Генетика и селекция на индустриални...

Генетика и селекция на

индустриални микроорганизми

Мутационно-селекционен подход за подобряване на

индустриални щамове микроорганизми

• Води до промени в генотипа в резултат на мутация или генетична

рекомбинация

Геномни мутации: промени в броя на хромозомите

Хромозомни мутации: промени в подредбата на гените върху

хромозомата

Точкови мутации: замени в нуклеотидната последователност на

гените

• Успехът на процеса зависи от оптималното приложение на мутагенния

фактор в комбинация с използването на ефективна система за селекция на

високопродуктивни щамове



Основни мутагенни фактори:

• Мутагенеза чрез облъчване:

Облъчване с UV лъчи с дължина на вълната 200-300 nm, с оптимум

при 254 nm (абсорбционния максимум на ДНК).

Основния продукт от действието на UV лъчите е получаването на

димери (тимин-тимин, тимин-цитозин и цитозин-цитозин) между

съседно стоящи пиримидини или пиримидини на комплементарните

вериги. UV лъчите основно предизвикват транзиции, трансверзии,

мутации с изместване рамката на четене (frameshift) или делеции.

NH

N N

N

R R

O O

O NH2

CH3

• Мутагенеза с химични агенти:



N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин – един от най-

ефективните химични мутагени. 90% от мутациите

предизвикани от нитрозогуанидин са GC -->AT транзиции;

рядко но може да предизвика и появата на делеции или на

“frameshift” мутации

етилен

етил метил сулфонат

Други фактори оказващи влияние върху мутационно-селекционния подход:

избор на подходящ мутаген за дадения щам

система за скрининг

избор на подходящи условия за култивиране

HN = C – N – NO2

O = N – N – CH3



Етапи мутационно-селекционния подход:

Мутационна биосинтеза

• Блокиране чрез мутация на определена стъпка от биосинтезата

на даден антибиотик

• Добавяне в хранителната среда на различни естествени или

синтетични прекурсори

• Синтез на нов антибиотик

А

С

В

D

DB

DE

E

a

Мутационна биосинтеза

Примери за мутационна биосинтеза:

Оригинален антибиотик Нов антибиотик Микроорганизъм продуцент

Пиролнитрин 4-флуоропоролнитрин Pseudomonas aureofaciens

Дауномицин Адриамицин W Streptomyces peuceticus

Рифамицин В Рифамицини Nocardia mediterranei

Сизомицин Мултамицини Micromonospora inyoensis

Стрептомицин Стрептомутин Streptomyces griseus

Пеницилин N 6-(D)-(2-амино-2-карбокси)

етилтиоацетамидо-пеницилин Acremonium chrysogenium

Гентамицин Хидрокси и деокси-

гентамицин Micromonospora purpurea

Дерегулация на метаболитни пътища

Блокиране или промяна в регулацията на даден метаболитен

път – изолиране на ауксотрофни или регулаторни мутанти

• свръхпродукция на аминокиселини

Asp Asp-P Asp-CHO Hse Met

Lys Thr

инхибиране

Аспартат киназа

S-(2-аминоетил) – L цистеин

Дерегулация на метаболитни пътища

• свръхпродукция на нуклеотиди –

блокирането на аденил синтетаза

нуклеозидаза

свръхпродукция на

инозин

пролин

глутамат

аргинин

бацитрацин

орнитин

• свръхпродукция на други метаболити

Сливане на протопласти

Основна техника за въвеждане на генетична рекомбинация при

про- и еукариотни микроорганизми

• Грам (+) – третиране с лизозим

• Грам (-) – комбинирано третиране с лизозим, ЕДТА и изотоничен разтвор на

захароза

• Гъби

дрожди – третиране с ензими, разграждащи глюко-манановия комплекс

и хитина /хеликаза, зимолиаза/

плесенни гъби – третиране с по-сложен езимен комплекс /глюканаза,

хитиназа, целулаза или литичен комплекс, получен от Streptomycetes/


Регенериране на протопласти

осъществява се при

• бактерии: в осмотично стабилизирани агаризирани среди

• гъби: в осмотично стабилизирани твърди или течни среди

честота на реверсия: силно варира във вида и между различните видове

Детекция на рекомбинантни щамове

• хранителна комплементация на ауксотрофни мутанти

• специфична устойчивост към токсични агенти

• комбинация от двете


• Brevibacterium glutamicum – повишаване синтезата на Lys и

съкращаване с 2/3 времето за култивиране

• Cephalosporium acremonium – висока скорост на растеж,

повишена спорулация, синтез на цефалоспорин от неорганичен

сулфат, 40% увеличена антибиотикопродукция

• Streptomyces rimosus var. kanamyceticus и Streptomyces

kanamyceticus – синтез на неомицин

• Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccaromyces pombe –

ензимни системи и на двата родителски вида

Приложение

Насочена мутагенеза

• Цел

насочена промяна в определени базови двойки в

нуклеотидната последователност

случайна промяна в oпределен ДНК регион

Този метод позволява въвеждане на промени във всеки един

участък на гена от интерес и последващо проследяване на ефекта

на тези промени върху функциите и активността на кодирания от

него белтък.

добро познаване на нуклеотидната последователност на

гена от интерес, или

информация за структурата на кодирания белтък и

значението на изграждащите го аминокиселини за

каталитичния акт

• Основа

третиране с химични агенти на изолирани ДНК региони

(метоксамин)

грешно инкорпориране на нуклеотиди (error-prone PCR)

олигонуклеотид насочена мутагенеза

• Подходи


алкална фосфатаза – замяна на Lys222 с Ala222

увеличена устойчивост на 1М Н2О2;

с 50% по-висока ензимна активност

• Примери


• Примери

въвеждане на дисулфидни мостове – увеличена Т0 и pH

стабилност

Т4 лизозим –

родителски щам: полуживот 11 min на

670С и pH 8.0

мутантен щам: полуживот 6 h на 670С и

pH 8.0

триозофосфат изомераза – замяна на двата Asp

остатъка, дезаминиращи се при термична денатурация

с два Thr остатъка

2 пъти по-висока термостабилност

ДНК рекомбинация in vitro - стратегия

Техника подходяща за случаите, когато броят на гените, участващи

в синтезата на даден продукт, е относително малък.

1. Избор на белтък, чийто ген ще бъде

клониран

2. Избор на ДНК, съдържаща подходящия

ген

3. Избор на подходящ вектор

4. Рекомбинация между векторната и

донорната ДНК

5. Трансформация

6. Селекция на клетки, съдържащи

рекомбинантната ДНК

7. Изолиране на амплифицираната ДНК и

характеризиране

8. Генна модификация

9. Инсерция на модифицираните гени в

съвместим експресионен вектор

10. Трансформация

11. Култивиране на клетките, изолиране и

характеризиране на плазмида

12. Култивиране на клетките, продуциращи

желания продукт

ДНК рекомбинация in vitro при бактерии

Подготовка и клониране на ДНК фрагментите

• PCR амплификация на желания ДНК фрагмент, или

• получаване на кДНК (RT-PCR)

• срязване на ДНК фрагмента и избрания вектор с подходящи

ендонуклеазни ензими

• лигазна реакция

Бактериални вектори

• плазмидни вектори

ori за репликация

маркер за селекция

(антибиотична резистентност)

единични сайтове за рестрикция


• фагови вектори – получават се бактериофаги на E. coli и С31

актинофага на Streptomyces lividans

клониране на токсични за клетката гостоприемник продукти


Въвеждане на ДНК

• трансформация

естествена трансформация

получаване на протопласти

електропорация

“gunshot” метод

• конюгация

• трансдукция


• космидни вектори

клониране на дълги фрагменти от ДНК

получаване на геномни библиотеки

• совалкови вектори


Детекция на клона, съдържащ желания ДНК фрагмент

• въз основа на получения белтък

- комплементационен тест, антранилат синтаза (trpE)

- детекция със специфични антитела

• въз основа на ДНК

последователността



Експресия на клонираните гени - използване на експресионни вектори

• силни конститутивни промотори – води до загуба на плазмид

• индуцируеми промотори (pLac; pTrp; pL и pR)

• формиране на инклузионни тела – силно редуцираща цитоплазма и

невъзможност за правилно нагъване и формиране на S-S мостове

Експресия на клонирани гени


• изолиране на инклузионни тела, денатурация (8М урея или 6М

гуанидин хидрохлорид) и ренатурация (внезапно, стъпаловидно или

постепенно отнемане на денатуриращия агент) на белтъка

• предотвратяване формирането на инклузионни тела

понижаване на температурата на растеж

свръхекспресия на E. coli шаперони (DnaK)

сливане с гена за тиоредоксин на E. coli

• секреторни вектори


Експресия на клонирани гени

IGF-1 IgG свързващия домен

на белтък А

Лидерен пептид

на белтък А

• експресия на слети белтъци

IgG свързващ домен на белтък А на Staphylococcus aureus

глутатион S трансфераза

6 His остатъка

периплазмена малтоза

ДНК рекомбинация in vitro при дрожди

Терапевтични продукти получени от дрожди

Животински продукти: хрудин; свински интерферон; интерлевкин;

трипсинов инхибитор

Човешки хормони: инсулин; паратироиден хормон; растежен

хормон, хорионов гонадотропин

Човешки растежни

фактори: IGF1; NGF; EGF; тъканен фактор; CSF; GM-CSF;

TNF

Човешки кръвни

белтъци: хемоглобин; фактори VIII и XIII; алфа-1-

антитрипсин; анти-тромбин III; серумен албумин

Прокариотни продукти: фрагмент C на токсина за тетанус; стрептокиназа

Повърхностни антигени

на вируси: хепатит B; СПИН; инфлуенца; полио;

полиома; Епщайн-Бар; онкогенни ретровируси

Малариен антиген -

други: Различни човешки ензими; CFTR; естрогенен

рецептор; INF-алфа; INF-бета1


Подготовка и клониране на ДНК фрагментите

Използват се методи, аналогични на тези при бактериите

Дрождеви вектори

• интегративни YIp вектори

• епизомални YEp вектори

• репликативни YRp вектори

• центромерни YCp вектори

Плазмид YIp YEp YRp YCp

________________________________________________________________________

E. coli гени или сегменти

ori, bla; tet + + + +

Дрождеви гени или сегменти

URA3; HIS3; LEU2; TRP1; LYS2; и др. + + + +

leu2-d 0 + + 0

2 m; 2 m-ori REP3; 0 + 0 0

ARS1; ARS2; ARS3; и др. 0 0 + +

CEN3; CEN4; CEN11; и др. 0 0 0 +

Меркери на гостоприемника (дрожди)

ura3-52; his3- 1; leu2- 1; trp1- 1; lys2-201; и др. + + + +

Стабилност ++ + + +

________________________________________________________________________

Компоненти на стандартните дрождеви вектори



Въвеждане на ДНК

• трансформация

Гени от особено значение в рекомбинантните технологии с дрожди

URA3 и LYS2 (оротидин -5’фосфат декарбоксилаза и -аминоадипат

редуктаза)

ADE1 и ADE2 (фосфорибозиламино-имидазол-сукцинокарбозамид

синтетаза и фосфорибозиламино-имидазол-карбоксилаза)

GAL1 промотор

AOX и MOX промотори

LAC4 промотор


Хетероложна експресия при дрожди

GRAS статус (не синтезират екзотоксини)

По-висока активност на ензимите в сравнение с тази на

експресираните в бактерии

Пост-транслационни модификации (N-крайно

ацетилиране, миристилизиране и протеолитично

срязване )

Коректно нагъване на белтъците и формиране на S-S

мостове

Възможност за секреция

Възможност за сплайсинг

Предимства и недостатъци на различните експресионни

системи

Escherichia coli

• най-добре проучените прокариоти относно биохимия и генетика

• добре развити технологии за култивиране

• добре установен последващ процесинг

• продуцира ендотоксини, които могат да замърсят продукта

• задържа извънклетъчните белтъци в периплазменото пространство

• формира инклузионни тела

Bacillus subtilis

• не е потенцилен патоген и не продуцира ендотоксини

• секретира белтъците в средата

• разработени са подходящи експресионни вектори

• лесно се трансформира

• много висока плазмидна нестабилност

Saccharomyces cerevisiae

• Получените продукти се приемат благосклонно от обществото

• Не са патогенни и притежават GRAS статус

• Най-добре проучените еукариоти относно биохимия и генетика

• Добре развити технологии за култивиране

• Добре установен последващ процесинг

• Наличност на голям брой лесно усвоими и нескъпи въглеродни източници

• Стабилни към индустриален стрес

• Относително малък геном, податлив на модификации

• Съществуват стабилни мутанти, които увеличават производителността

• Наличност на маркери за селекция на полиплоидни щамове

• Липса на вируси, които да провалят ферментационните процеси

• Съдържат плазмид (напр. 2 m плазмид);

• Възможност за автономна и интегративна трансформация

• Осъществяват пост-транслационни модификации

• Ефикасна и контролируема секреция на белтъци

• Често изрязват интроните от гените на бозайниците

• РНК полимеразара разпознава много животински промотори


системи

Candida maltosa

• усвояват n-алкани и мастни киселини

• контролираната екпресия на хетероложни протеини е с промотор P450

• продукция на целевите белтъци в специфични клетъчни органели

(ЕПР или пероксизоми)

• използват се за биотрансформация на хидрофобни органични съединения.

Hansenula polymorpha

• много висока генна експресия при използване на промоторите на

метанолоксидазата (MOX) или на формиат дехидрогеназата

• стабилна и в многокопийна интеграция на чужда ДНК

• синтеза на клетъчни белтъци при температура от 450C.

• голям набор от ауксотрофни щамове (ura-, leu- и др.)

• синтеза на белтъци, които не са хипергликозилирани

• възможност за секреция на целевите протеини или акумулирането им в

пероксизомите, когато тези белтъци са токсични.


системи

Род Kluyveromyces

• GRAS статус

• усвояват и ферментират лактоза

• имат подходящи плазмиди - Kl. lactis линейните килър плазмиди и кръговия

pKD1 плазмид, който е подобен на 2 m плазмид

Schwanomyces occidentalis

• усвояват нишесте

• могат да секретират белтъци по-големи от 140 кDa.

Род Pichia (Pichia pastoris и Pichia methanolica)

• индуцируем с метанол промотор за алкохол оксидаза (AOX)

• лесно се получават високоплътностни популации

• имат ефикасна секреция (> 1 g / L) на хетероложни протеини

• белтъците не са хипергликозилирани


системи

Yarowia lipolytica

• притежават ефикасна и прецизна интегративна трансформация

• ефикасна секреторна система, разпознаваща сигналните

последователности на висшите еукариоти

• използват ефикасно n-парафини като единствен въглероден източник.

Schizosaccharomyces pombe

• коректно изрязват интроните на бозайниците

• галактозилират белтъците както висшите еукариоти

• разстоянието от TATA-бокса до мястото за начало на транскрипцията

наподобява това при висшите еукариоти

• изолирането на хетероложни белтъци се улеснява от клетъчния лизис


системи

Генетика и селекция на индустриални...

Documents