kis)- kompleksiranje Fe2+sa hromogenom (batofenantrolin, ferozin)Nastali kompleks ima visoki molarni apsorbancioni koeficijent nazadatoj talasnoj duini, koja je proporcionalna koncentraciji FeMetoda se moze izvoditi manuelno ili na automatuPosebnu panju obratiti na istou epruveta, posua, reagenasa (najbolje koristiti zatvoren sistem epruveta ili plastine epruvete)31UzorakSerum (interferencija u jako hemolizovanom uzorku)Fe pokazuje cirkadijalni ritam (najvise conc. ujutru a najnize uvece):uzimati uzorak ujutruFe pokazuje i varijaciju iz dana u danCirkulisui pul Fe promeni se 10-20 puta dnevno jer se atom Fe nezadrava vise od 2h u plazmi (promene u koncentraciji serumskogFe od 20% deavaju se iznenada i kod zdravih ljudi, zbog trenutneneravnotee nastale ulaskomili izlaskomgvozda iz cirkulacije)Svi ovi faktori ograniavaju dijagnostiku upotrebljivost odreivanjaserumskog FeRezulatat serumskog Fe treba uvek interpretirati u kombinaciji saTIBC i saturacijomtransferina jer pojedinani rezultat serumskog Fe ima mali kliniki znaaj32TIBC -ukupni kapacitet vezivanja gvoa(Total Iron Binding Capacity)TIBC meri maksimalnu koliinu Fe koju transferin moe da veeTo ie indirektan nain za odreivanje transferinaPovien TIBC: deficijencija Fe hepatitis trudnoa upotreba oralnih kontraceptiva hemohromatozaSnien TIBC inflamacija, hronine infekcije malignitet nefrotski sindrom malnutricija megaloblastna i hemolizna anemija933Princip odreivanja TIBC1. Dodavanje Fe u viku (feri-amonijum citrata) viak nevezanog Fe(III) se uklanja (MgCO3) centrifugiranje u supernatantu se odredi koncentracija Fe: TIBC = UIBC + FeReferentne vrednostiSerumsko Femukarci:11,6 - 30,4 mol/Lene: 9,0 - 30,4 mol/LTIBC: 45 -80 mol/LSaturacija transferinaUdeo transferina zasienog gvoem u odnosu na njegov ukupan kapacitet vezivanja gvoaSaturacija transferina (%) = conc Fe u serumu (mol/L) x 100TIBC (mol/L)Referentni interval: 15-45%34Poviena saturacija transferina> >> > 55 %optereenje gvoem, hemohromatozatalasemija major, sideroblastna anemijaakutno trovanje gvoemSniena saturacija transferina< 400 g/L)36Ukoliko pored deficijencije Fe postoji i infekcija rezultat feritina mora se veoma oprezno tumaitiKoncentracija feritina u krvi je veoma niska: svega 1 % Fe u plazmiFeritin zavisi od koliine rezervnog Fe:1g/L feritina u serumu 140 g rezervnog Fe/kg t.t.Feritin je indikator veliine rezervnog dela gvoa-depo pul FeOdreivanje feritinaimunohemijske metode (turbidimetrija, nefelometrija), ELISA, hemiluminiscencija, IRMAReferentne vrednosti-uticaj pola i godinamukarci: 20-300 g/Lene:15-120 g/Lnovorodjenad: 25-200 g/Ldeca 1 m: 200-600 g/Ldeca 2-5 m: 50-200 g/Ldeca 6 m-15 g: 7-142 g/L1037Solubilni transferinski receptorNalazi se u serumu nakon proteolitike razgradnje TfR izmeu Arg 100 i Leu 101 kao monomerni fragment, MM 85 KDaGlavni izvor sTfR: eritropoetske elije i retikulocitisTfR je direktan pokazatelj funkcionalnog pula gvoaNema osobine reaktanta akutne fazeU savremenoj dijagnostici feritin i sTfR su dva najvanija parametra u proceni rane deficijencije gvoaVisoka specifinost i osetljivost u otkrivanju subklinikih i klinikih deficijencija gvoa kod pacijenata kod kojih je indikovana suplementacija FeKada je intracelularna koncentracija Fe niska inhibira se sinteza apoferitina a promovie se sinteza transferinskih receptora koji treba da unesu veu koliinu Fe u elijeOdreivanje sTfRimunohemijske metodeReferentni interval (zavisi od metode odreivanja)38Kliniki znaaj sTfR- diferencijalna dijagnoza hipohomne anemije i anemije honinihbolesti- rano otkrivanje deficijentne eritropoeze, subklinika neaneminadeficijencija Fe- procena deficita Fe kod osoba sa poveanim fiziolokim potrebama(trudnice, deca, sportisti)- praenje odgovora na terapiju eritropoetinomGenetska ispitivanjaMutacija na genu za HFE (hereditarni hemohromatozni protein) C282Y, naena kod 80% pacijenata sa hereditarom hemohromatozomMogue je odrediti da li je pacijent homozigot ili heterozigot: homozigoti mogu razviti optereenje gvoem i hemohromatozu dok heterozigoti ne akumuliraju Fe i ne razvijaju hemohromatozu