熊本大学学術リポジトリ

Kumamoto University Repository System

Title ABCトランスポーターBCRPの小胞体膜タンパク質Derlin-

1による品質管理

Author(s) 杉山, 崇

Citation

Issue date 2011-03-25

Type Thesis or Dissertation

URL http://hdl.handle.net/2298/22142

Right

熊本大学学位論文

ABC トランスポーター BCRP の

小胞体膜タンパク質 Derlin-1 による品質管理

2011

熊本大学大学院薬学教育部 分子機能薬学専攻

分子機能薬学講座 遺伝子機能応用学分野

杉山 崇

Glycosylation-dependent quality control of ABC transporter BCRP

by the ER membrane protein, Derlin-1.

Takashi Sugiyama

Glycosylation-dependent quality control of ABC transporter BCRP by the ER membrane protein, Derlin-1.

Department of Molecular Medicine, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kumamoto University

Takashi Sugiyama

Human breast cancer resistance protein (BCRP) is a well-recognized ABC half-transporter that is highly expressed at the apical membrane of kidney, intestine, liver, brain, and many other normal tissues and cancer cells. BCRP normally facilitates disposition of endogenous and exogenous harmful xenobiotics to protect cells/tissues from xenobiotic-induced toxicity. However, BCRP also removes many therapeutic drugs because of its capacity to work as “efflux pump”. BCRP is reported to be overexpressed in some cancer cell lines such as breast, colon, and lung cancer, among others. In these cases, anticancer reagents are removed from the cells, which dampens the cytotoxic effects of these drugs. This BCRP-dependent reduction of therapeutic effect is considered as one of the reasons for cancer cells to acquire “multidrug-resistance”. On the other hand, BCRP is also engaged in the transport of vitamins, uric acid, folate and other essential factors for vital activity. Especially in uric acid transport, some epidemiological research showed that sufferers of gout tend to have certain BCRP single nucleotide polymorphisms. As mentioned above, because BCRP transports a wide variety of substrates, identification of the regulatory mechanisms responsible for the expression and function of BCRP may help us to further understand BCRP-dependent physiological and pathophysiological events.

The expression level of BCRP protein is regulated by both transcriptional and posttranslational mechanisms. Recent reports on the posttranslational regulation of BCRP suggested that monitoring the quality of BCRP protein in the endoplasmic reticulum (ER) is critical for the regulation of BCRP expression. For example, despite the degradation of wild type (WT) BCRP by the endosome-lysosome pathway, some mutant BCRPs regarded as misfolded proteins by putative “Check Point” system in the ER readily undergo ER-associated degradation (ERAD). These suggest that there is a system that recognizes the difference between WT and mutant BCRPs. Interestingly, another “Check Point” system that recognizes the presence of N-linked glycan at Asn596 has been also reported. Although this glycosylation-dependent “Check Point” system also seems to be critical in the regulation of BCRP proteins, the molecules that are critical for the control of these

posttranslational regulations are yet to be fully understood.

In this study, I screened the factors that affect the expression pattern of WT BCRP and N596Q mutant BCRP, an N-linked glycosylation-deficient mutant that preferentially undergoes ERAD. I identified the ER membrane protein, Derlin-1, as a factor that differentially affects posttranslational BCRP expression in a glycosylation-dependent manner. When I overexpressed Derlin-1 with WT BCRP in HEK293 cells, ER to Golgi transport of WT BCRP was strongly inhibited, and resulted in the ER retention of WT BCRP. Because Derlin-1-induced ER retention reduces the wild type BCRP expression level at plasma membrane, Derlin-1 could negatively regulate WT BCRP function. Additionally, overexpression of Derlin-1 also resulted in the ER retention of endogenous WT BCRP in MCF-7 cells, which is a breast carcinoma cell line. From these results, a novel therapeutic approach to multidrug resistance, gout and other BCRP- derived diseases may be proposal with the use of Derlin-1-induced ER retention of BCRP. Furthermore, protein expression of N596Q variant of BCRP was strongly suppressed by the overexpression of Derlin-1, whereas knockdown of Derlin-1 stabilized N596Q protein, suggesting a negative regulatory role of Derlin-1 for N596Q protein expression. Notably, knockdown of Derlin-1 also stabilized the expression of tunicamycin-induced deglycosylated WT BCRP protein, implying the importance of glycosylation state for the recognition of BCRP by Derlin-1. Taken together, these data confirm the importance of glycosylation-dependent “Check Point” system in the regulation of both glycosylated and non-glycosylated BCRP expression, and suggest that Derlin-1 works as a critical molecule that regulates posttranslational BCRP expression.

Overall, the studies presented here are the first to show the involvement of Derlin-1 in the posttranslational negative regulation of human BCRP. Since specific factors that regulate posttranslational expression of BCRP were yet to be fully understood, my identification of Derlin-1 as a negative regulator of BCRP protein expression provides a novel posttranslational regulatory mechanism of BCRP, which may help us to further understand BCRP-dependent pathophysiological events. To date, there are only limited number of studies on Derlin-1 function in the glycosylation-dependent regulation of substrates, so that my study on BCRP regulation by Derlin-1 becomes the first model to show this idea, which would be of great interest to the field of protein quality control research.

ABC トランスポーター BCRP の小胞体膜タンパク質 Derlin-1 による品質管理

分子機能薬学専攻 遺伝子機能応用学分野 杉山崇

Breast cancer resistance protein（BCRP）は腎臓，腸管，肝臓，脳などの様々な正常組織や癌細胞に発現する ABC トランスポーターの一種である．BCRP の本来の生理的作用は内在性あるいは外来性の細胞障害性物質を細胞外に排出し，

組織を保護することである．しかしながら，その幅広い基質認識性ゆえに BCRPは種々の薬物に対しても細胞外排出作用を有し，結果として薬物の治療的効果

を減弱させてしまう．特に癌細胞において発現上昇した BCRP は化学療法における多剤耐性獲得に寄与して問題視されている．一方，ビタミンや尿酸，葉酸

などの生体内必須成分も BCRP の基質となることが明らかになりつつあり， BCRP の機能低下が高尿酸血症などの疾患に結び付くことも示された．このように，BCRP は多彩な基質輸送を担うことから生理学的，病理学的な観点から非常に重要な分子であり，その機能は過不足なく調節されていなければならな

い．よって BCRP の機能発揮に直接的に影響を与える発現調節メカニズムを明らかにすることは重要な意義を持つものと言える．

BCRP の発現調節は DNA からの転写段階および翻訳後修飾段階で調節されており，実際にトランスポーターとして機能するタンパク質レベルを一定に保

つ翻訳後修飾，なかでも小胞体（ ER）を中心とした BCRP の品質管理に関する研究が進みつつある．特に細胞内のタンパク質量のバランスを保つメカニズム

として，BCRP の小胞体関連分解（ER associated degradation ; ERAD）に関する検討が進められ，一定の成果が得られている．定常状態の BCRP に対する ERAD は変異型においてのみ顕著に起こることが報告されており，野生型 BCRP と変異型 BCRP を選別するようなチェックポイントの存在が示唆されていた．また，野生型 BCRP も脱糖鎖を受けると ERAD 感受性を示すようになることも報告されており，BCRP の品質管理における糖鎖付加の重要性が示されていた．しかしながら糖鎖付加依存的な BCRP チェックポイントという観点からの検討はなされておらず，関連する分子メカニズムについても全く不明

であった．そこで，本研究では，糖鎖付加状態が BCRP の野生型と変異型を区別するチェックポイントの一端であるという仮説に基づき，野生型 BCRP と糖鎖付加不全変異型 N596Q BCRP に対して異なった発現変化を起こすような因子をスクリーニングした．その結果，ER 膜タンパク質である Derlin-1 が，BCRPの糖鎖付加状態に応じて異なる発現変化を起こすことを見出した．

Derlin-1 の過剰発現に伴って野生型 BCRP の ER からゴルジ体（Golgi）への輸送が抑制されており，Derlin-1 は野生型 BCRP に対する ER retention 作用を有することが明らかになった．ER retention の結果として形質膜上への BCRP発現が抑制されていたことから，Derlin-1 の過剰発現は野生型 BCRP の機能を負に制御することが示唆された．さらに，ヒト乳癌細胞 MCF-7 においても Derlin-1 過剰発現による内在性 BCRP の ER retention 作用が確認されたため， Derlin-1 は生理的条件下においても BCRP の発現調節を行うことが示唆された．一方，N 型糖鎖付加不全変異型 N596Q BCRP 発現時に Derlin-1 を過剰発現させると，N596Q BCRP 発現量の顕著な減少が確認された．また， N596Q BCRP の発現は，ERAD 関連タンパク質分解阻害剤 MG-132 処理および Derlin-1 のノックダウンにより上昇した．これらの結果により，Derlin-1 が N596Q BCRP に対して ERAD を介した負の発現調節を行う因子であることが明らかになった．最後に，Derlin-1 のノックダウンは Tunicamycin 処理により脱糖鎖状態となった野生型 BCRP の ERAD も抑制したことから，Derlin-1 は BCRP の糖鎖付加状態を認識し，脱糖鎖状態の BCRP 分解を促進する因子であることが示された．

以上，本研究では BCRP の品質管理における Derlin-1 の負の役割を初めて明らかにした．BCRP のタンパク質レベルでの具体的な発現調節因子はこれまでに報告されておらず，今回同定した Derlin-1 の作用は BCRP の糖鎖付加依存的なチェックポイントという，新規の BCRP 発現制御メカニズムに相当すると考えられる．Derlin-1 発現誘導は野生型 BCRP の形質膜上発現を抑制するため， BCRP 活性上昇が問題となる多剤耐性を緩和し得る可能性を秘めている．本知見は今後の BCRP 関連研究の基礎として，様々な BCRP が関与する病理学的，生理学的現象の解明に有益なものとなるだろう．また，今日までに Derlin-1 の糖鎖付加依存的な基質分解制御を示唆する報告は少数であり，本研究は Derlin-1 の新規機能を明確に示したという点からも意義深く，タンパク質品質管理の研

究領域からも大変ユニークな知見であると思われる．

略語表

・本論文では以下の略語を使用する．

ABC : ATP binding cassette

ATP : adenosine 5’-triphosphate

BCRP : breast cancer resistance protein

BFA : breferdin A

CFTR : cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

CHX : cycloheximide

COP2 : coat protein complex 2

DMEM : Dulbecco’s modified Eagle Medium

DNA : deoxyribonucleic acid

ER : endoplasmic reticulum

FBS : fetal bovine serum

GFP : green fluorescent protein

HEK : human embryonic kidney

IgG : immunogloburin G

mRNA : messenger ribonucleic acid

MEM : minimum essential medium

MSD : membrane spanning domain

NBD : nucleotide binding domain

PAGE : polyacrylamide gel electrophoresis

PBS : phosphate buffered saline

PBS (-) : Ca2+, Mg2+ free phosphate buffered saline

PVDF : polyvinylidene difluoride

SDS : sodium dodecyl sulfate

siRNA : small interfering ribonucleic acid

SNPs : single nucleotide polymorphisms

本論文は，学術雑誌に掲載された以下の論文を基礎とするものである．

Posttranslational negative regulation of glycosylated and non-glycosylated BCRP

expression by Derlin-1

Takashi Sugiyama1, Tsuyoshi Shuto1, Shingo Suzuki1, Takashi Sato, Tomoaki Koga,

Mary Ann Suico, Hiroyuki Kusuhara, Yuichi Sugiyama, Douglas M. Cyr, Hirofumi Kai

Published in the Biochemical and Biophysical Research Communications, in press, 2010

December 8 accepted.

( 1 ; these authors contributed equally to this work. )

目次

第１章 緒論.....................................................................................................................1 第２章 実験成績 ...............................................................................................................10 第１節 BCRP の品質管理に関与する因子の模索 ......................................................... 10 第１項 BCRP 発現パターンの解析 ...........................................................................10 第２項 各種 E3 ユビキチンリガーゼ過剰発現に伴う BCRP 発現変化 ...................13 第３項 Derlin-1 過剰発現に伴う BCRP 発現変化 ....................................................15 第２節 Derlin-1 の野生型 BCRP 発現に対する影響 ....................................................16 第１項 Derlin-1 過剰発現時における野生型 BCRP 発現パターンの解析.................16 第２項 野生型 BCRP の ER-Golgi 輸送に対する Derlin-1 過剰発現の影響............18 第３項 Derlin-1 過剰発現に伴う GFP 標識 BCRP の局在変化................................20 第４項 Derlin-1 と野生型 BCRP の相互作用............................................................21 第５項 Derlin-1 が野生型 BCRP の分解に及ぼす影響 .............................................22 第６項 ヒト乳癌細胞 MCF-7 における Derlin-1 遺伝子導入の影響 ........................24 第７項 小括 ...............................................................................................................25 第３節 Derlin-1 の N596Q BCRP 発現に対する影響....................................................26 第１項 N596Q BCRP の分解における proteasome の寄与 ........................................26 第２項 N596Q BCRP に対する Derlin-1 ノックダウンの影響 ..................................27 第３項 Derlin-1 が N596Q BCRP の安定性に及ぼす影響 .........................................28 第４項 小括 ...............................................................................................................29

第４節 Tunicamycin による野生型 BCRP 安定性低下と Derlin-1 の関連性 ................30 第１項 Tunicamycin が野生型 BCRP 発現に及ぼす影響 ..........................................30 第２項 Tunicamycin 誘導性の野生型 BCRP 分解メカニズム ...................................32 第３項 Tunicamycin による野生型 BCRP の ERAD促進と Derlin-1 .......................33 第４項 小括 ...............................................................................................................35

第３章 考察 ......................................................................................................................36 第４章 総括 ......................................................................................................................43 第５章 実験の部 ...............................................................................................................46 第１節 実験材料 ...........................................................................................................46 第１項 試薬 ...............................................................................................................46 第２項 細胞株 ...........................................................................................................46 第３項 プラスミド DNA...........................................................................................47 第４項 mutagenesis ....................................................................................................47 第５項 プライマー ....................................................................................................48 第２節 細胞の培養法 ....................................................................................................48

第１項 培養液 ...........................................................................................................48 第２項 細胞培養法 ....................................................................................................48 第３節 siRNA 法...........................................................................................................49 第４節 遺伝子導入法 ....................................................................................................49 第５節 Western Blotting 法 ............................................................................................50 第６節 免疫沈降法 ........................................................................................................51 第７節 免疫蛍光染色法.................................................................................................51 謝辞 .................................................................................................................................... 53 参考文献 .............................................................................................................................55

第１章 緒論

ABC (ATP Binding-Cassette) トランスポーターは 1 機能分子中に複数の膜貫

通ドメイン (MSD : Membrane Spanning Domain) と，ヌクレオチド結合ドメイン

(NBD : Nucleotide Binding Domain) を持つ膜タンパク質の総称であり，現在７

種類のサブファミリーに分類されている．ABC トランスポーターの NBD には，

Walker A motif ，Walker B motif ，それぞれの ABC トランスポーターに特異的

な signature motif が保存されており，ヌクレオチドとの結合および加水分解に

よって機能することが知られている．ABC トランスポーターは ATP のエネル

ギーを利用してイオン，糖，アミノ酸，ビタミン，ペプチド，ポリサッカライ

ド，ホルモン，脂質，生体異物などを細胞内外に輸送する．その結果として，

浸透圧の調節，栄養素の取り込み，生体異物に対する防御，脂質の輸送，細胞

分裂，幹細胞の発達，自然免疫誘導などの様々な生命反応が誘導される 1．

BCRP (Breast cancer resistance protein) は抗癌剤耐性ヒト乳癌細胞である

MCF-7/AdrVp 細胞に発現する ABC トランスポーターの一種として同定され，

ABCG2 として G subfamily に分類されている (Table 1)．

Table 1. Members of ABCG subfamily.

ABCG subfamily Chromosome Tissue Function

ABCG1 21q22.3 Brain, Spleen, Lung Macrophage Cholesterol efflux

ABCG2 4q22 Kidney, Placenta, Breast, Liver, Intestine, Brain

Xenobiotics efflux uric acid efflux folate efflux vitamin efflux

ABCG4 11q23 Brain, Eye, Spleen ?

ABCG5 2q21 Liver, Small intestine

Sterol efflux

ABCG8 2q21 Liver, Small intestine

Sterol efflux

1

BCCRP は N 末端に 1 箇所の NNBD (Nucleeotide Binding Domain n) を，C 末末端に

6 箇箇所の TMDD (Trans MMembrane DDomain) かから成る MMSD を持つつハーフトトラン

スポポーターの一一種であり (Figure 1)) 2 ，ホモダダイマー或或いはホモオオリゴマーーを形

成すすることによよって機能能を獲得するる分子でああると考えらられているる．また， BBCRP

は NN 型糖鎖付付加を受けるタンパクク質であることが知らられており， 596 番目のア

スパパラギン残基基に糖鎖付付加部位を有有することが報告されれている 3--5．

Figuure 1. Struucture of BBCRP BCRRP has a nuccleotide binnding domaain (NBD) aat its N-termminus, and has a membbrane spannning doma in (MSD) consisted ffrom six trransmembraane domainns (TMD) at its C-terrminus. Onee putative gglycosylationn site is knoown to be loocated at N5596.

2

BCRP は生理的条件下において，腎臓，腸管，肝臓などに発現している 6,7．

BCRP が輸送を行う基質としては種々の細胞障害性物質が知られており，なか

でもメトトレキサート・ドキソルビシン・ミトキサントロン等の抗癌剤が特に

有名である．本来， BCRP は細胞に侵入した細胞障害性毒素を細胞外に排出す

るポンプとしての役割を担っているが 8，前述した抗癌剤のような薬物の排出

に関しては，細胞内濃度を低下させることで効果を減弱させてしまうという側

面も併せ持つ 9-12．このため，BCRP は薬物治療の観点からは問題視されるこ

とも多い．特に幾種類かの癌細胞株においては BCRP の過剰発現が起こって

おり，BCRP の基質である抗癌剤への感受性が著しく低下していることが報告

されている 13-15．したがって，今日では，BCRP は癌細胞における多剤耐性獲

得の一因を担う分子であると認識され，効率的な化学療法のための標的分子と

捉えられている．

Table 2. Known BCRP substrates used for the drug therapies.

Drugs Main indications

Daunomycin

9-Aminocamptothecin

Doxorubicin

Irinotecan

Topotecan

SN-38

Methotrexate

Mitoxantrone

Lamivudine

ZIdovudine

Leukemia

Leukemia

Hodgkin's disease, Lung carcinoma

Colonectal carcinoma, Lung carcinoma

Lung carcinoma

Colonectal carcinoma

Leukemia, Hodgkin's disease

Leukemia

Type B hepatitis, HIV infection

HIV infection

3

薬薬物排出ポンンプとしてての機能以外外にも，BBCRP はさまざまな生生体内必須須成分

の輸輸送に関与ししているこことが報告されているる．ノックアウトマウウスを用いいた研

究かから，BCRPP はポルフフィリン，リボフラビビンおよび他のビタミミンの細胞胞内濃

度をを調節していいることがが示された 16．また，尿細管上皮皮細胞におおける BCRRP は

尿酸酸トランスポポーターととして機能しているこことも示され，血中かから尿中へへの尿

酸排排出に必須のの分子でああることが明明らかにななった 17．関関連して，特特定の BCRRP 遺

伝子子変異（Q1441K）が高高尿酸血症患患者に一定定の割合で存在するこことも報告告され

ていいる 18．Q1411K 以外にも尿酸輸送送不全を呈呈する BCRRP 遺伝子変変異の存在在が多

数確確認されておおり（Tablee 3）18，BCCRP は高尿尿酸血症のの原因遺伝子子として認認識さ

れつつつある．ささらに BCRRP が葉酸酸の細胞内濃濃度調節にに重要な役割割を担うこことも

報告告され，細胞胞内の葉酸酸が欠乏したた際に BCRP の局在在が変化し，膜上発現現量が

減少少することでで細胞外へへの葉酸排出出を抑えてていることもも明らかにになっているる 19．

Tablle 3. Nonssynonymouus mutationns in BCRRP found by mutationn analysis of 90 hypeeruricemia patients.18

このように，薬物排出出トランスポポーターととして，あるいは生体体内必須成成分の

トラランスポーターとしてて BCRP の生理的なな重要性がが認識されれるにつれれて，

BCRRP に関するる様々な検検討が行われれるようにになってきてている．特特に BCRP の発

現調調節メカニズズムの解明明は，過不足足なく調節節されるべきき BCRP のの機能といいう観

点かからも非常にに重要でああると考えられる．一一般的なタンパク質のの発現調節節は，

DNAA から mRRNA が転写写される段段階（mRNAA レベル）と mRNAA が翻訳さされて

様々な翻訳後修修飾を受けける段階（タタンパク質質レベル）の 2 段階階に大別されれる．

BCRRP に関してては，機能能不全を示示すような変異型におおいても野野生型と同同等の

mRNNA 量を発現しているることが報報告されておおり 20，タンパク質レレベルでのの発現

調節節が BCRP の機能に直直接的な影影響を与えてていることが示唆されれている 211．

4

BCCRP をはじめとするる膜タンパパク質は，mmRNA から翻訳されれた後に小小胞体

（ERR）においてフォールルディンググを受ける．適切にフォールディィングされれたタ

ンパパク質はゴルルジ体（Goolgi）を経経由して形質質膜上に到到達し，個々々の機能をを発現

する．しかしなながら，遺遺伝子変異やや転写・翻翻訳のミスが発生したた場合，ここれら

のタンパク質はは適切なフフォールディングを受受けることができず，ミスフォォール

ドタンパク質ととして ER に蓄積した後に prooteasome でで分解を受受ける．このの ER

を中中心とした一一連のメカカニズムはタンパク質質の品質管理と呼ばれれ，タンパパク質

の運運命決定に極極めて重要要な経路である．特ににミスフォールドタンンパク質がが ER

からら細胞質に引き抜かれれて proteeasome で分分解されるることを小小胞体関連連分解

（ERR-associatedd degradatioon ; ERADD）と称し，品質管理理における重重要な局面面とみ

なされる（ Figuure 2）22 ．

Figuure 2. ER--associatedd degradatioon. 22

5

ERRAD は大きく分けてて 3 段階ののステップを踏むと考考えられている（ Figuure 3） 23．第第 1 段階として，基基質のフォールディンング異常が何らかのチチェックポポイン

トににより認識さされる．続いて第 2 段段階としてて translocoon と呼ばれれる小孔をを通し

て基基質が ER から細胞質質へ引き抜抜かれる（逆逆輸送； reetrotransloccation）．ささらに

第 33 段階としして基質特異異的な E33 ユビキチチンリガーゼゼによるユユビキチンン化が

起こり，このユユビキチン付加によっって基質は proteasomme におけるる分解を受受ける．

基質質のフォールルディンググ異常を認認識する因因子としてはは Heat shhock proteiin 70

（HSSP70）のよような様々なな分子シャャペロンが知知られておおり，基質のの逆輸送にに関し

てはは ER 膜タンパク質でである Derrlin-1 や，それと協調調して ERR からの引引き抜

きをを行う p97, VIMP 等のの補因子がが関与するこことが報告告されているる 24,25．

Figuure 3. A sttep-by-stepp illustratio n of ERADD. 23

6

BCCRP の品質管理に関関するこれれまでの知知見をまととめて，以以下の図に示す

（Figgure 4）．

Figuure 4. Knoown BCRPP quality control pathwways.

mRRNA かららの翻訳後後に ER でで適切なフフォールデディングをを受けた野生型

BCRRP は ER-GGolgi 間の輸送を経てて形質膜上上に発現したた後，エンドドサイトーーシス

により細胞内にに取り込ままれる．更にに初期～後後期エンドソームを経経由してリソソ

ームムにおける分分解を受けけるのが野生生型 BCRPP の主要なな分解経路でであり，EERAD

の影影響は受けにくいとされる 26．．一方，いいくつかのの BCRP siingle nucleeotide

polymmorphisms （SNPs）においてはは，翻訳後後のフォールディンググが適切にに行わ

れずず，proteasoome におけける分解の影響を強くく受ける（（Q141K，FF208S，S441N，

N5966Q 等）26-228．結果的に，Golgi または形質質膜上に輸輸送される量量が減少すするこ

とかから，変異型型 BCRP はは機能不全全を引き起ここすとされれている．ここのようにに，野

生型型および変異異型 BCRPP は品質管管理においててそれぞれれ異なった挙挙動を示すす．よ

ってて，野生型とと変異型をを認識し，BBCRP の品品質管理に異なる影響響を与えるるよう

な，何らかのチチェックポポイント（FFigure 3, steep 1）が ER に存在ししているこことが

示唆唆される 21．

7

このチェッククポイントトの概念に関関連して，興味深い報告がなさされているる．糖

鎖付付加阻害剤 Tunicamyccin を処理した野生型型 BCRP ，および NN 型糖鎖付付加部

位をを変異させたた N596Q BBCRP は EERAD の影影響を強く受ける，とというもののであ

る 277．タンパクク質への最初初の糖鎖付付加は ER で起こるこことから， BCRP 特特異的

な糖糖鎖付加を参参照する選選別メカニズズムが ERR に存在すする可能性はは高い．ままた，

本来来は ERAD に対する抵抵抗性が非非常に高い野生型 BCCRP が脱糖糖鎖を受けけると

ERAAD 感受性にになるといいう点においいても，糖糖鎖付加状態態が BCRPP 品質管理理のチ

ェックポイントの一端でであることがが予想されれる（Figuree 5）．しかしながら，糖鎖

付加加依存的な BCRP チェックポイイントといいう観点からの検討はは未だなされて

おらず，関連すする詳細なな分子メカニニズムも不不明である．

Figuure 5. Possible mechanism for gglycosylatioon-dependeent BCRP ccheckpointt.

8

このような背景の中，本研究では，糖鎖付加状態が BCRP の品質管理におけ

るチェックポイントのひとつであるという仮説に基づき，野生型と糖鎖付加不

全変異型（ N596Q） BCRP を用いて，これらの品質管理に関与する因子を模索

した．複数の E3 ユビキチンリガーゼや ERAD 補因子を用いたスクリーニング

の結果，ER 膜タンパク質である Derlin-1 29 が野生型 BCRP に対しては ER

retention 作用を，N596Q BCRP に対しては ERAD 誘導作用を示すことを見出

した．Derlin-1 が BCRP の糖鎖付加状態，および変異の有無に対応して異なる

挙動を示したことから，Derlin-1 は BCRP の品質管理の一端を担う分子である

可能性が示された．

以下，得られた知見を詳述する．

9

第２章 実験成績

第１節 BCRP の品質管理に関与する因子の模索

BCRP の品質管理において，野生型と変異型を区別するメカニズムが ERAD

を含むその後のタンパク質運命を決定していることが予想されるが，このメカ

ニズムに関与する因子は不明である．本節では，野生型および変異型（ N596Q）

BCRP に対する各種 ERAD 関連因子の作用を確認することによって，実際に

BCRP の品質管理に関与している分子を模索した．検討に際しては BCRP 同様

の ABC トランスポーターである CFTR （ABCC7）の E3 ユビキチンリガーゼ

として知られる gp78，CHIP，Rma1 と，30,31 ER 膜タンパク質である Derlin-1 29

を候補分子として用いた．

第１項 BCRP 発現パターンの解析

まず，本研究で用いる実験系において，BCRP がどのような発現パターンを

示すか確認した．HEK293 細胞に野生型 BCRP を遺伝子導入し，Western Blotting

により発現を確認したところ，81kDa 付近に 1 本，72kDa 付近に 2 本，計 3 本

のバンドが出現した（ Figure 6, Lane 1）．これらのバンド反映する BCRP の状態

を明らかにするため，エンドグリコシダーゼである EndoH および PNGaseF を

用いて検討を行った．野生型 BCRP を発現させた HEK293 細胞のライセート

に EndoH を処理したところ，72kDa 付近に存在した 2 本のバンドのうち，上

方に出現していたバンドが下方のバンドへとシフトすることが確認された．

EndoH は ER に存在するタンパク質糖鎖の切断を行う酵素であることから，

72kDa 付近上方のバンドが ER に存在する糖鎖付加体（Simply-Glycosylated

form ; S-G form）であり，下方のバンドが糖鎖付加を受けていない（Non-

Glycosylated form ; Non-G form）BCRP であることが示された（Figure 6, Lane 2）．

また，PNGaseF を処理した結果，81kDa 付近のバンドおよび 72kDa 付近の上

方のバンドが，全て 72kDa 付近下方のバンドにシフトした（Figure 6, Lane 3）．

これにより 81kDa のバンドが Golgi 以降に存在する，成熟型の糖鎖付加体

（Complex-Glycosylated form ; C-G form）であることが示された．

10

Figuure 6. Exppression proofile of wildd type BCRRP. HEKK293 cells wwere transiently transffected withh 2μg of wild type BCCRP. Cells were recovvered 48 h after transffection and lysed in RIIPA buffer. CCell lysatess were denaatured and ddigested wiith Endo H (500 U) or PNGase F (500 U) annd subjectedd to SDS-PAAGE. C-G indicates complex-gglycosylatedd form off BCRP, SS-G and NNon-G inddicate simpply-glycosyllated form aand non-glyycosylated foform of BCRRP, respectivvely.

11

さらに， N596Q BCRP に関してもも同様に，発発現プロフファイルの同同定を行っった．

N5996Q BCRPP を HEK293 細胞にに発現させせたところろ，過去のの報告と同様に

72kkDa 付近にに単一のババンドが出出現した 227．このババンドは EndoH および

PNGGaseF の双双方に対して抵抗性でであったことから，糖糖鎖付加を受受けていなない状

態でで適切に発発現しているることが確確認された（ Figure 7）．

Figuure 7. Exppression proofile of N5996Q mutannt BCRP. HEKK293 cells were transsiently transsfected withh 2mg of NN596Q mutaant BCRP. Cells

weree recoveredd 48 h afterr transfectioon and lyssed in RIPAA buffer. CCell lysates were denaatured and ddigested wiith Endo HH (500 U) orr PNGase FF (500 U) aand subjectted to SDS--PAGE. Noon-G indicattes non-glyccosylated foorm of BCRRP.

12

第２項 各種 E3 ユビキチンリガーゼ過剰発現に伴う BCRP 発現変化

BCRP の品質管理に関与する分子を模索するために，同様に ABC トランスポ

ーターである CFTR の ERAD に関与する E3 ユビキチンリガーゼを候補分子

として選択した．HEK293 細胞に野生型および N596Q BCRP と E3 ユビキチン

リガーゼ群を共過剰発現させ，BCRP 発現に変化が見られるか否かを検討した．

E3 ユビキチンリガーゼ群の作用を検討するにあたって．それぞれの

dominant-negative 変異体を同時に過剰発現させ，機能の特異性を確認するもの

とした．結果として，野生型 BCRP に関しては，E3 ユビキチンリガーゼ群お

よび dominant-negative 体の過剰発現を行っても明確な発現量変化は認められ

なかった（ Figure 8A-C, Lane 1-3）．これは野生型 BCRP が ERAD の影響を受け

にくいという過去の報告 26 とよく一致した結果であると言える．N596Q BCRP

に関しては，Rma1 の導入によって僅かな BCRP 発現量の減少が確認された

（Figure 8B, Lane 5）．更に，この発現量減少効果は dominant-negative 体である

C42S Rma1 によっては認められていなかったことから， Rma1 の E3 ユビキチ

ンリガーゼ活性に由来していることが示唆された（Figure 8B, Lane 6）． N596Q

BCRP は ERAD の影響を受けることが報告されていることから 27，N596Q

BCRP の分解に E3 ユビキチンリガーゼである Rma1 が一部関与している可能

性が示された．

13

Figuure 8. Thhe effect oof ER-locallized E3 uubiquitin lligases on the expreession profifiles of wild type and NN596Q BCRRP. Wildd type or N5596Q BCRP-transfecteed HEK2933 cells weree co-transfeected with eempty vectoors or expreession vectoors that encoode either wwild type or dominant-nnegative muutants of MMyc-tagged ggp78 (A), FFlag-taggedd Rma1 (B) , or Myc-taagged CHIPP (C). Cells were lysedd in RIPA bbuffer 48 h aafter transfeection. Cell lysates were subjectedd to SDS-PAAGE, blotteed to PVDFF membranee, and visuaalized with iindicated anntibodies. AActin was ussed as internnal control.

14

r

第第３項 DDerlin-1 過剰剰発現に伴伴う BCRP 発現変化

前項項で検討しした各種 EE3 ユビキチンリガーーゼ群と同同様に，膜膜タンパク質の

ERAAD 関連因子として報報告されてている 25 DDerlin-1 に関しても検検討を行った．

HEKK293 細胞にに野生型おおよび N596Q BCRP と Derlin--1 を遺伝子子導入したたとこ

ろ，興味深いこことに，野野生型と NN596Q の双双方において異なる発発現パターーン変

化がが確認されたた．野生型 BCRP におおいては 881kDa 付近近のバンド（恐らくは C-G

formm）の減少とと 72kDa付付近上方のババンド（恐恐らくは S-G form）のの増加が同同時に

起こっており， BCRP のの発現プロファイルにに何らかの変化がもたたらされたたこと

が示示唆された（ Figure 9AA）．また， NN596Q BCCRP に対ししては，そのの発現量がが著し

く低低下するといいう結果をを得た（Figgure 9B）． Derlin-1 のの導入が BBCRP 発現現に与

えたた影響は，本本節第２項項において Rma1 が N596Q BCCRP に与ええていた影影響と

比較較しても非常常に明瞭ななものでありり，Derlin--1 と BCRRP の間に何何らかの機機能的

関連連性が存在すする可能性性が強く示さされた．更更に Derlin--1 の導入にによって野野生型

およよび N596QQ BCRP がが異なる発発現パターン変化を示示したといいう結果かから，

Derliin-1 が BCCRP の品質質管理におおいて野生型型と変異型型を区別するるチェックポイ

ントの一端を担担う分子でである可能性性が示されれた．

Figuure 9. Deerlin-1 chaanges the eexpression pattern oof wild typpe and N5596Q BCRRPs. HEKK293 cells wwere transieently transffected with HA-taggedd Derlin-1 aand wild tyype or N5966Q BCRP. Cells were recovered 48 h after transfectionn and lysedd in RIPA bbuffer. Cell lysates werre subjectedd to SDS-PAAGE, blotteed to PVDFF membranee, and visuaalized

with indicated aantibodies. AActin was ussed as internal control.

15

第２節 Derlin-1 の野生型 BCRP 発現に対する影響

本章第１節において，Derlin-1 が野生型 BCRP の発現パターンを変化させる

という結果が得られた．本節においてはこの発現パターン変化の意義を明確な

ものとするため，種々の詳細な検討を行った．

第１項 Derlin-1 過剰発現時における野生型 BCRP 発現パターンの解析

野生型 BCRP と Derlin-1 を共過剰発現させたことによる BCRP 発現変化に

関して，BCRP の発現プロファイルがどのように変化しているのかを，エンド

グリコシダーゼ処理により改めて確認した．Derlin-1 の導入によって発現量が

増加していたバンド（ Figure 9A, Derlin-1 transfected）は 72kDa 付近に存在する

2 本のバンドの上方のもの（Figure 6, Lane 1）とサイズが同じであり．恐らく

は S-G form であると思われた．この予想通り，EndoH 処理によって 72kDa 下

方のバンドへのシフトダウンが見られたため，Derlin-1 過剰発現により増加し

たバンドは ER に局在する BCRP の S-G form であることが確認された

（Figure 10, Lane 1 and 2）．また，Derlin-1 導入により発現量が減少していたバ

ンド（Figure 9A, Derlin-1 transfected）は EndoH に耐性，PNGaseF に感受性の

性質を持っていたことから，Golgi 以降に存在する，成熟型の C-G form BCRP

であることが確認された（ Figure 10, Lane 1 and 3）．したがって，過剰発現した

Derlin-1 は野生型 BCRP を ER に強制的に留める，ER retention 作用を有して

いることが示唆された．

16

Figuure 10. Deerlin-1 increases simplly-glycosyllated form of wild typpe BCRP. HEKK293 cells were transsiently trannsfected wiith wild tyype BCRP and HA-taagged Derliin-1. Cells were recovvered 48 h after transffection and lysed in RRIPA buffer . Cell lysattes were deenatured andd digested with Endo H (500 U) or PNGasee F (500 UU) and subjeected to SD S-PAGE.

17

第２項 野生型 BCRP の ER-Golgi 輸送に対する Derlin-1 過剰発現の影

響

続いて，Derlin-1 が野生型 BCRP の ER retention を起こすという可能性につ

いて検討するため，ER-Golgi transport 阻害剤である BreferdinA （BFA）32を用

いた実験を行った．野生型 BCRP を発現させた HEK293 細胞に BFA を処理す

ることで，S-G form BCRP の蓄積が確認された（Figure 11A, Lane 1）．続いて BFA

を washout すると，Golgi への輸送が再開されたことによって，この S-G form

BCRP は経時的に C-G form BCRP へとシフトした（Figure 11A, Lane 2 and 3）．

興味深いことに，BFA washout chase を Derlin-1 導入条件下で行った際には，

S-G form から C-G form への移行がほとんど起こっていなかった（Figure 11A,

Lane 4-6）．更に，以下の数式で maturation ratio を算出し，BFA washout 後の

ER-Golgi 輸送の度合いを数値化した．“ Maturation ratio =（C-G form のバンド強

度）／（ C-G form のバンド強度 ＋ S-G form のバンド強度）”．この Maturation

ratio をグラフ化すると，Derlin-1 存在下では BCRP の ER-Golgi 輸送に伴う

maturation が有意に阻害されていることが明らかになった（Figure 11B）．

18

Figuure 11. Deerlin-1 inhibbits ER-Goolgi export of wild typpe BCRP. (A) HHEK293 ceells were traansiently traansfected wwith HA-taggged Derlin--1 and wildd type BCRRP. BreferdiinA (BFA) containing media wass added 39 h after traansfection ((Final conc ; 5mg/mLL). Six hourrs after BFAA treatmentt, media waas refreshedd and cells were harveested 0, 900, and 1800 min afterr BFA wasshout Cell lysates weere subjecteed to SDS--PAGE, blootted to PVVDF membbrane, and visualized with indiccated antiboodies. Actinn was used as internal control. (BB) Band inteensities were measuredd by using IImage Gaugge softwaree and relattive maturaation ratio was expreesse as (inntensity of C-G formm)/(intensity of Nonn-G form + intensity of CC-G form).. *P<0.055 vs. pcDNNA3.1-transsfected cellss (n=3). Errror bars show SEM.

19

第第３項 DDerlin-1 過剰剰発現に伴伴う GFP 標標識 BCRPP の局在変変化

Deerlin-1 導入入による BBCRP の EER retentionn を視覚化化するため，GFP 標識識され

た野野生型 BCRP を用いいた実験をを行った．HeLa 細胞胞に BCRRP-GFP および

Derliin-1 を発現現させたところ， HEKK293 細胞胞における検検討時と同同様に，Derlin-1

の導導入に伴ってて S-G formm と思われれるバンドの増加が見見られた（ FFigure 12A）．こ

の条条件下においいて免疫蛍蛍光染色を行行ったとこころ，BCRPP-GFP は定定常状態ににおい

てはは形質膜付近近に広く局局在していたたが（Figuure 12B, uppper panels），，Derlin-1 の導

入にによって ERR マーカーーである KKDEL と類類似の局在パターンにに変化してていた

（Figgure 12B, loower panelss）．したがって， Derllin-1 が BCCRP の ERR-Golgi 輸輸送を

阻害害し，ER rettention を起起こさせるる因子であるることが確確認された．．

Figuure 12. Deerlin-1 induuces ER rettention of GGFP-taggedd wild typee BCRP. (A) HeLa cellss were trannsiently trannsfected wiith GFP-taggged wild type BCRPP and HA-ttagged Derrlin-1. Cellss were recoovered 48 h after trannsfection CCell lysates were subjeected to SDDS-PAGE, bblotted to PPVDF memmbrane, andd visualizedd with indiicated antibbodies. Actiin was usedd as internaal control. (B) HeLa cells were transfectedd with GFP--tagged wiild type BBCRP and HA-taggeed Derlin-11. Forty-eigght hours after transsfection, cellls were fixxed and loccalization oof BCRP wwas determinned by connfocal laserr scanning microscoppy. To vissualize ERR, immunoffluorescence analysis was perfoormed with anti-KDELL antibody.

20

第第４項 DDerlin-1 と野野生型 BCCRP の相互互作用

さらに，野生生型 BCRP と Derlinn-1 の相互作作用を確認認するために，免疫沈沈降法

を用用いた検討をを行った．HEK293 細細胞に BCCRP-GFP とと Derlin-11 を共過剰剰発現

させせ，GFP 抗抗体によるる免疫沈降降を行ったたところ，外来性のの Derlin--1 と

BCRRP-GFP とのの結合が確確認された（ Figure 13, middle ppanel, Lanee 2）．内因因性の

Derliin-1 と野生生型 BCRPP との結合合は確認されれなかったた（Figure 113, lower ppanel,

Lanee 1 and 2）こことから，Derlin-1 はは発現上昇昇時にのみ野野生型 BCRRP と直接接的に

相互互作用するとという可能能性が示されれた．

Figuure 13. Deerlin-1 interracts with wwild type BBCRP whenn overexpreessed. (A) HeLa cellss were trannsiently trannsfected wiith GFP-taggged wild type BCRPP and HA-ttagged Derrlin-1. Cellss were recoovered 48 h after trannsfection CCell lysates were subjeected to SDDS-PAGE, bblotted to PPVDF memmbrane, andd visualizedd with indiicated antibbodies. Actiin was usedd as internaal control. (B) HeLa cells were transfectedd with GFP--tagged wiild type BBCRP and HA-taggeed Derlin-11. Forty-eigght hours after transsfection, cellls were fixxed and loccalization oof BCRP wwas determinned by connfocal laserr scanning microscoppy. To vissualize ERR, immunoffluorescence analysis was perfoormed with anti-KDELL antibody.

21

第第５項 DDerlin-1 が野野生型 BCCRP の分解解に及ぼす影影響

続続いて，Derrlin-1 の導導入が野生型型 BCRP のの分解にも影響を及ぼぼしているるか否

かをを確認した． HEK2933 細胞に野野生型 BCRRP と Derlin-1 を遺遺伝子導入入し，

Derliin-1 の有無無によって安定性が変変化するかか否かを，タンパク質合合成阻害剤剤であ

る CCycloheximmide （CHXX）を用いてて検討したた．CHX 存存在下で経時時的にタンンパク

質をを回収し，残残留した BBCRP タンンパク質発現量を確認認したところ， Derlin--1 導

入のの有無にかかかわらず，野生型 BCCRP 全タンンパク質のの発現減衰率率に変化はは見ら

れななかった（ FFigure 14）．これにより， Derlin--1 は野生型型 BCRP のの分解にはは影響

を及及ぼしていなないことがが示唆されたた．

Figuure 14. Deerlin-1 doess not affect wild type BBCRP stabbility. (A) HHEK293 ceells were traansiently traansfected wwith HA-taggged Derlin--1 and wildd type BCRRP or pcDNNA3.1 emptyy vector. Cyyclohiximidde (CHX)-containing mmedia was aadded 24 h after transffection (Finnal conc ; 500mM). Cellls were harvvested 0, 122, and 24 hh after CHXX treatment. Cell lysatees were subjjected to SDDS-PAGE, bblotted to PVVDF membbrane, and vvisualized wwith indicatted antibod dies. Actin wwas used ass internal coontrol. (B) Band intennsity of PNGGaseF-digested BCRPPs were meaasured to exxpress totall BCRP ammounts (n=3). Error barrs show SEMM.

22

r

f

さらに， siRNNA を用いいた Derlin--1 ノックダダウン実験験を行った．HEK293 細胞

に野野生型 BCRRP と Derlin-1 特異的的な siRNAA を遺伝子子導入し，定定常状態ににおけ

る BBCRP 発現現量を確認しした．そのの結果，Derrlin-1 をノックダウンンしても野野生型

BCRRP の発現にに顕著な変変化は見られれず（Figurre 15），Derrlin-1 は野野生型 BCRRP の

分解解に関与しなないことがが改めて確認認された．

Figuure 15. KKnockdownn of Derliin-1 showss little effect on wiild type BBCRP exprression. HEKK293 cells wwere transieently transfeected with 2mg of willd type BCRRP and 50nnM of Derliin-1 specifiic siRNA orr GL2 siRNNA. Cells wwere harvessted 48 h affter transfection. Cell lysates werre subjectedd to SDS-PAAGE, blotteed to PVDFF membranee, and visuaalized with indicated aantibodies. AActin was ussed as internal control.

23

第 6項 ヒト乳癌細胞 MCF-7における Derlin-l遺伝子導入の影響

Derlin-lによる ERretention作用が内在性の野生型 BCRPを高発現する細

胞においても起とり得るか否かを，ヒト乳癌由来の細胞株である MCF-7細胞

において検討した. MCF-7細胞に Derlin-lを過剰発現し，野生型 BCRPの発

現に変化が見られるかを確認したところ，わずかながら Derlin-l導入量依存的

な S-Gforrnの出現がみられた (Figure16A) .更に， MCF-7細胞に野生型 BCRP

を過剰発現することで，細胞中の BCRP発現量をさらに増加させた上で

Derlin-lの影響を確認した.その結果， MCF-7細胞に過剰発現させた野生型

BCRPおいても S-Gformの発現増加がみられた (Figure16B)、ことにより，

Derlin・1による ERretentionが起こっている可能性が示された.

A

!日山1陥 eI 0 0.5

81一 |

α-BCRP 72 I

IkDa)l

1.5

I4CG -司 S-G、Non-G

α仕圃口De肝刷rl巾l1向即叫喝 一"叫酬蜘晴…" 1、Endo・Derli

‘ α-acnn L斗 ぃぺ.町H …一日

B

+

α・HA

α-actin F戸町~íi，

Figure 16. Derlin-l induces ER retention ofBCRP in MCF圃 7cells.

+

+

C-G

S~G

(A，B) MCF-7 cells were transiently transfected with HA-tagged Derlin-l alone (A)， or

additional wild type BCRP (B). Cells were recovered 48 h a丘町transfectionand lysed in

RIPA buffer. Cell lysates were subjected to SDS-PAGE， blotted to PVDF membrane

and visualized with indicated antibodies. Actin was used as internal control.

24

第 7項小括

本節においては， 本章第 1節で見出した， Derlin-l過剰発現が野生型 BCRP

の発現を変化させるという現象 (Pigure9A)に基づいて，その意義を明らかに

すべく検討を行った.検討の結果， Der1in-l過剰発現によって変化した野生型

BCRPのバンドパターンは， Derlin-lによる BCRPの ERretentionを反映して

いたことが明らかになった (Pigure11 and 12) .更に， Derlin-1と野生型 BCRPの

結合が確認されたことにより， Derlin-1は野生型 BCRPと直接的に相互作用す

ることが示唆された CPigure13) .また， Derlin-lによって野生型 BCRPの安定

性は影響を受けておらず (Figure14)， Derlin-lノックダウンを行っても野生型

BCRPの定常状態における発現量には殆ど影響が無かったことから (Figure15) ，

Derlin-1は野生型 BCRPの分解には関与していないことが明らかになった.更

に，内在性の BCRPを発現するヒト乳癌細胞株においても Derlin-l過剰発現に

よって BCRP S-G formバンドの出現が起こっていた (Figure16) .このことか

ら Der1in-lによる野生型 BCRPに対する ERretention作用は生理的条件下に

おいても起こり得ることが示唆された.

25

第3節Derlin-1のN596QBCRP発 現 に 対 す る 影 響

本 章 第1節 に お い て,Derlin-1がN596QBcRPの 発 現 量 を 顕 著 に減 少 させ る

こ と が 見 出 され た.N596QBcRPはERADの 影 響 を 受 け る こ と が 報 告 され て

お り27,Derlin-1に よ るN596Qの 発 現 量 減 少 がERAD促 進 を 反 映 して い る 可

能 性 が 高 い.本 節 に お い て は,Derlin-1がN596QBcRPのERADに 関 与 し て

い る か 否 か を 確 認 す る べ く,各 種 検 討 を 行 っ た.

第1項N596QBCRPの 分 解 に お け るproteasomeの 寄 与

Derlin-1がN596QBCRPのERADに 関 与 す る か 否 か を 検 討 す る に あ た り,

本 研 究 の 実 験 系 に お い て もN596QBCRPがERADの 影 響 を 受 け て い る こ と

を 確 認 した.HEK293細 胞 にN596QBCRPを 遺 伝 子 導 入 し,proteasomeに お け

る タ ン パ ク 質 分 解 を 阻 害 す る33MG-132を 処 理 した と こ ろ,定 常 状 態 に お け る

N596QBCRPの 蓄 積 が み ら れ た(Figure17).こ れ に よ り本 研 究 の 実 験 系 に お い

て も,N596QBcRPはERADの 影 響 を 受 け て い る こ とが 確 認 され た.

N596QBCRP

MG-132-+

7α一BCRP,一 禦 嶋繭麟Non=G

(kDa)

α.Derlin.1Derlin-1

α一actin .知騨 譜騨幽麟〆actin

Figure17.N596QBCRPundergoesproteasome-dependentdegradation.

HEK293cellsweretransientlytransfectedwith2mgofN596QBCRP.Twenty-four

hoursaftertransfection,cellsweretreatedwith5ｵMofMG-132foranother24h.Cell

lysatesweresubjectedtoSDS-PAGE,blottedtoPVDFmembrane,andvisualizedwith

indicatedantibodies.Actinwasusedasinternalconirol.

26

第2項N596QBCRPに 対 す るDerlin-1ノ ック ダ ウ ン の影 響

続 い て,N596QBcRPに 対 す る 内在 性Derlin-1の 役 割 を解 明す る た め に,

Derlin-1特 異 的 なsiRNAを 用 い た ノ ック ダ ウ ン実験 を行 った.HEK293細 胞 に

N596QBCRPとDerlin-1特 異 的 なsiRNAを 遺 伝 子 導 入 し,定 常 状 態 のBCRP

発 現 量 に変 化 が 見 られ る か否 か を確 認 した.そ の結 果,Derlin-1ノ ック ダ ウン に

伴 い,N596QBcRPの 発 現 が 増 加 す る とい う結 果 が得 られ た(Figure18A).ま

た,例 数 を追 加 した 結 果,こ の 発 現 増加 は有 意 で あ っ た(Figure18B).Derlin-1ノ

ック ダ ウ ン に伴 うN596QBCRPの 発 現 増 加 は本 節 第1項 にお いてMG-132を

処 理 した 際 の 実 験 結 果 と類 似 して お り,Derlin-1がN596QBCRPのERADに

関 与 して い る こ とが示 唆 され た.

ABN596QBCRP

N596QBCRPv--

si-De・lin-1―+§ 岳a:

a-BCRP72_礫 麟 ・N。n-G§ 蒼2お

(kDa)σ £2

a-Derlin-1Derlin-1競1藷

ゆ

..1と0.5α一actmactmd

si-Derlin-1-+

Figure18KnockdownofDerlin-1increasesN596QBCRPexpression.

HEK293cellsweretransientlytransfectedwith2mgofN596QBCRPandSOnMof

Derlin-1specificsiRNAorGL2siRNA.Cellswereharvested48haftertransfection.

CelllysatesweresubjectedtoSDS-PAGE,blottedtoPVDFmembrane,andvisualized

withindicatedantibodies.Actinwasusedasinternalcontrol.(B)Bandintensitiesof

BCRPweremeasuredtoexpressrelativequantityofBCRPprotein.*P<0.05vs.siGL2

transfectedcells(n=3).ErrorbarsshowSEM.

27

第3項Derlin-1がN596QBCRPの 安 定 性 に及 ぼす 影 響

Derlin-1がN596QBC.RPのERADに 関与 す る とい う可 能 性 を さ らに 明確 な

もの とす る た め,Derlin-1の 過 剰 発 現 がN596QBCRPの 安 定 性 に及 ぼす 影 響 に

つ い て検 討 を行 っ た.HEK293細 胞 にN596QBCRPとDerlin-1を 共 過 剰 発 現

させ,CHXchaseを 行 っ た(Figure19A).そ の結 果,Derlin-1を 遺 伝 子 導 入 す

る と,chase後6時 間 にお け るN596QBcRPの 残 留 率 が 非 導 入 コ ン トロー ル

群 と 比 較 して 有 意 に 低 下 す る とい う結 果 を得 た(Figure19B).こ れ に よ り

Derlin-1がN596QBCRPの 安 定 性 を低 下 させ て い る こ とが 明 らか に な り,

ERADに お い て 重 要 な役 割 を担 う分 子 で あ る こ とが示 され た.

AB

N596QBCRP・ ・DNA3.1-0--HA -Derlin・9

[pcDNA3.1]HA-D・ ・lin-19175CHXchase(hrs)036036'R_150

72垂 書125α・BCRP… … 一 一 一N・n-G誤 錺100

《kDa)鑓75.

α一D。,lin-1__ぐE.。D。rlin.1Um50

EndoDerlin-15竪250

a-acti,㌔.,.・acti,HO

O36(hrs)

CHXchase

Figure19.Derlin-1decreasesthestabilityofN596QBCRP.

(A)HEK293cellsweretransientlytransfectedwithHA-taggedDerlin-1andN596Q

BCRPorpcDNA3.1emptyvector.Cyclohiximide(CH--containingmediawasadded

42haftertransfection(Finalconc;200mM).CellswereharvestedO,3,and6hafter

CHXtreatment.CelllysatesweresubjectedtoSDS-PAGE,blottedtoPVDFmembrane,

andvisualizedwithindicatedantibodies.Actinwasusedasinternalcontrol.(B)Band

intensityofBCRPsweremeasuredtoexpresstotalBCRPamounts.*P<0.05vs.

pcDNA3.1-transfectedcontrolcells(n=3).EnronbarsshowSEM.

28

第4項 小 括

本 節 に お い て は.本 章 第1節 で 得 られ た結 果 に基 づ く"Derlin-1がN596Q

BCRPのERADに 関 与 す る"と い う仮 説 につ い て検 討 を行 っ た.そ の結 果,

Derlin-1の ノ ッ ク ダ ウ ン がproteasome阻 害 剤MG-132と 同 様 の 効 果 を示 し

(Figure17and18),Derlin-1の 遺 伝 子 導 入 に よ ってN596QBCRPの 安 定 性 が有

意 に低 下 す る とい う結 果 を得 た(Figure19).こ れ らの結 果 はDerlin-1がN596Q

BCRPのERADに 関 与 して い る こ と を強 く示 唆 す る もの で あ り,Derlin-1が

BCRP品 質 管 理 に お け るチ ェ ック ポイ ン トの一 部 で あ る可能 性 が 示 され た.

29

第4節Tunicamycinに よ る野 生 型BCRP安 定性 低 下 とDerlin-1の 関 連性

野 生 型BCRPの 品質 管 理 に そ の 糖 鎖 付 加 状 態 が 重 要 な意 義 を 持 つ こ とを示

す 報 告 と して,糖 鎖 付 加 阻 害 剤 で あ るTunicamycinが 野 生型BCRPの 脱 糖 鎖 を

誘 導 し,ERADに 向 か わせ る こ とが 明 らか に され て い る27.本 章第3節 に て示

した 通 り,Derlin―1は 糖 鎖 付 加 不 全 変 異型 で あ るN596QBcRPのERADを 促

進 す る こ とが 明 らか に な った.そ こ で本 節 にお い て は,Tunicamycinに よ り糖 鎖

付 加 阻 害 を受 け た 野 生 型BCRPのERADとDerlin-1の 関 連 性 につ い て 検 討

を行 っ た.

第1項T㎜icamycinが 野 生 型BCRP発 現 に及 ぼす 影 響

HEK293細 胞 に 野 生 型BCRPを 遺 伝 子 導 入 し,Tunicamycinを 様 々 な濃 度 で

処 理 した と こ ろ,過 去 の報 告 と 同様 に,Tunicamycin濃 度 依 存 的 なC-Gfb㎜ の

減 少 と,そ れ に 伴 うNon-Gfbrmの 出 現 が み られ た(Figure20A).ま た,

Tunicamycinの 処 理 濃 度 が1ｵg/mLの 条 件 の と き,BCRPの 発 現 量 が

Tunicamycin処 理 に伴 っ て 有 意 に減 少 して い る こ と も確 認 され た(Figure20B).

こ の 結 果 は,過 去 の報 告 に も あ る通 り,TunicamycinがBCRPの 脱 糖 鎖 を 起 こ

し,そ の分 解 を促 進 して い る こ とに起 因す る と考 え られ た.

30

ABWTBCRPWTBCRP

躍 誌 藁1羅ll;;1。a-De翻De「lin-1塁 塁"41

侍KDEL照 コ こ 二1躍 £ α誌= -TunicamycinI-+

a・actinactin(1四1mL}

Figure20.TunicamycindecreasestheexpressionofWTBCRP.

(A)HEK293cellsweretransientlytransfbctedwitthwildtypeBCRP.Thirty-twohours

aftertransfection,tunicamycincontainingmediumwereaddedtomakeindicated

concentrations.Cellswereharvested16haftertunicamycintreatment.Celllysateswere

subjectedtoSDS-PAGE,blottedtoPVDFmembrane,andvisualizedwi劜indicated

antibodies.Actinwasusedasinternalcontrol.(B}BandintensityofC-GandNon-G

formBCRPweremeasuredtoexpresstotalBCRPamounts.*P<0.05vs.non-treated

conirolcells(n=3).ErrorbarsshowSEM.

31

第2項Tunicamycin誘 導 性 の野 生 型BCRP分 解 メ カ ニ ズ ム

続 い て,Tunicamycin誘 導 性 の 野 生 型BCRP発 現 量 減 少 が,脱 糖 鎖 に 伴 う

ERAD促 進 に よ る もの で あ る こ とを確 認 す るた め の検 討 を行 っ た.HEK293細

胞 に 野 生 型BCRPを 導 入 し,TunicamycinとMG-132を 併 用 処 理 した と こ ろ,

MG-132に よ るproteasome阻 害 に 伴 って 野 生 型BCRP発 現 減 少 が緩 和 され た

(Figure21).こ の こ とか らTunicamycinに よ る野 生 型BCRPの 発 現 量 減 少 は

ERADに 起 因す る こ とが 確 認 され た.

WTBCRP

Tunicamycin-++

MG-132-一+

81蜘 ぜ趣 ・C-G

α一BCRP72S.G

(kDa)噸 、N・n-G

GRP94

a-KDEL.....,、 一・GRP78

α一actin<actin

Figure21.TunicamycinacceleratesproteasomaldegradationofwildtypeBCRP.

WildtypeBCRP-transfectedHEK293cellsweretreatedwithlmg/mLtunicamycinin

thepressenceorabsenceofMG-132(SmM)for16h.Cellsweresubjectedto

SDS-PAGEandWesternBlotting.Proteinswerevisualizedwithindicatedantibodies.

Actinwasusedasinternalcontrol.

32

第3項Tunicamycinに よ る野 生 型BCRPのERAD促 進 とDerlin-l

Tunicamycinに よ る脱 糖 鎖 を受 け た 野 生 型BCRPはERADに よ り分 解 され

る こ と を本 節 第2項 で 明 らか に した.脱 糖 鎖型 のBCRPがERADを 受 け る と

い う現 象 は 本 章 第3節 で 示 したN596QBCRPに 関 す る知 見 と共 通 して お り,

Tunicamycinに よ り脱 糖 鎖 を受 け たBCRPのERADに 対 して もDerlin-1が 関

与 して い る可 能 性 が示 され た.こ の 可能 性 に つ い て検 討 す るた め,Derlin-1の 特

異 的siRNAを 用 い た ノ ック ダ ウン実 験 を行 っ た.HEK293細 胞 に野 生 型BCRP

を遺 伝 子 導 入 し,Tunicamycinを 処 理 した 条 件 下 に お い てDerlin-1を ノ ッ ク ダ

ウ ン した と ころ,興 味深 い こ とにTunicamycin誘 導 性 のBCRP発 現 量減 少 効 果

が 抑 制 され て い た(Figure22A).さ らに,c-Gfb㎜ とNon-GfbrmのBdRPバ

ン ド強 度 を測 定 してsiDerlin-1の 影 響 を確 認 した と ころ,siDerlin-1導 入 に よ り

有 意 にBCRP発 現 減 少 効 果 が抑 制 され て い る こ と も 明 らか に な っ た(Figure

22B).よ っ て,Derlin-1がTunicamycinに よ って 脱 糖 鎖 を受 け た 野 生 型BCRP

のERADに お い て も必 須 な 因子 で あ る こ とが示 唆 され た.

33

Ag

WTBCRP

Tunicamycin-++WTBCRP

si-Derlin-11-一+ も

=1.6★

81・ 鰯 一 櫛 くC-G言 碧1.4

砕BCRP

{k召。}・ ・{諭G§ ξ 話

α一De,1in.1-一 ・ 一 ・・… ・D・ ・lin-1錫0.6 のca(孚0.4

_,、.,、GRP94醍 。0・2

a-KDELIIO・　・'<GRP78Tunicamycin-++

α.actin_…_..wt':ter..一..sadactinsi-De・li・-1-一+

Figure22.Derlin-1alsofacilitatesERADofnon-glycosylatedformofwildtype

BCRP.

(A)WildtypeBCRP-transfectedHEK293cellswerecotransfectedwithSOnMof

control(一)orDerlin-1-specificsiRNA(+}.Aftertransfection,cellsweretreatedwith

lmg/mLtunicamycinfor16h.CellsweresubjectedtoSDS-PAGEandWestern

Blotting.Proteinswerevisualizedwithindicatedantibodies.Actinwasusedasinternal

control.(B}BandintensityofC-GandNon-GformBCRPweremeasuredtoexpress

totalBCRPamounts.*P<0,05vs.tunicamycin.treated,controlsiRNAtransfeciedcells

(n-3).ErrorbarsshowSEM.

34

第4項 小括

本節においては， Tunicamycinが野生型BCRPの糖鎖付加を阻害し， ERAD

を促進するとしづ過去の報告27に関する再現性(Figure 20 and 21)を得るととも

に， Derlin-1がTunicamycin誘導性の野生型BCRPのERADにおいても必須

の分子であることを明らかにした(Figure 22). 本章第3節で示したように，

Der1in-1はN596QBCRPのERADにも関与する. これはいずれも糖鎖付加が

起こっていなし、BCRPにおけるERADであり Derlin-1が糖鎖付加状態をチ

ェックするBCRPの品質管理メカニス、ムの一端を担う可能性が強く示された.

35

第3章 考察

BCRPの品質管理において， 野生型と変異型を識別するチェックポイントの

存在は以前から示唆されていたが21具体的な識別メカニズムやそれに関与する

分子に関してはこれまで明らかになっていなかった. 本研究においては，ER膜

タンパク質であるDerlin-lがBCRPの野生型とN596Q変異型に対して異な

る発現パターン変化をもたらし， N596Q変異型特異的にERADを導くことを

示した. また， 糖鎖付加阻害状態にある野生型BCRPのE札生Dにおいても

Derlin-lの関与を示唆し，BCRP品質管理における識別メカニズムの一端として，

その糖鎖付加状態が参照されている可能性を示した(Figure 23) .

Comp�e.x.:glycos'yl�te.d (C.:G) BCRP

Degrådatia

4

可

。

Gq/gf

Figure 23. Derlin-l works as a checkpoint selector during the glycosylation­

dependent BCRP quality control.

36

野生型BCRPの主たる分解経路は形質膜上からエンドサイトーシスされた

後に続くリソソーム経路であり， ERADの影響はほとんど受けないことが以前

から報告されていた26 この知見の通り， 本研究においてDerlin-lを遺伝子導

入しでも， 野生型BCRPのERADが促進されることはなかった. ERADの影

響を受けにくい， という意味では，ERAD関連因子である筈のDerlin-1が野生

型BCRPの発現パターンを変化させたことは予想外であり， 興味深いものだっ

たと言える(Figure9 A) . 野生型BCRPに対してDerlin-1が示した作用の本態

は強力なER retention作用で、あった. 未だ多くの検討の余地があるものの， こ

の作用の生理的意義を考察すると， Derlin-1はBCRPをER retentionさせるこ

とで適切なフォーノレディングを補助し， 変異やフォールデ、イング異常等の問題

点があればERAD経路へ向かわせる，一種の分子、ンャベロンのような役割を担

っているという仮説を立てることができる. この仮説に基づいて今回の実験結

果を見直してみると， Derlin・1を過剰発現することによって野生型BCRPが

ERで品質チェックを受ける機会が増加し，結果としてER retentionが起こった

と考えられる. しかしながら， BCRPは野生型であるためにチェックポイント

で問題視されるような要素はなく， .ERADへ向かうこともなかったと予想され

る(Figure14) .

Derlin-1の野生型BCRPに対する作用として特筆すべきは，Derlin-1が発現

上昇した時にのみ両者の相互作用が認められる(Figure13)， という点である.

この結果より，何らかの影響によりDer1in-1の発現が上昇すると，BCRPはER

retention状態になることが示唆される. Derlin-1が発現上昇する条件のひとつ

としてER stressが知られており， mRNAレベルでのDerlin-1発現上昇が過去

に報告されている34 即ちER s仕ess誘導によってBCRPのER retentionを起

こせることが予想され，BCRP機能を負に調節できる可能性がある. この可能

性と関連し て ，Derlin-1 はヒト乳癌 細 胞 に おいても野生型 BCRP の ER

retentionを起こすことが示唆された. よって，癌細胞においてER stressを誘導

するとDerlin-lの発現が上昇し， BCRPのER retentionを起こすことが予想さ

れる. これによりBCRPの基質となる抗癌剤の細胞外排出が抑制され， 多剤耐

性を緩和しうることが予測される.Derlin-1の発現を変動させることが生体にど

37

ういった影響を及ぼすか， ER retentionによってBCRPの輸送活性が どの程度

抑制されているかなど， 多くの検討が必要となってくるものの， 化学療法にお

ける癌細胞多剤耐性緩和の観点からも本知見は有用なものとなり得る. 一方，

Derlin-lノックダワンは野生型BCRPの発現に影響を与えなかった(Figure 15) .

即ち内在性のDerlin-lを抑制することによって定常状態の野生型BCRP発現

を正に調節することは困難と考えられ， BCRP機能低下に よる高尿酸血症 な ど

の疾患に 対して ， 本知見を直接的に応用 する こ とは困難である と考えられる.

しかしなが ら， 高尿酸血症の原因 となるのは Q1 41KBCRP をは じめとした変異

型BCRPであり， これらの変異型の発現に対してDerlin-lが どのような影響を

示すかは非常に興味深く， 今後 の重要な 検討課題である.

また， Derlin-lはこれまでERAD基質の逆輸送を行う際に重要な分子である

ことが 知られていたが (Figure 3) 23 膜タンパク質のERretentionに関与する

ことは報告されていなかった. 以前 CFTRに対しでも本研究におけるBCRP

と類似の結果が 報告されていたが 31 CFTRのimmature formからmature form

への移行抑制が 示されたのみでf 実際の局在変化やGolgiへの輸送抑制までは

確認されていなかった. 本知見はDerlin-1が BCRPの局在変化を起こすこと

(Figure 12)やER-Golgi 輸送抑制を起こすこと(Figure 11)まで明確に示して

おりJ BCRPやCFTRに代表される膜タンパク質 のERretention としづ新規

のDer1in・1機能を見出した報告であると捉えることも出来る. 膜タンパク質の

ERからの輸送はSec23/24 ， Sec13/31 ， Sarl等が 関与するCOP2小胞 輸送が

一般的である(Figure 24) 35 . これらの因子と Der1 in・1 との関連性を示す報告は

現在までのところ存在しないが ， 今後検討を進めていくことで， より普遍的な

膜タンパク質の品質管理におけるDerlin-lの重要性が 明らかにることが 期待さ

れる.

38

Sec13 Sec31

Figure 24. Schematic diagram of COP2 vesicle formation. 35

近年， Nakagawaらは糖鎖付加阻害剤であるTunicamycinが野生型BCRPの

脱糖鎖を起こし， ERADに導くことを報告した. 更に， この報告においては

BCRPのN型糖鎖付加部位である596番目のアスパラギン(N596) をグル

タミンに変異させたN596Q BCRPもE孔ゅの影響を受けることが示されて

いた27 本研究では， この報告に基づいてN596QBCRPの発現に影響を与える

ようなERAD関連因子をスクリーニングし， Derlin-lがN596Q BCRPおよび

脱糖鎖状態にある野生型BCRPのE孔生Dに関与することを見出した. これま

での関連研究の中でBCRPのERADに関与する具体的な分子を同定した報告

は存在せず， 本知見は今後の関連研究においても重要な意義をもつものと言え

る.

野生型BCRPと変異型BCRPのE.RAD感受性の違いなどから， BCRPのタ

ンパク質発現調節におけるチェックポイントの存在は以前から示唆されていた

21 このチェックポイントは大きく分けて2段階存在していると考えられる.

即ち， 遺伝子レベルで、の変異をm貯�Aからの翻訳直後に排除するための第1

段階目と， フォールディングや糖鎖付加等の修飾を受けて ERから輸送される

段階での異常を排除するための第2段階目である(Figure25) .

39

窺

麟1.Rib。some

≡…RBCRP -BCRP

Wτva「fiantskCheckp・ 盈nレ唯va「iahts

,..一一一■一_

Properfo】d韮n辱

(S・Sbondformati6n破c_}

N同inkedg藝ycosylat韮onatAs晦596

¢heckpoint-2=Derlln国1

■一一一!

Multiple

G◎19垂91ycosy警at藍on

MatureformBCRP納isfoldedBCRP

Figure25.ImplicatedcheckpointsforBCRPqualitycontrolintheER.

今 回Derlin-1がERADに 関与 す る こ とを示 した の はTunicamycinに よ り脱

糖 鎖 を受 け た 野 生 型BcRPとN596QBcRPで あ り,両 者 はN型 糖 鎖 付 加 を

受 け て い な い こ とか ら,第2段 階 目のチ ェ ックポ イ ン トに よ りERADへ と導

かれ た 可 能 性 が 高 い.よ って,本 研 究 にお いて 明 らか に な っ たDerlin-1が 関与

す るBCRP発 現 チ ェ ック ポ イ ン トは第2段 階 目に相 当 し,糖 鎖 付 加 状 態 を参

照 して い る こ とが示 唆 され る(Figure25).

40

本研究においてはJ Derlin・1は糖鎖付加状態が適切なBCRP に対してはER

retention作用を有し， 糖鎖付加不全状態にあるBCRPに対してはERAD促進

作用を有する可能性が示された. しかしながら どのようにしてDerlin-lが

BCRPの糖鎖付加状態を確認しつつERADに向かわせているかという点に関

して， 未だ詳細は不明である. このメカニズムを明らかにするためには， まず

Derlin-lがダイレクトに糖鎖自体を認識しているのか，或いは脱糖鎖による立体

構造変化等を認識しているのかを確認する必要がある. N596の直接的な変異型

ではないが， N型糖鎖付加不全を起こすことが知られているSNPsもいくつか

存在するため(R383A J G553.L J G553E) 36ベこのような変異型に対するDerlin-l

の効果をさらに検討することで，より詳細なDerlin-lによるBCRPの品質管理

メカニズムの解明を行う必要がある.

また，実際にBCRPが分解を受けるメカニズムに関しでも詳細は不明である.

一般的な膜タンパク質のERADにおいては，基質特具的なE3ユピキチンリガ

ーゼによるユビキチン付加が重要なステップであると認識されている. Derlin-l

はE3ユビキチンリガーゼであるRmalと協調してCFTRのERADを促進

することや31 VIMPやp97といった他のER膜タンパク質と共にERAD基

質のERからの逆輸送を起こすことが報告されているため (Figure 26) 25，38 実

際のBCRPのE貼Dにおいてもこれらの分子が関与している可能性は高い.

この可能性を支持する結果として， 本研究第2章第2節においても，Rmalが

N596Q BCRPの発現を僅かに減少させることを確認している.E3ユピキチンリ

ガーゼの同定はタンパク質の特異的分解経路の解明に必要不可欠であることか

ら， この現象は非常に興味深く， 今後J BCRPとRmalの関連性について， 更

なる検討が必要で、ある.

41

ERAQsubstrate

畑 良鯛'"二∫∴l

ERlumen'i;

瀬灘彊 懸 獅[鞭:瀬1灘 鑓咽 司 辱罰

�E

DeαradatiOh'"・`

Figure26.Derlin-1-dependentretrotlanslocationofERADsubstrate.

42

第4章 総括

BC.RPはABCトランスポーターの一種であり， その基質輸送によって多様

な生命現象を司る分子である. BCRPの発現上昇に伴って輸送活性が上昇する

と， 多くの薬物が基質として細胞外排出を受けるために， 期待する治療的効果

が発揮されないという状態に陥る. 特にドキソルビシン， メトトレキサート，

ミトキサントロン等の抗癌剤を基質として輸送する BCRPの性質は， 癌細胞が

多剤耐性を獲得する一因とみなされ， 化学療法の効率化を妨げる一因として問

題視される. 一方， BCRPの発現低下による輸送活性の低下は 生命活動に必

須となるビタミン， 尿酸， 葉酸などの適切な細胞内濃度調節を破綻させ， 疾患

のリスクを高める. 事実， 高尿酸血症患者を対象とした遺伝子解析において

BCRPのSNPsが高頻度で認められることが報告されており BCRPの疾患関

連遺伝子としての認識も高まりつつある. このように BCRPの発現および機

能を過不足なく調節することは生体恒常性を維持する上で不可欠で あり， 細胞

内における BCRPの品質管理メカニズムを明らかにすることは大 きな意義を

持つものと考えられる.

BCRPの野生型はERADの影響を受けにくく， 多くの変異型はERADに対

して感受性を示す. これはBCRPのERADにおいて， 変異型に生じている何

らかのdysfunctionを認識し， proteぉome経路へ導くチェックポイントが存在し

ていることを示唆している. 関連する知見として， 野生型BCRPの脱糖鎖を誘

導すると， そのE孔生D感受性が増大することが報告された. 同時に糖鎖付加不

全変異型で あるN596QBCRPもERADの影響を受けることも見出され， 野生

型BCRPの安定性に糖鎖付加状態が重要であることが報告された. この知見か

ら， “ BCRPの糖鎖付加状態が野生型と変異型を認識するチェックポイントで

ある"という可能性が導かれる. しかしながら， この糖鎖付加依存的なBCRPの

チェックポイントという観点からの検討は未だなされておらず， 具体的な分子

メカニズムも不明で、 あった. そこで本研究では， 野生型BCRPとN596Q'BCRP

をHEK293細胞に遺伝子導入し， 糖鎖付加状態に応じたBCRP発現変化を起

こすような因子をスクリーニングした. その結果， ER膜タンパク質である

Derlin- lが野生型BCRPとN596QBCRPに対してそれぞれ異なる影響を示す

43

ことを見出した. 更に検討を進めることによって， 脱糖鎖状態にあるBCRPの

ERADにDerlin-lが関 与していることを明らかにした.

野生型BCRPの発現パターンはDerlin-lの過剰発現によってC-G forrn偏

重からS- G fonn偏重に変化していた(Figure6-9) . これによりDerlin-lは野生

型BCRPのER retentionを起こし， 膜上発現を抑制する， 野生型BCRPの負

の 調節因子であることが明らかになった. Derlin-lによる野生型BCRPのER

retentionはヒト乳癌細胞MCF-7においても起こり得ることが示唆され， 生理

的条件下においてもDerlin-lの過剰発現がBCRPの形質膜上発現を抑制する

可能性が示された.Derlin-l発現変動が生体に影響を与えるか，野生型BCRPの

ER retentionに 伴って基質輸送がどの程度抑えられているか， 等の検討すべき項

目は存在するものの，Derlin四1発現を誘導することによりBCRP活性を負に調

節すれば癌細胞の多剤耐性が緩和できる可能性があり， これまでにない疾患治

療戦略の構築が期待される. さらに既知のDerlin-lの機能としてはERAD基

質の逆輸送が挙げられるが， ER retention factorとしての役割について 明確なデ

ータを示した例は過去に存在しない. 膜タンパク質の細胞内輸送 に おける

Derlin-lの新規機能を示唆した点からも 本知見は意義深いものであると言える.

また，Derlin-lノックダウンはN596QBCRPの定常状態発現量をMG- 132

処理時と類似なレベルまで増加させるとともに (Figure 14 and 15)， Tunicamycin

により脱糖鎖された野生型BCRPの発現量減少を抑制していた(Figure 19) . こ

れらの 作用からDerlin-lが脱糖鎖状態 にある BCRPのERADに関与するこ

とが予想され， BCRPの糖鎖付加依存的なチェックポイントの本態として，

Derlin-1が野生型 BCRPと変異型BCRPを区別している可能性が示された.

Derlin-1を含む， 糖鎖付加依存的なBCRPのERAD経路が存在する可能性は

示されたものの， 実際に分解を行う他のタンパク質に関しては未だ不明なまま

である. Derlin-lはE 3ユピキチン リガーゼであるRmalと協調的に 作用して

CFTRのERADを促進することが報告されている. BCRPにおいても同様に

RmalがE3ユピキチンリガーゼとして機能している可能性があり， 実際に本

研究においても Rma1がN596QBCRPの定常状態発現量を減少させるとい

う結果を得ている (Figure5B， Lane 4-6). BCRP特異的な分解経路の解明という

44

観点から， E3ユピキチンリガーゼの同定は極めて重要で、あり， 今後の重要な検

討課題のひとつで、ある.

未だ多くの検討を要する段階ではあるが， BCRPの品質管理において実際に

機能する分子の同定としては， 今回の Derlin-lが初めての報告となる. Derlin-l

は前述したRmalの他にも， HRDl ， p97等の因子と協調的に働くことが知ら

れており， これらの因子か， あるいは全く未知の Derlin-lと協調する因子が

BCRPの品質管理に関与していると考えられる. Derlin-lを起点として更なる検

討によ刀BCRP品質管理の全容が解明されれば， BCRPを標的とした癌細胞の

多剤耐性緩和， 高尿酸血症等の疾患治療も可能になるものと予想される. 本研

究は今後のBCRP関連研究に対する重要な基礎的知見であり， BCRPが関与す

る生命現象や疾患全般に対する治療的観点からも重要な意義を持つものと考え

る.

45

第5章 実 験 の 部

第1節 実 験 材 料

第1項 試 薬

本 研 究 に 際 し,使 用 した 主 な 試 薬 を 以 下 に ま と め て 記 した.

Trypsin,Bacto●TRYPTONE,Bacto●YEASTEXT.R.ACT(以 上,Difco),1kbDNA

ladder,(以 上,GIBCO),DMEM(Wako),MG-132(CALBIOCHEM),Precesion

proteinStandardsTM(Bio-Rad),ampicilinesodiumsalt,kanamycinsodiumsalt,

NP-40,urea,X-gal,IPTG(以 上,ナ カ ラ イ テ ス ク),penicillinG,streptomycin,bovine

serumalbumin,cycloheximide,breferdin-A,PROTEASEINHIBITORCOCKTAIL(以

上,Sigma),StealthRNAiNegativeUniversalcontrol(Invitrogen),ECLTMWestern

BlottingAnalysisSystem(Amersham),TranslT●-LTlTransfectionReagent,

TransIT⑭ 一TKO(以 上,Mirus),Hily-Max(同 仁 化 学),AmplitaqGold(ApPlied

Biosystems),pyr�est(TAK.ARA),QuikChange●Site-directedMutagenesiskit

(stratagene),Supersignal●WestPicoChemiluminescentSubstrate(PIERCE),CanGet

SignalTMImmunoreactionEnhancersolution(TOYOBO),VECTASIELDO(VECTOR

Laboratories),EndoH,PNGaseF(NewEnglandBiolabs,ins).

そ の 他 の 試 薬 お よ び 無 機 塩 類 は す べ て 市 販 の 特 級 品 を 使 用 し た.

第2項 細 胞 株

本 研 究 で 用 い た 細 胞 を 以 下 に 示 した.

Table4.Celllinesusedinthisresearch.

細 胞 株 備 考

HEK293ヒ ト胎 児 腎 由 来 細 胞

HeLaヒ ト子 宮 頚 部 扁 平 上 皮 癌 由 来 細 胞

MCF-7ヒ ト乳 癌 由 来 細 胞

46

第3項 プ ラ ス ミ ドDNA

本 研 究 に 際 し,使 用 し た プ ラ ス ミ ドDNAに 関 す る情 報 は 以 下 の 通 りで あ る.

Table5.Plasmidinformationusedinthisresearch.

namevector入 手 先 あ る い は 作 成 方 法

BCRP-GFPpEGFP-N1杉 山雄 一 博 士(東 京 大 学)よ り供 与

WTBCRPpcDNA3.1杉 山雄 一 博 士(東 京 大 学)よ り供 与

N596QBCRPpcDNA3.1WTBCRPよ'りmutagenesisに て 作 成

HA-Derlin-1pcDNA3.1Dr.Cyr(Universityof.NorthCarolina)よ り供 与

RmalWTpcDNA3.1Dr.Cyr(Universityof.NorthCarolina)よ り供 与

RmalC42SpcDNA3.1RmalWTよ りmutagenesisに て 作 成,

Dr.AllanMWeissman(NationalCancerlnstitute,NIH)

gp78WTpcDNA3.1 よ り供 与

Dr.AllanMWeissman(NationalCancerlnstitute,NIH)

gp78R2MpcDNA3.1 よ り供 与

CHIPWTpcDNA3.1Dr.Cyr(Universityof.NorthCarolina)よ り供 与

CHIPH260QpcDNA3.1CHIPWTよ りmutagenesisに て 作成

第4項mutagenesis

そ れ ぞ れ の プ ラ ス ミ ドに 対 応 す る 変 異 の 挿 入 に は,QuikChangeOSite-directed

Mutagenesiskit(stratagene)を 用 い た.使 用 した プ ラ イ マ ー に つ い て は 本 節 第5

項 に 示 す.鋳 型DNAに 対 す るPCR反 応 は(95℃fbrlmin,1cycle,95℃for50

sec,60℃fbr50sec,and68℃fbr5min,18cycle,78℃fbr7min)に て 行 い,目 的 の

コ ン ス トラ ク トを 得 た .

4?

第5項 プライマー

本研究に際し，使用したプライマーを以下に記した. なお， オリゴヌクレオチ

ドの合成はGennet (株)に依頼した.

(F or mutagenesis)

N596Q BCRP-sense ターCTGCCCAGGACTCCAGGCAACAGGAAACAATCC-3'

N596Q BCRP-antisense ターGGATTGTTTCCTGTTGCCTGGAGTCCTGGGCAG-3'-

Rma1 C42S-sense ターGCTGTGGTCAGTGTGTCTGGCCACCTGTAC-3'

Rma1 C42S-antisense 5'-GTACAGGTGGCCAGACACACTGACCACAGC-3'

CHIP H260Q-sense ターGGACATCGAGGAGCAGCTGCAGCGTGTGGG-3'

CHIP H260Q四antisense ターCCCACACGCTGCAGCTGCTCCTCGATGTCC-3'

第2節 細胞の培養法

第1項 培養液

基礎培養液 HEK293 ，およびMCF-7細胞の培養液には，DMEM (GIBCO)を，

HeLa 細胞の培養液にはMEM (GIBCO)を，それぞれの基礎培養液として用い

た.

細胞増殖用培養液:使用した基礎培養液には全て，10% FBS (fetal bovine serum)

および，抗生物質(penicillin G (100 units/mL) ， streptomycin (100μg/mL)を添加

したものを細胞増殖用培養液として用いた.

第2項 細胞培養法

全ての細胞は，細胞増殖用培養液で1.0x105 cell/mLになるように懸濁し，5%

CO2， 370C下にて静置培養した.

48

第3節 siRNA法

siRNAのtransfectionには， TranslT@ーTKO Transfection Reagent (Mirus)を

用い， リポソーム法により行った. まず， オートクレーブ済み1.5mLチューブ

に無血清培地(Opti-MEM) を250μL 入れ， 次に TransIT⑮田TKO Transfection

Reagentを10μL/tube 加え， タッピングにより混和後にスピンダウンし， 室温

で20分間インキュベートした(so1.A). その後， control siRNA (Stealth⑮RNAi

Negative Universal control， Invitrogen)およびD�r1in-1 specific siRNA (Invitrogen)

を最終濃度が 50凶4になるように so1.Aに添加し， タッピングにて混和後にス

ピンダウンし，さらに室温で20分間インキュベートした(so1.B). 細胞を 40%

� 70% コンフルエント(サブコンフルエント )まで培養し，新しい細胞増殖用

培養液に置換した. そこに so1.Bを滴下し， 370C， 5 % CO2で24時間培養

した. その後に新鮮な細胞増殖用培養液との入れ替えを行い， 更に24時間の

培養を行った.

第4節 遺伝子導入法

DNA全量 : TransIT@-LT1或いはHily-Max溶液の比が1μg:3μLになるよ

うに使用した. まず，250μL の Opti-MEMに適量の TransIT@ーLT1或いは

Hily-Maxを加え， タッピングにより混合し， スピンダウンした後室温で20分

間反応させた(so1.A) . その後， 目的遺伝子を so1.Aに加えさらに室温で20分

間反応させた(so1.B). 細胞を サブコンフルエントまで培養し，新しい細胞増殖

用培養液に置換した. そこに so1.Bを滴下し 370C， 5% CO2で24時間培

養した. その後に新鮮な細胞増殖用培養液との入れ替えを行い， 更に24時間

の培養を行った.

49

第5節WesternBlotting法

Westernblotting法 は 常 法 に 従 っ た.な お,以 下 に そ の 方 法 を 示 す.ま ず,細

胞 をPBS(一)で 洗 浄 し た 後,RIPAbuffer(1%Nonidet°P-40,proteaseinhibitor

cocktail)を 用 い て,celllysateを 回 収 し,BCA法 に よ り タ ン パ ク 質 定 量 を 行 い,

各 サ ン プ ル の タ ン パ ク 質 量 を 一 定 に し た.各 サ ン プ ル に つ い て 常 法 に 従 い8%

ま た は12%SDS-PAGEを 行 っ た 後,PVDF膜 に 転 写(250mA,2hr)し た.た だ

し,BCRPの タ ン パ ク 質 発 現 量 の 検 討 に お い て は,denaturing(90℃fbr5min)は

行 わ な か っ た.転 写 し たPVDF膜 は5%ス キ ム ミ ル ク を 含 む0.1%PBS-Tween

中 で4℃,一 晩 マ ス キ ン グ し た.そ の 後,PVDF膜 を0.05%PBS-Tweenで200

～1,000倍 希 釈 し た1次 抗 体 を 用 い て 室 温 で1時 間,1次 抗 体 反 応 を 行 っ た.

1次 抗 体 反 応 後,PVDF膜 を 洗 浄 し,0.05%PBS-Tweenで5,000倍 に 希 釈 し た2

次 抗 体 を 用 い て 室 温 で1時 間,2次 抗 体 反 応 を 行 っ た.2次 抗 体 反 応 終 了 後,

PVDF膜 を 洗 浄 しECL試 薬(Amersham)ま た はSupersignal●WestPico

ChemiluminescentSubstrate(PIERCE)に よ り 反 応 さ せ た 抗 体 を 検 出 し た.使 用 し

た 抗 体 と 希 釈 倍 率 は 以 下 の 通 り で あ る.

Table6.AntibodiesforWesternBlotting.

A皿tibo"yCo.Dilutionratio

MouseAnti-...(BXP21)(monoclonal)abcam1:500

MedicalandRabbitAnti-Derlin-1(polyclona1) ..1:1000Bi

ological.Laboratries

MouseAnti-HA(F-7)(monoclonal)Santacruz1:500

Medicaland

RabbitAnti-G]FP(polyclonal) ..1:500BiologicalLaboratrien

MouseAnti-c-Myc(9E10)(monoclonal)Santacruz1:500

GoatAnti-Actin(1-19)(Polyclonal)Santacruz1:1000

Peroxidase-conjugatedAffinipureGoatAnti-MouseJackson

1:50001gGImmunoR・esearch

Peroxidase-conjugatedAffinipureGoatAnti-rabbitJackson

1:10000

1gGImmunoResearch

Peroxidase-conjugatedAffinipureI)onkeyAnti-GoatJackson

1:10000

1gGImmunoResearch

50

第6節 免疫沈降法

BCRP-GFPおよびDerlin-lをHEK293細胞に遺伝子 導入後， 1 % Digitonin

buffer (1 % Digitonin， 50mM Tris-HCl (pH 7. 5)， 1 50mM NaCl， 1 % protease inhibitor

cocktail)を用い てcell lysateを回収した. その後 cell lysateを Protein G

Sepharose 4 Fast Flow (Amersham) に 固定化したGFP抗体(10μL)および

control mouse IgG抗体と40C， 2時間反応させた. なお， 反応 に用いたcell

lysateのタンパク量はサンフツレ間で一定にした.反応後，遠心(6000中m for 3 min

at 40C)し， pelletをDigitonin buffer 1 mL で4回洗浄後， 2 x Sample bufferを

適量加え， タッピング後， 370C ， 30分間incubateし， 結合タンパク質を溶出

した.遠心(6000中m for 3 min at room temperature) 後， 上清をWestem Blotting法

に用いた.

第7節 免疫蛍光染色法

コーティング済み(ポリ4ーリジン ・ コーティング )の glass bottom dish

(MATSUNAMI JAP刷)上に細胞を培養した.BCRP-GFP遺伝子の導入操作後，

細胞から培養液を除き， PBS(ー)で2 回洗浄した.次 に， 3.7% paraformaldehyde

を加 え ， 室 温 で 20 分 間静置し ， 細 胞 を固 定し た. その後 0 .1 % Triton

X-100IPBS(ー)により細胞のpermeabilizeを行い， 1 % BSA-PBS 溶液 で希釈した

1次抗体(Anti目KDEL (10C 3)ョStressgen Biotechnologies， 1 :200)を室温で1時間

反応させた.反応後， PBS(ー)にて3回洗浄し， Alexa Fluor 546標識2次抗体

(1 :500， Mouse)を室温で45分間処理した.反応終了後，細胞をPBS(ー)にて3

回洗浄後， 槌色を防ぐために VECTASHIELD@ mounting medium (VEC TOR

Laboratories ョInc， Burlingame， CA)によりマウントし， dishを蛍光顕微鏡(FV 300，

OLYMPUS)にセットし， 488 nmおよび 543nmの励起光を照射し細胞を観察

した.なお， 観察条件を以下に列挙する.

51

観察条件

・OLYMPUS FLUOVIE羽1300

. CONFOCAL APERTURE ; 2

. LASER INTENSIT Y; 100

・水浸用対物レンズ X40

Table 7. The wavelength and fluorescence of typical laser.

Wavelength Fluorescence Fluorescent Laser

(nm) (Second antibody) protein

Ar 488 FITC Alexa Fluor 488 EGFP

HeNe 546 TRITC Alexa Fluor 568 DsRed2

52

謝辞

稿を終えるにあたり， 本研究の機会を与えて戴き， また， 終始御懇篤なる御指

導， 御鞭援および御校閲を賜りました熊本大学大学院生命科学研究部 甲斐広

文教授に深甚なる感謝の意を表します.

本研究に際し， 有益なる御指導と御助言を賜り， 共同研究者としてBCRP遺伝

子を譲渡して頂きました東京大学大学院薬学系研究科 杉山 雄一教授， およ

びDerlin-l遺伝子を譲渡して頂きましたUnìversi旬of North Carolina， Douglas

M.Cyr教授に深く感謝の意を表します.

本稿作製にあたり， 有益なる御助言と御校闘を賜りました熊本大学大学院生命

科学研究部 丸山 徹 教授， 演田 哲暢 准教授に厚く御礼申し上げます.

本研究並びに本稿作製にあたり， 多大なる御教示， 御助力を賜りました 熊本大

学大学院生命科学研究部 首藤剛 講師， Mary Ann Soten Suico助教に深く感

謝の意を表します.

本研究に際し，共同研究者として， 日夜御協力いただいた 新堀 晶子 博士，

鈴木 伸悟 学士に厚く御礼申し上げます.

本研究ならびに学生生活に際し， 研究室配属時より数々の御指導， 御協力を頂

きました 沖米国 司 博士，原田 一恒 博士，古賀 友紹 博士，佐藤 卓

史 博士， 橋本 泰明 博士， 古賀 沙緒里 博士， 菅原 卓哉 博士， 田浦

学 博士， 宮田 将徳、 博士をはじめとする諸先輩方に謝辞を表します.

本研究ならびに学生生活に際し， 素晴らしき友人として私を支えてくれた 小

松 賢生 修士， 島崎 省吾 修士， 矢野 惰一朗 修士， 及川 貴美子 修

士， 関本 絵梨香 修士， 水之江 河太 修士に心から感謝の意を表します

53

本研究および大学生活に際し， 日夜御協力頂きました熊本大学大学院薬学教育

部遺伝子機能応用学分野の諸氏に謝意を表します.

最後に， ここまで私を支えてくれた友人と， 育て見守ってくれた両親， 家族に

深く感謝の意を表します.

54

参考文献

1. Jones， P.M. & George， A.M. The ABC transporter structure and mechanism:

perspectives on recent rese泣ch. Cellu1ar & Mo1ecular Li岳Scienoθs 61， 682・699

(2004).

2. Oldham， M.L.， Davidson， A.L. & Chen， J. Structural insights into ABC transporter

mechanism. Curr Opin Struct Bio118， 726・733 (2008).

3. Kage， K'J et a1. Dominant-negative inhibition of breast cancer resistance protein as

drug efflux pump through the inhibition of S-S dependent homodimerization.

Internationa1 Journa1 ofCanoθ'r 97 ，626・630 (2002).

4. Litman， T'J et a1. Use of peptide antibodies to probe for the mitoxantrone

resistance-associated protein MXRIBCRP/ABCP/ABCG2. Biochimica et Biophysica

Acta 1 56 5， 6-16 (2002).

5. l\位tomo，H'J et a1. A functional study on polymorphism of the ATP-binding cassette

transporter ABCG2: critical role of arginine-482 in methotrexate transport.

Biochemica1ゐurna1373， 767-774 (2003).

6. Ni， Z .， Bikadi， Z.， Rosenberg， M.F. & Mao， Q. Structure and function of the human

breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2). Curr Drug Metab 11， 603・617

(2010).

7. Kusuhara， H. & Sugiyama， Y. ATP-binding cassette， subfamily G (ABCG family).

PD.ugersArch 453，735-744 (2007).

8. Borst， P. & Elferink， R.O. Mammalian ABC transporters in health and disease.

Annua1 Reviθw of Biochemistry 71， 537・592 (2002).

9. Volk， E.L. & Schneider， E. Wild-type breast cancer resistance protein

(BCRP/ABCG2) is a methotrexate polyglutamate transporter. ぬncer Research 63，

5538・5543 (2003).

10. Litman， Tリet al. The multidrug-resistant phenotype associated with overexpression

of the new ABC half-transporter， MXR (ABCG2) . ゐurna1 of Cell Science 113，

2011・2021 (2000).

11. Komatani， H.J et a1. Identi五cation of breast cancer resistant proteinlmitoxantrone

resistance/placenta -speci五c， ATP-binding cassette transporter as a transporter， of

NB-506 and J-I07088， topoisomerase 1 inhibitors with an indolocarbazole structure.

Cancer Research 61， 2827・2832 (2001).

12. Krishnamurthy， P. & Schuetz， J.D. Role of ABCG2IBCRP in biology and medicine.

Annua1 Review of Pharmaco1ogy & Toxico1ogy 46 ， 381・410 (2006).

13. Perego， P.J et aよ A novel 7・modified camptothecin analog overcomes breast cancer

55

resistance protein-associated resistance in a mitoxantrone-selected colon carcinoma

cell line. Cancer Research 61，6034・6037 (2001).

14. Noguchi， K.， Katayama， K.， Mitsuhashi， J. & 8ugimoto， Y. Functions of the breast

cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in chemotherapy. Adv Drug Deliv Rev 61，

26・33 (2009).

15. Yoh， Kリ θt a1. Breast cancer resistance protein impacts clinical outcome in

platinum-based chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer. Clin Cancer

Res 10，1691・1697 (2004).

16. Vlaming， M.L.， Lagas， J.8. & 8chinkel， A.H. Physiological and pharmacological roles

of ABCG2 (BCRP): recent findings in Abcg2 knockout mice. Adv Drug Deliv Rev61，

14・25 (2009).

17. Woodward，O.Mリet a1. Identification of a urate transporter， ABCG2， with a common

fqnctional polymorphism causing gout. Proc Nat1 Acad Sci U S A 106， 10338・10342

(2009).

18. Matsuo， Hリet a1. Common defects of ABCG2， a high-capacity urate exporter， cause

gout: a function-based genetic analysis in a Japanese population. Sci Trans1 Med 1，

5rall (2009).

19. Lemos， Cリ et a1. Folate deprivation induces BCRP (ABCG2) expression and

mitoxantrone resistance in Caco・2 cells. Int J白ncer1 23， 1712・1720 (2008).

20. Tamura， Aリ et a1. Genetic polymorphisms of human ABC transporter ABCG2:

development of the standard method for functional validation of 8NPs by using the

Flp recombinase system. J Exp Ther Onco16， 1・11 (2006).

21. Wakabayashi-Nakao， K.， Tamura， A.， Furukawa， T.， Nakagawa， H. & Ishikawa， T.

Quality control of human ABCG2 protein in the endoplasmic reticulum:

ubiquitination and proteasomal degradation. Adv Drug Deliv Rev 61， 66-72 (2009).

22. Hirsch， C.， Gauss， R.， Horn， 8.C.， Neuber， O. & 8ommer， T. The ubiquitylation

machinery of the endoplasmic reticulum. Nature 458， 453・460 (2009).

23. V色mbar，8.8. & Brodsky， J.L. One step at a time: endoplasmic reticulum -associated

degradation. Nat Rev Mo1 Cell Bio19， 944-957 (2008).

24. Katiyar， 8.， Joshi， 8. & Lennarz， W.J. The retrotranslocation protein Derlin-l binds

peptide:N-glycanase to the endoplasmic reticulum. Mo1 Bio1 Cell 16， 4584・4594

(2005).

25. Ye， Yリ θt a1. Recruitment of the p97 ATPase and ubiquitin ligases to the site of

retrotranslocation at the endoplasmic reticulum membrane. Proc Nat1 Acad Sci U S

A 102，14132・14138 (2005).

26. Furukawa， Tリet a1. Major 8NP (QI41K) variant of human ABC transporter ABCG2

56

undergoes lysosomal and proteasomal degradations. Pharm Res 26， 469-479 (2009).

27. Nakagawa， Hリ et a1. Disruption of N-linked glycosylation enhances

ubiquitin-mediated proteasomal degradation of the human AT P-binding cassette

transporter ABCG2. Fehs J276， 7237-7252 (2009).

28. Nakagawa， Hリ et a1 . Ubiquitin-mediated proteasomal degradation of

non-synonymous SNP variants of human ABC trarisporter ABCG2. Biochem J 411，

623・631 (2008).

29. Knop， M.， Finger， A.， Braun， T.， Hellmuth， K. & Wolf， D.H. Der1， a novel protein

speci五cally required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. Emho J 1 5，

753-763 (1996).

30. Ballar， P.， Ors， A.U.， Yang， H. & Fang， S. Differential regulation of CFTRDeltaF508

degradation by ubiquitin ligases gp78 and Hrd1. Int J Biochemα，11 Bio142， 167・173

(2009).

31. Younger， J.Mリ et al. Sequential quality-control checkpoints triage misfolçled cystic

fibrosis transmembrane conductance regulator.α11126，571・582 (2006).

32. Klausner， R.D.， Donaldson， J.G. & Lippincott-Schwartz， J. Brefeldin A: insights into

the control of membrane traffic and organelle structure. J α，11 Bio1116， 1071・1080

(1992).

33. Lee， D.H. & Goldberg， A.L. Selective inhibitors of the proteasome-dependent and

vacuolar pathways of protein degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Bio1 Chem

271， 27280-27284 (1996).

34. K註・st，M.E .， Meyer， D.J.， Gibbon， B.C.， Jung， R. & Boston， R.S. Identi五cation and

characterization of endoplasmic reticulum -associated degradation proteins

differentially affected by endoplasmic reticulum stress. P1ant physio1ogy 1 38，

218・231 (2005).

35. Budni.k， A. & Stephens， D.J. ER exit sites--localization and control of COPII vesicle

formation. FEBS Lett58 3， 3796-3803 (2009).

36. Polgar， O.� et a1. Mutational studies of G553 in TM5 of ABCG2: a residue potentially

involved in dimer匂ation. Biochemistry 45， 5251・5260 (2006).

37. Polgar， O.� et a1. Arginine 383 is a crucial residue in ABCG2 biogenesis. Biochim

Biophys Acta 1788， 1434・1443 (2009).

38. Sun， F.� et a1. Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis

transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants. J Bio1

Chem 281， 36856・36863 (2006).

57