Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования «Санкт-Петербургский государственный

педиатрический медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

КОРАБЛЕВ Родион Владимирович

ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НЕОАНГИОГЕНЕЗА И

СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА ПРИ РАЗВИТИИ НОВООБРАЗОВАНИЙ

РАЗЛИЧНОГО ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ТИПА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.03 – патологическая физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Васильев Андрей Глебович

Санкт-Петербург

2018

2

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 4

Глава 1. АНГИОГЕНЕЗ, КАНЦЕРОГЕНЕЗ И ГЕМОСТАЗ (обзор литературы) .. 13

1.1.Процесс формирования сосудов в физиологических условиях ...................... 13

1.2. Структура VEGF и его рецепторов. Функции VEGF ...................................... 17

1.4. Роль белков семейства ангиопоэтинов в ангиогенезе ..................................... 30

1.5. Роль Notch-сигнального пути в канцерогенезе и неоангиогенезе ................. 32

1.6. Роль белка p53 в канцерогенезе и ангиогенезе. ............................................... 36

1.7. Изменение системы гемостаза при развитии неопластического процесса ... 39

1.8. Антиангиогенная терапия. ................................................................................. 43

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ........................................ 47

2.1. Характеристика лабораторных животных. Информация об уходе,

содержании и эвтаназии животных .......................................................................... 47

2.2. Моделирование опухолевого процесса............................................................. 48

2.3. Обследуемые группы. ......................................................................................... 50

2.4. Методы взятия биологического материала и его первичная обработка ....... 51

2.4.1. Взятие крови у мышей. ............................................................................. 51

2.4.2. Макроскопическая оценка опухолевого поражения органов ............... 52

2.4.3. Обработка крови........................................................................................ 52

2.5. Диагностика эндотелиальных нарушений и нарушений в системе

гемостаза. .................................................................................................................... 53

2.5.1. Определение концентрации маркеров функциональной активности

эндотелия сосудов ...................................................................................................... 53

2.5.2. Диагностика нарушений коагуляционного компонента системы

гемостаза. .................................................................................................................... 53

2.6. Методы статистической обработки полученных результатов ....................... 55

3

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................................................................. 56

Глава 3. Анализ динамики маркеров состояния эндотелия кровеносных сосудов у

мышей линии FVB/N, трансгенных по HER2/neu, при развитии у них опухолей

молочной железы. .......................................................................................................... 56

3.1. Особенности развития опухолей молочной железы у мышей линии FVB/N,

трансгенных по HER-2/neu........................................................................................ 57

3.2. Исследование динамики маркеров состояния эндотелия кровеносных

сосудов в сыворотке крови у мышей линии FVB/N, трансгенных по HER2/neu.58

3.2.1. Анализ динамики сосудистого фактора роста (VEGF). ........................ 58

3.2.2. Анализ динамики инсулиноподобного фактора роста (IGF). .............. 63

3.2.3. Анализ динамики оксида азота (NO). ..................................................... 66

3.2.4. Анализ динамики тканевого активатора плазминогена (tPA). ............. 69

3.2.5. Анализ динамики активатора ингибитора плазминогена (PAI-1). ...... 72

3.3. Обсуждение. ........................................................................................................ 74

Глава 4. Характеристика неоангиогенеза и системы гемостаза при развитии

лимфоцитарной лейкемии Р-388 у мышей линии CDF1 ........................................... 83

4.1. Особенности неоангиогенеза при развитии лимфоцитарной лейкемии P-388

у мышей линии CDF1 ................................................................................................. 83

4.2. Характеристика системы гемостаза при развитии лимфоцитарной лейкемии

у мышей линии CDF1. ................................................................................................ 85

4.3. Обсуждение ......................................................................................................... 89

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................................. 96

ВЫВОДЫ ....................................................................................................................... 97

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ....................................................................... 99

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ .......................... 100

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................... 103

4

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Согласно данным ВОЗ, злокачественные новообразования остаются одной из

основных причин смертности во всем мире и представляют большую социально-

экономическую угрозу. Удельный вес злокачественных новообразований в

структуре общей заболеваемости в развитых странах продолжает расти ввиду

широкой распространенности, увеличения продолжительности жизни населения,

многообразия этиологических факторов и сложности профилактики данных

заболеваний.

Ежегодно в мире регистрируется около 14 миллионов новых случаев

заболевания раком и 8 миллионов смертей, связанных со злокачественными

опухолями. Показатель заболеваемости злокачественными новообразованиями

населения развитых стран составляет от 300 до 450 на 100 000 жителей [26].

Вероятно, количество впервые выявленных злокачественных новообразований в

следующие десятилетия увеличится примерно на 70% и будет неуклонно расти до

25 миллионов [190]. В Российской Федерации за 2017 год впервые выявлено более

600 000 случаев злокачественных новообразований [18]. Прирост данного

показателя по сравнению с 2016 годом составил 3%.

В связи с этим, особое внимание сосредоточено на механизмах развития

злокачественных новообразований, и в частности на процессах неоангиогенеза и

нарушениях в системе гемостаза, как важнейших компонентах патогенеза

опухолевого процесса. Несмотря на относительную независимость, клетки опухоли

все же испытывают влияние микроокружения, в том числе эндотелия. Развитие и

рост злокачественных опухолей приводит к эндотелиальной дисфункции,

проявляющейся активацией неоангиогенеза и гиперкоагуляцией.

Неоангиогенез - показатель перехода клеток от состояния гиперплазии к

5

неоплазии, т.е. перехода от контролируемого клеточного роста к росту

неконтролируемому. Неоваскуляризация большинства злокачественных опухолей

– один из показателей их метастатического потенциала и индикатор прогноза

онкологического заболевания [65].

Без кровеносных сосудов опухоль вскоре теряет способность к росту и

метастазированию, но без эффективной сети кровоснабжения и

химиотерапевтические препараты не в состоянии достигнуть всех участков

опухоли в необходимых концентрациях. Согласно современным представлениям,

взаимодействие опухоли и ее сосудистой сети двунаправленно, поскольку

опухолевые клетки инициируют неоангиогенез, продуцируя ангиогенные факторы,

а новообразованное сосудистое русло обеспечивает опухоль пластическими

субстратами и экспрессирует факторы, способствующие опухолевой прогрессии

[69]. Наиболее изученным маркером интенсивности неоангиогенеза является

фактор роста эндотелия сосудов (VEGF-А).

Патологические изменения в системе гемостаза у больных

злокачественными новообразованиями входят в структуру паранеопластических

синдромов и проявляются разнообразными гемостатическими нарушениями от

кровоизлияний до тромбозов и ДВС-синдрома. Тромботические осложнения у

онкологических больных составляет около 20% всех венозных тромбоэмболий,

занимая второе место в структуре причин смерти данной категории пациентов

[139]. У пациентов со злокачественными новообразованиями риск развития

тромботических осложнений в среднем в 7 раз выше, а при некоторых видах

злокачественных опухолей в 20-30 раз выше, чем у больных неонкологического

профиля [54]. Венозные тромбозы подчас могут быть первыми клиническими

проявлениями недиагностированных злокачественных опухолей.

В основе патогенеза паранеопластического гиперкоагуляционного синдрома

лежит активация коагуляционного и сосудисто-тромбоцитарного звеньев системы

гемостаза. Этот синдром реализуется через сложную систему взаимодействий:

тромбоцит – эндотелий – опухолевая клетка. Опухолевые клетки могут напрямую

6

активировать коагуляционный каскад, секретируя собственные прокоагулянты,

или стимулировать тромботический потенциал других клеток крови [95; 144].

Помимо этого, терапия онкологических заболеваний, как правило, требует

коррекции системы гемостаза антиагрегантами и антикоагулянтами. Комплексное

изучение активности неоангиогенеза и нарушений в работе системы гемостаза

чрезвычайно актуально, поскольку разработка и внедрение методов, эффективно

препятствующих этим процессам, могли бы существенно влиять на прогноз и

течение онкологического заболевания.

Степень разработанности темы исследования

Вопросы влияния ангиогенных факторов на прогрессию и метастазирование

опухоли является предметом изучения онкологов на протяжении последних

нескольких десятилетий. Положительная роль антиангигенной терапии у больных

онкологического профиля, несмотря на доказанную терапевтическую

эффективность остается спорной, кроме того она зачастую носит временный

эффект [34].

Данное исследование основано на материалах научных работ большого

числа российских и зарубежных авторов [11; 12; 23; 34; 38; 91; 92; 111; 122; 187], в

которых приведен анализ особенностей неоангиогенеза и тромбоэмболических

осложнений при злокачественных опухолях различной локализации, а также

возможные методы их коррекции.

Несмотря на большой объем публикаций, механизмы сосудистых нарушений

при развитии злокачественных опухолей на сегодняшний день остаются

недостаточно изученными. Информация о возрастных особенностях этих

нарушений достаточно фрагментарна и противоречива. Дискутабельным остается

вопрос о целесообразности применения и схемах использования антиангиогенных

препаратов при злокачественных опухолях ряда локализаций.

7

Цель: изучить патофизиологические особенности неоангиогенеза и

коагуляционного гемостаза у мышей линий CDF1 и FVB/N, трансгенных по

HER2/neu, при развитии у них злокачественных новообразований.

Задачи исследования

1. Исследовать интенсивность неоангиогенеза по изменению его основного

маркера (VEGF) в сыворотке крови самок-мышей линии FVB,

трансгенных по HER-2/neu, в процессе развития спонтанных

аденокарцином молочной железы к 9-му месяцу жизни животных.

2. Выявить период наиболее интенсивного неоангиогенеза у самок-мышей

линии FVB, трансгенных по HER-2/neu, по мере роста у них спонтанных

аденокарцином молочной железы.

3. Исследовать динамику основных маркеров эндотелиальной дисфункции

(IGF-1, NO, tPA, PAI-1) у самок-мышей линии FVB, трансгенных по HER-

2/neu, в ходе развития у них спонтанных аденокарцином молочной

железы.

4. Исследовать динамику основных маркеров эндотелиальной дисфункции

(VEGF, IGF-1, NO, tPA, PAI-1) у самцов-мышей линии FVB, трансгенных

по HER-2/neu, на 6 месяце жизни.

5. Исследовать динамику интенсивности неоангиогенеза по величине его

основного маркера (VEGF) в сыворотке крови мышей линии CDF1 по мере

развития перевиваемой лимфоцитарной лейкемии P-388.

6. Исследовать динамику изменений состояния системы гемостаза у мышей

линии CDF1 по мере развития перевиваемой лимфоцитарной лейкемии P-

388 при помощи основных коагуляционных тестов (АЧТВ, ПВ, наличие

фибриногенемии).

8

Научная новизна исследования

Впервые проведено систематическое сравнительное исследование

особенностей неоангиогенеза и изменений системы гемостаза у мышей 2 линий:

FVB, трансгенных по HER2/neu, с последующим развитием у них аденокарцином

молочных желез, а также линии CDF1, которым был перевит штамм

лимфоцитарной лейкемии P-388.

В результате исследования впервые установлено, что развитие

аденокарцином молочной железы у мышей линии FVB, трансгенных по HER2/neu,

и перевиваемой лейкемии Р-388 у мышей линии CDF1 сопровождается выраженной

эндотелиальной дисфункцией, активацией неоангиогенеза, нарушением

функционирования всех компонентов системы гемостаза, приводящими к

гиперкоагуляции.

Впервые показано, что у мышей линии FVB/N, трансгенных по HER2/neu,

наибольшие выраженные сосудистые нарушения развиваются в период

интенсивного роста опухолевого узла с последующей тенденцией к снижению

непосредственно перед гибелью животного. При этом у мышей линии CDF1,

которым был перевит штамм лимфоцитарной лейкемии P-388, наибольшие

интенсивные сосудистые нарушения развиваются непосредственно перед гибелью

животных.

Оригинальные результаты исследования дополняют теоретические данные о

роли активаторов ангиогенеза в аспекте опухолевой прогрессии и

метастазирования, а также их взаимосвязь с тромбоэмболическими осложнениями

у больных онкологического профиля. Поиск новых методов ранней диагностика и

эффективной коррекции данных патологических процессов позволит существенно

влиять на исход онкологического заболевания.

9

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в данной экспериментальной работе данные уточняют

представления о характере изменений системы гемостаза и особенностях

неоангиогенеза при развитии солидных опухолей (на примере опухоли молочных

желез) и гемобластозов (на примере перевиваемой лейкемии Р-388). В

исследовании показано, что развитие аденокарцином молочной железы и лейкемии

Р-388 у мышей приводит к активации неоангиогенеза и сопровождается

значительными нарушениями в системе гемостаза. Установленный в работе факт

усиления ангиогенного потенциала эндотелия и дисфункции гемостатических

механизмов при лейкемии Р-388 и аденокарциномах молочных желез служит

теоретическим обоснованием возможности и целесообразности использования

этих моделей опухолевого роста при изучении паранеопластического синдрома

Труссо.

Результаты исследования дополняют знания о патофизиологических

аспектах сосудистых нарушений, развивающихся в результате неопластического

процесса, расширяют представления о роли основных активаторов ангиогенеза в

прогрессировании злокачественных опухолей и метастазировании, свидетельствуя

о важности оценки данных показателей на фоне развивающегося опухолевого

процесса.

Результаты исследования обосновывают применение антиангиогенных

препаратов и антикоагулянтов (при отсутствии противопоказаний) в комплексной

терапии ряда злокачественных новообразований.

Методология и методы исследования

Методологическая основа исследования представляла собой

последовательное применение методов научного познания: от сравнительного

анализа данных литературных источников к сравнительно-сопоставительному

анализу данных, полученных в исследовании. Нами были выбраны информативные

10

методы, достоверно отражающие степень эндотелиальной дисфункции и

нарушения в работе системы гемостаза подопытных животных, которые

выполнялись на базе ГБОУ ВО СПбГПМУ Минздрава России (г. Санкт-

Петербург). Материалом для иммунологических исследований

(иммуноферментный анализ) служила сыворотка крови животных, для оценки

гемостатической функции крови – обедненная тромбоцитами плазма.

Статистический анализ полученных результатов проводился при помощи пакета

прикладных программ статистической обработки данных STATISTICA 10.0 («Stat

Soft®»).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Развитие спонтанных аденокарцином молочной железы у самок-мышей

линии FVB, трансгенных по HER-2/neu, происходит к 9-му месяцу жизни в 100%

случаев; развитие этих опухолей сопровождается активацией неоангиогенеза с

достоверным увеличением его основного маркера (VEGF) в сыворотке крови по

мере развития заболевания. У самцов мышей линии FVB, трансгенных по HER-

2/neu, также выявлено достоверное повышение концентрации VEGF на 6 месяце

жизни.

2. Изменения неоангиогенеза у самок-мышей линии FVB, трансгенных по

HER-2/neu, по мере развития спонтанных аденокарцином молочной железы имеет

возрастные особенности: наибольшая интенсивность неоангиогенеза наблюдается

в возрасте 6 месяцев – периоде максимально интенсивного и агрессивного роста

опухоли с последующей тенденцией к снижению в возрасте 9 месяцев.

3. По мере развития аденокарциномы молочной железы у самок-мышей

линии FVB, трансгенных по HER-2/neu, происходит достоверное снижение

сывороточной концентрации NO и tPA, что может свидетельствовать о

вовлеченности данных показателей в патогенез опухолевого процесса, при

отсутствии достоверных изменений концентрации IGF-1 и PAI-1 в сыворотке

крови.

11

4. Развитие лейкемии Р-388 у мышей линии CDF1 приводит к 5-суткам жизни

к выраженному увеличению интенсивности неоангиогенеза с достоверным

повышением сывороточной концентрации VEGF: максимальные его уровни

наблюдаются на 8-9 сутки исследования, непосредственно перед гибелью

животных.

5. Развитие лейкемии Р-388 у мышей линии CDF1 сопровождается

развертыванием выраженного синдрома гипрекоагуляции, с достоверным

снижением показателей АЧТВ и ПВ и достоверным повышением сывороточной

концентрации фибриногена к 5-суткам исследования с максимумом на 8-е сутки

перед гибелью животных.

Степень достоверности и апробация работы

Достоверность результатов настоящего исследования определяется

репрезентативным объемом групп экспериментальных наблюдений, применением

современных методов статистической обработки данных, адекватных задачам

исследования.

Основные положения работы доложены на научно-практическом семинаре

«Наследственная и приобретенная патология свертывания крови – тромбозы и

кровотечения: диагностика, профилактика, лечение, экономика» (Санкт-

Петербург, 2013), I Всероссийской научно-практической конференции с

международным участием «Инновации в здоровье нации», (Санкт-Петербург,

2013), Межгородской конференции молодых учёных «Актуальные проблемы

патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2014).

Публикации по теме диссертации

По материалам исследования опубликовано 8 печатных работ в российских

рецензируемых изданиях, в том числе 5 научных публикаций в журналах,

рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

12

Личное участие автора в получении результатов

Постановка цели и задач работы, составление совместно с научным

руководителем программы исследования, аналитический обзор отечественной и

зарубежной литературы по изучаемой проблеме (100%),

проведение серии экспериментов по воспроизведению опухолевых моделей у

лабораторных животных (95%), получение результатов исследования (95%),

статистическая обработка данных (100%). В целом личный вклад автора в

исследование превышает 85%.

Диссертационная работа соответствует паспорту специальности

14.03.03 – патологическая физиология по пунктам П. 2, П. 9, П. 10.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, включает

введение, 4 главы (обзор литературы, описание материалов и методов

исследования, результаты собственных исследований и их обсуждения,

заключение, выводы, практические рекомендации), список литературы,

состоящий из 210 литературных источников (40 отечественных и 170

иностранных). Работа содержит 8 таблиц и 20 рисунков.

13

Глава 1. АНГИОГЕНЕЗ, КАНЦЕРОГЕНЕЗ И ГЕМОСТАЗ (ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Процесс формирования сосудов в физиологических условиях

Кровеносная система в развивающемся организме является важнейшей

функциональной системой. Образование нормальной сети кровоснабжения крайне

важно для дальнейшего развития эмбриона и плода. Формирование единой сети

кровеносных сосудов в период эмбрионального развития обеспечивается двумя

механизмами: васкулогенезом и ангиогенезом.

В ходе васкулогенеза происходит образование новых кровеносных сосудов

из эндотелиальных клеток-предшественников (ЭПК). ЭПК являются гетерогенной

популяцией, характеризующейся экспрессией различных поверхностных

маркеров: CD14+, CD34+, CD133+, VEGFR2+, CD31+, CD144+. Основным

источником ЭПК в постнатальный период является костный мозг, к

альтернативным относятся мезенхимальные клетки и тканевые резидентные клетки

[166; 185].

В процессе васкулогенеза ассоциации гемангиобластов образуют островки,

внутренние клетки которых дифференцируются в гемопоэтические стволовые

клетки, дающие пул всех клеток крови, в то время как наружные клетки становятся

ЭПК (aнгиобластами). ЭПК являются высоко инвазивными клетками, поскольку их

движение через эмбриональную мезодерму происходит во всех направлениях. В

процессе эмбрионального развития миграция и пролиферация ЭПК

сопровождается экспрессией гликопротеинов (фибронектина и ламинина), что

обусловливает адгезию эндотелиальных клеток на базальной мембране и

дальнейшую дифференцировку примордиальных сосудов [154].

До конца прошлого века считалось, что в постнатальный период

формирование новых сосудов осуществляется только благодаря ангиогенезу.

14

Однако проведенное Asahara исследование показало, что популяция ЭПК,

выделенная из периферической крови человека и имеющая основные

поверхностные маркеры CD34+ и CD 133+, in vitro способна дифференцироваться

в клетки с фенотипом зрелых эндотелиальных клеток, что обеспечивает

реваскуляризацию в условиях тканевой ишемии [47]. Таким образом удалось

установить, что образование новых сосудов происходит также за счет

васкулогенеза. Дальнейшие исследования позволили идентифицировать две

субпопуляции ЭПК по скорости формирования характерных клеточных колоний:

ранние ЭПК (CD 133+/CD34+/VEGF+ клетки) и поздние ЭПК (CD31+/Flk-l+/vWF+

клетки) [46].

Ранние и поздние ЭПК отличаются в основном своим пролиферативным

потенциалом. Ранние ЭПК характризуются низкой пролиферативной активностью

и экспрессируют маркеры, специфичные для зрелых эндотелиальных клеток, что

недостаточно способствует перфузии in vivo. Поздние ЭПК могут поддерживаться

в клеточной культуре и характеризуются большим пролиферативным

потенциалом. Поздние ЭПК играют ключевую роль в неоангиогенезе in vivo,

являясь сосудоформирующими.

Согласно современным представлениям под ангиогенезом понимают

процесс образования новых кровеносных сосудов из уже существующих сосудов.

Ангиогенез происходит в интактных и патологически измененных тканях

эукариотических организмов под влиянием ауто- и паракринных регуляторов [35].

По мере развития эмбриона из эндотелиальных клеток появляются примитивные

сосудистые сети. Ассоциируясь с гладкими миоцитами, эндотелиоциты образуют

множественные ветвления. Формируется обширная сосудистая сеть, способная

реагировать на потребности ткани, как на местном, так и на системном

уровне. Конечным результатом является возможность поддержания капиллярной

сетью каждой клетки, что позволяет клеткам получать питательные субстраты и

кислород, а также экспортировать свои продукты (цитокины, гормоны,

вазоактивные пептиды, продукты метаболизма и др.) [172].

15

Ангиогенез считается физиологическим процессом в эндометрии в

фолликулярную фазу менструального цикла, при заживлении ран или при

коллатерализации, обусловленной ишемией [70; 91; 132; 204]. Патологический

неоангиогенез наблюдается при злокачественных новообразованиях, псориазе,

диабете, эндометриозе и др. [84; 129; 174].

Ключевым стимулом для инициации ангиогенеза является состояние, при

котором метаболические потребности ткани в кислороде превышают

перфузионную способность сосудов [29; 167]. В условии гипоксии происходит

активация проангиогенных генов, что приводит к экспрессии активаторов

ангиогенеза и запуску механизмов образования новых сосудов для возобновления

трофики участков поврежденных тканей. По достижении необходимого эффекта

происходит активация антиангиогенных генов, экспрессируются ингибиторы

ангиогенеза, и рост сосудов прекращается. В частности, процессы ангиогенеза

находятся под контролем гена Гиппель-Ландау (VHL), локализованным в 3р25

хромосоме [50].

Сниженная экспрессия гена VHL обуславливает наследственный синдром,

наследуемый по аутосомно-доминантному типу и проявляющийся активацией

неоангиогенеза и повышенным риском развития злокачественных

новообразований различной локализации (головной мозг, надпочечники, почки,

поджелудочная железа и др.) [34].

Продуктом кодирования VHL является белок pVHL, состоящий из 213

аминокислот. При достаточной концентрации кислорода в тканях и сохранности

гена VHL, pVHL входит в состав компонента распознавания комплекса убиквитин-

Е3-лигазы, направленного на гипоксия-индуцибельный фактор-альфа (HIFα),

который состоит из 2 субъединиц (HIF1α и HIF1β) [78]. Субъединица гена HIF1a –

одна из основных регуляторов клеточного адаптативного ответа, синтез которого

значительно повышается в условиях тканевой гипоксии. В условиях же

нормальной или повышенной концентрации кислорода pVHL связывается с

гидроксипролином и убиквитированным HIFa, образуя комплекс, что влечет за

16

собой деградацию HIFa в протеасомах. При нарушении стабильности гена VHL

pVHL не синтезируются, что также наблюдается в условиях тканевой гипоксии.

При этом концентрация HIFla возрастает, не происходит полное его

убиквитирование. В результате концентрация свободного HIFla в тканях

повышается, происходит димеризация HIF1α с его изоформой HIF1β, что ведет к

транскрипции гипоксия-индуцибельных генов и повышенной экспрессии VEGF и

PDGF [5; 68].

Вышеописанные процессы приводят к инициации ангиогенеза.

В настоящее время накоплено большое число работ, освещающих

последовательность этапов ангиогенеза. На начальных этапах активированные

перициты, тесно контактирующие с эндотелием, укорачивают свои отростки и

увеличиваются в объеме, происходит ослабление межклеточных контактов.

Перициты проецируются в периваскулярное пространство, базальная мембрана

деградирует, и происходит диссоциация перицитов и эндотелия [90].

Несмотря на то, что на первичных этапах врастания эндотелиоцитов во вновь

васкуляризуемую ткань процесс может протекать без участия перицитов, в

дальнейшем именно перициты локализуются по линии эндотелиального врастания

и образуют отростки, тем самым направляя вновь формирующиеся сосуды [155].

Эндотелиальные клетки начинают ответвляться в направлении Ang-1

продуцирующей ткани и продуцируют ферменты, в том числе матриксные

металлопротеиназы (MMPs), катепсины и активаторы плазминогена, приводящие

к деградации базальной мембраны, при этом матриксные металлопротеиназы

являются основными протеолитическими энзимами, принимающими участие в

этом процессе. При расщеплении белков внеклеточного матрикса образуются их

фрагменты, оказывающие как про-, так и антиангиогенные эффекты. Лизис белков

внеклеточного матрикса регулируется ингибиторами протеаз (uPA, PAI).

Ослабление межклеточных контактов между эндотелиоцитами и разрушение

базальной мембраны способствуют последующей миграции эндотелиоцитов в

периваскулярное пространство при участии молекул клеточной адгезии и

17

интегринов, лигандами для которых служат белки внеклеточного матрикса

(фибронектин, ламинин, витронектин) [117].

Клетки эндотелия начинают активно пролиферировать, формируя

каналоподобные структуры, впоследствии модифицирующиеся в зрелые

кровеносные сосуды. Отдельные микрососуды объединяются в общую

циркуляторную сеть, через которую осуществляется перфузия тканей (рис. 1). До

этой точки целостность и выживание эндотелиальных клеток зависят от VEGF [35;

189].

Рис.1 Этапы ангиогенеза. (Clapp C. et al., 2009)

1.2. Структура VEGF и его рецепторов. Функции VEGF

Факторы, входящие в семейство VEGF, являются основными

проангиогенными факторами, инициирующими ангиогенез. Впервые данные белки

были описаны в 1989 г. как гепарин-связывающие ангиогенные факторы роста,

18

оказывающие специфическое митогенное воздействие на эндотелиальные клетки

[83].

Семейство VEGF включает 5 факторов: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-

D и PLGF (плацентарный ростовой фактор) (рис. 2). VEGF-A является основным

фактором, стимулирующим митоз эндотелиоцитов, усиливающим сосудистую

проницаемость и формирование новых капилляров. VEGF-B, как полагают, играет

роль в клеточной адгезии, миграции, регуляции деградации внеклеточного

матрикса, а VEGF-C и VEGF-D участвуют, главным образом, в лимфангиогенезе.

PLGF в большом количестве экспрессируется трофобластом, определяя развитие

сосудистой сети в плаценте.

Рис. 2. VEGF и его рецепторы. (Samar Masoumi Moghaddam et. al., 2011)

VEGF-A включает 4 изоформы (VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206),

образующиеся в результате альтернативного сплайсинга мРНК VEGF [175].

19

VEGF165 является основным фактором, продуцируемым большинством

интактных и трансформированных клеток. VEGF121 и VEGF189 могут определяться

на всех клетках, экспрессирующих ген VEGF. VEGF206 является редкой формой,

обнаруженной в печени эмбриона человека.

Способность связывать гепарин определяется размером молекулы VEGF.

Так наибольшим сродством к гепарину обладают VEGF189, VEGF206, в то время как

VEGF165 обладает меньшей гепарин-связывающей способностью, а VEGF121 не

обладает такой способностью вовсе [210].

VEGF189, VEGF206 связаны с внеклеточным матриксом, но могут

высвобождаться под действием плазмина или же матричной металлопротеазы-9.

VEGF121 и VEGF165 являются растворимыми формами, способными к диффузии,

следовательно, более доступными для эндотелиоцитов [158; 196].

Биологические эффекты VEGF осуществляются при помощи

комплементарных рецепторов VEGFR-1 и VEGFR-2, являющихся

тирозинкиназами (трансмембранными гликопротеидами с молекулярной массой

170—235 кДa). Оба рецептора имеют внеклеточную часть, состоящую из 7

иммуноглобулиновых доменов, трансмембранный регион и внутриклеточный

тирозин-киназный домен, разделенных интеркиназной вставкой.

VEGFR-1 экспрессируются на гемопоэтических стволовых клетках,

моноцитах и эндотелиоцитах. VEGFR-2 экспрессируется на эндотелиоцитах и

эндотелии лимфатических сосудов, в то время как VEGFR-3 экспрессируется

только на эндотелиальных клетках лимфатических сосудов [160].

VEGFR-1 связывается с VEGF c десятикратной афинностью выше, чем

VEGFR-2, однако данное взаимодействие сопровождается недостаточным

фосфорилированием внутриклеточного домена рецептора, следовательно, мало

влияет на пролиферативный потенциал эндотелиоцитов [66]. Согласно

исследованию Hiratsuka, у эмбрионов мышей с индуцированной мутацей,

сопровождающейся потерей внутриклеточного тирозин-киназного домена VEGFR-

1, но с сохраняющимся внеклеточным доменом VEGFR-1 наблюдался нормальный

20

ангиогенез. Таким образом, VEGFR-1 рассматривался в качестве лиганд-

связывающей молекулы [112].

По данным Holmes, функция VEGFR-1 состоит в рекрутировании

гемопоэтических стволовых клеток и усилении миграции моноцитов и макрофагов

[115].

Ангиогенные эффекты VEGF-А реализуются преимущественно через

VEGFR-2. Но несмотря на то, что связь VEGF c рецептором VEGFR-2 обладает

аффинностью в 10 раз меньше, чем с VEGFR-2, фосфорилирование

внутириклеточного домена происходит эффективнее [103].

Взаимодействие VEGF с рецептором VEGFR-2 приводит к димеризации

рецептора, за которым следует аутофосорилирование рецептора каталитического

домена, запускающий сигнальный путь PI3K/v-akt (более известный как Akt), Raf

и MAP2K, после чего происходит фосфорилирование MAPK (Erk). Akt – один из

главных сигнальных путей, защищающих клетки от апоптоза. В результате

усиливается экспрессия антиапоптических белков Bcl2, XIAP, Bcl-A1, сурвивина,

циклинов и циклин-зависимых протеинкиназ, что в конечном счете приводит к

выходу эндотелиоцитов из G0-фазы клеточного цикла [38].

Активация MAPK фосфорилирует множество ядерных и

цитоплазматических белков, в том числе факторы транскрипции, регуляторные

белки цитоскелета, компоненты сигнального пути SOS, Raf1, RPTK-рецепторы. В

конечном счете происходит инициация пролиферации, миграция и усиление

проницаемости эндотелицитов. Активация VEGFR-2 является основным

событием, инициирующим ангиогенез [85; 115].

Помимо VEGFR, способностью специфически распознавать и связывать

белки семейства VEGF обладает белковые рецепторы, лишенные киназной

активности – нейропилины (NPR-1) [177]. Они широко представлены на многих

клетках, в том числе эндотелиоцитах, а также экспрессируются некоторыми

опухолевыми клетками. Нейропилины охарактеризованы как рецепторы для

белков семейства коллапсинов/семфоринов, регулирующих рост аксонов [110]. В

21

ряде публикациях Robinson NPR-1 описывается как ко-рецептор VEGFR-2,

обеспечивающий более эффективное взаимодействие с VEGF-А. Установлено, что

мыши с избыточной экспрессией NPR-1 погибают на 17-е сутки в результате

формирования сети, состоящей из расширенных сосудов, склонных к геморрагиям

[175; 176].

В норме экспрессия VEGF незначительна, однако существенно повышается

в условиях гипоксии через индукцию транскрипционного фактора HIF-1. Согласно

ряду данных гипогликемия также может вызывать повышение экспрессии VEGF

[43; 161].

Клетками, экспрессирующими VEGF in vivo, помимо эндотелиоцитов,

являются фибробласты, астроциты, пигментный эпителий сетчатки, гепатоциты,

эпителиальные клетки, миоциты гладкой мускулатуры [56; 146]. VEGF может

синтезироваться мегакариоцитами и накапливаться в α-гранулах тромбоцитов

[116].

Ряд клеток иммунной системы обладают способностью продуцировать

VEGF. В частности, мононуклеарные фагоциты экспрессируют более 20

ангиорегуляторных соединений (в том числе VEGF) в условиях гипоксии

различного генеза, мигрируя в очаги воспаления под влиянием хемоаттрактантов

[19].

Нейтрофилы содержат VEGF во внутриклеточных гранулах, cекретируя его

во внеклеточное пространство под действием TNF-α. Экспресcия VEGF

нейтрофилами значительно усиливается у больных злокачественными

новообразованиями [200].

Опухоль-ассоциированные макрофаги (TAM), доминирующие в

лейкоцитарном инфильтрате злокачественных новообразований, способны

экспрессировать целый спектр соединений, активирующих ангиогенез. Находясь

вблизи кровеносных сосудов опухоли, ТАМ секретируют эпидермальный фактор

роста (EGF), что приводит к миграции опухолевых клеток по направлению к

сосудам. Помимо этого, ТAM экспрессируют ряд протеолитических ферментов

22

(матричные металлопротеазы, катепсины), вызывают деградацию базальной

мембраны и способствуют метастазированию [76; 121; 142].

Повышенная экспрессия VEGF индуцируется гипоксией и в большинстве

клеток in vitro [203]. Гипогликемия также активирует экспрессию VEGF.

Эксперименты, проведенные в клеточных монослоях, показали, что ангиогенез

может быть независимо индуцирован гипоксией или гипогликемией [42; 59].

Интересен факт, что индукции VEGF не происходит в культивируемых клетках

глиомы, лишенных и кислорода, и глюкозы [161].

Таким образом, увеличение содержания VEGF возможно практически во

всех васкуляризованных тканях, что свидетельствует о важности VEGF, как

регулятора ангиогенеза.

Согласно многочисленным данным, VEGF усиливает проницаемость

сосудистой стенки [98; 122; 163]. VEGF способен усиливать проницаемость

коллоидных белков в 50000 раз сильнее гистамина, что может рассматриваться как

важный фактор, обуславливающий повышенное пропотевание плазмы и диапедез,

сопровождающие онкологические заболевания. Считается, что связывание VEGF с

комплементарным ему рецептором приводит к нарушению организации

межклеточных контактов эндотелиоцитов. VEGF может вызывать диссоциацию

белков актинового цитоскелета и VE-кадгеринов, а также влиять на

фосфорилирование белков фокальной адгезии, фосфорилирование окклудина ZO-

1, формирующих плотные контакты между эндотелиоцитами, что в конечном итоге

приводит к образованию пор и фенестрации эндотелия. Однако, эти эффекты

характерны только для изоформ VEGF121 и VEGF165 [182].

Другим важным эффектом VEGF является усиление миграции лейкоцитов,

гемопоэтических стволовых клеток (CD34+/CD133+) и опухолевых клеток через

эндотелий. Активация эндотелиоцитов посредством VEGF, сопровождается

усилением экспрессии на них молекул клеточной адгезии (ICAM-1, VCAM-1, E- и

P-селектина) приводит к адгезии и последующей миграции лейкоцитов [125]. По

данным Tan, VEGF является хемоаттрактаном для CD34+/CD133+ клеток,

23

обеспечивая их рекрутинг из костного мозга последующую миграцию в зоны

ишемии или к опухолевому узлу [194]. Таким образом, VEGF является участником

воспалительной реакции, однако выраженность биологических эффектов

определяется его концентрацией в тканях.

VEGF может рассматриваться как фактор, способствующий выживанию

клеток, о чем свидетельствуют данные исследования, проведенные Infagner.

Показано, что VEGF препятствует апоптозу эндотелиальных клеток в условиях

невесомости. Автор связывал это явление с влиянием VEGF на экспрессию

фибронектина и остепонтина [119]. По данным Ferrarri, антиапоптическое действие

VEGF обусловлено повышением экспрессией белков Всl-2 и A1[87].

VEGF – фактор, играющий важную роль в развитии сосудистого русла в

эмбриогенезе. По данным Ferrara, эмбрионы мышей с индуцированной мутацией

гена VEGF в эмбриональных стволовых клетках погибали между 11 и 12 сутками

развития. При этом авторами были отмечены многочисленные пороки развития

эмбриона [84].

Сходные данные были получены Shalaby. Эмбрионы мышей с

нокаутированным геном VEGF погибали между 8-ми и 9-ми сутками развития в

результате аномального формирования сосудистой сети [183].

Помимо VEGF, активаторами ангиогенеза является ряд соединений: фактор

роста гепатоцитов (HGF), ангиопоэтины (Ang 1, Ang 2), инсулиноподобный фактор

роста (IGF-I), PlGF, трансформирующий фактор роста (TGF-β), щелочной фактор

роста фибробластов (bFGF), фактор некроза опухоли α (TNF-α), фактор роста из

тромбоцитов (PDGF), металлопротеиназы (MMP-1, -2 и -9) и др., что осложняет

проведение антиангиогенной терапии.

1.3. Особенности неоангиогенеза при развитии неопластического процесса.

Проблема формирования и развития опухолью новых сосудов

(неоангиогенез), как одного из ключевых компонентов патогенеза опухолевого

процесса, является важной проблемой в современной онкологии. Влияние на

24

механизмы, приводящие к образованию новой капиллярной сети в опухоли, может

существенно влиять на течение и прогноз онкологического заболевания.

В процессе опухолевой трансформации неопластические клетки

приобретают ряд характерных им свойств: возникновение геномной

нестабильности, иммортализацию, относительную автономность от

регулирующего влияния организма, способность снижать активность клеток-

эффекторов иммунной системы, способность к инвазии и метастазированию,

способность инициировать процессы неоангиогенеза [80; 143].

Без кровеносных сосудов, опухоль теряет способность к росту и

метастазированию. Точно так же, без эффективной сети кровоснабжения

химиотерапевтические препараты не в состоянии достигнуть всех участков

опухоли в необходимых концентрациях [61].

Неоангигенез является одним из показателей перехода клеток от состояния

гиперплазии к состоянию неоплазии, т.е. перехода от состояния контролируемого

клеточного роста в состояние неконтролируемого [40]. Помимо этого,

неоваскуляризация солидных опухолей является одним из показателей их

метастатического потенциала и индикатором прогноза ряда онкологических

заболеваний [6; 30; 37].

Вирхов, основатель патологической анатомии, обратил внимание на

огромное количество кровеносных сосудов в опухоли еще в 1865 году. Но более

детально процессы васкуляризации опухоли были описаны Goldman в 1907 году

[106]. Первая гипотеза о том, что опухоли производят некие ангиогенные

«субстанции» была выдвинута в 1968 году Greenblatt и Shubik [107].

Прорыв в понимании роли неоангиогенеза в развитии злокачественных

новообразований совершил J. Folkman, впервые предположивший, что развитие

опухолей, превышающих в диаметре несколько миллиметров, возможно только в

случае формирования капиллярной сети и что рост опухоли можно остановить

прекращением ее кровоснабжения [92].

Теория J. Folkman была признана и послужила почвой для обширных

25

исследований ингибиторов ангиогенеза в терапии онкологических заболеваний.

В последние десятилетия большие успехи в изучении неоангиогенеза при

злокачественных новообразованиях обусловлены новыми молекулярно-

биологическими и биохимическими методами, позволившими выявить целый ряд

биологически активных соединений, принимающих участие в механизмах

регуляции ангиогенеза.

Долгое время считалось, что опухоли размером от 1 до 2 кубических

миллиметров не васкуляризированы, но при объеме опухоли более 2 кубических

миллиметров опухолевые клетки, расположенные в центре новообразования,

испытывают состояние гипоксии, что является одним из пусковых механизмов

опухолевого неоангиогенеза [88]. Однако, современная точка зрения иная.

Исследования, проведенные Li, показали, что у мышей линии BALB/c

опухолевый неоангиогенез начинается на раннем этапе, когда масса опухоли

содержит примерно 100-300 клеток (через 6 суток после имплантации опухолевых

клеток животным). Через двое суток в микроопухоли, содержащей более 400

клеток, формируются сосуды, в которых уже находились эритроциты [134].

In vivo рост новых сосудов определяется балансом активирующих и

ингибирующих сигналов, влияющих на процесс неоангиогенеза. Нормальные

клетки обычно экспрессируют низкие уровни активаторов ангиогенеза, однако, это

компенсируется гиперпродукцией ингибиторов [2; 89].

В процессе бласттрансформации, в условиях нарастающей гипоксии клетки

поэтапно приобретают гиперангиогенный фенотип путем снижения секреции

ингибиторов и увеличением продукции индукторов ангиогенеза [131].

Продуцируемые неопластическими клетками ангиогенные факторы

способствуют привлечению в опухолевую зону клеток-участников воспалительной

реакции (лимфоцитов, макрофагов, тромбоцитов, тучных клеток и др.),

приводящей к продукции целой палитры цитокинов (TNF-α, IL-1, IL-2, IL-8 и др.),

усиливающих митогенный потенциал эндотелиоцитов [86; 109; 165].

В результате этих процессов, происходит ангиогенное переключение

26

эндотелиальных клеток и приобретение ими ангиогенного фентотипа, что

сопровождается повышенной экспрессией множества тирозинкиназных

рецепторов (VEGF-R, Tie-1, Tie-2, HER и др.) [147].

При этом происходит потеря чувствительности эндотелиоцитов к

антипролиферативным вазоактивным факторам, секретируемых перицитами.

Приобретение эндотелиоцитами ангиогенного фенотипа сопровождается

внутриклеточными изменениями: увеличение числа митохондрий, увеличение

поверхности эндоплазматического ретикулума [58].

Вместе с тем, опухолевые сосуды становятся более проницаемы, им присуща

большая плотность на единицу площади (плотность микрососудов опухоли). Это

позволяет опухолевым клеткам получать достаточное количество нутриентов,

несмотря на незрелость сосудистой сети, и облегчает процессы метастазирования.

Причиной повышенной проницаемости опухолевых сосудов на фоне

гиперпродукции VEGF является увеличение секреции неопластическими клетками

оксида азота (NO), являющегося сильным вазодилататором [64].

Результатом совместного действия VEGF и NO является увеличение

расстояния между соседними эндотелиоцитами, при этом промежутки могут

заполняться микротромбами, а базальная мембрана начинает разрываться под

действием металлопротеиназ (ММPs). Формирование сосудистой сети опухоли

сопровождается гиалинозом стенок, внутристеночными геморрагиями и

плазморрагиями. Клинически подобные изменения сосудистой сети опухоли

приводят к кровотечениям из опухолевого узла и формированию асцита.

Нарушенная архитектоника и особенности структуры опухолевых сосудов

обуславливают формирование у последних высокого градиента давления, что

затрудняет кровоток и доставку лекарственных веществ в опухолевый узел [34].

На фоне секреции опухолью протеолитических ферментов (тканевых

протеиназ, катепсинов B, D, L, металлопротеиназ) происходит миграция

эндотелиальных предшественников и гемопоэтических стволовых клеток из

костного мозга, на поверхности которых представлены рецепторы VEGF-R [104].

27

Неопластические клетки начинают экспрессировать множество индукторов

неоангиогенеза: VEGF, фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобный

фактор роста 1 (IGF-1), ангиогенин, трансформирующие факторы роста α (TGF-α)

и β (TGF-β), эпидермальный фактор роста (EGF), тромбоцитарный фактор роста

(PDGF), оксид азота (NO), IL-8. Эндотелиальные клетки увеличивают на своей

поверхности рецепторы к ним. Эндотелиальные клетки являются источником ряда

цитокинов (гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора

(GM-CSF), ИЛ-6, SCF), продукция которых усиливается под действием VEGF

[186].

Клетки опухолевой стромы в результате гиперстимуляции эндотелия

начинают продуцировать урокиназу, что сопровождается гиперэкспрессией ее

рецепторов эндотелиальными клетками [126; 153]. Это способствует протеолизу

примыкающего к сосудам соединительнотканного матрикса. На данном этапе

неоангиогенеза эндотелиоцитам свойственен высокий инвазивный потенциал.

Инвазия эндотелия в соединительнотканный матрикс сопровождается

гиперэкспрессией на эндотелиоцитах молекул клеточной адгезии (ICAM, VCAM,

P- и E-селектины, интегины, VE-кадхерины). В частности, интегрины

способствуют прикреплению эндотелиоцитов к внеклеточному матриксу,

определяя направление их миграции [93; 140].

Вышеописанные процессы приводят к ремоделированию сосудов опухоли с

формированием сосудистой почки, образующейся в результате миграции

пролиферирующих эндотелиоцитов во внеклеточный матрикс. Пролиферативная

активность эндотелия опухоли на порядок отличается от эндотелия интактных

сосудов, что объясняется секрецией большой палитры ангиогенных факторов и

геперэкспрессией рецепторов к ним.

Итогом описанных выше процессов является формирование «незрелых»

кровеносных сосудов с нарушенной структурой сосудистой стенки, неправильной

цитоархитектоникой (расположением сосудистой сети «в пространстве») [170].

Морфологически сосудистое русло опухоли атипично и составляет значительную

28

часть опухолевой стромы. Системы артериол, венул и капилляров, характерной для

большинства здоровых органов, нет. В опухолевых кровеносных сосудах

отсутствует монослой эндотелиальных клеток, а сами сосуды являются рыхлыми и

беспорядочно связанными друг с другом.

Макроскопически сосудистая перфузия опухоли может быть центральной и

периферической. В центре опухолей с периферическим типом сосудистой

перфузии имеются крупные участки некроза, а в опухолях с центральным типом

сосудистого русла наоборот. Однако эти фенотипы внутри опухоли во многом

перекрываются, причем в одной части опухоли может быть любой из этих двух

типов кровоснабжения. Кроме того, из-за недостаточности стромального

компонента многие сосуды опухоли находятся в спавшемся состоянии и

микроскопически выглядят извитыми, расширенными, с множеством слепых

петель и выростов и малочисленными анастомозами. Подобные различия в

структуре сосудов отражаются на кровотоке внутри опухоли, который по сути

является непредсказуемым, что создает сложности с доставкой

химиотерапевтических препаратов во все участки опухоли [197].

После установления факта стимуляции опухолевого ангиогенеза VEGF

показано, что аналогичным действием обладают многие другие ангиогенные

факторы, причем выявлена их продукция не только опухолевыми клетками и

эндотелиоцитами, но и клетками стромы, макрофагами, лимфоцитами, тучными

клетками, которые определяют в опухоли, а также компонентами внеклеточного

матрикса [35].

Как и при физиологическом ангиогенезе, процесс роста капилляров в

опухоли продолжается, пока не будет достигнуто близкое расстояние с клеткой.

После этого ангиогенез прекращается. Исключением является ангиогенез в

женской репродуктивной системе в связи с постоянными циклическими

изменениями эндометрия [138].

Поскольку при опухолевом процессе наблюдается постоянное увеличение

клеточной массы, в опухолевой ткани постоянно идет процесс неоваскуляризации

29

для поддержания адекватной сосудистой плотности. Таким образом, можно

предположить, что ангиогенез индуцируется при обстоятельствах, когда

метаболические потребности клеток превышают перфузионную способность

имеющихся сосудов.

Корреляционная связь экспрессии ангиогенных факторов с прогнозом и

течением различных онкологических заболеваний доказана в ходе

многочисленных исследований [96; 100; 145; 152].

Данные Abulafia свидетельствуют о прямой корреляции интенсивности

ангиогенеза при раке эндометрия I стадии со степенью дифференцировки опухоли

[41]. Sato et al. получили данные, доказывающие зависимость длительности общей

выживаемости больных раком яичников от активности неоангиогенеза и степенью

васкуляризация опухоли [181].

Подобные результаты были получены и в более раннем исследовании

Hollingsworth с соавт., показывающем важность интенсивности неоваскуляризации

для прогноза безрецидивного периода и длительности общей выживаемости

больных раком яичников [114].

По данным Герштейн уровень VEGF существенно влияет на прогноз

выживаемости при раке молочной железы. Высокий уровень VEGF указывает на

неблагоприятный прогноз как на ранних стадиях, так и при распространенном раке

данной локализации [12]. Также отмечено, что наличие HER - позитивного статуса

обуславливает агрессивное течение рака молочной железы. Таким образом,

сигнальные пути HER2 и VEGF обладают синергичным действием, способствуя

опухолевой прогрессии. Стоит отметить, что повышенная экспрессия VEGF при

раке молочной железы ведет к снижению чувствительности опухоли к проводимой

гормональной и химиотерапии.

В исследовании Gasparini наблюдался более короткий безрецидивный период

у больных раком молочной железы с высоким уровнем VEGF в сыворотке крови

[99].

Данные, приведенные рядом авторов, свидетельствуют о неэффективности

30

химиотерапевтического лечения больных неходжкинскими лимфомами и

мелкоклеточным раком легкого у пациентов с высоким уровнем VEGF [179].

Giatromanolaki с соавт., анализируя иммуногистохимические маркеры

неоваскуляризации при колоректальном раке, выявили наиболее плотную

сосудистую сеть у больных с метастазами в печени. Также авторами было

предположено, что высокий уровень ангиогенных факторов в первичной опухоли

повышает вероятность отдаленных метастазов и больший инвазивный потенциал

опухоли при ее местном распространении [101; 102].

Таким образом, с увеличением роста и прогрессии большинства

злокачественных опухолей различного гистологического типа отмечается четкая

тенденция к усилению продукции ангиогенных факторов опухолевыми клетками.

1.4. Роль белков семейства ангиопоэтинов в ангиогенезе

Помимо VEGF, выраженной проангиогенной активностью обладают белки

семейства ангиопоэтинов. В настоящее время изучено 4 типа ангиопоэтинов –

Ang1-4. Ангиопоэтин Ang1 в развивающемся организме экспрессируется на

клетках мезенхимы, перицитах, гладкомышечных клетках, а Ang2 экспрессируется

только в местах ремоделирования сосудов [171]. Ang 2 является антагонистом Ang-

1 [141].

Лигандами ангиопоэтинов являются тирозинкиназные рецепторы Tie2,

экспрессируемые клетками эндотелия. Лиганд для Tie1 пока не выявлен. Как и

сигнальная система, ассоциированная с VEGF и его рецепторами, Tie/Ang-

сигнальная система важна для развития сосудистой системы в период эмбриогенеза

[79].

Исследования, проведенные на мышах с нокаутированным геном,

отвечающим за экспрессию Tie2, показали, что животные гибнут в диапазоне от 9,5

до 10,5 суток эмбрионального развития. При этом на начальных стадиях

формирования капилляров отклонений не выявляются, а при дальнейшем развитии

31

процессы созревания и стабилизации капилляров существенно нарушаются, и

первичное капиллярное сплетение не преобразуется в более сложно разветвленную

сеть сосудов [82].

Активация рецептора Тie2 не вызывает пролиферации эндотелиальных

клеток, наблюдаемой при действии других стимуляторов ангиогенеза, но

стимулирует выживание и миграцию эндотелиальных клеток, а также образование

и рост новых ответвлений кровеносных сосудов [74].

VEGF и Ang2 обладают синергичным действием. В участках опухоли, в

которых был инициирован рост сосудов, наблюдалась повышенная экспрессия

данных ангиогенных факторов [113; 191]. При этом избыточная экспрессия Ang-2

приводит к диссоциации перицитов от сосудов, снижает общее количество

перицитов и приводит к дестабилизации сосудов внутри опухолей даже в

присутствии стимуляции VEGF, что было подтверждено в экспериментах на

трансгенных мышах [81; 208].

Ряд исследований доказывает гипотезу, что опухолевый ангиогенез

стимулируется в результате дисбаланса ангиопоэтина-2(Ang2) и ангиопоэтина-1

(Ang1), а точнее вследствие гиперэкспрессии Ang2 при сниженной экспрессии

Ang1. Подобные события могут способствовать нарушению прочного соединения

перицитов со слоем эндотелия. При этом эндотелиальные клетки становятся более

доступными для действия факторов, стимулирующих ангиогенез, что

впоследствии приводит к формированию новых кровеносных сосудов.

De Palma et al. продемонстрировали, что экспрессия Tie-2 свойственна

некоторым клеткам, участвующих в неоваскуляризации – проангиогенным клеткам

кроветворного происхождения и предшественникам перицитов мезенхимального

происхождения [72].

Подобные различия в действии одного и того же рецептора могут

объясняться тем, что подавление каскада передачи сигнала через рецептор Tie2

снижает приток клеток, необходимых для формирования сосудистой стенки, что

приводит к нарушению стабилизации вновь сформированных эндотелиальными

32

клетками капилляров. Вместе с тем они обладают большей чувствительностью к

стимулирующему действию VEGF [113].

1.5. Роль Notch-сигнального пути в канцерогенезе и неоангиогенезе

Notch-сигнальный путь является эволюционно консервативным путем

межклеточного сигнального каскада и участвует как в морфо-, так и гистогенезе.

Notch – рецептор сигнальной трансдукции, участвующий в дифференцировке,

пролиферации, апоптозе различных клеток многоклеточных организмов [77].

Одним их отличий Notch-сигнального пути является тот факт, что передача сигнала

между клетками осуществляется лишь при физическом контакте клеток, одни из

которых несут лиганды, а другие соответствующие рецепторы. Другие сигнальные

пути могут использовать паракринный механизм регуляции посредством лигандов,

секретируемых в межклеточное пространство и достигающие мишени при помощи

активного транспорта или диффузии. Активация или ингибирование Notch-

сигналинга может привести к различным клеточным ответам (пролиферация или

клеточная гибель) в зависимости от микроокружения.

На сегодня у млекопитающих описано 4 рецептора Notch и 5

соответствующих лигандов (Jagged1, Jagged2, Dll1, Dll3, Dll4) [169].

Взаимодействие Notch-рецептора с соответствующим лигандом приводит к

протеолитическому расщеплению рецептора, которое происходит в 2-х участках. В

первую очередь расщепление происходит во внеклеточном пространстве рядом с

трансмембранным доменом. Другой участок расщепления локализуется в

трансмембранном домене (рис. 3). В результате данного расщепления происходит

транспорт цитоплазматического домена Notch-рецептора в ядро клетки, где он

взаимодействует с транскрипционным фактором CBF1, приводя к активации

транскрипции генов, регулирующих баланс между пролиферацией,

дифференцировкой и апоптозом [130].

33

По мере развития молекулярных механизмов с участием Notch, как на

клеточных линиях, так и на модельных организмах, установлена прямая связь

между нарушением Notch-сигналинга и развитием ряда заболеваний [130].

Мутации Notch рецепторов и их лигандов являются причиной нарушения

нормального развития организма и могут приводить к появлению неоплазм у

животных и человека.

Дизрегуляция Notch-сигнального пути является важным компонентом

патогенеза опухолевого процесса. Повышенная экспрессия Notch-рецепторов и их

лигандов наблюдается при многих злокачественных новообразованиях (острый

лимфобластный лейкоз, лимфоидная кистозная карцинома, рак мочевого пузыря,

пищевода, поджелудочной железы, остеосаркома и др.) [52; 135; 159; 184; 205].

Рис. 3. Notch-сигнальный путь. (T. Gridley,2007)

Впервые на вовлеченность Notch-сигнального пути обратили внимание при

изучении Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза, при котором нарушения

34

в этом сигнальном пути встречается в 10-20% случаев. В случае развития солидных

опухолей онкогенный Notch сигнальный путь был обнаружен при учении мышиной

аденокарциномы молочной железы. Было установлено, что активация Notch

сигналинга может стимулировать прогрессию опухоли, а повышенная экспрессия

Notch1 и Jagged1 коррелировать с неблагоприятным прогнозом. Как полагают,

формирование неоплазий может возникать из-за мутаций основных компонентов

этого сигнального пути, что влечет за собой клеточную трансформацию.

С другой стороны, Notch сигнальный путь может способствовать супрессии

опухолей. В серии исследований были продемонстрированы антионкогенные

функции Notch сигнального пути. Условное удаление Notch 1 в коже мышей

приводило к значительному увеличению базального эпидермального слоя и к

спонтанным базальным клеточным карциномам, которые чаще возникали у

пожилых мышей. В исследованиях на трансгенных мышах с формированием у них

гепатокарциномы с гистологическими и молекулярными особенностями,

характерными для человеческой, было установлено, что ингибирование передачи

сигналов Notch у мышей с использованием ингибитора γ-секретазы приводило к

ускоренному развитию гепатокарциномы, а принудительная активация Notch-

сигнального пути приводила к остановке клеточного цикла и апоптозу в первичных

клетках гепатокарциномы мышей, а также в клеточных линиях гепатокарциномы

человека. Позднее результаты исследований были подтверждены на когорте

пациентов, у которых отмечались лучшие показатели выживаемости при условии

более высокой экспрессию генов, связанных с Notch [139].

Долгое время считалось, что Notch-сигнализация играет ключевую роль в

физиологическом ангиогенезе, например, при заживлении ран или беременности,

однако позднее была доказана роль Notch-сигнализации в патологическом

неоангиогенезе.

Ряд исследователей сходятся во мнении, что из всех сигнальных путей,

участвующих в опухолевом ангиогенезе, Notch сигнальный путь является наиболее

значимым [135; 159]. Из четырех типов мембран связанных рецепторов Notch,

35

Notch1 и Notch4 экспрессируются на эндотелиальных клетках, но полагают, что

Notch1 наиболее важен для развития неоангиогенеза. Dll4 - лиганд рецепторов

Notch1 и Notch4, экспрессируемый преимущественно на эндотелии, оказывает

существенное влияние на стимуляцию ангиогенеза, в то время как другой лиганд,

Jagged1, подавляет ангиогенез, конкурируя с Dll4 [53]. Ряд работ свидетельствуют

о том, что делеция одного из аллелей Dll4 приводят к необратимым изменениям в

сосудистой сети в период раннего эмбрионального развития, приводя к гибели

эмбрионов [97; 128].

VEGF-A, воздействуя на клетки эндотелия, повышает экспрессию Dll4 и его

Notch-рецепторов [137]. В участках сосуда, где происходит активация ангиогенеза,

экспрессия Dll4 и Notch1 распределена между клетками эндотелия мозаичным

образом, а, свойственные tip-клеткам характеристики приобретают

преимущественно те клетки эндотелия, у которых отсутствует экспрессия Notch1.

Однако активация клеток эндотелия, экспрессирующих рецептор Notch1, лигандом

Dll4 предотвращает появление избыточного количества tip-клеток [192]. Dll4

функционирует как негативный регулятор ангиогенеза опухоли и усиливает свою

активность в сосудистой сети опухоли.

Данные Williams с соавт. свидетельствуют о том, что гиперэкспресия Dll4 на

клетках эндотелия сопровождается снижением экспресии VEGFR2 и его ко-

рецептора нейропилина-1 [201]. Снижение экспрессии Dll4 или блокирование

Notch-сигнального пути приводят к усилению образования tip-клеток, что

способствует увеличению активности, ветвления и слияния вновь образовавшихся

капилляров, которые формируются неправильно, что характерно для сосудистой

сети в опухоли.

Совокупные данные о роли Notch-сигнального пути в ангиогенезе и

канцерогенезе позволяют рассматривать его компоненты как терапевтическую

мишень, воздействуя на которую можно влиять на опухолевый рост,

метастазирование и лекарственную устойчивость опухолевых клеток [136].

Большинство ингибиторов Notch-сигнального пути продемонстрировали

36

противоопухолевые эффекты в доклинических исследованиях. В то же время,

комбинированный эффект этих ингибиторов с химиотерапевтическими

препаратами все еще служит предметом обширных клинических исследований.

Поскольку Notch-сигнальный путь может оказывать двунаправленное действие на

клеточный и опухолевый рост, что в значительной степени определяется

микроокружением клеток и гистологическим типом опухоли, подобные препараты

следует применять с особой осторожностью. Применение ингибиторов Notch-

сигнального пути, как и других препаратов, использующихся в терапии

злокачественных опухолей, демонстрирует в клинической практике значительные

побочные эффекты [193].

1.6. Роль белка p53 в канцерогенезе и ангиогенезе.

Продолжительность жизни нормальных клеток ограничена 50-60 делениями.

В результате каждого последующего деления хромосомы укорачиваются примерно

на 50-60 нуклеотидов. При укорочении длины хромосом до критических значений,

наступает апоптоз. Апоптоз наряду с клеточным старением рассматриваются как

процесс, препятствующий канцерогенезу [27]. По данным Gunes с возрастом

клетка может терять способность к апоптозу [108].

Особую роль в старении и канцерогенезе играют дефекты генов,

участвующие в регуляции клеточной пролиферации и повреждениях ДНК. Белок

р53 – продукт гена-супрессора TP53, локализованном в коротком плече хромосомы

17. К основным функция р53 относят участие в репарации ДНК, пролиферации,

апоптозе [4].

Экспрессия р53 свойственна всем клеткам человеческого организма. В

условиях относительной стабильности генетического аппарата белок р53

находится в неактивном состоянии, но при появлении значительного числа

мутаций происходит его активация, которая сопровождается остановкой

клеточного цикла и репликации ДНК, а при более выраженной активации запуском

37

апоптоза. Таким образом р53 напрямую влияет на продолжительность жизни

клетки [55].

Снижение экспресии р53 в процессе нормального деления клеток может

приводить к повышению репликативного потенциала клеток, но не должно

приводить к бесконтрольному клеточному росту. При формировании клона

опухолевых клеток длина их хромосом восстанавливается, и клетка приобретает

способность делиться неограниченное число раз.

В клетках, в которых накапливаются мутации в p53, развивается

нестабильность генома, значительно повышающей риск злокачественной

трансформации клетки [20; 209]. Примерно в половине случаев неоплазий у

человека наблюдаются мутации в 17 хромосоме в области p53. Мыши с

отсутствующими копиями p53, обычно рождаются нормальными, но уже в раннем

возрасте у них возникают опухоли по причине утраты адекватного контроля за

изменениями структуры ДНК [108].

Ряд химиотерапевтических препаратов оказывают действие путем индукции

апоптоза. Клетки уже лишенные р53 не подвергаются апоптозу, а химиотерапия

может способствовать накоплению р53 дефицитных мутантов. Утрата р53

приводит к агрессивному течению опухоли и слабому ответу на проводимую

химиотерапию [55].

В исследованиях, проведенных Chappell с соавт. на культуре

опухолевых клеток карциномы предстательной железы, была показана связь

экспрессии p53 и чувствительности опухолевых клеток к химиотерапии. Было

продемонстрировано, что опухолевые клетки предстательной железы несут WT

p53, а чувствительность этих клеток к химиотерапевтическим препаратам

наблюдается при трансфекции доминантно-негативным p53. Рост колонии

опухолевых клеток карциномы предстательной железы был более

распространенным, когда транскрипционная активность p53 была снижена, в то

время как рост был более ограниченным в присутствии функционального р53. Эти

результаты показывают, что состояние опухолевых супрессоров р53 играет

38

важную роль в прогрессировании рака простаты и определяет эффективность

химиотерапевтических препаратов, что свидетельствует о том, что р53

транскрипционный фактор является важнейшим элементом в способности клеток

регулировать клеточный цикл и его изменения в ответ на повреждение ДНК [63].

Экспериментальные данные ряда работ, показывают взаимосвязь мутации

гена р53 с активацией опухолевого неоангиогенеза. Исследования Zhang с соавт.

проводились на мышах, которым вводили WT p53 в саркому клетки, содержащие

мутантный ген р53. Авторами было обнаружено значительное снижение

экспрессии VEGF. Это доказало предположения авторов в том,

что противоопухолевый эффект, вызванный гиперэкспрессией гена WT р53 в

клетках саркомы, объясняется не только усилением контроля клеточного цикла, но

и торможением ангиогенеза [209].

Kieser с соавт. предположили о существовании определенного пути,

благодаря которому мутированный р53 может запускать экспрессию VEGF

[124]. Однако мутация р53 может проводить к снижению регуляции факторов,

влияющих на ангиогенез отрицательно. При этом мутации в р53 являются одними

из наиболее частых генетических альтераций при раке у человека.

По данным Хамидуллиной с соавт., примерно в 50 % случаев колоректальных

карцином и метастазов в печень (22–70 %) проявляется инактивация гена р53,

являющаяся результатом действия ряда механизмов, включая потерю

гетерозиготности и соматических точечных мутаций [36]. Согласно дизайну

исследования, авторами производился анализ роли р53 в опухолевой

неоваскуляризации по отношению к предраку, раннему и инфильтративному

колоректальному раку. Использовалось иммунофенотипирование в срезах аденом

с дисплазией, первичных ранних и инфильтративных колоректальных раков, а

также “переходной” слизистой оболочки кишки рядом с опухолью.

Гиперэкспрессия иммуногистохимически определяемого белка р53 была

обнаружена в 78,6 % (110/140) первичных аденокарцином, в 90,9 % (100/120)

аденом с различной степенью малигнизации и в 50,0 % (60/120) в “переходной”

39

слизистой рядом с опухолью. Таким образом, было показано, что уровень

экспрессии белка р53 в аденокарциномах с повышенным ангиогенезом и высоким

уровнем раково-эмбрионального антигена. Также было доказано, что при

увеличении уровня экспрессии белка р53 в аденомах с фокусами малигнизации

также отмечается усиление неоангиогенеза.

1.7. Изменение системы гемостаза при развитии неопластического процесса

Влияние злокачественного новообразования на организм человека носит

системный характер. В частности, активация системы гемостаза при развитии

онкологического заболевания достигается различными путями взаимодействия

опухолевых клеток на все ее компоненты [150; 157].

Тромботические осложнения у онкологических больных составляет около

20% от всех венозных тромбоэмболий в популяции, занимая второе место в

структуре причин смерти больных со злокачественными новообразованиями [8; 24;

178].

Согласно рекомендациям Американского общества клинической онкологии

(American Society of Clinical Oncology), все госпитализированные пациенты c

злокачественными опухолями должны считаться кандидатами на профилактику

тромбозов глубоких вен и тромбоэмболии легочной артерии (в отсутствие

кровотечения) антикоагулянтами, что делает изучаемую проблему чрезвычайно

актуальной.

Впервые взаимосвязь спонтанно возникающих венозных тромбозов со

скрыто протекающими или же диагностируемыми онкологическими

заболеваниями была описана Armand Trousseau в 1865 году в лекции “Phlegmasia

Alba Dolens” [198]. Однако результаты первого ретроспективного исследования

Askerman с соавт., касающегося взаимосвязи тромбозов и «скрытых» опухолей

были опубликованы лишь в 1951 году [48].

40

Патологические сдвиги в системе гемостаза при развитии как солидных

опухолей, так и гемобластозов патогенетически разнообразны и могут проявляться

в различных клинических вариантах: от системной кровоточивости до тромбозов

вен, облитерации артерий и даже ДВС-синдрома [32].

Наличие злокачественной опухоли расценивается как независимый фактор

риска тромбоэмболических осложнений (ТЭО). Клинически наличие ТЭО

диагностируется от 4% до 20% случаев, но по результатам аутопсий частоты

выявлений ТЭО может достигать 50%. При этом злокачественные опухоли разной

локализации не в равной степени оказывают влияние на систему гемостаза.

Показано, что чаще ТЭО могут вызывать злокачественные новообразования

поджелудочной железы, почки, легкого, яичников [123]. У больных

онкогематологического профиля ТЭО чаще диагностируют при миеломе,

неходжкинских лимфомах, лимфоме Ходжкина [188].

Наличие отдаленных метастазов в большей степени повышает риск ТЭО, чем

локализованный опухолевый процесс. При этом рядом исследований показана

взаимосвязь выраженности гемостатических нарушений и прогноза

онкологического заболевания, то есть чем выше риск тромбоза, чем хуже прогноз

заболевания, и наоборот, степень выраженности изменений в системе гемостаза

зависит от стадии развития злокачественной новообразования, гистологического

типа опухоли и состояния организма пациента [95; 127]. Рядом исследований

показано, что при достижении ремиссии онкологического заболевания, риск ТЭО

существенно снижается [180; 187]. Стоит отметить, что изменения в системе

гемостаза у онкологических больных могут быть вызваны не только самой

опухолью, но и приемом различных химиотерапевтических препаратов.

В основе патогенеза паранеопластического гиперкоагуляционного синдрома

лежит активация как коагуляционного, так и сосудисто-тромбоцитарного звеньев

системы гемостаза. Данный синдром реализуется через сложную систему

взаимодействий: тромбоцит-эндотелий-опухолевая клетка [32].

Активация опухолевыми клетками коагуляционного каскада может

41

достигаться за счет нескольких механизмов: секреции опухолевыми клетками

прокоагулянтов, секрецией ряда цитокинов, взаимодействия с эндотелиальными

клетками и клетками крови (макрофаги, эритроциты, тромбоцитами, моноцитами).

При этом большинство проведенных исследований указывает на возникновение

гиперкоагуляции крови, протекающую преимущественно по внешнему пути

свертывания [144].

Активация системы гемостаза при развитии неопластического процесса

обуславливается секрецией опухолевыми клетками ряда прокоагулянтов. К

наиболее важным из них относят:

- тканевой тромбопластин (ТF)

- раковый прокоагулянт (CP)

- фактор активации системы гемостаза, идентичный XIII фактору

свертывания крови

- рецептор к V фактору свертывания крови

- провоспалительные цитокины

Тканевой тромбопластин (TF) является трансмембранным гликопротеином,

состоящим из 263 аминокислотных остатков. Он относится к семейству

рецепторов цитокинов II класса, обладающим повышенным сродством к

циркулирующему в крови фактору VII. В присутствии Сa++ TF образует комплекс

с фактором VII, вызывая конформационные изменения и превращая последний в

фактор VIIа [60].

Образовавшийся комплекс (фактор VII-фактор VIIа) способен активировать

как фактор X, так и фактор IX, что в конечном итоге приводит к генерации

тромбина. Экспрессия TF интактными эндотелиальными клетками крайне низка.

Усиление экспреcсии TF происходит ассоциированными с опухолью макрофагами,

провоспалительными цитокинами (TNF-α и IL-1β), экзогенными агонистами

(бактериальными липополисахаридами) или рядом специфических опухолевых

антигенов [95].

Раковый прокоагулянт (CP) является кальций-зависимой цистеиновой

42

протеинкиназой, состоящей из 674 аминокислотных остатков, способной

активировать фактор X без участия фактора VII. Уровень ракового прокоагулянта

повышен примерно у 85% больных злокачественными опухолями. CP

экспрессируются эмбриональной тканью и злокачественными клетками.

Рецептор к V фактора свертывания крови экспрессируется на поверхности

плазменной мембраны опухолевой клетки, основным свойством которого является

способность ускорять формирование протромбиназного комплекса (факторы V, Х,

тромбоциты, Сa++).

Секретируемые опухолевыми клетками цитокины (ФНО, ИЛ-1 и др.),

усиливают продукцию тканевого фактора моноцитами и повышают экспрессию в

эндотелиальных клетках ингибиторов фибринолиза, в частности ингибитора

активатора плазминогена (PAI-1). В результате в печени снижается синтез

протеина С и AT III. Это ведет к снижению антикоагулянтной и усилению

прокоагулянтной активности сосудистой стенки, что имеет существенное значение

в формировании тромбозов сосудов и метастазировании опухолей [139].

Помимо активации механизмов коагуляции, злокачественные клетки

способны воздействовать на тромбоцитарное звено системы гемостаза, приводя к

усилению адгезии и агрегации тромбоцитов, как правило, за счет повышенного

образования тромбина и фактора Виллебранда, усиления метаболизма

арахидоновой кислоты.

Активация плазменного и тромбоцитарного компонентов системы гемостаза

могут приводить к повышенному образованию тромбина, что в итоге приводит к

образованию и отложению фибрина [14]. Рядом авторов показано, что отложение

фибрина вокруг опухолевых клеток, как одного из проявлений нарушений

гемостаза у онкологических больных, тесно вовлечена в процесс опухолевого роста

и ангиогенеза и может иметь разнонаправленное влияние на опухоль [13].

Фибрин может являться своеобразным “каркасом” для роста опухолевой

клетки и протективным фактором от натуральных киллеров. Наряду с этим, в ответ

на постоянное фибринообразование, опухолевые клетки усиленно экспрессируют

43

регуляторы фибринолиза (uPA, tPA, PAI-1 и др.) Усиление фибринолитической

активности и постоянная продукция плазмина может усиливать потенциал к

инвазии опухолевыми клетками.

Стоит отметить, что повышенное образование фибрина вследствие развития

опухолевого процесса является по данным ряда исследователей одним из главных

факторов в процессе метастазирования [162; 168].

При метастазировании гематогенным путем опухолевые клетки способны

потенцировать образование микротромба, что облегчает их прикрепление к

сосудистой стенке и формирование метастатического очага. При этом так

называемый “фибриновый экран” защищает опухолевую клетку от воздействия

компонентов системы комплемента, лейкоцитов, иммуноглобулинов.

Несмотря на значительный объем проведенных экспериментальных

исследований, на настоящий момент не существует окончательного представления

о детальных механизмах изменения системы гемостаза при развитии

злокачественных опухолей. Вероятно, это обусловлено большим разнообразием

злокачественных опухолей, а также различной способностью и степенью

воздействия последних на систему гемостаза. Остается малоизученным вопрос

влияния гемостатических и антигемостатических механихмов на течение

опухолевого процесса.

1.8. Антиангиогенная терапия.

Сложность терапии злокачественных новообразований заставляет

исследователей искать новые подходы к воздействию на различные компоненты

опухолевого процесса, и в частности на ангиогенез. Большие достижения в

онкологии в течение последних десяти лет были связаны с таргетной терапией,

которая в отличие от терапии, мишенью для которых являются делящиеся клетки

и которая действует неспецифически, затрагивая в том числе и интактные клетки,

44

направлена на патогенетические клетки-мишени, характерные для опухолевых

клеток [49]. Оказывая избирательное действие на соединения, экспрессирующиеся

неопластическими клетками, таргетная терапия может быть более эффективной и

менее токсичной по отношению к нормальным клеткам. При этом препараты

таргетной терапии могут комбинироваться друг с другом или со стандартной

химиотерапией, оказывая при этом более значимое воздействие на течение

опухолевого процесса, что может влиять на исход онкологического заболевания

[16].

Как правило, таргетная терапия направлена на компоненты внутриклеточных

сигнальных путей и поверхностные клеточные рецепторы, индуцирующие

бесконтрольный клеточный рост [15; 65]. Стоит отметить, что мишени для

таргетной терапии могут присутствовать на нормальных клетках, но при

опухолевой трансформации может происходить их гиперэкспрессия или

гиперактивация. В качестве препаратов таргетной терапии как правило используют

моноклональные антитела (химерные и гуманизированные), избирательно

связывающие рецепторы на поверхности опухолевых клеток.

В последнее время накапливается все больше работ о применении

ингибиторов ангиогенеза с терапевтической целью [44; 120]. Ингибиция

ангиогенеза в опухоли возможна следующими способами: нейтрализация

ангиогенных факторов, ингибиция рецепторов ангиогенных факторов, блокада

сигнальных путей, в которых принимает участие VEGF, ингибиторами

тирозинкиназ, ингибиция матриксных металлопротеаз, ингибиция адгезии

эндотелиальных клеток, ингибиция миграции эндотелиальных клеток. Влияние на

эти процессы приводят к подавлению роста опухолевого узла путем снижения

плотности сосудистой сети опухоли, уменьшению риска метастазирования или

роста существующих метастазов. Также данная терапия возможна для

предупреждения возникновения рецидивов у больных из групп повышенного

риска. Оказывая менее токсичное действие на организм пациента, в отличие от

химиотерапии, антиангиогенная терапия приводит в меньшем проценте случаев к

45

резистентности к противоопухолевым препаратам.

К сожалению, многие антиангиогеные препараты для лечения

злокачественных заболеваний показали эффективность только на животных

моделях. В терапии больных онкологического профиля ингибиторы ангиогенеза

могут оказывать значимый клинический эффект только в комплексной терапии

злокачественных новообразований и не приводят к предполагаемой быстрой

регрессии опухоли. Ряд исследований указывают на недостаточность

блокирования какого-либо одного фактора роста сосуда или его рецепторов для

регрессии опухоли, поскольку в васкуляризации опухоли принимает участие

множество факторов, инициирующих ангиогенез, и злокачественные опухоли

могут проявлять способность к дальнейшему росту и обеспечению себя сетью

кровеносных сосудов [75]. Помимо этого, опухоль может получать кислород и

пластические субстраты от уже имеющихся сосудов и дальнейший рост опухоли

продолжается вокруг них. Некоторые злокачественные опухоли способны

сохранять способность к росту в даже в условиях гипоксии [105].

В ряде исследований приводятся данные о низкой эффективности

ингибиторов ангиогенеза при некоторых видах рака или же об их преходящей

пользе с последующим возобновлением роста и прогрессией опухоли, а также об

усилении токсичности химиопрепаратов и сокращения безрецидивного периода на

фоне таргетной ангиангиогенной терапии [33; 69; 207]. Антиангиогенная терапия

не всегда хорошо переносится пациентами и сопровождается целым рядом

побочных эффектов: повышение артериального давления, кровотечения различной

локализации, диарея, общая слабость [28; 206; 207].

Несмотря на это, антиангиогенная терапия может быть эффективна при

комплексной терапии колоректального рака, почечно-клеточного рака, ряде

гемобластозов, немелкоклеточном раке легкого, раке яичников [67; 181; 196].

На сегодняшний день не вызывает сомнения двусторонний характер

взаимодействия в системе «кровеносные сосуды-опухоль». Активность

неоангиогенеза оказывает существенное влияние на прогрессию опухоли и ее

46

метастатический потенциал. В равной мере опухолевый процесс влияет на скорость

роста новых кровеносных сосудов.

47

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика лабораторных животных. Информация об уходе, содержании

и эвтаназии животных

В исследование было включено 82 самки и 30 самцов мышей линии FVB/N,

трансгенных по HER2/neu, массой тела 25-30 г., а также 61 самец линии CDF1

(потомство от самок линии BALB/c и самцов линии DBA/2) массой от 26 до 28 г.

Линия мышей FVB/N, трансгенная по HER2/neu, была получена из вивария

ФГБУ “НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова” Минздрава России (г. Санкт-

Петербург).

Линия мышей CDF1 (потомство от самок линии BALB/c и самцов линии

DBA/2) была получена путем разведения в виварии ГБОУ ВПО СПбГПМУ

Минздрава России (г. Санкт-Петербург).

После поступления из вивария все подопытные животные подвергались

карантину в течение 14 суток в карантинном блоке вивария ГБОУ ВПО СПбГПМУ

Минздрава России для исключения из эксперимента животных с соматической

и/или инфекционной патологией.

После завершения периода карантина животные проходили дополнительный

период адаптации к основному помещению вивария в течение 1 суток. На

протяжении всего исследования производилась оценка состояния животных:

аппетит, поведение, масса тела, активность, состояние шерсти.

Содержание, питание, выведение животных из эксперимента и утилизация

биологических отходов осуществлялись в соответствии с международными и

российскими нормативными актами, регламентирующими работу с

лабораторными животными, и правилами биоэтики [25]. Ограничения в питании и

питьевом режиме не вводились. Соблюдался световой режим в помещении

вивария: 12 часов – свет («день» с 08.00 до 20.00); 12 часов – темнота («ночь» с

20.00 до 08.00). Учитывая суточные колебания основных клинико-

физиологических и лабораторных показателей, все эксперименты с подопытными

48

животными проводились в первой половине дня. Выведение животных из

эксперимента осуществлялось методом цервикальной дислокации за исключением

животных, наблюдение за которыми продолжалось до естественной гибели.

2.2. Моделирование опухолевого процесса

Невозможность проведения экспериментальных исследований на человеке, а

также необходимость более глубокого понимания причин возникновения и течения

различных онкологических заболеваний, делает моделирование опухолевого

процесса на лабораторных животных основным методом экспериментальной

онкологии. Основными опухолевыми моделями являются спонтанные

новообразования животных, перевиваемые опухоли и индуцированные

злокачественные опухоли. В нашем исследовании для моделирования

неопластического процесса у мышей линии CDF1 были использован штамм

лимфоцитарного лейкоза P-388, полученный в лаборатории канцерогенеза и

старения (ФГБУ “НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова” Минздрава России).

Лимфоцитарная лейкемия Р-388 является моделью злокачественных

лимфоидных новообразований, являющимися актуальной группой онкологических

заболеваний, изучению которой уделяют большое внимание во всем мире. Данную

опухоль трансплантируют подкожно или интраперитонеально, она

характеризуется высоким инвазивным потенциалом опухолевых клеток и

генерализацией новообразования с первых дней после трансплантации. Впервые

лейкемия P-388 была индуцирована в США в 1955г. у мышей линии DBA2 после

овариэктомии путем нанесения на кожные покровы метилхолантрена. Лейкемия P-

388 является асцитной жидкостью, в которой содержатся 2 типа клеток (крупные –

с выраженным ядром и хроматином, распределенным подобно мелкозернистой

сети, мелкие – лимфоциты с гиперхромными оптически плотными ядрами и узким

участком цитоплазмы). Как правило, в процессе перевивки подопытное животное

49

получает 105-106 клеток.

В данном экспериментальном исследовании для моделирования

лимфоцитарного лейкоза производили трансплантацию злокачественных клеток,

полученных от животных-опухоленосителей: 0,2 мл асцитической жидкости,

разведенной стерильным 0,9% физиологическим раствором в соотношении 1:4,

вводились интраперитонеально.

Для моделирования карциномы молочной железы, занимающей лидирующие

места среди онкологических заболеваний среди женского населения разных стран,

нами были использованы мыши линии FVB/N с инкорпорированным онкогеном

HER2/neu. Известно, что избыточная экспрессия и амплификация HER2/neu

связана с клиническими признаками прогрессии опухоли данной локализации [45].

Согласно исследованиям Алимовой, у мышей линии FVB/N, трансгенных по

HER2/neu, опухоли молочной железы встречаются в более раннем возрасте, а их

количество нарастает быстрее, чем у мышей низко раковых линий (SHR), при этом

наблюдается более раннее метастазирование (преимущественно в легкие) [1; 3].

Среди неопухолевой патологии у мышей данной линии автором были

отмечены: поражение почек с кистозными изменениями канальцев, сморщиванием

клубочков и интерстициальной мелкоклеточной инфильтрацией, атрофия

фолликулов селезенки и печеночных балок, скопление мелкозернистого

содержимого в печени и селезенке, а также большее потребление корма, более

низкая температура тела, нарушение эндокринного баланса. Отмеченные

изменения были сходны с нарушениями обмена веществ, наблюдаемых при

амилоидозе, характерного для стареющих животных.

Самки мышей линии FVB/N обладают повышенной репродуктивной

способностью и дают большие пометы. Оплодотворенные яйцеклетки самок

FVB/N содержат пронуклеусы относительно больших размеров, что облегчает

проведение микроинъекции ДНК и увеличивает способность к выживанию зигот

после микроинъекции.

Таким образом, мыши FVB/N, трансгенные по HER2/neu, являются удобной

50

экспериментальной моделью для изучения злокачественных новообразований

молочной железы и их связи со старением [3; 71].

В контрольных точках исследования оценивали следующие показатели роста

и развития экспериментальных опухолей:

1. Динамика роста опухолевого узла (изменение объема опухолевого узла

солидных новообразований – 3 взаимоперпендикулярных размера – a × b × c; см 3).

2. Средняя продолжительность жизни подопытных животных (сутки).

3. Частота метастазирования в легкие – процент животных с метастазами по

отношению к общему количеству животных в группе.

2.3. Обследуемые группы.

Включенные в эксперимент мыши были разделены на группы в зависимости

от линии и пола животных.

Мыши линии FVB/N были разделены на группы:

«Группа 1» (n=32) – самки, наблюдение за которыми велось до их

естественной гибели для расчета показателей продолжительности жизни, частоты

возникновения и верификации гистологического типа новообразований.

«Группа 2» (n=50) – самки, выведенные из эксперимента в возрасте 3 (n=10),

6 (n=17) и 9 (n=23) месяцев методом цервикальной дислокации, у которых

проводили оценку сывороточной концентрации маркеров эндотелиальной

дисфункции и гемостатической активности в контрольных точках исследования.

«Группа 3» (n=30) – самцы, выведенные из эксперимента в возрасте 3 (n=13),

6 (n=11) и 9 (n=6) месяцев методом цервикальной дислокации, у которых

проводили оценку сывороточной концентрации маркеров эндотелиальной

дисфункции и гемостатической активности в контрольных точках исследования.

Мыши линии CDF1 (самцы) были разделены на группы:

«Группа 1» (n=15) – интактные мышей (“Контроль”), у которых определяли

51

содержание сосудистого фактора роста эндотелия (VEGF-A) и показатели

коагуляционного гемостаза.

«Группа 2» (n=46) – мыши с перевитым лимфоцитарным лейкозом P-388

(“Лейкоз P-388”), у которых регистрировали частоту развития новообразований и

продолжительность жизни (n=30), содержание сосудистого фактора роста

эндотелия (VEGF-A) и показатели коагуляционного гемостаза на 5 е (n=6) и 8 е

(n=10) сутки исследования.

2.4. Методы взятия биологического материала и его первичная обработка

Взятие биологического материала для анализа производили в контрольных

точках исследования. Взятие крови производили в начале светового периода суток,

без предварительного ограничения доступа животных к корму и воде.

2.4.1. Взятие крови у мышей.

После проведения цервикальной дислокации конечности животного

фиксировали лейкопластырем на операционном столике в положении «на спине»,

после чего производили вскрытие грудной клетки мыши и обнажали сердце. Взятие

крови производили в одноразовый медицинский шприц объёмом 2 мл следующим

образом: игла надевалась на шприц, освобождалась от защитного пластикового

кожуха, далее игла вводилась в сердце мыши, после чего осуществлялось взятие

крови в объеме 0,7 мл.

Взятие крови с целью дальнейшего получения плазмы для определения

гемостатических показателей осуществлялась следующим образом: после

проведения забора крови в объеме 0,4 мл из сердца в медицинский шприц, камеры

сердца надрезали скальпелем и собирали 0,3 мл крови в медицинский шприц

52

объемом 1 мл с предварительно набранным цитратом натрия в объеме 0,05 мл.

2.4.2. Макроскопическая оценка опухолевого поражения органов

Всех павших и подвергнутых эвтаназии в терминальном состоянии мышей

подвергали полной некропсии. Опухоли молочной железы измеряли и после

рутинной гистологической обработки исследовали макроскопически, производя

анализ иссеченных фрагментов при помощи бинокулярной лупы. Легкие

фиксировали в формалине, после чего подсчитывали число и размеры метастазов.

При патоморфологическом исследовании выявленные новообразования

классифицировали в соответствии с рекомендациями Международного агентства

по изучению рака.

2.4.3. Обработка крови

Обработку крови осуществляли сразу после ее взятия. Собранную в шприц

кровь переносили в пробирку типа Эппендорф с замком Safe-Lock объемом 1,5 мл

и оставляли на 40 минут при комнатной температуре, после чего иглой осторожно

отделяли образовавшийся сгусток от стенок пробирки и однократно

центрифугировали с ускорением 3000 об/мин (1200g) на протяжении 20 минут.

Образовавшуюся сыворотку переносили в криопробирку в объеме 0,5 мл и

сохраняли до проведения анализа при температуре -20º С. Длительность хранения

биологического материала не превышала 6 месяцев.

Для исследований показателей гемостаза получали обогащенную

тромбоцитами плазму крови следующим образом: стабилизированную цитратом

кровь переносили из шприца в пробирки типа Эппендорф объемом 0,5 мл и

подвергали центрифугированию с ускорением 240g в течение 7 минут с

последующим переносом обогащенной тромбоцитами плазмы в другую пробирку.

53

Затем из обогащенной получали обедненную тромбоцитами плазму с помощью

центрифугирования с ускорением 1200g на протяжении 15 минут.

2.5. Диагностика эндотелиальных нарушений и нарушений в системе гемостаза.

2.5.1. Определение концентрации маркеров функциональной активности

эндотелия сосудов

Интенсивность неоангиогенеза и степень эндотелиальной дисфункции у

подопытных животных оценивали по сывороточной концентрации основных

маркеров функциональной активности эндотелиоцитов. Определяли содержание

сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF-A), инсулиноподобного

фактора роста первого типа (IGF-1), монооксида азота II (NO), тканевого

активатора плазминогена (tPA), ингибитора активатора плазминогена первого типа

(PAI-1) методом иммуноферментного анализа при помощи готовых наборов фирм

Cusabio (КНР), Abcam (Великобритания) и R&D Systems (США) в соответствии с

инструкциями производителей.

2.5.2. Диагностика нарушений коагуляционного компонента системы

гемостаза.

2.5.2.1. Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ)

АЧТВ является базовым тестом, определяющим эффективность внутреннего

пути свертывания крови.

АЧТВ определяли с помощью коагулометра АПГ 2-02-П (ООО «ЭМКО»,

Россия) с использованием набора реагентов «АЧТВ-тест» (НПО «Ренам», Россия)

54

согласно прилагаемой инструкции от производителя; результат был представлен в

виде времени свертывания (в секундах).

В измерительную кювету вносилось 0,05 мл исследуемой бедной

тромбоцитами плазмой. Далее в кювету вносилось 0,05 АЧТВ - реагента, после чего

исследуемую смесь подвергали инкубации при температуре при 370С в течение 3-

х минут. Далее добавлялось 0,05 мл хлорида кальция, после чего запускался таймер

прибора с дальнейшей фиксацией времени образования сгустка.

2.5.2.2. Протромбиновое время (ПВ)

ПВ является базовым тестом, определяющим эффективность внешнего пути

свертывания крови.

ПВ определяли с помощью коагулометра АПГ 2-02-П (ООО «ЭМКО»,

Россия) с использованием набора реагентов «Диагем-П» (НПО «Ренам», Россия);

результат был представлен в виде времени свертывания (в секундах).

В измерительную кювету вносилось 0,05 мл исследуемой бедной

тромбоцитами плазмой и подвергал инкубации при температуре 370С в течение 1

минуты. Далее в исследуемую смесь добавляли 0,01 мл тромбопластин-кальциевой

смеси, предварительно прогрев ее до 370С, после чего запускался таймер прибора

с дальнейшей фиксацией времени образования сгустка.

2.5.2.3. Определение концентрации фибриногена

Концентрация фибриногена определялась с помощью коагулометра АПГ 2-

02-П (ООО «ЭМКО», Россия) с использованием реагента «Фибриноген-тест» (НПО

«Ренам», Россия) согласно прилагаемой инструкции; результат был представлен в

виде концентрации фибриногена (г/л).

В соответствии с инструкцией производителя, при помощи калибратора был

создан калибровочный график для определения концентрации фибриногена.

55

В измерительную кювету вносилось 0,01 мл исследуемой бедной

тромбоцитами плазмой, после чего производилось разведение имидазоловым

раствором в соотношении 1:10, после чего в исследуемую смесь диспансером

опускали металлический шарик и подвергали инкубации при температуре 370С в

течение 2-х минут. Далее в исследуемую смесь добавляли 0,05 мл раствора

тромбина после чего запускался таймер прибора с дальнейшей фиксацией времени

образования сгустка. Концентрацию фибриногена определяли в соответствии с

калибровочным графиком.

2.6. Методы статистической обработки полученных результатов

Статистическую обработку полученных результатов производили при

помощи программы статистической обработки данных STATISTICA 10.0 («Stat

Soft®»). Точные доверительные интервалы для долей вычисляли по методу

Клоппера-Пирсона с помощью программы CONFINT. Проверка характера

распределения данных производилась расчетом критерия Колмогорова-Смирнова.

Сравнение средних значений независимых выборок производилось при помощи t-

критерия Стьюдента (при нормальном характере распределения выборочной

совокупности), U-критерия Манна-Уитни (при распределении выборочной

совокупности, отличном от нормального). Сравнение средних значений зависимых

выборок производилось при помощи критерия Вилкоксона или χ2-Фридмана.

Результаты анализа полученных данных представлены в виде М±SЕ (средняя

арифметическая ± ошибка средней арифметической). Достоверным уровнем

различий, при котором отвергали нулевую гипотезу, принимали вероятность не

менее 95% (р<0,05), что является стандартом в медико-биологических

исследованиях.

56

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Анализ динамики маркеров состояния эндотелия кровеносных сосудов у

мышей линии FVB/N, трансгенных по HER2/neu, при развитии у них опухолей

молочной железы.

Для моделирования опухолей молочной железы были использованы

трансгенные мыши линии FVB/N с инкорпорированным онкогеном HER2/neu,

традиционно применяемые в экспериментальной онкологии для этой цели. Для

данной линии животных характерно более раннее возникновение новообразований

молочной железы, чем у мышей низко раковых линий (SHR и др.) с более ранним

возникновением метастазов (преимущественно в легкие).

Предполагая относительно невысокую продолжительность жизни мышей

FVB/N, трансгенных по HER2/neu (до 10 месяцев), и ожидаемое развитие у них

опухолей молочной железы, а также связанную с ними гибель животных, нами

были установлены контрольные точки исследования с 3-х месячным интервалом

(3, 6, 9 месяцев).

Включенные в эксперимент мыши были разделены на 3 группы: Группа 1

(самки; n=32), наблюдение за которыми велось до их естественной гибели, Группа

2 (самки; n=50) и Группа 3 (самцы; n=30), выведенные из эксперимента в

контрольных точках исследования с последующим взятием крови для определения

сывороточной концентрации маркеров состояния эндотелия кровеносных сосудов.

Выраженность ангиогенеза оценивалась по содержанию VEGF в сыворотке

крови в контрольных точках исследования. Для оценки выраженности

эндотелиальной дисфункции исследовались соединения, принимающие участие в

процессах неоангиогенеза, канцерогенеза и гемостаза (IGF-1, NO, tPA, PAI-1).

57

3.1. Особенности развития опухолей молочной железы у мышей линии FVB/N,

трансгенных по HER-2/neu.

Средняя продолжительность жизни самок Группы 1 составила 278±5,4 суток.

На 150 сутки исследования была выявлена первая опухоль молочной железы. К 6-

месячному возрасту опухоли определялись у 37,5%, а к 9-му месяцу у 100%

подопытных животных. Суммарное число опухолей молочной железы,

морфологически классифицированных как аденокарциномы (рис. 4), у самок в

Группе 1 составило 212.

Рис.4. Аденокарцинома молочной железы: наблюдается большое

количество митозов и интенсивный ангиогенез. Гематоксилин-эозин, ув. х400

В Группе 2 аденокарциномы молочной железы к 6 месяцу были выявлены у

10,4% животных, а к 9-му месяцу – у 98,6%. Средний объем опухоли составил

1,46±0,05 см3. У 50% мышей были выявлены метастазы опухоли молочной железы

в легкие. С увеличением возраста животного отмечено увеличение массы тела

особи (здесь и далее в 3, 6 и 9 месяцев соответственно): 22,3±0,54 г, 28,3±0,76 г

(p<0,01) и 34,8±0,98 г (p<0,01).

58

В Группе 3 не было выявлено ни одной опухоли молочной железы.

3.2. Исследование динамики маркеров состояния эндотелия кровеносных сосудов

в сыворотке крови у мышей линии FVB/N, трансгенных по HER2/neu.

Для исследования динамики маркеров эндотелиальной дисфункции были

проанализированы данные, полученные от животных Групп 2 и 3. У мышей в

контрольных точках исследования были определены значения сывороточной

концентрации маркеров ангиогенеза (VEGF) и эндотелиальной дисфункции (IGF-

1, NO, tPA, PAI-1) методом иммуноферментного анализа при помощи

соответствующих готовых наборов согласно инструкциям производителей. В

последующих разделах подробно анализируются изменения содержания VEGF,

IGF-1, NO, tPA и PAI-1.

3.2.1. Анализ динамики сосудистого фактора роста (VEGF).

При использовании непараметрического дисперсионного анализа получены

данные о наличии достоверной связи уровня фактора роста эндотелия сосудов

(VEGF) и возраста подопытных животных. Средний уровень VEGF у самок мышей

FVB/N, трансгенных по HER2/neu (Группа 2), в возрасте 3,6,9 месяцев составил

34,8±9,2; 397,9±133,92; 50,0±10,89 пг/мл соответственно (таб 1, рис. 5).

59

Таблица 1.

Изменение уровня VEGF (пг/мл) в сыворотке крови мышей линии FVB,

трансгенных по HER-2/neu, в различные возрастные периоды (M±SE)

Пол

животных

Возраст животных

3 мес 6 мес 9 мес

Самки n=10 n=17 n=23

34,8±9,23 397,9±133,92a 50,0±10,89b

Самцы n=13 n=11 n=6

96,5±24,33 241,7±89,84

28,5±9,42b

n- объем выборки a- различие с показателями мышей того же пола в возрасте 3 месяца достоверны (p<0,05)

b- различие с показателями мышей того же пола в возрасте 6 месяцев достоверны (p<0,05)

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

3 месяца 6 месяцев 9 месяцев

Кон

цен

трац

ия

VE

GF

(п

г/м

л)

Возраст самок мышей FVB/N

Рис. 5. Содержание VEGF (пг/мл) в сыворотке крови у самок мышей FVB\N,

трансгенных по HER-2/neu в различные возрастные периоды.

60

Средний уровень исследуемого показателя в группе 6-месячных самок (n=17)

достоверно превышал аналогичный показатель в группе 3-х месячных (n=10) в 11,4

раза (р=0,005) и в 8 раз значение в группе 9-и месячных (n=23; р=0,002). При этом

статистически значимых отличий по изучаемому показателю между группами

самок в 3 и 9 месяцев выявлено не было (p=0,203).

Распределение животных линии FVB, трансгенных по HER-2/neu, по уровню

VEGF (%) в различные возрастные периоды представлены в таблице 2.

Верхней границей нормы для VEGF нами было определено значение 100

пг/мл. Мы основывались на собственных наблюдениях на культуре

эндотелиальных клеток, в которых показано, что увеличение содержания VEGF в

культуральной среде более 100 пг/мл значительно стимулирует пролиферацию

эндотелиоцитов.

Уменьшение концентрации VEGF ниже 10 пг/мл рассматривали как

гипоергическое состояние, характеризующее низкий уровень митотической

активности в эндотелии сосудов. Экстремально высоким считали значение

концентрации VEGF более 1000 пг/мл.

Таблица 2.

Распределение мышей линии FVB, трансгенных по HER-2/neu, по уровню

VEGF (%) в различные возрастные периоды.

Название

группы

Возраст

животных

Количество

животных в

группе

< 10

пг/мл

10-100

пг/мл

100-

1000

пг/мл

> 1000

пг/мл

Группа 2 3 мес 10 10% 90% 0% 0%

6 мес 17 12% 23% 53% 12%

9 мес 23 17% 70% 13% 0%

Группа 3 3 мес 13 15% 54% 31% 0%

6 мес 11 0% 18% 72% 10%

9 мес 6 16% 84% 0% 0%

61

Повышенный уровень VEGF в сыворотке крови (от 100 до 1000 пг/мл) был

зарегистрирован у 53% самок мышей в возрасте 6 месяцев, что статистически

значимо превышало его значения у мышей в возрасте 3 (0%) и 9 (13%) месяцев

(рис. 6). Значения VEGF свыше 1000 пг/мл наблюдались у 12% мышей самок в

возрасте 6 месяцев и не наблюдались в двух других контрольных точках

исследования в 3 и 9 месяцев (0%). Также у 6-месячных самок были выявлены

особи с низким (менее 10 пг/мл) содержанием VEGF (12%). У 9-месячных самок

повышенный уровень VEGF в диапазоне от 100 до 1000 пг/мл наблюдался только

у 13% особей, при этом у 70% особей значения VEGF находились в диапазоне от

10 до 100 пг/мл, а у 17% не достигал 10 пг/мл. У особей в контрольной точке 3

месяца повышенный уровень VEGF (более 100 пг/мл) выявлен не был.

Рис. 6. Распределение самок мышей линии FVB, трансгенных по HER-2/neu, по

уровню VEGF в различные возрастные периоды.

В группе самцов мышей линии FVB (n=30), трансгенных по HER-2/neu

(Группа 3), в контрольных точках исследования средние показатели уровня VEGF

составили: в 3 месяца (n=13) – 96,5±24,33 пг/мл, в 6 месяцев (n=11) – 241,7±89,84

10% 12%17%

90%

23%

70%

0%

53%

13%

0%

12%

0%0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

3 мес 6 мес 9 мес

Проц

ент

жи

вотн

ых

в г

руп

пе

Возраст животных

< 10 пг/мл

10-100

пг/мл

100-1000

пг/мл

> 1000

пг/мл

62

пг/мл, в 9 месяцев (n=6) – 28,5±9,42 пг/мл (таб. 1, рис. 7).

Средний уровень VEGF 6-ти месячных самцов мышей линии FVB

достоверно превышал аналогичный показатель 9-месячных в 8,5 раз (р=0,028),

однако достоверных различий с показателями 3-х месячных самцов выявлено не

было (р=0,091). Статистически значимых отличий по изучаемому показателю

между 3-х и 9-месячными самцами выявлено не было (p=0,116).

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

350,00

3 месяца 6 месяцев 9 месяцев

Ко

нц

ентр

аци

я V

EG

F (

пг/

мл)

Возраст самцов мышей FVB/N

Рис. 7. Содержание VEGF (пг/мл) в сыворотке крови у самцов мышей FVB\N,

трансгенных по HER-2/neu, в различные возрастные периоды.

Повышенный уровень VEGF (в диапазоне от 100 до 1000 пг/мл) в сыворотке

крови был зарегистрирован у 72% самцов мышей в возрасте 6 месяцев, что

статистически значимо превышало значение аналогичного показателя у мышей в

возрасте 9 (0%) месяцев, при этом статистически значимых различий с уровнем

VEGF в сыворотке 3-х месячных мышей (31%) выявлено не было (рис. 8).

Содержание VEGF более 1000 пг/мл было отмечено у 10% самцов в возрасте 6

месяцев, при этом в 2 других контрольных точках (3 и 9 месяцев) животных с таким

63

содержанием VEGF не встречалось (0%). Наряду с этим, в группе 6-месячных

самцов не выявлено ни одной особи с содержанием VEGF менее 10 пг/мл, тогда как

в группе 3-х месячных самцов таких особей был 31%, а в группе 9-х месячных 17%.

Рис. 8. Распределение самцов мышей линии FVB, трансгенных по HER-2/neu, по

уровню VEGF в различные возрастные периоды.

3.2.2. Анализ динамики инсулиноподобного фактора роста (IGF).

Анализ содержания инсулиноподобного фактора роста (IGF-1), как одного из

факторов, влияющих на опухолевую прогрессию, в контрольных точках

исследования у подопытных животных обоих полов не выявил достоверной связи

между сывороточной концентрацией изучаемого фактора и возрастом животного

(таб. 3).

15%

0%

16%

54%

18%

84%

31%

72%

0%0%

10%

0%0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

3 мес 6 мес 9 мес

Проц

ент

жи

вотн

ых

в г

руп

пе

Возраст животных

< 10 пг/мл

10-100 пг/мл

100-1000 пг/мл

> 1000 пг/мл

64

Таблица 3.

Изменение уровня IGF-1 (нг/мл) в сыворотке крови мышей линии FVB,

трансгенных по HER-2/neu, в различные возрастные периоды (M±SE)

Пол

животных

Возраст животных

3 мес 6 мес 9 мес

Самки n=10 n=17 n=23

82,4±14,11 157,3±41,48 186,3±45,36

Самцы n=13 n=11 n=6

39,5±12,42 25,9±5,29 32,8±8,28

n- объем выборки

Средний уровень IGF-1 у самок линии FVB, трансгенных по HER-2/neu, в

сыворотке крови в контрольных точках исследования составил: в 3 месяца (n=10)

82,4±14,11 нг/мл, в 6 месяцев (n=17) 157,3±41,48 нг/мл, 186,3±45,36 нг/мл в 9

месяцев (n=23; рис. 9). Средний уровень исследуемого показателя имел отчетливую

тенденцию к увеличению, при этом не достигая статистически значимого уровня

(χ2 (2) = 3,200; p=0,202).

65

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

3 месяца 6 месяцев 9 месяцев

Ко

нц

ентр

аци

я IG

F-1

(н

г/м

л)

Возраст самок FVB/N

Рис. 9. Содержание IGF-1 (нг/мл) в сыворотке крови у самок мышей FVB\N,

трансгенных по HER-2/neu в различные возрастные периоды.

В контрольной группе самцов данной линии мышей были получены

следующие значения уровня IGF-1 в сыворотке крови в контрольных точках

исследования: 39,5±12,42 нг/мл в 3 месяца (n=13), 25,9± 5,29 нг/мл в 6 месяцев

(n=11), 32,8±8,28 нг/мл в 9 месяцев (n=6; рис. 10). Средний уровень исследуемого

показателя не имел тенденции к увеличению или снижению с увеличением

возраста животных, при этом статистически значимых различий между уровнем

IGF-1 в контрольных точках исследования выявлено не было (χ2 (2) = 3,000;

p=0,223).

66

0

10

20

30

40

50

60

3 месяца 6 месяцев 9 месяцев

Ко

нц

ен

тр

ац

ия IG

F-1 (

нг/м

л)

Возраст самцов FVB/N

Рис. 10. Содержание IGF-1 (нг/мл) в сыворотке крови у самцов мышей FVB\N,

трансгенных по HER-2/neu, в различные возрастные периоды.

3.2.3. Анализ динамики оксида азота (NO).

Оксид азота (NO) является основным эндогенным вазодилататором для

комплекса сосудов микроциркуляторного русла, а также веществом,

стимулирующим синтез VEGF и подавляющим синтез внеклеточного матрикса и

гипертрофию сосудов. Динамика уровня NO у животных обоих полов представлена

в таблице 4.

67

Таблица 4.

Изменение уровня NO (мкмоль/л) в сыворотке крови мышей линии FVB,

трансгенных по HER-2/neu, в различные возрастные периоды (M±SE)

Пол

животных

Возраст животных

3 мес 6 мес 9 мес

Самки n=10 n=17 n=23

44,5±8,17 14,4±2,97a 22,7±5,17a

Самцы n=13 n=11 n=6

34,8±11,15 16,0±2,0 34,3±5,47

n- объем выборки a- различие с показателями мышей того же пола в возрасте 3 месяца достоверны (p<0,05)

В контрольной точке 3-месяца средний уровень NO в сыворотке крови самок

мышей линии FBV составил 44,5±8,17 мкмоль/л, в возрасте 6-мес 14,4±2,97

мкмоль/л, в возрасте 9-месяцев 22,7±5,17 мкмоль/л (рис. 11). Полученные данные

свидетельствуют о достоверном снижении изучаемого показателя с увеличением

возраста самок мышей линии FVB при развитии у них опухолей молочных желез

(χ 2 (2) = 7,400; p=0,025). Так уровень NO у 3-х месячных мышей превышал уровень

6-месячных в 3 раза (p=0,037), и в 2 раза аналогичный показатель у 9-ти месячных

самок (p=0,116). При этом достоверных различий между уровнем NO у 6-ти и 9-ти

месячных не наблюдалось (p=0,028).

68

0

10

20

30

40

50

60

3 месяца 6 месяцев 9 месяцев

Ко

нц

ентр

аци

я N

O (м

кмо

ль/

л)

Возраст самок мышей FVB/N

Рис. 11. Содержание NO (мкмоль/л) в сыворотке крови у самок мышей FVB\N,

трансгенных по HER-2/neu, в различные возрастные периоды.

В группе самцов не наблюдалось достоверных различий между уровнем NO

в контрольных точках исследования (χ 2 (2) = 4,333; p=0,115). Стоит отметить, что

средний уровень NO в группе 3-х месячных (34,8±11,15 мкмоль/л) и 9-месячных

самцов линии FVB практически не отличался (34,3±5,47 мкмоль/л), в то время как

у 6-месячных самцов FVB средний уровень NO в сыворотке был в 2 раза меньше,

чем в двух других контрольных точках исследования (16,0±2,00 мкмоль/л; рис. 12)

69

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

3 месяца 6 месяцев 9 месяцев

Кон

цен

трац

ия

NO

(м

кмоль/

л)

Возраст самцов мышей FVB/N

Рис. 12. Содержание NO (мкмоль/л) в сыворотке крови у самцов мышей FVB\N,

трансгенных по HER-2/neu, в различные возрастные периоды.

3.2.4. Анализ динамики тканевого активатора плазминогена (tPA).

Тканевой активатор плазминогена (tPA), участвующий в ремоделировании

тканей (в том числе и злокачественных), принимает участие в инвазии и

метастазировании неопластических клеток, являясь одним из маркеров

антитромботической и вазодилатационной активности эндотелия. Динамика

уровня tPA у животных обоих полов представлена в таблице 5.

70

Таблица 5.

Изменение уровня tPA (нг/мл) в сыворотке крови мышей линии FVB,

трансгенных по HER-2/neu, в различные возрастные периоды (M±SE)

Пол

животных

Возраст животных

3 мес 6 мес 9 мес

Самки n=10 n=17 n=23

12,3±1,28 9,4±0,89 17,5±1,14a,b

Самцы n=13 n=11 n=6

7,5±1,09 9,9±1,29 14,7±2,33

n- объем выборки a- различие с показателями мышей того же пола в возрасте 3 месяца достоверны

(p<0,05) b- различие с показателями мышей того же пола в возрасте 6 месяцев достоверны

(p<0,05)

Полученные данные указывают на достоверные различия в содержании tPA

в контрольных точках исследования у самок (χ 2 (2) = 13,400; p=0,001). Средний

уровень tPA у самок линии FVB в 3 месяца составил 12,3±1,28 нг/мл, в 6 месяцев -

9,4±0,89 нг/мл, в 9 месяцев - 17,5± 1,14 нг/мл (рис. 13). Наибольшая концентрация

tPA в сыворотки крови самок наблюдались возрасте 9 месяцев, что на 42%

превышало уровень tPA у 3-месячных (p=0,017) и на 46% – у 6-месячных животных

(p=0,001).

71

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

3 месяца 6 месяцев 9 месяцев

Ко

нц

ентр

аци

я t

PA

(н

г/м

л)

Возраст самок мышей FVB/N

Рис. 13. Содержание tPA (нг/мл) в сыворотке крови у самок мышей FVB\N,

трансгенных по HER-2/neu в различные возрастные периоды.

В группе самцов не наблюдалось достоверных различий между средним

уровень tPA и возрастом животного в контрольных точках исследования (χ 2 (2) =

4,333; p=0,115). Стоит отметить, что средний уровень tPA имел тенденцию к

увеличению с возрастом животного: в группе 3-х месячных средний уровень

изучаемого показателя составил 7,5±1,09 нг/мл, в 6 месяцев - 9,9±1,29 нг/мл, в 9

месяцев 14,7±2,33 нг/мл (рис. 14).

72

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

3 месяца 6 месяцев 9 месяцев

Кон

цен

трац

ия

tPA

(н

г/м

л)

Возраст самцов мышей FVB/N

Рис. 14. Содержание tPA (нг/мл) в сыворотке крови у самцов мышей FVB\N,

трансгенных по HER-2/neu в различные возрастные периоды

3.2.5. Анализ динамики активатора ингибитора плазминогена (PAI-1).

Ингибитор активатора плазминогена (PAI-1) - один из компонентов

фибринолитической системы. Секретируемые опухолевыми клетками соединения

могут усиливать образование ингибиторов фибринолиза эндотелиоцитами и

тромбоцитами, в частности PAI-1. Основной функцией PAI-1 является селективная

специфическая ингибиция tPA. Повышение секреции РAI-1 тромбоцитами при

относительно невысоких концентрациях tPA в сосудистой стенке может приводить

к снижению ее антикоагулянтной и усилению прокоагулянтной активности, что

имеет существенное значение в формировании тромбозов сосудов и

метастазировании опухолей.

Возрастная динамика уровня tPA у животных обоих полов представлена в

таблице 6.

73

Таблица 6.

Изменение уровня PAI-1 (нг/мл) в сыворотке крови мышей линии FVB,

трансгенных по HER-2/neu, в различные возрастные периоды (M±SE)

Пол

животных

Возраст животных

3 мес 6 мес 9 мес

Самки n=10 n=17 n=23

70,7±3,00 71,1±3,47 67,9±2,70

Самцы n=13 n=11 n=6

67,5±3,38 66,4±2,46 64,3±5,37

n- объем выборки

Изменения среднего уровня ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1) с

увеличением возраста самок линии FVB не были достоверны (χ2 (2) = 1,400;

p=0,497). В 2-х контрольных точках исследования 3 и 6 месяцев средний уровень

PAI-1 был практически одинаков (70,7±3 нг/мл и 71,1±3,47 нг/мл), но к возрасту 9

месяцев немного снижался (67,9±2,7 нг/мл; рис. 15).

60

62

64

66

68

70

72

74

76

3 месяца 6 месяцев 9 месяцев

Ко

нц

ентр

аци

я P

AI-

1 (н

г/м

л)

Возраст самок мышей линии FVB/N

Рис. 15. Содержание PAI-1 (нг/мл) в сыворотке крови самок мышей FVB\N,

трансгенных по HER-2/neu в различные возрастные периоды.

74

Изменения среднего уровня ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1),

селективного специфического ингибитора tPA, с увеличением возраста самцов

линии FVB также не были достоверны (χ 2 (2) = 1,333; p=0,513). Средний уровень

PAI-1 во всех контрольных точках исследования был примерно одинаков. Так

среднее содержание PAI-1 у самцов линии FVB в 3 месяца составило 67,5±3,38

нг/мл, в 6 месяцев 66,4±2,46 нг/мл, в 9 месяцев 64,3±5,37 нг/мл (рис. 16).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

3 месяца 6 месяцев 9 месяцев

Кон

цен

трац

ия

PA

I-1 (

нг/

мл)

Возраст самцов мышей линии FVB/N

Рис. 16. Содержание PAI-1 (нг/мл) в сыворотке крови у самцов мышей FVB\N,

трансгенных по HER-2/neu в различные возрастные периоды.

3.3. Обсуждение.

В описанном эксперименте была использована линия мышей FVB/N,

трансгенная по HER-2/neu, характеризующаяся ранним возникновением рака

молочной железы с высокой частотой [1]. Полученные данные показывают, что

развитие опухолей у животных данной линии приводило к выраженной

75

эндотелиальной дисфункции, что находило отражение в содержании ряда

соединений, синтезируемых эндотелием.

Анализ динамики маркеров эндотелия кровеносных сосудов выявил

характерное для неопластического процесса увеличение интенсивности

ангиогенеза, сопровождающийся синдромом гиперкоагуляции.

Индивидуальный анализ полученных данных показал, что с увеличением

возраста подопытных животных, а также по мере развития опухолей происходило

повышение концентрации VEGF в сыворотке крови.

Наиболее выраженное нарастание концентрации VEGF наблюдалось у самок

линии FBV к возрасту 6 месяцев - периоду наиболее интенсивного роста первичных

узлов опухолей молочной железы, что подтверждается полученными данными

(уровень VEGF в возрасте 6 месяцев в 11,4 раза превышал уровень изучаемого

показателя в 3 месяца и в 8 раз в возрасте 9 месяцев).

Снижение среднего уровня VEGF у самок к 9 месяцам (изучаемый показатель

незначительно превышал уровень 3-х месячных мышей), на наш взгляд, можно

объяснить стабилизацией опухолевого процесса и нарастанием опухолевой

интоксикации.

Стоит отметить, что временной отрезок 9 месяцев являлся критическим для

самок мышей Группы 1, где наблюдение за животными велось до их естественной

гибели (278±5,4 суток).

Как уже говорилось, в группе самцов наблюдались достоверные различия

между содержанием VEGF в сыворотке крови в возрасте 6 и 9 месяцев. В нашем

исследовании не было выявлено ни одной опухоли молочной железы у самцов. Но,

несмотря на то, что злокачественные новообразования молочной железы в

подавляющем проценте случаев характерны для самок, у самцов мышей крайне

редко могут выявляться опухоли данной локализации, поскольку молочная железа

у самцов имеет принципиально то же строение, что у самок, и при нормальном

гормональном балансе не развивается.

Можно предположить, что мыши высоко раковой линии FVB/N, трансгенные

76

по HER2/neu склонны к усилению неоангиогенеза в периоды, когда наблюдается

наиболее частое развитие опухолей (6 месяцев), вероятно, связанное с активацией

различных сигнальных путей, участвующих в канцерогенезе.

Выраженная тенденция к увеличению экспресии VEGF характерна при

развитии карцином молочной железы [17; 31; 111].

VEGF является не только ключевым регулятором неоангиогенеза, но и

важным участником сигнальных путей, участвующих в регуляции пролиферации

клеток опухоли. Об этом свидетельствуют работы ряда авторов,

продемонстрировавших участие VEGF в регуляции выживаемости и пролиферации

некоторых культивируемых in vitro опухолевых клеток [61; 65]. VEGF принимает

участие в регуляции значительного числа внутриклеточных сигнальных путей,

препятствующих апоптозу при раке молочной железы. По мере развития опухоли

молочной железы некоторые ее участки, как и у большинства солидных опухолей,

подвергаются гипоксии и нехватке нутриентов, что значительно повышает

экспрессию VEGF через индукцию транскрипционного фактора HIF-1 и

способствует усилению неоангиогенеза [43; 161].

Ряд работ указывают не только на проангиогенную активностью VEGF, но и

на участие этого соединения в усилении проницаемости сосудистой стенки,

усилении миграции гемопоэтических стволовых клеток, лейкоцитов, опухолевых

клеток через эндотелий сосудов, что способствует метастазированию опухолевых

клеток [35; 89].

Помимо этого, опухолевые клетки молочной железы являются продуцентами

целого ряда индукторов ангиогенеза (VEGF, эпидермальный фактор роста (EGF),

инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-1), фактор роста фибробластов (FGF),

интерлейкин-8 (IL-8), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), трансформирующие

факторы роста α (TGF-α) и β (TGF-β), оксид азота). При повышенной экспресии

данных соединений эндотелиальные клетки увеличивают на своей поверхности

соответствующие рецепторы [12].

Результаты оценки уровня IGF-1 у самок мышей, трансгенных по HER2/neu

77

показали, что несмотря на то, что различия в среднем уровне изучаемого

показателя в разные периоды онтогенеза не являлись статистически значимыми, с

увеличением возраста подопытных животных наблюдалась отчетливая тенденция

к повышению данного показателя.

Увеличение средней концентрации IGF-1 у самок к возрасту 6 месяцев по

сравнению с 3-месячными животными и дальнейшее нарастание к 9 месяцу жизни

коррелирует с темпами развития опухолей молочной железы, что указывает на

вовлечение IGF-1 в патогенез опухолевого процесса на изучаемой модели. При

этом, уровень IGF-1 у самцов не имел тенденций к повышению или понижению, и

различия в контрольных точках не были статистически значимы.

Увеличение концентрации IGF-1 по мере развития опухолей согласуется с

данным мировой литературы [28; 51; 118]. Рядом исследований установлена

прямая зависимость между уровнем экспресии IGF-1 и риском развития

злокачественных опухолей. Установлено, что IGF сигнальный путь вовлечен в

патогенез многих злокачественных опухолей, в частности опухолей молочной

железы [9; 28].

Рядом авторов продемонстрировано, что в исследованиях с трансгенными

мышами с гиперэкспрессией человеческого IGF-1 примерно в половине случаев

развивается аденокарцинома молочной железы [12; 28]. Еще большему риску

подвергаются животные с мутантным геном p53 [205].

Вместе с тем, у животных со сниженным уровнем IGF-1 в плазме крови (на

75%) риск опухолей молочной железы значительно ниже. В экспериментах на

приматах установлено, что введение IGF-1 вызывает гиперплазию молочных желез

[118; 149].

В физиологических концентрациях IGF-1 в экспериментальных

исследованиях in vitro предохраняет многие типы клеток от проапоптических

факторов, таких как гиперэкспрессия c-myc, активация Fas-рецепторов и др. In vivo

рядом работ продемонстрировано, что сниженная экспрессия IGF-1 ассоциируется

с усилением апоптоза.

78

IGF-сигнальный путь индуцирует активацию MAP-киназного пути,

способствуя усилению выживаемости опухолевых клеток. Считается, что этот

механизм реализован из-за способности комплекса IGF-1/IGF-1R индуцировать

фосфорилирование PI-3К, что впоследствии активирует Akt, инактивирует Bad и

приводит к блокаде апоптоза [21].

Также установлено, что уровень IGF-1 и IGF-2 влияет на экспрессию половых

стероидов и их рецепторов при некоторых видах раков (опухоли молочной железы,

опухоли поджелудочной железы). Установлено, что данные соединения влияют на

чувствительность опухолевых клеток к эстрогенам. Показано, что IGF-1

увеличивает транскрипционную активность, опосредованную рецепторами

эстрогенов, усиливает экспрессию эстроген-индуцируемых генов, в частности

генов рецепторов прогестерона [21].

Являясь компонентом системы комплексной сети передачи сигналов IGF-1 /

инсулин, IGF-1 регулирует клеточный метаболизм, стимулирует пролиферацию и

способствует метастазированию при ОМЖ [51].

Показано, что блокада IGF-1R сигнального пути инсулина ингибирует рост и

метастазирование при множественных типах рака, включая рак молочной железы,

как in vitro, так и in vivo [57; 62].

Очень низкий уровень IGF-1R в опухолевых клетках молочной железы по

данным ряда авторов часто ассоциирован с высоким риском метастазирования и

низким показателем выживаемости. Сверх высокая экспрессия IGF-1R сокращает

потребности опухолевых клеток в эстрогенах в процессе пролиферации, повышает

их выживаемость, но при этом ограничивают их подвижность и способность к

миграции путем Е-кадгерин клеточной адгезии [9].

Рядом исследований выявлено перекрестное реагирование IGF-1 с системой

интегринов, поскольку данный фактор структурно схож с интегрином avb3. В

культурах клеток ОМЖ человека митогенные эффекты ингибируются в результате

активации системы интегрина. Несмотря на то, что механизмы подобных

взаимодействий остаются не ясны, полагают, что данный факт оказывает влияние

79

на метастатический потенциал опухолевых клеток при ОМЖ.

Таким образом, экспрессия IGF-1 в той или иной степени влияет на

различные аспекты опухолевого роста, такие как злокачественная трансформация

клетки, инвазия, метастазирование, устойчивость к химиотерапевтическим

препаратам.

В группе самцов линии FVB достоверных отличий в содержании NO не

наблюдалось. Полученные данные об изменении среднего уровня NO самок линии

FVB в контрольных точках исследования свидетельствуют об отчетливом

снижении изучаемого показателя с увеличением возраста животного, при этом

максимально низкая концентрация NO наблюдалась у 6-месячных особей, что

совпадало с периодом максимального роста ОМЖ. В последующем наблюдалась

некоторая тенденция к повышению NO к 9 месяцам. Данный факт свидетельствует

о вовлеченности NO в патогенез опухолевого процесса, а также является

отражением прямого воздействия опухоли на эндотелий сосудов, приводя к его

дисфункции. Известно, что действие NO на эндотелиальные клетки во многом

зависит от концентрации этого соединения. В высоких концентрациях NO

вызывает токсический эффект, связанный с образованием соединения,

обладающего сильным окислительным потенциалом – пероксинитритом (ONOO-),

путем взаимодействия NO c с супероксидным анион-радикалом (О2-). Токсический

эффект на эндотелий обусловлен влиянием NO на синтез ДНК и энергетический

обмен. В низких концентрациях NO является основным эндогенным

вазодилататором, а также веществом, стимулирующим синтез VEGF и

подавляющим синтез внеклеточного матрикса и гипертрофию сосудов. Влияние

NO на злокачественные клетки по данным ряда авторов также может быть

различным, в большей степени зависящим от концентрации этого соединения [37;

176]. Точно также в высоких концентрациях NO оказывает цитотоксическое

действие на опухолевые клетки, но в небольших является стимулятором

опухолевого роста. Вызывая одно- и двунитевые разрывы ДНК, NO влияет на

баланс протоонкогенов и генов-супрессоров. Кроме того, метаболит NO

80

пероксинитрит является мутагеном [64].

В настоящее время активаторам и ингибиторам плазминогена уделяют все

больше внимания в связи важной ролью этих соединений в патогенезе опухолевого

процесса.

Известно, что уровень экспрессии компонентов системы активации

плазминогена в опухолевой ткани может являться маркером инвазивной и

метастатической активности неопластических клеток, а также показателем риска

малигнизации доброкачественных опухолей [7].

Плазмин, способный понизить уровень внеклеточных матричных

гликопротеидов, является активатором некоторых прометаллопротеиназ, в

частности, коллагеназы 4 типа, что имеет большое значение в локальном

распространении опухоли, а также ее метастатического потенциала [11]. В

многоступенчатом протеолизном каскаде, ведущему к деградации внеклеточного

матрикса, одну из главных ролей играет активатор плазминогена урокиназного

типа (uPA) и активатор тканевого типа (tPA). Однако их роль во многом

разнонаправлена, поскольку tPA по данным ряда авторов участвует в разрушении

опухолевых клеток и защите окружающих тканей [173; 197].

Активность uPA и tPA регулируется другими соединениями, принадлежащих

к классу серпинов - PAI-1 и PAI-2. По данным ряда авторов, уровень uPA, tPA и

PAI-1 вариабелен и зависит от гистологического типа опухоли и стадии

заболевания [10; 11].

Полученные нами данные свидетельствуют о достоверном повышении tPA

по мере увеличения возраста самок линии FBV (к 9 месяцам), при этом в период

интенсивного развития ОМЖ в возрасте 6 месяцев наблюдалось снижение среднего

уровня изучаемого показателя.

Средний уровень PAI-1 был практически одинаков на всем протяжении

исследования, что можно объяснить вариабельностью данного показателя.

По данным ряда исследователей изменения концентрации tPA и PAI-1

разнонаправлены в зависимости от стадии развития опухоли, в частности ОМЖ

81

[148; 156].

По данным Е.С. Герштейн, наибольшая концентрация tPA обнаруживается

на ранних стадиях ОМЖ, снижаясь по мере его развития, а при распространенном

процессе концентрация tPA практически такая же, как и на ранних стадиях

заболевания [11].

Но для PAI-1 характерна следующая тенденция: при ранних стадиях ОМЖ

концентрация PAI-1 повышается с увеличением распространенности процесса, а

при дальнейшем распространении ОМЖ концентрация PAI-1 в опухолевой ткани

снижается.

По данным ряда авторов, превышения пороговых значений uPA и PAI-1

повышает риск метастазирования и рецидивирования ОМЖ в 1,5-3 раза, и является

прогностическим показателем при данном заболевании: при этом высокий уровень

uPA ухудшает прогноз при ОМЖ, а высокий уровень tPA улучшает.

По данным ряда авторов, концентрация tPA не связана с циркулирующими

опухолевыми клетками на ранних стадиях ОМЖ [151; 195].

Положительная корреляция между уровнем экспресии tPA и PAI-1 в ткани

опухоли и интактной ткани характерна не только для ОМЖ, но и для ряда

злокачественных новообразований.

По данным Герштейн и соавт., в тканях рака слизистой оболочки полости рта

наблюдается существенное увеличение концентрации uPA и PAI-1 по сравнению с

неизмененной окружающей тканью, в то время как уровень tPA в опухолевой ткани

остается существенно сниженным по сравнению с нормой [11].

При опухолях щитовидной железы (по данным Кушлинского) наблюдается

значительное и координированное увеличение экспрессии uPA и PAI-1 по

сравнению неизмененными тканями щитовидной железы, а уровень tPA снижается

по мере развития опухолей щитовидной железы. При этом в доброкачественных

образованиях щитовидной железы наблюдается высокая экспрессия tPA, и низкая

uPA и PAI-1 [22].

Достоверные изменения экспрессии uPA, PAI-1 и tPA по сравнению с

82

неизменной ткань характерно для множества злокачественных опухолей (рак

кости, немелкоклеточный рак легкого, рак пищевода, меланомы и др.) [13; 23]

Общей закономерностью для многих злокачественных новообразований

является увеличение экспрессии uPA по мере развития опухоли. Аналогичная

закономерность прослеживается и для PAI-1.

Данный факт позволяет предположить, что усиление активации

плазминогена по урокиназному типу способствует увеличению инвазивного

потенциала опухоли, влияя на прогноз заболевания. При этом усиление экспрессии

PAI-1, возможно, способствует защите опухолевых клеток от разрушения.

По данным ряда автором tPA является более вариабельным показателем [11;

197]. Как правило, экспрессия tPA снижается независимо от уровня экспрессии

других компонентов системы активации плазминогена (в отличие от экспрессии

uPА и PAI-1) и связана с содержанием данного фактора в окружающей ткани.

Наблюдаемые нами изменения содержания tPA согласуются с данными

мировой литературы и, вероятно, свидетельствует о затухании интенсивности

опухолевого процесса и уменьшении агрессивности распространения

новообразования с возрастом испытуемых животных. На сегодняшний день,

влияние на систему активации плазминогена рассматривается как один из видов

противоопухолевой терапии.

83

Глава 4. Характеристика неоангиогенеза и системы гемостаза при развитии

лимфоцитарной лейкемии Р-388 у мышей линии CDF1

Как упоминалось ранее, развитие злокачественных новообразований

способствует нарушению структурной целостности эндотелия, усиливая его

тромбогенный потенциал. При этом механизмы нарушения сосудистого и

коагуляционного компонента системы гемостаза при неопластических процессах

требуют дальнейшего изучения.

Нами проведено исследование состояния компонентов системы гемостаза и

неоангиогенеза на модели перевиваемой лейкемии P-388, являющейся моделью

лимфопролиферативных заболеваний. Работа проведена на 61 самце мышей линии

CDF1, разделенных на 2 группы: группу интактных мышей (“Контроль”) и группу

с перевиваемой лейкемией P-388 (“Лейкоз Р-388”). Подробное описание групп

животных и принципы отбора изложены в главе «Материалы и методы

исследования».

В ходе проведенной работы частота успешной перевивки лейкемии Р-388

составила 100%, а средняя продолжительность жизни мышей группы “Лейкоз Р-

388” – 9,70±0,36 суток.

4.1. Особенности неоангиогенеза при развитии лимфоцитарной лейкемии P-388 у

мышей линии CDF1

Полученные нами данные свидетельствовали об активации механизмов

неоангиогенеза в результате развивающегося опухолевого процесса. Анализ

содержания VEGF в сыворотке крови у мышей линии CDF1 выявил достоверное

увеличение изучаемого показателя по мере развития лимфоцитарной лейкемии Р-

388 (рис. 17).

84

Рис. 17. Концентрация VEGF (пг/мл) в сыворотке крови у самцов мышей CDF1

при развитии лейкемии Р-388 в различные возрастные периоды.

Средний уровень VEGF мышей группы “Контроль” составил 6,0±0,6 пг/мл.

Средний уровень VEGF мышей в группе “Лейкоз Р-388” составил 10,50±2,09 пг/мл

на 5 сутки развития лейкемии, что достоверно превышало аналогичный показатель

группы “Контроль” в 1,75 раза (p <0,05; табл. 7). При этом средний уровень VEGF

мышей группы “Лейкоз Р-388” на 8 сутки развития опухоли составил 16,10±1,57

пг/мл, что превышало уровень VEGF группы “Контроль” в 2,6 раза (p<0,05).

Максимальные показатели содержания VEGF в крови подопытных животных

наблюдались на 8-9 сутки исследования, непосредственно перед их гибелью.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Группа

"Контроль"

Группа "Лейкоз

Р-388" 5-е сутки

Группа "Лейкоз

Р-388" 8-е сутки

Кон

цен

трац

ия V

EG

F

(пг/

мл)

85

Таблица 7.

Содержание VEGF в сыворотке крови при развитии лейкемии Р-388 у мышей

линии CDF1

Показатель

Время после

перевивки, сут

Количеств

о мышей

Концентрация

VEGF, пг/мл

Группа («Контроль») — 15 6,0±0,6

Группа («Лейкоз Р-388») 5 6 10,50±2,09*

8 10 16,10±1,57*

Примечание: *p <0,05 по сравнению с контролем.

Анализ полученных в ходе экспериментального исследования данных о

воздействии перевиваемой лейкемии Р-388 на сосудистую стенку позволяет

сделать вывод о выраженной эндотелиальной дисфункции, выражающейся в

активации неоангиогенеза.

4.2. Характеристика системы гемостаза при развитии лимфоцитарной лейкемии у

мышей линии CDF1.

Исследование динамики основных показателей плазменного компонента

системы гемостаза выявило активацию гемостатических механизмов по мере

развития лейкемии у животных группы “Лейкоз Р-388”, приводящее к развитию

опухоль-ассоциированного синдрома гиперкоагуляции (табл. 8).

86

Таблица 8.

Показатели коагуляционного гемостаза при развитии лейкемии Р-388 у мышей

линии CDF1.

Группа Время

после

перев

ивки,

сут

Колич

ество

мыше

й

АЧТВ, с ПВ, с Фибриноген, г/л

Группа

«Контроль» — 15 35,10±1,65 14,50±0,68 3,80±0,13

Группа

«Лейкоз

Р-388»

5 6 26,00±2,99* 10,80±1,33* 5,20±0,26*

8 10 17,90±0,69* 9,50±1,13*

6,40±0,21*

Примечание: *p <0,05 по сравнению с контролем.

Анализ результатов теста АЧТВ, отражающий активность внутренней

системы свертывания, выявил статистически значимые различия у животных

группы “Лейкоз Р-388” по сравнению с контрольной группой (рис. 18).

На 5 сутки от перевивки опухоли показатель АЧТВ составил 26,00±2,99 с,

что в среднем в 1,5 раза меньше, чем средний показатель группы контроля

35,10±1,65 с (р=0,0011). При этом на 8 сутки развития лейкемии изучаемый

показатель был в среднем в 2 раза меньше, чем в контрольной группе, составив в

среднем 17,90±0,69 с (р<0,001).

87

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Группа "Контроль" Группа "Лейкоз Р-388" 5-е сутки

Группа "Лейкоз Р-388" 8-е сутки

Пок

азат

ель

тест

а А

ЧТ

В (

с)

Рис. 18. Результаты теста АЧТВ (с) у самцов мышей CDF1 при развитии лейкемии

Р-388 в различные возрастные периоды.

Анализ полученных данных в ходе определения протромбинового времени

(ПВ), отражающего активность внешнего каскада свертывания крови, выявил

повышение активности коагуляционного компонента системы гемостаза и

наличие значимого уровня различий между группами “Лейкоз Р-388” и

“Контроль” (рис. 19). Уменьшение ПВ по сравнению с контрольной группой в

среднем составляло в среднем 4 с на 5 сутки после перевивки и 5 с на 8 сутки

исследования (р<0,001).

88

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Группа "Контроль" Группа "Лейкоз Р-388" 5-е сутки

Группа "Лейкоз Р-388" 8-е сутки

Пока

зате

ль

тест

а П

В (

с)

Рис. 19. Результаты теста ПВ (c) у самцов мышей CDF1 при развитии лейкемии Р-

388 в различные возрастные периоды.

Наряду с нарастанием коагуляции по внешнему и внутреннему пути, при

анализе концентрации фибриногена в сыворотке крови подопытных животных

выявлены статистически значимые различия между группами “Лейкоз Р-388” и

“Контроль” (рис. 20).

89

0

1

2

3

4

5

6

7

Группа "Контроль" Группа "Лейкоз Р-388" 5-е сутки

Группа "Лейкоз Р-388" 8-е сутки

Ко

нц

ентр

аци

я ф

иб

ри

но

ген

а (г

/л)

Рис. 20. Концентрация фибриногена (г/л) в сыворотке крови у самцов мышей

CDF1 при развитии у них лейкоза Р-388 в различные возрастные периоды.

Средняя концентрация фибриногена контрольной группы составила

3,80±0,13 г/л. После перевивки опухоли на 5-е сутки исследования концентрация

фибриногена достоверно увеличивалась по сравнению с группой “Контроль”

(р<0,001) в среднем на 1,4 г/л и составила 5,20±0,26 г/л. На 8-е сутки

фибриногенемия у животных-опухоленосителей достигла максимальных значений,

превышая показатели 5-х суток эксперимента (р=0,003) в среднем на 1,2 г/л и

контрольной группы в среднем на 3,40 г/л (р<0,001).

4.3. Обсуждение

В результате перевивки лейкемии Р-388 самцам мышей линии CDF1 и

последующего развития у них гемобластозов обнаружены значительные изменения

в сосудистой стенке, выражающихся в активации неоангиогенеза и нарушениях

гемостатических механизмов, усугубляющихся по мере прогрессирования

опухоли.

В ходе исследования выявлено достоверное увеличение VEGF в сыворотке

90

крови подопытных животных по мере развития лейкемии Р-388. Максимальные

концентрации VEGF наблюдались на 8-9 сутки исследования непосредственно

перед гибелью животных.

Полученные данные согласуются с данными мировой литературы.

Установлено, что инициация ангиогенеза характерна при развитии гемобластозов

наравне с солидными опухолями [10; 94; 164]. Высокая экспрессия VEGF описана

при большинстве опухолей кроветворной ткани и является независимым

прогностическим фактором [199].

Долгое время значение неоангиогенеза в развитии и прогрессии

онкогематологических заболеваний игнорировалось. Однако высокие

концентрации индукторов ангиогенеза, обнаруженные в крови, моче и биоптатах

костного мозга пациентов послужили основанием для более детального изучения

роли ангиогенеза при развитии опухолей кроветворной системы.

Впервые усиление васкуляризации костного мозга при лейкемии было

продемонстрировано Perez-Atayde с соавт., проанализировавших биоптаты 40

пациентов с острым лейкозом. Во всех образцах наблюдалось значительное

усиление плотности сосудистой сети по сравнению с контролем. Созданная

трехмерная модель кровоснабжения костного мозга показала в лейкозных образцах

сложные, ветвящиеся микрососуды, при этом в контрольной группе были

выявлены прямые микрососуды без ветвления [164].

Несмотря на схожесть механизмов неоангиогенеза при развитии солидных

опухолей и гемобластозов, его инициация может обуславливаться различными

факторами. Как отмечалось ранее, одним из ключевых событий для роста новых

сосудов в солидных опухолях является гипоксия, связанная с формированием

участков, где метаболические потребности опухолевых клеток превышают

возможности для их осуществления. Как правило, это связано с быстрым ростом

клеточной массы опухоли, а также с формированием кровеносных сосудов с

нарушенной цитоархитектоникой, что затрудняет доставку пластических

субстратов и кислорода. В условиях нарастающей гипоксии инициация ангиогенеза

91

обусловлена повышением экспрессией белка pVHL, направленного на HIF1α,

являющегося одним из основных регуляторов клеточного адаптативного ответа. В

данном случае неоангиогенез инициируется при участии HIF-сигнального пути, а

также Ang/Tie2 и VEGR/VEGFR-сигнальных путей.

Развитие ангиогенеза в костном мозге – более сложный, комплексный

процесс, протекающий с вовлечением множества сигнальных путей. При этом

особую роль придают микроокружению самих эндотелиоцитов и злокачественных

клеток крови. Проангиогенные факторы, и в частности VEGF, могут

секретироваться самими опухолевыми клетками, фибробластами, васкулярным

эндотелием, стромальными клетками. Таким образом, воздействие на клетки

осуществляется как по аутокринному, так и паракринному механизму. В

экспериментальных исследованиях Dias с соавт. показано, что в условиях in vitro

антитела, блокирующие VEGFR2, способны ингибировать рост свежевыделенных

опухолевых клеток, полученных об больных с острым лейкозом [73]. Также было

продемонстрировано, что при совместном культивировании лейкозных клеток с

эндотелиальными, повышенная секреция проангиогенных и провоспалительных

факторов (bFGF, IL-6) лейкозными клетками приводят к усилению экспрессии

VEGF на эндотелиоцитах. Это позволяет предположить, что рост опухолевых

клеток находится под контролем VEGF.

Высокая интенсивность неоангиогенеза при развитии онкогематологических

заболеваний может быть связана со структурными особенностями костного мозга,

основой которого является ретикулярная ткань, васкуляризированная множеством

капилляров. Эндотелий костномозговых капилляров фенестрирован, базальная

мембрана может отсутствовать или быть прерывистой, перициты также могут

отсутствовать, что создает повышенный риск метастазирования. Контактирование

опухолевых клеток с микроокружением в костном мозге происходит крайне

динамично в отличие от солидных опухолей. Наконец в костном мозге находятся

области, представленные долгоживущими остеобластными и гемопоэтическими

клетками, в которых наблюдается состояние выраженной гипоксии. Полагают, что

92

подобные условия необходимы для защиты генетического аппарата

гемопоэтических стволовых клеток от воздействия активных форм кислорода [10].

Повышенная экспрессия HIF1α наблюдается в большинстве случаев как

острых, так и хронических онкогематологических заболеваний. В исследовании

Frater и соавт. были проанализированы 42 биоптата больных хроническим

лимфолейкозом. Оценивались плотность сосудистой сети, концентрации VEGF,

TSP-1, HIF-1a. Во всех образцах с пациентов с хроническим лимфолейкозом

обнаружили расширенную, извитую сосудистую сеть, причем усиление

формирования новых сосудов было взаимосвязано с увеличением концентрации

VEGF, а подавление с TSP-1. Наличие VEGF-рецепторов на опухолевых клетках

больных подразумевало по мнению исследователей аутокринный эффект VEGF.

Активация HIF1α наблюдалась у всех больных хроническим лимфолейкозом, что

свидетельствовало о роли тканевой гипоксии в стимуляции пролиферации новых

микрососудов [94].

Исследование Wellmann показало, что HIF-1а избыточно экспрессируется на

кластерах злокачественных клеток при остром лимфобластном лейкозе у детей,

чего не наблюдалось в группе контроля. В половине биоптатов наблюдалась

повышенная экспрессия VEGF, сопряженная с низкой 3-летней выживаемостью

пациентов и плохим ответом на проводимую химиотерапию [199].

Таким образом, повышенная экспрессия VEGF при развитии

онкогематологических заболеваний доказывает важную роль проангиогенных

факторов в прогрессии лейкозов, влияя на различные аспекты опухолевого роста,

такие как злокачественная трансформация клетки, неоангиогенез, инвазия,

метастазирование, устойчивость к химиотерапевтическим препаратам.

Согласно полученным данным, развитие лейкемии P-388 сопровождалось

значительными изменениями плазменного компонента гемостаза: выявлено

достоверное снижение длительности базовых коагуляционных тестов — АЧТВ, ПВ

и развитие гиперфибриногенемии. Таким образом, все наблюдаемые

гемостатические нарушения были направлены в сторону усиления процессов

93

свертывания крови и тромбообразования.

Снижение показателей тестов АЧТВ и ПВ у мышей группы “Лейкоз Р-388”

по мере развития опухоли могло свидетельствовать об активации плазменного

компонента гемостаза как по внутреннему, так и по внешнему пути, приводя к

нарастанию гиперкоагуляционного потенциала крови мышей и возможным

тромботическим осложнениям. При этом активация системы гемостаза

сопровождалась повышенным образованием фибриногена (показан статистически

значимый уровень отличий между группами “Контроль” и “Лейкоз Р-388), что

возможно способствовало повышенному синтезу фибрина с его последующей

деградацией фибринолитической системой крови.

На наш взгляд, подобное усиление гиперкоагуляционного потенциала крови

может способствовать формированию “экрана” из микротромбов сосудистой сети

опухоли, что согласуется с данными мировой литературы [32; 133].

Мы полагаем, что подобный “экран” способен оказывать двойственное

влияние на развитие злокачественной опухоли. С одной стороны, он может

выполнять протективную функцию, ограничивая доступ иммунокомпетентных

клеток и гуморальных факторов. С другой стороны, наличие микротромбов

сосудистой сети опухоли способствует нарушению притока в зону опухолевого

роста питательных субстратов, что может оказывать влияние на скорость

опухолевого роста. Мы полагаем, что баланс “положительных” и “отрицательных”

факторов “экрана” из микротромбов, а также степень их преобладания может

оказывать влияние на опухолевую прогрессию и ответ на противоопухолевую

терапию.

Наблюдаемые изменения могут соответствовать картине

паранеопластического гиперкоагуляционного синдрома, обусловленному

продукцией опухолевыми клетками факторов свертывания, их аналогами и

рецепторами, изменением цитокинового баланса в органах и тканях, приводящих к

нарушению работы форменных элементов крови, и прямой инвазии кровеносных

сосудов, запускающей механизмы тромбообразования.

94

Как правило, развитие тромбоза при прогрессировании злокачественных

опухолей, в том числе и экспериментальной лейкемии, включает все составляющие

триады Вирхова (изменение характера кровотока с тенденцией к снижению,

склонность к гиперкоагуляции, повреждение сосудистой стенки). При этом

наибольшее значение придают гиперкоагуляции, развивающейся

преимущественно по внешнему механизму за счет влияния ракового прокоагулянта

и тканевого фактора, экспрессия которых в интактном эндотелии низка.

Установлено, что опухолевые клетки способны продуцировать данные соединения

и приводить к внутрисосудистому свертыванию крови, а также секретировать

индукторы агрегации тромбоцитов (тромбин, АДФ и др.), приводя к

формированию микроэмболов [8].

Развитие неопластического процесса сопряжено с изменениями в клеточном

компоненте системы гемостаза. Установлено, что у больных онкологического

профиля наблюдается усиление адгезивных и агрегационных свойств тромбоцитов,

как правило, за счет усиленного образования тромбина, АДФ, повышения уровня

фактора Виллебранда. Чаще подобные изменения наблюдаются при инвазии

опухоли в окружающие ткани и связанным с ним повреждением сосудистой

стенки, попадании клеточного детрита в кровоток в результате некроза в опухоли

[13; 133].

Изменения в системе гемостаза при развитии неопластического процесса

рассматривается как важный компонент в процессе метастазирования [6].

Метастатические клетки могут потенцировать развитие тромбов вокруг себя

вследствие усиленной продукции прогемостатических соединений и сами

вовлекаться в их структуру. Прикрепившись к сосудистой стенке, тромбы с

опухолевыми клетками могут стать впоследствии новым опухолевым узлом.

«Экранирование» метастатических клеток минимизирует влияние факторов

иммунной системы (компоненты комплемента, цитокины, иммуноглобулины) и

клеток иммунной системы (Т-клеток, макрофагов) на них, позволяя уходить от

иммунологического контроля [121; 133].

95

Степень выраженности изменений в системе гемостаза коррелирует с

темпами прогрессии опухолей, но во многом зависит от гистологического типа

опухоли, стадии развития заболевания, сопутствующей патологии пациента. Чаще

дизрегуляция в системе гемостаза наблюдается при опухолях центральной нервной

системы, пищеварительной системы, опухолях простаты и яичников. Среди

пациентов онкогематологического профиля ТЭО чаще развиваются при миеломе,

неходжкинских лимфомах, лимфоме Ходжкина [188].

В обширном исследовании Маджуга и соавт, проанализировавших состояние

системы гемостаза у 680 пациентов с злокачественными новообразованиями

различной локализации, показано что у онкологических больных по сравнению со

здоровыми лицами концентрация фибриногена была повышена в 2-2,5 раза и

наблюдалось увеличение содержания растворимых комплексов мономеров

фибрина, D-димера, увеличение концентрации продуктов деградации фибрина в 4-

4,5 раза. Повышение агрегационных свойств тромбоцитов наблюдалось в 37%

случаев. Синдром Труссо был диагностирован в 16% случаев до начала терапии

[24].

Таким образом, полученные данные согласуются с данными мировой и

отечественной литературы. В проведенном исследовании показано, что развитие

неопластического процесса приводит к значительным изменениям в системе

гемостаза и сопровождается выраженным неоангиогенезом, что способствует

дальнейшему росту опухоли, усиливая ее метастатический потенциал. Наибольшие

концентрации изучаемых показателей наблюдались в период наиболее

интенсивного роста опухоли или непосредственно перед гибелью животных.

Данные исследования вносят вклад в вопрос сложного взаимодействия опухоли и

организма, требующего дальнейшего изучения.

96

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высокая распространенность злокачественных новообразований и связанная

с ней летальность среди населения, а также сложность терапии злокачественных

опухолей, заставляет исследователей искать новые подходы к воздействию на

различные компоненты опухолевого процесса, и в частности на неоангиогенез и

нарушения в системе гемостаза.

Невозможность проведения экспериментальных исследований на человеке, а

также необходимость более глубокого понимания механизмов развития

злокачественных новообразований, делает моделирование опухолевого процесса

на лабораторных животных основным методом экспериментальной онкологии.

Учитывая сказанное выше, нами было проведено исследование

неоангиогенеза и коагуляционного гемостаза, а также поиск признаков

эндотелиальной дисфункции на 2-х опухолевых моделях: перевиваемой

лимфоцитарной лейкемии P-388, являющейся моделью лимфопролиферативных

заболеваний, и опухоли молочной железы, развивающейся у мышей линии FVB/N,

трансгенных по HER2/neu, являющейся моделью солидных опухолей. В обоих

случаях наблюдалась активация неоангиогенеза, с наибольшими значениями

сывороточной концентрации VEGF, основного маркера неоангиогенеза, в период

интенсивного роста опухолевого узла, зачастую непосредственно перед гибелью

животного. Выявлена выраженная эндотелиальная дисфункция и нарушения в

работе системы гемостаза у животных обеих исследуемых линий, усугубляющиеся

по мере роста опухоли, приводящие к развитию гиперкоагуляции.

Полученные данные подчеркивают необходимость проведения дальнейших

исследований особенностей системы “опухоль – неоангиогенез – гемостаз” и могут

внести значимый вклад в область теоретической онкологии.

97

ВЫВОДЫ

1. Развитие спонтанных аденокарцином молочной железы у самок-мышей

линии FVB, трансгенных по HER-2/neu, происходящее к 9-му месяцу жизни

животных в 100% случаев, сопровождается активацией неоангиогенеза с

достоверным увеличением его основного маркера (VEGF) в сыворотке крови

подопытных животных по мере развития заболевания.

2. Наибольшая интенсивность неоангиогенеза у самок-мышей линии FVB,

трансгенных по HER-2/neu, наблюдается в возрасте 6 месяцев – периоде

максимально интенсивного и агрессивного роста аденокарциномы молочной

железы с последующей тенденций к снижению в возрасте 9 месяцев.

3. По мере развития аденокарциномы молочной железы у самок-мышей линии

FVB, трансгенных по HER-2/neu, происходит достоверное снижение

основных маркеров эндотелиальной дисфункции -сывороточной

концентрации NO и tPA, однако достоверного изменения в сыворотке крови

концентрации IGF-1 и PAI-1 при этом не выявлено.

4. У самцов-мышей линии FVB, трансгенных по HER-2/neu, наблюдается

достоверное повышение основных маркеров эндотелиальной дисфункции -

концентрации VEGF на 6 месяце жизни, без достоверного изменения

концентрации IGF-1, NO, tPA, PAI-1 с увеличением возраста животного.

5. Развитие лейкемии Р-388 у мышей линии CDF1 приводит к 5-суткам жизни

животных к выраженному увеличению интенсивности неоангиогенеза с

достоверным повышением сывороточной концентрации VEGF.

Максимальные значения этого показателя наблюдаются на 8-9 сутки

исследования, непосредственно перед их гибелью.

6. По мере развития лейкемии Р-388 у мышей линии CDF1 разворачивается

выраженный опухоль-ассоциированный синдром гипрекоагуляции, с

достоверным снижением показателей АЧТВ и ПВ по сравнению с

98

контрольной группой и достоверным повышением сывороточной

концентрации фибриногена к 5-суткам исследования; фибриногенемия у

животных-опухоленосителей достигает максимума на 8-е сутки

исследования непосредственно перед гибелью.

99

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Установленное в ходе исследования нарастание сывороточной

концентрации сосудистого эндотелиального фактора роста по мере развития

аденокарциномы молочной железы и перевиваемой лейкемии Р-388 доказывает

необходимость контроля степени выраженности неоангиогенеза и является

обоснованием целесообразности применения антиангиогенных препаратов в

комплексной терапии злокачественных новообразований молочной железы и

лимфопролиферативных заболеваний.

2. Установленная в ходе исследования дисфункция гемостатических

механизмов, направленная на активацию процессов свертывания крови, позволяет

рекомендовать применение антикоагулянтов (при отсутствии противопоказаний) в

комплексной терапии злокачественных новообразований молочной железы и

лимфопролиферативных заболеваний.

3. Выявленный в ходе исследований факт дисфункции компонентов

системы гемостаза мышей при развитии перевиваемой лейкемии Р-388 позволяет

рекомендовать использовать данную опухоль в качестве модели для изучения

паранеопластического синдрома Труссо.

100

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ATIII – антитромбин III

АДФ – аденозиндифосфат

АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время

ВАК – Высшая аттестационная комиссия

ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения

ДВС-синдром – синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ОМЖ – опухоли молочной железы

ПВ – протромбиновое время

ТЭО – тромбоэмболические осложнения

ФНО – фактор некроза опухоли

Akt – alpha serine/threonine-protein kinase – один из трёх членов семейства

протеинкиназ

Ang – angiopoietin– ангиопоэтин

bFGF – basic fibroblast growth factor – щелочной фактор роста фибробластов

Ca++ – кальций

CBF1 – С promoter binding factor 1– транскрипционный фактор

CD – cluster of differentiation – кластер дифференцировки

CP – сancer procoagulant – раковый прокоагулянт

Dll – Delta-like – дельта-подобный рецептор

EGF – epidermal growth factor – эпидермальный фактор роста

Fas – first apoptosis signal receptor – сигнальный рецептор апоптоза

GM-CSF – granulocyte-macrophage colony-stimulating factor –гранулоцитарно-

макрофагального колониестимулирующего фактора

HER – human epidermal growth factor receptor – рецептор эпидермального фактора

роста

HGF – hepatocyte growth factor – фактор роста гепатоцитов

101

HIF – hypoxia-inducible factor – гипоксия-индуцибельный фактор

ICAM – intercellular adhesion molecules – межклеточные молекулы адгезии

IGF-1 – Insulin-like growth factor 1 – инсулиноподобный фактор роста 1 типа

IL – interleukin – интерлейкин

MAP – mitogen-activated protein kinase — митоген-активируемая протеинкиназа

MAPK – mitogen-activated protein kinase — митоген-активируемая протеинкиназа

MMP – matrix metalloproteinase enzymes – металлопроиназы

NO – nitric oxide – оксид азота

NPR – neuropillin – нейропиллин

PAI-1 – plasminogen activator inhibitor-1 – ингибитор активатора плазминогена 1

типа

PDGF – platelet-derived growth factor – фактор роста из тромбоцитов

PLGF –placental growth factor – плацентарный фактор роста

TAM – tumor-associated macrophage – опухоль-ассоциированные макрофаги

TF – tissue factor – тканевой фактор

TGF-β – transforming growth factor – трансформирующий фактор роста

Tie – tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 1 –

тирозинкиназа

TNF-α – tumor necrosis factor alpha – фактор некроза опухоли альфа

tPA – tissue plasminogen activator, medication used for stroke – тканевой активатор

плазминогена

TSP – trombospodin – тромбосподин

uPA – urokinase-type plasminogen activator – активатор плазминогена урокиназного

типа

PAI – plasminogen activator inhibitor – активатор ингибитора флазминогена

VCAM – vascular cell adhesion protein – белок клеточной адгезии

VE – vascular endothelial cadherin – кадхерины

VEGF – vascular endothelial growth factor – фактор роста эндотелия сосудов

VEGFR – vascular endothelial growth factor receptor – рецептор фактора роста

102

эндотелия сосудов

VHL – von Hippel–Lindau tumor suppressor – ген фон Гиппель-Ландау

WT – wild type – ген дикого типа

XIAP – x-linked inhibitor of apoptosis protein – ингибитор апоптоза

ZO-1 – zonula occludens-1 – белок окклудин

103

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алимова, И.Н. Особенности старения и канцерогенеза у трансгенных мышей

HER-2/neu: механизмы и модифицирующие воздействия / И.Н. Алимова //

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата

биологических наук. – СПб., 2002. – 21 с.

2. Амчиславский, Е. И. Цитокиновый контроль процесса ангиогенеза / Е.И.

Амчиславский, Д. И. Соколов, Э.А. Старикова [и др.] // Медицинская

иммунология. – 2003. – № 5. – С. 493-506.

3. Анисимов, В.Н. Метформин замедляет старение и развитие опухолей

молочной железы у трансгенных мышей HER-2/neu / В.Н. Анисимов, П.А.

Егормин, Л.М. Берштейн [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и

медицины. – 2005. – № 6. – С. 691-694.

4. Антонов, В. Г. Патогенез онкологических заболеваний: иммунные и

биохимические феномены и механизмы / В.Г. Антонов, В.К. Козлов //

Цитокины и воспаление. – 2004. – Т. 3 – № 1. – С. 8-19.

5. Баныра, О.Б. Блокада ангиогенеза в терапии рака почки: механизмы,

особенности и перспективы / О.Б. Баныра, А.В. Шуляк // Экспериментальная

и клиническая урология. – 2011. – № 1 – С. 59-68.

6. Барышников, А. Ю. Взаимоотношение опухоли и иммунной системы

организма / А.Ю. Барышников // Практическая онкология. – 2003. – Т. 4 – №

3. – С. 127-130.

7. Берштейн, Л.М. Онкоэндокринология. Традиции, современность и

перспективы / Л.М. Берштейн – Санкт-Петербург: Наука, 2004. – 343 с.

8. Бокарев, И.И. Тромбозы и противотромботическая терапия в клинической

практике / И.И. Бокарев, Л.В. Попова, Т.В. Козлова – Москва: ”МИА”. – 2009.

– 416 с.

9. Бочкарева, Н.В. Инсулиноподобные факторы роста и связывающие их белки

в патогенезе рака эндометрия / Н.В. Бочкарева // Сибирский онкологический

журнал. – 2008. – № 3. – С. 86-93.

104

10. Вартанян, А.А. Основные закономерности при ангиогенеза при

онкогематологических заболеваниях / А.А. Вартанян // Клиническая

онкогематология. – 2013. – Т. 6. – № 4. – С. 343-353.

11. Герштейн, Е.С. Система активации плазминогена как показатель

метастатической активности опухолей и потенциальная мишень

противоопухолевой терапии / Е.С. Герштейн // Материалы IV ежегодной

Российской онкологической конференции. – Москва, 2000. – С. 21.

12. Герштейн, Е.С. Биологические маркеры рака молочной железы:

методологические аспекты и клинические рекомендации / Е.С. Герштейн,

Н.Е. Кушлинский // Маммология. – 2005. – №1. – С. 65-69.

13. Данилова, А.Б. Нарушения свертывания крови у онкологических больных /

А.Б. Данилова, В.Б. Окулов, Л.П. Папаян // Вопросы онкологии. – 1998. –

Т.44. – № 1. – С. 12-18.

14. Добровольский, А.Б. Образование тромбина и его функции в системе

гемостаза / А.Б. Добровольский, Е.В. Титаева // Атеротромбоз. – 2013. – №1.

– С. 66-72.

15. Иванцов, А.О. Молекулярные маркеры чувствительности и резистентности

карцином толстой кишки к терапии антагонистами EGFR / А.О. Иванцов,

Г.А. Янус, Е.Н. Суспицын [и др.] // Сибирский онкологический журнал. –

2016. – Т. 15. – №1. – С. 59-66.

16. Кадагидзе, З.Г. Новые возможности регуляции противоопухолевого

иммунного ответа / З.Г. Кадагидзе, А.И. Черткова, Т.Н. Заботина [и др.] //

Злокачественные опухоли. – 2015. – Т. 12. – № 1. – С. 24-30.

17. Кайгородова, Е.В. Новые показатели функционального состояния HSP27 в

опухолевых клетках рака молочной железы при различных вариантах

HER2/neu-статуса / Е.В. Кайгородова, М.В. Богатюк, М.В. Завьялова [и др.]

// Сибирский онкологический журнал. – 2015. – Т. 1. – №1. – С. 38-44.

105

18. Каприн, А.Д. Состояние онкологической помощи населению в 2017 году /

А.Д. Каприн, В.В. Старинский, Г.В. Петрова. – Москва: МНИОИ им. П.А.

Герцена филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2017. – 250 с.

19. Киселева, Е.П. Фактор роста сосудистого эндотелия и иммунная система /

Е.П. Киселева, А.В. Крылов, Э.А. Старикова [и др.] // Успехи современной

биологии. – 2009. – Т. 129. – № 4. – С. 336-347.

20. Кобалава, Ж.Д. Артериальная гипертония на фоне терапии онкологических

заболеваний ингибиторами ангиогенеза: серьезное препятствие или

управляемая реакция? / Ж.Д. Кобалава, Е.К. Шаварова // Опухоли головы и

шеи. – 2017. – Т. 7. – №2. – С. 70-80.

21. Костылева, О.И. Рак молочной железы и инсулиноподобные факторы роста /

О.И. Костылева, А.В. Масляев, Ю.В. Крюк [и др.] // Российский

биотерапевтический журнал. – 2012. – Т. 11. – № 1. – С. 79-84.

22. Кушлинский, Н.Е. Активаторы плазминогена урокиназного и тканевого

типов и их ингибитор при заболеваниях щитовидной железы. / Н.Е.

Кушлинский, И.А. Казанцева, Е.С. Герштейн [и др.] // Проблемы

эндокринологии. – 2004. – Т. 50. – №3 – С. 25-29.

23. Кушлинский, Н.Е. Активаторы плазминогена и их ингибитор в опухолях и

опухолеподобных поражениях костей / Н.Е. Кушлинский, А.И. Юсифов, Е.С.

Герштейн [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. –

2001. – Т. 132. – №2. – С. 180-182.

24. Маджуга, А.В. Патогенез, диагностика и профилактика нарушений системы

гемостаза у больных злокачественными новообразованиями / А.В. Маджуга,

О.В. Сомонова, А.Л. Елизарова // Практическая онкология. – 2001. – №5. – С.

2-5.

25. Матюшин, А.И. Деонтология медико-биологического эксперимента / А.И.

Матюшин, В.С. Осняч, Т.Н. Павлова. – Москва: МЗ РСФСР; 1987 – 76 с.

26. Мерабишвили, В.М. Злокачественные новообразования в Санкт-Петербурге

(анализ базы данных ракового регистра по международным стандартам:

106

заболеваемость, смертность, выживаемость) / Под ред. проф. А.М. Беляева. –

СПб, 2015. – 296 с.

27. Носарева, O.Л. Нарушение экспрессии мРНК Hsp27 и убиквитина как

механизма ускользания опухолевых клеток линии Iukat от апоптоза / О.Л.

Носарева, Е.А. Степовая, Н.В. Рязанцева [и др.]// Бюллетень сибирской

медицины. − 2015. − Т.14. − №1. − С.66-72.

28. Семиглазов, В.Ф. Неоадъювантное и адъювантное лечение рака молочной

железы: учебное пособие / В. Ф. Семиглазов, В. В. Семиглазов, А. Е.

Клетсель. – Москва: МИА, 2008. – 288 с.

29. Спринджук, М. В. Ангиогенез: значение в современной медицине, ключевые

аспекты патогенеза, проблемы оценки изображений, полученных при

исследовании гистологических микропрепаратов / М.В. Спринджук, М. В.

Фридман // Медицинская панорама. – 2009. – N 10. – С. 5-9.

30. Стенина, М.Б. HER2 как мишень современной противоопухолевой терапии

рака молочной железы / М.Б. Стенина // Эффективная фармакотерапия. –

2015. – №. 10. – С.24-31.

31. Султансеитов, Ш.С. Неоадъювантная химиотерапия местно-

прогрессирующего рака молочной железы / Ш.С. Султансеитов //

Современные тенденции развития науки и технологий. – 2016. – Т. 4. – №2. –

С. 109-112.

32. Трашков, А.П. Сравнительная характеристика нарушений работы

плазменного компонента системы гемостаза крыс при развитии

экспериментальных опухолей различного гистологического типа / А.П.

Трашков, А.Г. Васильев, Е.А. Дементьева [и др.] // Вестник Российской

военно-медицинской академии. – 2011. – № 1. – С. 148-153.

33. Трашков, А.П. Проблема регуляции неоангиогенеза в онкологии: механизмы

и перспективы практического применения / А.П. Трашков, Н.А. Верлов, Н.В.

Цыган [и др.]// Регионарное кровообращение и микроциркуляция. – 2015. –

№ 4. – С. 11-17.

107

34. Тюляндин, С. А. Ингибиторы ангиогенеза в терапии эпителиального рака

яичников / С.А. Тюляндин, А.С. Тюляндина // Современная онкология. –

Москва:Медиа Медика, 2010. – № 4. – С. 15-19.

35. Фильченков, А.А. Терапевтический потенциал ингибиторов ангиогенеза /

А.А. Фильченков // Онкология. – 2007. – № 4. – С. 321-328.

36. Хамидуллина Г.А. Неоангиогенез в колоректальных аденомах и

аденокарциномах / Г.А. Хамидуллина, Н.В. Жарков, Е.Н. Середа // Вестник

КРСУ. – 2012. – Т.12. – № 4. – С. 63-65.

37. Цыган, В.Н. Иммунная система против рака / В.Н. Цыган // Обзоры по

клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2004. – Т. 3. – № 3. –

С. 68-74.

38. Чехонин, В.П. Роль VEGF в развитии неопластического ангиогенеза / В.П.

Чехонин, С.А. Шеин, А.А. Корчагина [и др.] // Вестник РАМН. – 2012. – №

2. – С. 23-33.

39. Шедогуб, О.И. Значение онкомаркеров в диагностике рака молочной железы

на ранней стадии развития и при метастазировании / О.И. Шедогуб, Н.Н.

Улитина, А.Е. Карих // Теоретические и прикладные аспекты современной

науки. – 2015. – Т. 9. – № 1. – С. 77-81.

40. Щербаков, А.М. Белки-регуляторы эпителиально-мезенхимального перехода

и некоторые компоненты VEGF-сигнального пути в опухолях молочной

железы / А.М. Щербаков, Е.С. Герштейн, Е.А. Короткова [и др.] //

Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2015. – Т. 160. – №12.

– С. 773-778.

41. Abulafia, O. Angiogenesis in endometrial hyperplasia and stage I endometrial

carcinoma / O. Abulafia, W.E. Triest, D.M. Sherer [et all] // Obstetrics &

Gynecology – 1995. – Vol. 86(1) – P. 479-485.

42. Adham, S.A. Modeling of hypo/hyperglycemia and their impact on breast cancer

progression related molecules / S.A. Adham, H. Al Rawahi, S. Habib [et all] //

PLOS One. – 2014. – Vol. 9(11). – P. 45-56.

108

43. Adham, S.A. Glucose is a key regulator of VEGFR2/KDR in human epithelial

ovarian carcinoma cells / S.A. Adham, B.L. Coomber // Biochemical and

Biophysical Research Communications. – 2009. – Vol. 390(1) – P. 130-135.

44. Al-Husein, B. Antiangiogenic therapy for cancer: an update. / B. Al-Husein, M.

Abdalla, M. Trepte [et all] // Pharmacotherapy. – 2012. – Vol. 32(12). – P.1095-

1111.

45. Andrechek, E.R. Amplification of the neu/erbB-2 oncogene in a mouse model of

mammary tumorigenesis / E.R. Andrechek , W.R. Hardy, P.M. Siegel [et all] //

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. – 2000. –

Vol. 97(7). – P. 3444-3449.

46. Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vascular medicine / T.Asahara //

Yakugaku Zasshi. – 2007. – Vol.127 (5). – P. 841-845.

47. Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis / T.

Asahara, T. Murohara, A. Sullivan [et all] // Science. – 1997. – Vol. 275(5302). –

P. 964-967.

48. Askerman, R. Prognosis in idiopathic thrombophlebitis / R. Askerman, J. Estes //

Annals of Internal Medicine. – 1951. – Vol. 34(4). – P. 902-910.

49. Barzi, A. Angiogenesis-related agents in esophageal cancer / A. Barzi, H.J. Lenz //

Expert Opinion on Biological Therapy. – 2012. – Vol. 12(10). – P. 1335-1345.

50. Basic, V.T. TNF stimulation induces VHL overexpression and impairs angiogenic

potential in skeletal muscle myocytes / V.T. Basic, A. Jacobsen, A. Sirsjö [et all]

// International Journal of Molecular Medicine. – 2014. – Vol. 34(1). – P. 228-236.

51. Belfiore, A. The role of insulin receptor isoforms and hybrid insulin/IGF-I

receptors in human cancer / A. Belfiore // Current Pharmaceutical Design. – 2007.

– Vol. 13. – P. 671-686.

52. Bell, D. Expression and significance of notch signaling pathway in salivary

adenoid cystic carcinoma / D. Bell, E.Y. Hanna, L. Miele [et all] // Annals of

Diagnostic Pathology. – 2014. – Vol. 18. – P.10-13.

109

53. Benedito, R. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on

angiogenesis / R. Benedito, C. Roca, I. Sörensen [et all] // Cell. – 2009. – Vol.

137(6). – P. 1124-1135.

54. Blom, J.W. Malignancies, prothrombotic mutations, and the risk of venous

thrombosis / J.W. Blom, C.J. Doggen [et all] // Journal of the American Medical

Association. – 2005. – Vol. 293. – P. 715-722.

55. Braun, M.W. Regulation of cytotoxic T-cell responses by p53 in cancer / M.W.

Braun, T. Iwakuma // Translational Cancer Research. – 2016. – Vol. 5(6). – P. 692-

697.

56. Brockmann, C. Influence of seasonal sunlight intensity and iris color on the anti-

VEGF therapy for neovascular age-relatedmacular degeneration / C. Brockmann,

T. Brockmann , J. Dawczynski // Eye. – 2013. – 27(10). – P. 1169-73.

57. Buck, E. Small molecule inhibitors of the IGF-1R/IR axis for the treatment of

cancer / E. Buck, M. Mulvihill // Expert Opinion on Investigational Drugs. – 2011.

– Vol. 20. – P. 605-621.

58. Burkholder, B. Tumor-induced perturbations of cytokines and immune cell

networks / B. Burkholder, R.Y. Huang, R. Burgess [et all] // Biochimica et

Biophysica Acta. – 2014. – Vol. 1845(2). – P. 182-201.

59. Cao, Y. Angiogenesis modulates adipogenesis and obesity / Y. Cao // The Journal

of Clinical Investigation. – 2007. – Vol. 117(9). – P. 2362-2368.

60. Carlsson, K. Probing the interface between factor Xa and tissue factor in the

quaternary complex tissue factor-factor VIIa-factor Xa-tissue factor pathway

inhibitor / K. Carlsson, P.O. Freskgård, E. Persson [et all] // European Journal of

Biochemistry. – 2003. – Vol. 270(12). – P. 2576-2582.

61. Carmeliet, P. Angiogenesis in cancer and other diseases / P. Carmeliet, R.K. Jain

// Nature. – 2000. – Vol. 407(6801). – P. 249-257.

62. Cerná, M. IGF1 and tumor markers in different breast cancer stages / M. Cerná, A.

Narsanská, V. Treska [et all] // Rozhledy v chirurgii. – 2011. – Vol. 90(12). – P.

688-694.

110

63. Chappell, W.H. p53 expresion controls prostate cancer sensitivity to chemotherapy

and the MDM2 inhibitor Nutlin-3 / W.H. Chappell, B.D. Lehmann, D.M. Terrian

[et all] // Cell Cycle. – 2012. – Vol. 27. – P. 11-24.

64. Cheng, H. Nitric oxide in cancer metastasis / H. Cheng, L. Wang, M. Mollica [et

all] // Cancer Letters. – 2014. – Vol. 353(1). – P. 1-7.

65. Claesson-Welsh, L. Blood vessels as targets in tumor therapy/ L. Claesson-Welsh

// Upsala Journal of Medical Sciences. – 2012. – Vol. 117(2). – P. 178-186.

66. Claesson-Welsh, L. VEGF receptor signal transduction - A brief update / L.

Claesson-Welsh // Vascular Pharmacology. – 2016. – Vol. 86. –P. 14-17.

67. Coşkun, Ö. Determination of IL-6, TNF-α and VEGF levels in the serums of

patients with colorectal cancer / Ö. Coşkun, Ö. Öztopuz, Ö.F. Özkan // Cellular and

Molecular Biology (Noisy-le-grand). – 2017. – Vol. 63(5). – P. 97-101.

68. Cvetkovic, D. Increased hypoxia correlates with increased expression of the

angiogenesis marker vascular endothelial growth factor in human prostate cancer /

D. Cvetkovic , B. Movas , A.P. Dicker // Urology. – 2001. – Vol. 57. – P. 821-825.

69. Daniele, G. New biological treatments for gynecological tumors: focus on

angiogenesis / G.Daniele, M. Di Maio, M.C. Piccirillo [et all] // Expert Opinion

on Biological Therapy. – 2014. – Vol. 14(3). – P. 337-346

70. De Falco, S. The discovery of placenta growth factor and its biological activity / S.

De Falco // Experimental & Molecular Medicine. – 2012. – Vol. 44(1) – P. 1-9.

71. De Giovanni, С. Vaccines against human HER2 prevent mammary carcinoma in

mice transgenic for human HER2 / C. De Giovanni, G. Nicoletti, E. Quaglino [et

all] // Breast Cancer Research. – 2014. – Vol. 16(1): R10.

72. De Palma, M. Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes

required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte

progenitors / M. De Palma, M.A. Venneri, R. Galli [et all] // Cancer Cell. – 2005.

– Vol. 8(3). – P. 211-226.

111

73. Dias, S.Autocrine stimulation of VEGFR-2 activates human leukemic cell growth

and migration / S. Dias, K. Hattori, Z. Zhu // Journal of Clinical Investigation.–

2000. – Vol. 106. – P. 511-21.

74. Eklund, L. Tie receptors and their angiopoietin ligands are context-dependent

regulators of vascular remodelling / L. Eklund, B.R. Olsen // Experimental Cell

Research. – 2006. – Vol. 312. – P. 630-634.

75. Ellis, L.M. Role of angiogenesis inhibitors in cancer treatment / L.M. Ellis, W. Liu,

F. Fan [et all] // Oncology (Williston Park). – 2001. – Vol. 15 (7 Suppl 8). – P. 39-

46.

76. Erreni, M. Tumor-associated Macrophages (TAM) and Inflammation in Colorectal

Cancer / M.Erreni, A. Mantovani, P. Allavena // Cancer Microenviron. – 2011. –

Vol. 4(2). – P. 141-154.

77. Espinoza, I. Notch inhibitors for cancer treatment / I. Espinoza, L.Miele //

Pharmacology & Therapeutics. – 2013. – Vol. 139(2). – P. 95-110.

78. Evans, C.E. Diverse roles of cell-specific hypoxia-inducible factor 1 in cancer-

associatedhypercoagulation / C.E. Evans, P.O. Bendahl, M. Belting [et all] //

Blood. 2016. – Vol. 127(10) – P. 1355-1360.

79. Fagiani, E. Angiopoietins in angiogenesis / E. Fagiani, G. Christofori // Cancer

Letters. – 2013. – Vol. 328(1) – P. 18-26.

80. Fantozzi, A. VEGF-mediated angiogenesis links EMT-induced cancer stemness to

tumor initiation / A. Fantozzi, D.C. Gruber, L. Pisarsky [et all] // Cancer Research.

– 2014. – Vol. 74(5) – P. 1566-1575.

81. Feng, Y. Impaired pericyte recruitment and abnormal retinal angiogenesis as a

result of angiopoietin-2 overexpression / Y. Feng, F. vom Hagen, F. Pfister [et all]

// Thrombosis and Haemostasis. – 2007. – Vol. 97(1). – P. 99-108.

82. Ferrara, N. Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of

the VEGF gene / N. Ferrara, K. Carver-Moore, H. Chen // Nature. – 1996. – Vol.

380. – P. 439-442.

112

83. Ferrara, N. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor

specific for vascular endothelial cells / N. Ferrara , W.J. Henzel // Biochemical and

Biophysical Research Communications. –1989. – Vol. 161(2). – P. 851-858.

84. Ferrara, N. VEGF and Intraocular Neovascularization: From Discovery to Therapy

/ N. Ferrara // Translational Vision Science & Technology. – 2016. – Vol. 5(2). –

P. 10.

85. Ferrara, N. The biology of VEGF and its receptors. / N. Ferrara, H.P. Gerber, J. Le

Couter // Nature Medicine. – 2003. – Vol. 9(6). – P. 669-676.

86. Ferrari, G. Transforming growth factor-beta 1 (TGF-beta1) induces angiogenesis

through vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated apoptosis / G.

Ferrari, B.D. Cook, V. Terushkin [et all] // Journal of Cellular Physiology. – 2009.

– Vol. 219(2). – P. 449-458.

87. Ferrari, G. Mignatti P. TGF-β1 induces endothelial cell apoptosis by shifting

VEGF activation of p38 (MAPK) from the prosurvival p38β to proapoptotic p38α

/ G. Ferrari, V. Terushkin, M.J. Wolff [et all] // Molecular Cancer Research. –

2012. – Vol. 10(5). – P. 605-614.

88. Folkman, J. Fighting cancer by attacking its blood supply / J. Folkman // Scientific

American. – 1996. – Vol. 275. – P. 150-154.

89. Folkman, J. Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis / J. Folkman //

Seminars in Oncology. – 2002. – Vol. 29. – P. 15-18.

90. Folkman, J. The vascularization of tumors / J. Folkman // Scientific American. –

1976. – Vol. 234(5). – P. 158-154.

91. Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis-dependent?/ J.

Folkman // Journal of the National Cancer Institute. – 1990. – Vol. 82(1). – P. 4-

6.

92. Folkman, J. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis /J. Folkman,

E. Merler, C. Abernath [et all] // The Journal of Experimental Medicine. – 1971.

– Vol. 133(2). – P. 275-288.

113

93. Folkman, J. Angiogenesis inhibitors generated by tumors / J. Folkman // Molecular

Medicine. – 1995. – Vol. 1(2). – P. 120-122.

94. Frater, J.L. Dysregulated angiogenesis in B-chronic lymphocytic leukemia:

Morphologic, immunohistochemical, and flow cytometric evidence / J.L. Frater,

N.E. Kay, C.L. Goolsby [et all] // Diagnostic Pathology. – 2008. – Vol. 3: 16.

95. Furie, B. Mechanisms of thrombus formation / B. Furie, B. C. Furie // The New

England Journal of Medicine. – 2008. – Vol. 359(9). – P. 938-949.

96. Fushida, S. VEGF is a target molecule for peritoneal metastasis and malignant

ascites in gastric cancer: prognostic significance of VEGF in ascites and efficacy

of anti-VEGF monoclonal antibody / S. Fushida, K. Oyama, J. Kinoshita, Y. Yagi

[et all] //OncoTargets and Therapy. – 2013. – Vol. 16. – P. 1445-1451.

97. Gale, N.W. Haploinsufficiency of delta-like 4 ligand results in embryonic lethality

due to major defects in arterial and vascular development / N.W. Gale, M.G.

Dominguez, I. Noguera, L. Pan [et all] // Proceedings of the National Academy of

Sciences. – 2004. – Vol. 101(45). – P. 15949-15954.

98. García-Román, J. Vascular permeability changes involved in tumor metastasis / J.

García-Román, A. Zentella-Dehesa // Cancer Letters. – 2013. – Vol. 335(2). – P.

259-269.

99. Gasparini, G. Prognostic significance of vascular endothelial growth factor protein

in node-negative breast carcinoma / G. Gasparini, M. Toi, M. Gion [et all] // Journal

of the National Cancer Institute. – 1997. – Vol. 89(2). – P. 139-147.

100. Giatromanolaki, A. Angiogenesis and angiogenic factor expression in

thyroid cancer / A. Giatromanolaki, G. Lyberakidis, N. Lyratzopoulos [et all] //

JBUON. – 2010. – 15(2). – P. 357-361.

101. Giatromanolaki, A. Activated VEGFR2/KDR pathway in tumour cells and

tumour associated vessels of colorectal cancer / A. Giatromanolaki, M.I.

Koukourakis, E. Sivridis [et all] // European Journal of Clinical Investigation. –

2007. – Vol. 37(11). – P. 878-886.

114

102. Giatromanolaki, A. Vascular density analysis in colorectal cancer patients

treated with vatalanib (PTK787/ZK222584) in the randomised CONFIRM trials /

A. Giatromanolaki, M.I. Koukourakis, E. Sivridis [et all] // British Journal of

Cancer. – 2012. – Vol. 107(7). – P. 1044-1050.

103. Gille, H. Analysis of biological effects and signaling properties of Flt-1

(VEGFR-1) and KDR (VEGFR-2). A reassessment using novel receptor-specific

vascular endothelial growth factor mutants / H. Gille , J. Kowalski, B. Li // The

Journal of Biological Chemistry. – 2001. – Vol. 276. – P. 3222-3230.

104. Goel, H.L. VEGF targets the tumour cell / H.L. Goel, A.M. Mercurio //

Nature Reviews Cancer. – 2013. – Vol. 13(12). – P. 871-882.

105. Goel, H.L. P-Rex1 Promotes Resistance to VEGF/VEGFR-Targeted

Therapy in Prostate Cancer / H.L. Goel, B. Pursell, L.D. Shultz [et all] // Cell

Reports. – 2016. – Vol. 14(9). – P. 2193-2208.

106. Goldman, E. The growth of malignant disease in man and the lower animals

with special reference to the vascular system / E. Goldman // Lancet. – 1907. – Vol.

1. – P. 1236-1240.

107. Greenblatt, M. Tumor angiogenesis: transfilter diffusion studies in the

hamster by the transparant chamber technique / M. Greenblatt, P. Shubik // Journal

of the National Cancer Institute. – 1968. – Vol. 41. – P. 111-124.

108. Gunes, C. Telomeres in cancer / C. Gunes, A.I. Avila, K.L. Rudolph //

Differentiation. – 2017. – Vol. 99– P. 41-50.

109. Hagemann, T. Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells

via NF-kappa B and JNK / T. Hagemann, J. Wilson, H. Kulbe [et all] // The Journal

of Immunology. – 2005. – Vol. 175(2). – P. 1197-1205.

110. He, Z. Neuropilin is a receptor for the axonal chemorepellent Semaphorin III

/ Z. He, M.Tessier-Lavigne // Cell. – 1997. –Vol. 90 – P. 739-751.

111. Hein, A. Genetic variants in VEGF pathway genes in neoadjuvant breast

cancer patients receiving bevacizumab: Results from the randomized phase III

115

GeparQuinto study / A. Hein, D. Lambrechts, G. von Minckwitz [et all] //

International Journal of Cancer. – 2015. – Vol. 137(12). – P. 2981-2988.

112. Hiratsuka, S. Flt-1 lacking the tyrosine kinase domain is sufficient for normal

development and angiogenesis in mice / S. Hiratsuka, O. Minowa, J. Kuno, T.

Noda, M. Shibuya // Proceedings of the National Academy of USA – 1998. – Vol.

95(16). – P. 9349-9354.

113. Holash, J. New model of tumor angiogenesis: dynamic balance between

vessel regression and growth mediated by angiopoietins and VEGF / J. Holash,

S.J. Wiegand, G.D. Yancopoulos // Oncogene. – 1999. – Vol. 18(38). – P. 5356-

5362.

114. Hollingsworth, H.C. Tumor angiogenesis in advanced stage ovarian

carcinoma. / H.C. Hollingsworth, E.C. Kohn, S.M. Steinberg, M.L. Rothenberg,

M.J. Merino // The American Journal of Pathology. – 1995. – Vol. 147(1). – P. 33-

41.

115. Holmes, K. Vascular endothelial growth factor receptor-2: structure,

function, intracellular signalling and therapeutic inhibition / K. Holmes, O.L.

Roberts, A.M. Thomas, M.J. Cross // Cell Signaling. – 2007. – Vol. 19(10). – P.

2003-2012.

116. Hormbrey, E. A critical review of vascular endothelial growth factor (VEGF)

analysis in peripheral blood: is the current literature meaningful? / E. Hormbrey,

P. Gillespie, K. Turner [et all] // Clinical & Experimental Metastasis. – 2002. –

Vol. 19(8). – P. 651-663.

117. Humphries, M.J. Mechanisms of integration of cells and extracellular

matrices by integrins / M.J. Humphries, M.A. Travis, K. Clark, A.P. Mould //

Biochemical Society Transactions. – 2004. – Vol. 32. – P. 822-825.

118. Ibrahim, Y.H. Insulin-like growth factor-I and breast cancer therapy / Y.H.

Ibrahim, D. Yee // Clinical Cancer Research. – 2005. – Vol. 11(2). – P. 944-950.

119. Infanger, M. Vascular endothelial growth factor inhibits programmed cell

death of endothelial cells induced by clinorotation / M. Infanger, P. Kossmehl, M.

116

Shakibaei [et all] // Journal of Gravitational Physiology. – 2004. – Vol. 11(2). – P.

199-200.

120. Jain, R.K. Normalizing tumor vasculature with anti-angiogenic therapy: a

new paradigm for combination therapy / R.K. Jain // Nature Medicine. – 2001. –

Vol. 7(9). – P. 987-989.

121. Jedinak, A. Activated macrophages induce metastatic behavior of colon

cancer cells / A. Jedinak, S. Dudhgaonkar, D. Sliva // Immunobiology. – 2010. –

Vol. 215. – P. 242-249.

122. Jiang, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular

hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway / M.

Jiang, C. Qin, M. Han // Molecular Carcinogenesis. – 2016. – Vol. 55(6). – P. 1087-

1095.

123. Khorana, A.A. Frequency, risk factors, and trends for venous

thromboembolism among hospitalized cancer patients / A.A. Khorana, C. W.

Francis, E. Cula-kova [et all] // Cancer. – 2007. – Vol. 110. – P. 2339-2346.

124. Kieser, A. Mutant p53 potentiates protein kinase C induction of vascular

endothelial growth factor expression / A. Kieser, H.A. Weich, G. Brandner [et all]

// Oncogene. – 1994. – Vol. 9(3). – P. 963-969.

125. Kim, S.J. Monosialic ganglioside GM3 specifically suppresses the monocyte

adhesion to endothelial cells for inflammation / S.J. Kim, T.W. Chung, H.J. Choi

[et all] // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. – 2014. – Vol.

46. – P. 32-38.

126. Kobayashi, H. Suppression of urokinase receptor expression by thalidomide

is associated with inhibition of nuclear factor kappaB activation and subsequently

suppressed ovarian cancer dissemination / H. Kobayashi, T. Yagyu, T. Kondo [et

all] // Cancer Research. – 2005. – Vol. 65(22). – P. 10464-10471.

127. Kraaijpoel, N. Clinical Impact and Course of Anticoagulant-Related Major

Bleeding in Cancer Patients / N. Kraaijpoel, N. van Es, S.M. Bleker [et all] //

Thrombosis and Haemostasis. – 2018. – Vol. 118(1). – P. 174-181.

117

128. Krebs, L.T. Haploinsufficient lethality and formation of arteriovenous

malformations in Notch pathway mutants / L.T. Krebs, J.R. Shutter, K. Tanigaki

[et all] // Genes & Development. – 2004. – Vol. 18(20). – P. 2469-73.

129. Krikun, G. Endometriosis, angiogenesis and tissue factor / G. Krikun //

Scientifica (Cairo). – 2012; 2012:306830.

130. Kuhnert, F. Dll4-Notch signaling as a therapeutic target in tumor

angiogenesis / F. Kuhnert, J.R. Kirshner, G. Thurston // Vascular Cell. – 2011. –

Vol. 3(1). – P. 20.

131. Lammers, P.E. Targeting angiogenesis in advanced non-small cell lung

cancer / P.E. Lammers, L. Horn // Journal of the National Comprehensive Cancer

Network. – 2013. – Vol. 11(10). – P. 1235-1247.

132. Lash, G.E. Localization of angiogenic growth factors and their receptors in

the human endometrium throughout the menstrual cycle and in recurrent

miscarriage / G.E. Lash, B.A. Innes, J.A. Drury [et all] // Human Reproduction. –

2012. – Vol. 27(1). – P. 183-195.

133. Levine, M. Thrombosis in cancer patients / M.Levine, A. Rickles, A. Kakkar

// Thrombosis and Haemostasis. – 1997. – Vol. 78. – P. 607-611.

134. Li, C.Y. Initial stages of tumor cell-induced angiogenesis: evaluation via

skin window chambers in rodent models / C.Y. S. Li, Shan, Q. Huang [et all] // The

Journal of the National Cancer Institute. – 2000. – Vol. 92(2). – P. 143-147.

135. Li, W. High expression of Notch ligand Jagged2 is associated with the

metastasis and recurrence in urothelial carcinoma of bladder / W. Li, M. Liu, Y.

Feng [et all] // International Journal of Clinical and Experimental Pathology. –

2013. – Vol. 6(11). – P. 2430-2440.

136. Liu, Z. Dll4-Notch signaling in regulation of tumor angiogenesis / Z. Liu, F.

Fan, A. Wang [et all] // Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. – 2014.

– Vol. 140(4). – P. 525-536.

137. Liu, Z.J. Regulation of Notch1 and Dll4 by vascular endothelial growth

factor in arterial endothelial cells: implications for modulating arteriogenesis and

118

angiogenesis / Z.J. Liu, T. Shirakawa, Y. Li [et all] // Molecular and Cellular

Biology. – 2003. – Vol. 23(1). – P. 14-25.

138. Lockwood, CJ. Mechanisms of normal and abnormal endometrial bleeding /

C.J. Lockwood // Menopause. – 2011. – Vol. 18(4). – P. 408-411.

139. Lyman, G.H. Thrombosis and cancer: emerging data for the practicing

oncologist / G.H. Lyman, A.A. Khorana, A. Falanga // American Society of

Clinical Oncology Educational Book. – 2013. – P. 337-345.

140. Maione, P. Treating advanced non-small cell lung cancer in the elderly / P.

Maione, A. Rossi, P.C. Sacco [et all] // Therapeutic Advances in Medical

Oncology. – 2010. – Vol. 2(4). – P. 251-260.

141. Maisonpierre, P.C. Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts

in vivo angiogenesis / P.C. Maisonpierre, C. Suri, P.F. Jones// Science – 1997. –

Vol. 277. – P. 55-60.

142. Mantovani, A. The origin and function of tumor-associated macrophages /

A. Mantovani, B. Bottazzi, F. Colotta [et all] // Immunology Today. – 1992. – Vol.

13. – P. 265-270.

143. Maqsood, M.I. Immortality of cell lines: challenges and advantages of

establishment / M.I. Maqsood, M.M. Matin, A.R. Bahrami [et all] // Cell Biology

International. – 2013. – Vol. 37(10). – P. 1038-1045.

144. Marco, P. Biomolecular markers in cancer-associated thromboembolism / P.

Marco, A. Marco // Medicina clínica Facultad de Medicina de Barcelona. – 2015.

– Vol. 144(1). – P. 21-25.

145. Mattern, J. Association of vascular endothelial growth factor expression with

tumor cell proliferation in ovarian carcinoma / J. Mattern, G. Stammler, R.

Koomagi // Anticancer Research. – 1997. – Vol. 17(1B). – P. 621-624.

146. Maurer, B. Vascular endothelial growth factor aggravates fibrosis and

vasculopathy in experimental models of systemic sclerosis / B. Maurer, A. Distler,

Y.A. Suliman [et all] // Annals of the Rheumatic Diseases. – 2014. – Vol. 73(10).

– P. 1880-1887.

119

147. McCarthy, M.J. The endothelial receptor tyrosine kinase tie-1 is upregulated

by hypoxia and vascular endothelial growth factor / M.J. McCarthy, M. Crowther,

P.R. Bell [et all] // FEBS Letters. – 1998. – Vol. 423(3). – P. 334-338.

148. McMahon, B.J. Components of the Plasminogen-Plasmin System as

Biologic Markers for Cancer / B.J. McMahon, H.C. Kwaan // Advances in

Experimental Medicine and Biology. – 2015. – Vol. 867. – P. 145-156.

149. McMahon, S. Mutational patterns in the breast cancer mitochondrial

genome, with clinical correlates / S. McMahon, T. Laframboise // Carcinogenesis.

– 2014. – Vol. 35(5). – P. 1046-1054.

150. Mege, D. Microparticles and cancer thrombosis in animal models / D. Mege,

S. Mezouar, F. Dignat-George [et all] // Thrombosis Research. – 2016. – Vol.

140(1). – P. 21-26.

151. Mego, M. Relationship between circulating tumor cells, blood coagulation,

and urokinase-plasminogen-activator system in early breast cancer patients / M.

Mego, M. Karaba, G. Minarik [et all] // The Breast Journal – 2015. – Vol. 21(2). –

P. 155-160.

152. Mohri, Y. Clinical correlations and prognostic relevance of tissue angiogenic

factors in patients with gastriccancer / Y. Mohri, C. Miki, K. Tanaka [et all] //

Clinical Oncology. – 2012. – Vol. 24(9). – P. 610-616.

153. Morita, S. Cancer cells overexpress mRNA of urokinase-type plasminogen

activator, its receptor and inhibitors in human non-small-cell lung cancer tissue:

analysis by Northern blotting and in situ hybridization / S. Morita, A. Sato, H.

Hayakawa [et all] / International Journal of Cancer. – 1998. – Vol. 78(3). – P. 286-

292.

154. Muñoz-Chápuli, R. Cellular precursors of the coronary arteries / R. Muñoz-

Chápuli, M. González-Iriarte, R. Carmona [et all] // The Texas Heart Institute

Journal. – 2002. – Vol. 29(4). – P. 243-249.

120

155. Nehls, V. Pericyte involvement in capillary sprouting during angiogenesis in

situ / V. Nehls, K. Denzer, D. Drenckhahn // Cell and Tissue Research. – 1992. –

Vol. 270(3). – P. 469-474.

156. Nielsen, V.G. Tissue-type plasminogen activator-induced fibrinolysis is

enhanced in patients with breast, lung, pancreas and colon cancer / V.G. Nielsen,

R.W. Matika, M.L. Ley [et all] // Blood Coagulation & Fibrinolysis. – 2014. – Vol.

25(3). – P. 248-253.

157. Noble, S. Epidemiology and pathophysiology of cancer-associated

thrombosis / S. Noble, J. Pasi // British Journal of Cancer. – 2010. – Vol. 102,

Suppl. 1. – P. 2-9.

158. O'Donnell, R.K. VEGF-A/VEGFR Inhibition Restores Hematopoietic

Homeostasis in the Bone Marrow and Attenuates Tumor Growth / R.K. O'Donnell,

B. Falcon, J. Hanson [et all] // Cancer Research. – 2016. – Vol. 76(3). – P. 517-

524.

159. Ogawa, R. NOTCH1 Expression Predicts Patient Prognosis in Esophageal

Squamous Cell Cancer / R. Ogawa, H. Ishiguro, M. Kimura [et all] // European

Surgical Research. – 2013. – Vol. 51(3-4). – P. 101-107.

160. Olsson, A.K. VEGF receptor signalling - in control of vascular function /

A.K. Olsson , A. Dimberg, J. Kreuger [et all] // Nature Reviews Molecular Cell

Biology. – 2006. – Vol. 7(5). – P. 359-371.

161. Oltmanns, K. Divergent effects of hyper- and hypoglycemia on circulating

vascular endothelial growth factor in humans / K. Oltmanns, U.H. Melchert, H.G.

Scholand-Engler [et all] // Metabolism. – 2008. – Vol. 57(1). – P. 90-94.

162. Ornsein, D.L. The use of heparin for treating human malignancies / D.L.

Ornsein, L.R. Zacharski // Haemostasis. – 1999. – Vol. 29 Suppl S1. – P. 48-60.

163. Ourradi, K. VEGF isoforms have differential effects on permeability of

human pulmonary microvascular endothelial cells / K. Ourradi, T. Blythe, C.

Jarrett [et all] // Respiratory Research. – 2017. – Vol. 18(1). – P. 116.

121

164. Perez-Atayde, A.R. Spectrum of tumor angiogenesis in the bone marrow of

children with acute lymphoblastic leukemia / A. R. Perez-Atayde, S.E. Sallan, U.

Tedrow [et all] // American Journal of Pathology. –1997. – Vol. 150(3). – P. 815-

821.

165. Pintucci, G. Mechanical endothelial damage results in basic fibroblast

growth factor-mediated activation of extracellular signal-regulated kinases / G.

Pintucci, B.M. Steinberg, G. Seghezzi // Surgery. – 1999. – Vol. 126(2). – P. 422-

427.

166. Poole, T.J. Vasculogenesis and angiogenesis: two distinct morphogenetic

mechanisms establish embryonic vascular pattern / T.J. Poole, J.D. Coffin //

Journal of Experimental Zoology. – 1989. – Vol. 251(2). – P. 224-231.

167. Potente, M. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis / M. Potente, H.

Gerhardt, P. Carmeliet // Cell. – 2011. – Vol. 146(6). – P. 873-887.

168. Prandoni, P. Cancer and venous thromboembolism / P. Prandoni, F. Falanga,

A. Piccioli // Lancet Oncology. – 2005. – Vol. 6. – P. 401-410.

169. Radtke, F. The Notch 'gospel'. / F. Radtke, F. Schweisguth, W. Pear // EMBO

Reports. – 2005. – Vol. 6(12). – P. 1120-1125.

170. Rafii, S. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-

angiogenesis therapy? / S. Rafii, D. Lyden, R. Benezra // Nature Reviews Cancer.

– 2002. – Vol. 2. – P. 826-835.

171. Ramsauer, M. Getting Tie(2)d up in angiogenesis / M. Ramsauer, P.A.

D'Amore // Journal of Clinical Investigation. – 2002. – Vol. 110(11). – P. 1615-

1617.

172. Ribatti, D. History of research on angiogenesis / D. Ribatti // Chemical

Immunology and Allergy. – 2014. – Vol. 99. – P. 1-14.

173. Rickles, F.R. Molecular basis for the relationship between thrombosis and

cancer / F.R. Rickles, A. Falanga // Thrombosis Research. – 2001. – Vol. 102(6).

– P. 215-224.

122

174. Roberts, E. The Role of Vascular Endothelial Growth Factor in Metastatic

Prostate Cancer to the Skeleton / E. Roberts, D.A. Cossigny, G.M. Quan // Prostate

Cancer. – 2013. 2013:418340

175. Robinson, C.J. The splice variants of vascular endothelial growth factor

(VEGF) and their receptors / C.J. Robinson, S.E. Stringer // Journal of Cell Science.

– 2001. – Vol. 114(Pt 5). – P. 853-865.

176. Robinson, E.S. Suppression of the nitric oxide pathway in metastatic renal

cell carcinoma patients receiving vascular endothelial growth factor-signaling

inhibitors / E.S. Robinson, E.V. Khankin, T.K. Choueiri [et all] // Hypertension. –

2010. – Vol. 56(6). – P. 1131-1136.

177. Robinson, S.D. Alphav beta3 integrin limits the contribution of neuropilin-1

to vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis / S.D. Robinson, L.E.

Reynolds, V. Kostourou // Journal of Biological Chemistry. – 2009. – Vol.

284(49). – P. 33966-33981.

178. Sallah, S. Venous thrombosis in patients with solid tumors: determination of

frequency and characteristics / S. Sallah // Thrombosis and Haemostasis. – 2002. –

Vol. 87. – P. 575-579.

179. Salven, P. A high pretreatment serum vascular endothelial growth factor

concentration is associated with poor outcome in non-Hodgkin's lymphoma / P.

Salven, L. Teerenhovi, H. Joensuu // Blood. – 1997. – Vol. 90(8). – P. 3167-3172.

180. Sampson, M.T. Coagulation proteases and human cancer / M.T. Sampson,

A.K. Kakkar // Biochemical Society Transactions. – 2002. – Vol. 30. – P. 201-

217.

181. Sato, S. Bevacizumab and ovarian cancer / S. Sato, H. Itamochi // Current

Opinion in Obstetrics and Gynecology. – 2012. – Vol. 24(1). – P. 8-13.

182. Senger, D.R. Stimulation of endothelial cell migration by vascular

permeability factor/vascular endothelial growth factor through cooperative

mechanisms involving the alphavbeta3 integrin, osteopontin, and thrombin / D.R.

123

Senger, S.R. Ledbetter, K.P. Claffey [et all] // American Journal of Pathology. –

1996. – Vol. 149(1). – P. 293-305.

183. Shalaby, F. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-

deficient mice / F. Shalaby, J. Rossant, T.P. Yamaguchi [et all] // Nature. – 1995.

– Vol. 376(6535). – P. 62-66.

184. Shao, H. Targeting Notch signaling for cancer therapeutic intervention / H.

Shao, Q. Huang, Z.J. Liu [et all] // Advances in Pharmacology. – 2012. – Vol. 65.

– P. 191-234.

185. Sharifpanah, F. Stimulation of vasculogenesis and leukopoiesis of

embryonic stem cells by extracellular transfer RNA and ribosomal RNA / F.

Sharifpanah, S. De Silva, M.M. Bekhite [et all] // Free Radical Biology and

Medicine. – 2015. – Vol. 89. – P. 1203-1217.

186. Sharpe, K. The Effect of VEGF-Targeted Therapy on Biomarker Expression

in Sequential Tissue from Patients with Metastatic Clear Cell Renal Cancer / K.

Sharpe, G.D. Stewart, A. Mackay [et all] // Clinical Cancer Research. – 2013. –

Vol. 19(24). – P. 6924-6934.

187. Silvis, S.M. Cancer and risk of cerebral venous thrombosis: a case-control

study / S.M. Silvis, S. Hiltunen, E. Lindgren // Journal of Thrombosis and

Haemostasis. – 2018. – Vol. 16(1). – P. 90-95.

188. Sorensen, H.T. Prognosis of cancers associated with venous

thromboembolism / H.T. Sorensen, L. Mellemkjaer, J. H. Olsen // New England

Journal of Medicine. – 2000. – Vol. 343. – P. 1846-1850.

189. Sprindzuk, V.M. Angiogenesis in thyroid malignant neoplasm: State of the

art and advances of the modern digital pathology and nanotechnology / V.M.

Sprindzuk // Journal of Clinical Pathology and Forensic Medicine. – 2010. – Vol.

1(3). – P. 16-34.

190. Stewart, BW. World Cancer Report 2014 / B.W. Stewart, C.W.Wild // ISBN

978-92-832-0429-9

124

191. Stratmann, A. Cell type-specific expression of angiopoietin-1 and

angiopoietin-2 suggests a role in glioblastoma angiogenesis / A. Stratmann, W.

Risau, K.H. Plate // American Journal of Pathology. – 1998. – Vol. 153(5). – P.

1459-1466.

192. Suchting, S. The Notch ligand Delta-like 4 negatively regulates endothelial

tip cell formation and vessel branching / S. Suchting, C. Freitas, F. le Noble [et all]

// Proceedings of the National Academy of Sciences of U S A. – 2007. – Vol.

104(9). – P. 3225-3230.

193. Takebe, N. Targeting Notch signaling pathway in cancer: Clinical

development advances and challenges / N. Takebe, D. Nguyen, SX. Yang //

Pharmacology & Therapeutics. – 2014. – Vol. 141(2). – P. 140-149.

194. Tan, Y.Z. CD34+ VEGFR-3+ progenitor cells have a potential to

differentiate towards lymphatic endothelial cells / Y.Z. Tan, H.J. Wang, M.H.

Zhang [et all] // Journal of Cellular and Molecular Medicine. – 2014. – Vol. 10(2).

– P. 160-170.

195. Thielemann, A. High concentration of urokinase-type plasminogen activator

receptor in the serum of women with primary breast cancer / A. Thielemann, A.

Baszczuk, P. Kopczyński [et all] // Contemporary Oncology. – 2013. – Vol. 17(5)

– P. 440-445.

196. Thornton, A.D. Angiogenesis inhibition with bevacizumab and the surgical

management of colorectal cancer / A.D. Thornton, P. Ravn, M. Winslet [et all] //

British Journal of Surgery Society. – 2006 – Vol. 93(12). – P.1456-1463.

197. Thornton, S. Urokinase plasminogen activator and receptor promote

collagen-induced arthritis through expression in hematopoietic cells / S. Thornton,

H. Raghu, C. Cruz // Blood Advances. – 2017. – Vol.1(9). – P. 545-556.

198. Trousseau, A. Phlegmasia alba dolens / A. Trousseau // Clinique Medicale

de l’HotelDieu de Paris. Vol 3. – Paris: Balliere, 1865. – Р. 654-712.

125

199. Wellmann, S. Activation of the HIF pathway in childhood ALL, prognostic

implications of VEGF / S. Wellmann, M. Guschmann, W. Griethe [et all] //

Leukemia. – 2004. – Vol. 18(5). – Р. 926-933.

200. Werther, K. Prognostic impact of matched preoperative plasma and serum

VEGF in patients with primary colorectal carcinoma / K. Werther, I.J. Christensen,

H.J. Nielsen // British Journal of Cancer. – 2002. – Vol. 86(3). – P. 417-423.

201. Williams, C.K. Up-regulation of the Notch ligand Delta-like 4 inhibits

VEGF-induced endothelial cell function / C.K. Williams, J.L. Li, M. Murga [et all]

// Blood. – 2006. – Vol. 107(3). – P. 931-939.

202. Yakar, S. The role of the growth hormone/insulin-like growth factor axis in

tumor growth and progression: Lessons from animal models / S. Yakar, D. Leroith,

P. Brodt // Cytokine Growth Factor Reviews. – 2005. – Vol. 16. – P. 407-420.

203. Ye, P. Hypoxia-Induced Deregulation of miR-126 and Its Regulative Effect

on VEGF and MMP-9 Expression / P. Ye, J. Liu, F. He // International Journal of

Medicine Science. – 2013. – Vol. 11(1). – P. 17-23.

204. Yoo, S.Y. Angiogenesis and its therapeutic opportunities / S. Y. Yoo, S.M.

Kwon // Mediators Inflammation. – 2013:2013:127170.

205. Yu, Z. Cancer stem cells / Z. Yu, T.G. Pestell, M.P. Lisanti [et all] //

International Journal of Biochemistry & Cell Biology. – 2012. – Vol. 44(12). – P.

2144-2151.

206. Zamorano, J.L. 2016 ESC Position Paper on cancer treatments and

cardiovascular toxicity developed under the auspices of the ESC Committee for

Practice Guidelines: The Task Force for cancer treatments and cardiovascular

toxicity of the European Society of Cardiology (ESC) / J.L. Zamorano, P.

Lancellotti, D. Rodriguez Munoz [et all] // European Heart Journal. – 2016. – Vol.

37(36). – P. 2768-2801.

207. Zarrin, B. Acquired tumor resistance to antiangiogenic therapy: Mechanisms

at a glance / B. Zarrin, F. Zarifi, G. Vaseghi, S.H. Javanmard // Journal of Research

in Medical Sciences. – 2017. – Vol. – P. 117.

126

208. Zhang, Z. Expression of angiopoietin-2 gene in non-small cell lung cancer /

Z. Zhang, L. Xing, Y. Xu // Journal of Huazhong University of Science and

Technology. Medical Sciences. – 2003. – Vol. 23(4) – P. 362-364.

209. Zhang, L. Wild-type p53 suppresses angiogenesis in human leiomyosarcoma

and synovial sarcoma bytranscriptional suppression of vascular endothelial growth

factor expression / L. Zhang, D. Yu, M. Нu [et all] // Cancer research. – 2000. – P.

3655-3661.

210. Zhao, W. Binding affinities of vascular endothelial growth factor (VEGF)

for heparin-derived oligosaccharides / W. Zhao, S.A. McCallum, Z. Xiao [et all] //

Bioscience Report. – 2012. – Vol. 32(1). – P. 71-81.