- microscopia y tecnicas de estudio celular –

MICROSCOPíA Y TÉCNICAS DE ESTUDIO CELULAR

Tipos de microscopios

Ópticos

Electrónicos

Campo claro

Campo Oscuro

Contraste de fase

Confocal

Fluorescencia

Transmisión

Barrido

Microscopía -Resumen

Algunos Conceptos…

Resolución (D)Magnificación

Aumento que logra el equipo

Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar

dos puntos como entidades separadas

¿De qué depende la resolución?

0,5 . λ


n . senθ D =

¿Cómo disminuir D?


0,5 .


n . senθ D =

Longitud de onda del haz de luzλ FILTRO

AZUL



0,5 .

n . D =

λ

senθ

Objetivo

muestra

LENTE CONAN MAYOR



Índice de refracción

Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un medio transparente a otro también transparente. Este cambio de dirección está originado por la distinta velocidad de la luz en cada medio. nAire: 1 nAceite:1,5

0,5 .

nD =λ

. senθ

ACEITE DE INMERSIÓN

Microscopio óptico

EL PORTAOBJETOS

REVOLVER

TORNILLOS DE

Microscopio óptico

Microscopio óptico - Campo claro - imágenes

Eosinofilia

Microscopio óptico – Campo oscuro

Observar organismos vivos sin necesidad

de tinción

Objetos brillantes sobre un fondo oscuro

Microscopio óptico – Campo oscuro - Imágenes

Treponema pallidum

Aumenta pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad en la célula

Microscopio óptico – Contraste de fase

Observar organismos vivos sin necesidad

de tinción

El anillo forma un cono hueco de luz.

El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse respecto del rayo que siga de largo

luz sombra

Células HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos

Zygnema Filamentous Algae


Microscopio óptico – Interferencia

Permite la visualización detallada sin teñir

Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares

Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada

Microscopio óptico – Contraste de fase e interferencia - Imágenes

Contraste de fase

Interferencia diferencial

Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten

Microscopio óptico - Fluorescencia

Restringe infrarrojo

Pasa sólo la λ que permite la excitación del fluorocromo

Aequoria victoria

Microscopio óptico - Fluorescencia

Algunos “objetos” fluorescentes…

GFP(Green fluorescent protein)

hela

Drpspphila

Célula de cebolla (peroxisomas)

Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

Microscopía electrónica

Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Microscopía electrónica de barrido (SEM)

Microscopía electrónica

Estructura interna y detalles ultraestructurales

Morfología y características de la superficie

Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Bacilos en división Mitocondria 60.000x

Herpes virus ensamblándose en el núcleo

Bacteria fagocitada por un macrófago

Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)

Glomérulo renal 1200x

Célula en corte transversal Piel humana

Espermatozoides bovinos


Célula vegetal con cristales (falsa tinción)Bacterias sobre un estoma

Glób. RojoGlób. Blanco


Microscopía óptica vs. electrónica

Elevados costos de los equipos y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio.

Altos costos de procesamiento de las muestras La manipulación de reactivos se torna

peligrosa por la elevada condición tóxica de los mismos.

Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos

La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado.

Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación

Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas

Microscopía de fuerza atómica (AFM)


Imágenes AFM de fibras de colágeno (izquierda) y ADN (derecha).

Imágenes AFM de una célula viva en un medio de cultivo (izquierda) y cromosoma humano (derecha).


AFM images of M13 phage and mtDNA. M13 phage genomes before (A) and after (B) binding to SSB. Clayton et al, 2006.

ELISAWestern blotDot blotInmunohistoquímicaInmunofluorescenciaCitometría de flujo

Técnicas inmunológicas

Introducción a las Técnicas inmunológicas

Técnicas Inmunológicas - Inmunoglobulinas

Anticuerpo

Antígeno

Técnicas Inmunológicas - Producción de Inmunoglobulinas (anticuerpos)

epitope

Linfocito B

Activación

Antígeno

Técnicas Inmunológicas - Anticuerpos

Epitope A

Epitope C

Epitope B

Los antígenos suelen presentar múltiples copias del mismo epítope, y/o presencia de múltiples epítopes que son reconocidos por múltiples anticuerpos.

Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Policlonales

Antigeno

Activación

Linfocitos B

Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Policlonales

SueroCentrifugación

Sangre

Purificación

Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales

Antígeno

Purificación de Linfocitos B

Sangrado Cultivo de células tumorales

+Fusión

Hibridoma

Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales

Hibridomas

Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento

Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas

Técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA)

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)

Para detectar Antígenos

Anticuerpos

ELISA

ELISA Para detectar Anticuerpos

Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

ELISA


Lavado Anticuerpo 2º Revelado

ELISA

ELISA Para detectar Antígenos

Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

ELISA


Lavado Anticuerpo 2º Revelado

Revelado – Detección Indirecta

Revelado:

Complejo biotina-avidina

Antígeno

Ac. primario

Ac. secundario

Biotina

Cromógeno

Cromóforo

Avidina

Peroxidasa

Revelado – Detección indirecta

Revelado – Detección indirecta

Formación de colores por la acción enzimática de distintos cromógenos

Ventajas ELISA

Gran número de muestras procesadas simultáneamente

Muy sensible

Resultados rápidos

Cuantificación de sustancias diversas (hormonas, fármacos, etc.)

Western blot

Western blot: identificación de proteínas

Transferencia

SDS - PAGE

Gel Membrana

Incubación con Ab y revelado

Transferencia

Western blot

Bloqueo Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado

Biotina-avidina + peroxidasa Revelado

•Sustrato coloreado que precipita al reaccionar•Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima (revelado en placa radiográfica)

Ejemplo Western blot

Membrana nitrocelulosa

50

ActinaDAT

75105160250

Placas radiográficas

Gel acrilamida

Dot blot

DOT BLOT

Dot blot analysis of proteins extracted from wild-type spores and from spores exposing a TTFC chimera. (Ricca and Cutting. Journal of Nanobiotechnology 2003 1:6)

Variante de las técnicas de Southern, Northern y Western blot

Identificación de moléculas

Inmunohistoquímica

Trozo de tejido

Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos

Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado

Avidina-peroxidasa Revelado

Inmunohistoquímica: identificación en el tejido

Inmunohistoquímica - Revelado

Anti MMP-13 revelado con DABContratinción hematoxilina

Inmunohistoquímica - Sustratos

Rodamina

FluoresceinaFicoeritrina

DAPI Bromuro de Etidio

Naranjade Acridina

Inmunofluorescencia

N-myc/CD56

Rat neurons

Inmunofluorescencia

Inmunofluorescencia-colocalización

La colocalización permite determinar si dos antígenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retículo, etc)

dentro de una célula

Inmunofluorescencia - colocalización

Citometría de Flujo

Citometría de FlujoCélula Medida En movimiento

Medida de las propiedades de las células mientras están en un flujo de líquido

InmunophenotipificaciónViabilidad/apoptosis/ProliferaciónCiclo celularCambios en la superficieActividad enzimáticaetc


Mezcla de células

Marcación con anticuerpos monoclonales


La presión ejercida por una columna de fluido obliga a las células a “enfilarse” de a una


Columna de células


Laser

Detector


Tamaño

Granularidad

La luz que se detecta en la misma dirección del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC).La intensidad de la señal detectada se relaciona con el tamaño, y el indice de refracción de las células

La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC)La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de estructuras citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones, etc)

Fluorescencia -Técnicas - Citometría de Flujo

Fluorescencia -Técnicas - Citometría de Flujo

Ejemplo:Selección del sexo a través de

citometría de flujo de espermatozoides

- microscopia y tecnicas de estudio celular –

Documents