臨床検査の進歩に基づく

膠原病・リウマチ性疾患の最新知見

京都大学大学院医学研究科・臨床免疫学

京都大学医学部附属病院免疫・膠原病内科

三森 経世

JCCLS学術集会2010-8-28（東京）

「臨床検査の現状－標準化へ向けて」

抗核抗体の染色パターン（間接蛍光抗体法）

クロマチン・DNA (ds, ss and Z-form)・PolyADP ribose・Nucleosome・Histones・Centromere/Kinetocore・DNA topoisomerase I・Ku・HMG

核質・マトリックス・U1RNP・U2RNP・Sm (U1-U6RNP)・SS-B/La・hnRNP・Ku・Ki/SL・PCNA・Mi-2

核小体・Ribosomal RNA・U3RNP (Fibrillarin)・7-2/8-2RNP・PM-Scl・RNA polymerase I・NOR-90/hUBF

細胞質・Ribosome・SS-A/Ro・Aminoacyl-tRNA syntases・SRP・Mitochondria・Golgi complex・Centriole・Calpastatin

RNA-protein complex

DNA-protein complex

Nucleic acids

自己抗原の分類と細胞内局在

主要自己抗原の生物学的機能

機 能 自己抗原 生理活性

DNA複製・細胞分裂 PCNA DNA polymerase d補助因子

Scl-70 DNA topoisomerase I

Centromere 染色体の凝集と分離

DNA修復・組み換え Ku DNA-PK活性化因子

PARP 核蛋白のADPリボシル化

遺伝子転写 RNA polymerase DNA→RNAの転写酵素

SS-B/La RNA polymerase III転写終結因子

NOR-90/hUBF リボゾームRNA転写調節因子

RNAプロセシング U1RNP/Sm pre-mRNAスプライシング

U3RNP リボゾームRNAプロセシング

7-2/8-2RNP RNaseMRP/RNaseP

蛋白翻訳・合成 Jo-1 hystidyl-tRNA synthetase

SRP シグナル認識粒子

Ribosome P 蛋白合成

疾 患 自己抗体 陽性率

SLE抗ヌクレオゾーム抗体（LE因子）抗DNA抗体抗Sm抗体

40-60%50-70%15-25%

強皮症抗Scl-70抗体抗セントロメア抗体

20-30%20-30%

多発性筋炎・皮膚筋炎 抗Jo-1抗体 15-20%

Sjögren症候群抗SS-B/La抗体抗SS-A/Ro抗体

20-30%50-70%

Overlap症候群 抗U1-RNP抗体 80%

血管炎症候群C-ANCA (Wegener肉芽腫症)P-ANCA (顕微鏡的多発血管炎など)

50-80%30-70%

関節リウマチ 抗CCP抗体 70-80%

膠原病・リウマチ性疾患の疾患標識抗体

注目される自己抗体

• 多発性筋炎・皮膚筋炎

抗アミノアシルtRNA合成酵素抗体

抗CADM-140抗体

• 関節リウマチ

抗シトルリン化蛋白抗体

-P-adenosine

ATP

Amino acid

tRNA

Aminoacyl-

tRNA

ARS

アミノアシルｔRNA合成酵素（ARS）

3‘-OH

抗アミノアシルtRNA合成酵素抗体

抗 体 対応抗原 筋炎出現頻度

抗Jo-1抗体 ヒスチジルtRNA合成酵素 15-20%

抗PL-7抗体 スレオニルtRNA合成酵素 5%

抗PL-12抗体 アラニルtRNA合成酵素 ＜5%

抗EJ抗体 グリシルtRNA合成酵素 5-10%

抗OJ抗体 イソロイシルtRNA合成酵素 ＜5%

抗KS抗体 アスパラギニルtRNA合成酵素 ＜5%

抗Zo抗体 フェニルアラニルｔRNA合成酵素 １例報告

抗YRS抗体 チロシルｔRNA合成酵素 １例報告

同一患者に併存はまれ

S R

NA

a J

o-1

a P

L-7

a P

L-1

2

a E

J

a O

J

a K

S

ｔRNA

U1

U2

5S

7S

32P-H3PO４

32P

32P

32P

32PImmunoprecipitates

Phenol extraction of 32P-RNA

Protein A-Sepharose

Patient serum

HeLa cells

Sonicate sups Sonicated S/N IgG-Protein A-Sepahrose

Autoradiography

Separation by Urea-PAGE

Immunoprecipitates

Phenol extraction of RNA

Protein A-Sepharose

Patient serum

HeLa cells

Sonicate sups Sonicated S/N IgG-Protein A-Sepahrose

Silver Staining

Separation by Urea-PAGE

RNA免疫沈降法による抗アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）抗体の検出

Anti-Synthetase Syndrome

アミノアシルtRNA合成酵素(ARS)に対する自己抗体を

持つ患者は共通の臨床的特徴を有する

その他： 多発関節炎/関節痛，レイノー現象，発熱など

筋炎（PM>DM） 間質性肺炎（縮小肺を伴う）

Mechanic’s hand

（機械工の手）

PM/DMにおける筋炎関連自己抗体のプロフィール（自験例）

(Yoshifuji et al: Autoimmunity 2006)

間質性肺炎（IP）を合併したPM/DMにおける筋炎関連自己抗体のプロフィール （自験例）

(Yoshifuji et al: Autoimmunity 2006)(* SAILD: seropositive amyopathic ILD)

*

PM/DM自験例（74症例）における臨床症状の頻度

(Yoshifuji et al: Autoimmunity 2006)

p<0.01

間質性肺炎の治療反応性と臨床経過

%

%

(Yoshifuji et al: Autoimmunity 2006)

A．間質性肺炎の初回ステロイド治療反応性

B．抗ARS抗体と間質性肺炎の臨床経過

抗ARS抗体定量的測定系の開発

コンセプト

抗ARS抗体は現在のところRNA免疫沈降法でしか検出できない（限られた研究室のみ）

簡便な定量的測定法（ELISA）の必要性

６種類の抗ARS抗体を同時に測定しても、個々に測定しても、臨床的意義はほぼ同じと考えられる

ARSの種類を問わず、「抗ARS抗体同時測定システム」として開発

75

50

37

25

kDa

PBS可溶性画分からの精製

収量：5.6 mg/L

1L培養で5.6mgの精製His-Tag EJ抗原が得られる

EJ-cDNAをRT-PCRでHeLa細胞mRNAより増幅↓

シーケンスで塩基配列をチェックし、変異修復↓

pET28(+)ベクターにEJ遺伝子を挿入↓

大腸菌BL21(DE3)RILでHis-Tag EJ抗原として発現↓

PBS溶解成分をコバルトキレートカラム精製

4ug/ml

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

0 1 2 3

2ug/ml

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

0 0.5 1 1.5 2 2.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 0.5 1 1.5 2 2.5

1ug/ml

ARS自己抗体ELISA測定系の開発（EJ抗原の調整）

0.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

160.000

180.000

Inde

x

0.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

160.000

180.000In

dex

－ 多抗原同時感作ELISAプレートを用いた抗ARS抗体の検出 －

a-PL-7 a-PL-12 a-KS a-Jo-1 a-EJ a-OJ normal

100% 100% 100% 100% 100% 40% 0%

(6/6) (7/7) (5/5) (5/5) (9/9) (2/5) (0/186)

抗ARS自己抗体検出ELISA系の開発

(U/ml)

0

50

100

150

200

250

300

0 2 4 6 8 10 12 140

50

100

150

200

250

300

0 2 4 6 8 10 12 14

25

膠原病における抗ARS抗体ELISAの陽性率

DM

(50例）32%

PM

(58例）34%

RA

(49例）2%

SSc

(40例）0%

SLE

(49例）2%

IIP

(62例）11%

HC

(30例）0%

RNA免疫沈降法でOJ以外の抗ARS抗体陽性

RNA免疫沈降法でOJ以外の抗ARS抗体陰性

感度97.7% 特異度99.3%

抗ARS抗体測定ELISAの有用性

対象疾患と臨床的意義

・ PM/DMの診断と病型分類

・ ミオパチーの鑑別診断

・ 間質性肺炎の鑑別診断（特発性、膠原病合併）

・ PM/DM合併間質性肺炎の予後予測および治療方針決定

・ PM/DMの疾患活動性指標？

まず研究用試薬として開発

臨床データの蓄積（多施設共同研究）

診断用試薬の認可申請、健康保険収載を目指す

症例１： 69歳女性．機械工の手，筋力低下，CK 1578 IU/L，抗PL-7抗体(+)

mPSLパルスPSL 50mg/日CsA 100mg/日

症例２： 64歳女性．Gottron徴候(+)，筋力低下(-)，CK 141 IU/L，自己抗体(-)

mPSLパルス×2ｺｰｽPSL 50mg/日CsA 100mg/日IV-CY ×2ｺｰｽ

呼吸不全，挿管4週後に死亡剖検：DAD，感染(-)

筋炎に合併する間質性肺炎と自己抗体

• 縮小肺をきたす慢性・亜急性間質性肺炎

（NSIP，一部にUIP，BOOP）

抗ARS抗体陽性： 治療効果あり（再燃多い）

• Amyopathic DM（ADM）に伴う急性間質性肺炎

（DAD）

筋炎特異抗体陰性： 治療抵抗性，予後不良

（抗CADM-140抗体 (Sato S, A&R 2005)）

「筋症状のない」皮膚筋炎

• 定型的皮疹（ヘリオトロープ疹やGottron徴候）のみで筋症状がないか乏しい例

Amyopathic Dermatomyositis

Hypomyopathic Dermatomyositis

Clinically Amyopathic Dermatomyositis (Sontheimer)

Mr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

220k

97k

66k

45k

30k

1, 8: anti-Mi-2

3, 5, 12: anti-p155/140

2, 6, 9, 10, 11: anti-CADM-140

皮膚筋炎特異自己抗体が免疫沈降する蛋白成分（35S-HeLa細胞）

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Age at

onset/sex44/M 51/M 63/F 64/F 57/F 64/F 53/M 69/F 71/F 45/F 52/F 60/M 52/F

Gottron + + + + + + + + - + + + +

Heliotrope - - - + - - - - + - - - -

Maximal CK

value(IU/L)3435 213 180 253 455 82 106 33 91 156 203 178 20

Fever up + + + + + + - - + + - + -

Maximal

ferritin

(ng/ml)

17285 n.d. 1908 1392 1756 n.d. n.d. 1246 n.d. 1405 281 5652 9.1

EMG + + + + + n.d. n.d. + + n.d. n.d. + +

Raynaud’s

Phenomenon - - - - - + - - - - - - -

Arthritis - + - + + + + + - + + - +

Interstitial

Pneumonia + + + + + + + - + + + + +

Prognosis † † alive † alive alive alive alive † † alive † alive

MSA/MAA - - - - - - - - - - - - -

Diagnosis DM ADM ADM ADM DM ADM ADM ADM ADM ADM ADM ADM ADM

n.d.: not done; †, died; EMG, electromyography; Fever up > 38°C.

Clinical manifestations of thirteen patients with the anti-CADM-140 antibody

(Nakashima R, Rheumatology (Oxford) 2010 Mar;49(3):433-40)

Feature α-CADM-140(+) n=13 α-CADM-140(-) n=24 p values

Age at onset, mean±SD

(years)57.3±9.4 61.3±11.0 p=0.27

No. male/no. female 3/13 8/16 p=0.47

Gottron’s sign (%) 92 75 p=0.38

Heliotrope rash (%) 15 58 p=0.017

Muscle weakness (%) 46 83 p=0.028

Elevation of CK (%)† 38 87 p=0.006

Elevation of serum ferritin

concentration (%)85 33 p=0.005

Raynaud’s phenomenon (%) 8 25 p=0.38

Arthritis (%) 69 38 p=0.09

Malignancy (%) 8 17 p=0.64

ILD (%) 92 54 p=0.027

Rapidly progressive ILD (%) 54 4 p=0.001

Mortality (%) 46 8 p=0.013

Comparison of clinical manifestations between anti-CADM-140（＋）and anti-CADM-140 （-） DM patients

CK, creatin kinase; ILD, interstitial lung disease; †: CK≥300 (Nakashima R, Rheumatology 2010;49(3):433-40)

抗IFIH1抗体と患者抗CADM-140抗体に

よるアフィニティー精製抗原の反応性

210

140

95

70

(kD)

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) によるPeptide Fingerprinting解析

Interferon-induced helicase C domain-containing protein 1 (IFIH1) と同定=Melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5)

ウイルス認識におけるIFIH1/MDA5の役割

IFIH1/MDA5

(Nakashima R, Rheumatology 2010;49(3):433-40) 成田 蛋白質 核酸 酵素 52(10), 2007より

関節リウマチの自己抗体

リウマトイド因子

抗ガラクトース欠損IgG抗体

抗シトルリン化蛋白抗体

関節リウマチで報告されている自己抗体

対応抗原 RAでの陽性率

Rheumatoid Factor 70-80%Agalactosyl IgG 90%Perinuclear granule 52-87%“Keratin” 37-59%Type II collagen 20-90%Cytokeratin-18 40%(IgA type)IL-1a 17%Lipocortin-1 34% in steroid-Tx RARA33（hnRNP-A2 protein） 36%Sa 22-43%Calpastatin 48-80%Filaggrin/Profilaggrin 33-75%CCP 41-88%Follistatin-related protein (FRP) 35%Soluble gp130 73%HSP90 43%GPI (G6P isomerase) 15-64%a-Enolase 46%

シトルリン化蛋白

関節リウマチで報告されている自己抗体

対応抗原 RAでの陽性率

Rheumatoid Factor 70-80%Agalactosyl IgG 90%Perinuclear granule 52-87%“Keratin” 37-59%Type II collagen 20-90%Cytokeratin-18 40%(IgA type)IL-1a 17%Lipocortin-1 34% in steroid-Tx RARA33（hnRNP-A2 protein） 36%Sa（citrullinated vimentin） 22-43%Calpastatin 48-80%Filaggrin/Profilaggrin 33-75%CCP 41-88%Follistatin-related protein (FRP) 35%Soluble gp130 73%HSP90 43%GPI (G6P isomerase) 15-64%a-Enolase 46%

抗シトルリン化蛋白抗体Filaggrin• 抗ケラチン抗体（AKA），抗核周囲因子Perinuclear factor（APF）

の対応抗原として同定 (Sebbag: JCI 1995)

• 角質化上皮組織に分布し，サイトケラチンの凝集に関与

• シトルリン化されたペプチドが抗原認識部位となる

CCP（Cyclic Citrullinated Peptide）• シトルリン化ペプチドを人工的に環状化させたもの

• RAにおける感度76%，特異度96%．RA早期から出現すると報告(Schellekens: JCI 1998)

AKA APF

報告者(年) 対象 抗原(測定法)* 感度 特異度

Simon (1993) RA48/対照56 ヒト皮膚FA(IB) 75% 89%

Schellekens (1998) RA134/対照154 CCP(ELISA) 76% 96%

Schellekens (2000) RA134/対照154 CCP(ELISA) 68% 98%

早期関節炎486 CCP(ELISA) 48% 96%

Goldbach-Mansky 1年以内関節炎238 ヒト皮膚FA(ELISA) 33% 93%

(2000) （RA106/他122) CCP(ELISA) 41% 91%

Bizzaro (2001) RA98/対照232 CCP(ELISA) 41% 97.8%

Vincent (2002) RA240/対照471 ラットr-cFA(ELISA) 67%

ヒトr-cFA(IB) 48% 98.5%

CCP(ELISA) 58%

Suzuki (2003) RA549/対照208 CCP(ELISA) 87.6% 88.9%

ヒトr-cFA(ELISA) 68.7% 94.7%

Rantapaa- 発症前RA83 CCP (ELISA) 33.7% 98.2%

Dahlqvist (2003) (献血ドナー）

RAにおける抗シトルリン化蛋白抗体の意義に関する報告

* FA: フィラグリン，r-cFA: 組換型シトルリン化フィラグリン，IB: 免疫ブロット法，ELISA: 固相化酵素抗体法

初診時診断未確定関節炎100例の転帰

初診時抗CCP抗体 F

転 帰 ＋ －

(35) (65)

RA ２２ ９

RA疑い（DMARDs on） ５ ３

他のリウマチ性疾患 ７ ３０

診断未確定 １ ２３

77%

23%

18%

82%

P<0.00001

初診時RF F

＋ －

(48) (52)

２０ １１

５ ３

１５ ２２

８ １６

52%

48%

27%

73%

P=0.010

1

2

3

4

5

6

0M 3M 6M 12M 24M 36M

*

* * * *

* * * *

†

* P<0.001 for 0M† P<0.05 for 0M

P=0.0005

P=0.012

抗CCP抗体≧20 ： 17例抗CCP抗体＜20 ： 11例

DA

S-28

RAのDAS28による臨床経過と抗CCP抗体

High Activity

Moderate Activity

Low Activity

Remission

治療開始後期間

抗CCP抗体とRAの治療

抗CCP抗体

使用薬剤 ≧20 ＜20

（22例） （17例）

Glucocorticoid 41% 35%

Bucillamine 64% 41%

Sulfasalazine 45% 35%

MTX 41% 18%

GST 14% 6%

Auranofin 5% 29%

Actarit 5% 18%

Misoribin 5% 0

Leflunomide 5% 0

Cyclosporine 5% 0

Biologics 5% 0

DMARDs Combination 59% 6% P=0.0043

P=0.022

10

15

20

25

30

0M 12M 24M 36M

抗CCP抗体≧20 ： 15例抗CCP抗体＜20 ： 9例

*

*

*

†

* P<0.05 for 0M† P<0.1 for 0M

Lar

sen S

core

抗CCP抗体と関節X線所見進行度の関連

N.S.

初診後観察期間

RA診療上の抗CCP抗体の意義

• 抗CCP抗体はRAと非RAの早期の層別化に優れ，早期診断

の最も有用な血清マーカーである

• 抗CCP抗体は関節破壊の進行を予測する

• 抗CCP抗体は臨床経過を予測する（ただし疾患活動性マー

カーとしては不適）

➤ 2007年4月健康保険点数収載（210点）

➤ RA新分類基準（EULAR/ACR 2009）に採用

RAを疑うが診断基準を満たさない場合

• 抗CCP抗体陽性→RAとして抗リウマチ薬治療開始

• 抗CCP抗体陰性→他疾患の鑑別，経過観察

1 med-large joints 0

2-10 med-large joints 1

1-3 small joints 2

4-10 small joints 3

>10 joints (at least one small joints) 5

Neither RF or ACPA positive 0

At least one test low positive titer 2

At least one test high positive titer 3

<6 weeks 0

≥6 weeks 1

Neither CRP or ESR abnormal 0

Abnormal CRP or abnlormal ESR 1

JOINT INVOLVEMENT (0-5)

SEROLOGY (0-3)

DURATION of SYNOVITIS (0-1)

ACUTE PHASE REACTANTS (0-1)

RA改訂新分類基準 (EULAR/ACR 2009)（その２）

合計６点以上をRAと分類する

新基準の目的・早期からRAを診断・MTXを早期から使用・関節破壊の阻止

「早期から強力な抗リウマチ療法

を行なうべし」との考え

「治療機会の窓」（Window of Therapeutic Opportunity）

→RAの骨破壊は早期（発症から2年以内）に進行が早い

→RAの早期ほど抗リウマチ薬の有効性が高い

Treat-to-Target （T2T）（EULAR2009）

→ある治療目標が達成できるようにTight Controlを行う

→寛解（DAS28<2.6）、尐なくとも低活動性（DAS28<3.2）を目標とする

Window of Therapeutic

Opportunity

RAにおける関節破壊の進行と治療介入

生物学的製剤の種類と構造

キメラ型抗体 ヒト化抗体 完全ヒト型抗体

・インフリキシマブ（抗TNFa）・リツキシマブ（抗CD20）

・トシリズマブ（抗IL-6R） ・アダリムマブ（抗TNFa）・ゴリムマブ（抗TNFa）

受容体・IgG-Fc融合蛋白

・エタネルセプト（TNF受容体）・アバタセプト（CTLA4）

PEG化抗体

・セルトリズマブ（抗TNFa）

PEG

RAの治療戦略の変化

初期治療

従来の治療

通常のDMARDs

無効の場合

他のDMARDs

を追加・変更生物学的製剤を追加・変更

有効の場合

初期治療

単独療法または併用療法

現在の治療の考え方

DMARDs 生物学的製剤

無効の場合

併用療法生物学的製剤の減量または中止

寛解導入

• 抗TNF療法は重症例に対する最終手段ではなく、早期から積極的に導入すべきである（EULAR2007）

自己抗体測定の臨床的意義

1．膠原病の補助診断 抗Sm抗体→ SLE

抗Scl-70抗体→ 強皮症

抗Jo-1抗体→ 多発性筋炎

ANCA→ 血管炎症候群

抗CCP抗体→RA

2．病型分類 抗dsDNA抗体→ ループス腎炎

抗Scl-70抗体→ びまん型強皮症

抗Jo-1抗体→ 間質性肺炎合併筋炎

抗SS-A/Ro抗体→新生児ループス

3．疾患活動性の指標 抗dsDNA抗体→ SLE

C-ANCA → ウェジナー肉芽腫症

4．予後・重症度の推定 抗Scl-70抗体→ 重症肺線維症

抗CCP抗体→RA関節破壊