逐次的構造変化による多状態 dna 機械とその二次構造設計

逐次的構造変化による多状態 DNA 機械とその二次構造設計

萩谷研　修士２年上嶋裕樹

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目次

技術的背景と既存研究分子レベルの multi-state machine (CREST, JST)

分子機械の二次構造設計の概要（中間発表分）二次構造変化経路の予測アゾベンゼンを利用した DNA 二重鎖形成の光制御まとめと今後の課題

技術的背景と既存研究



DNA の二次構造と熱力学モデル（１）

nearest neighbor モデル (Zimm et al., 1964) 隣接した塩基対や mismatch の組による stacking エ

ネルギー等を加算する。folding 問題 (Zuker et al., 1981)inverse folding 問題 (Hofacker et al., 1994) fold 関数を評価関数とする探索問題

5’ 3’TTC…GCA

3’5’塩基配列（一次構

造）二次構造

folding

inverse folding

DNA の二次構造と熱力学モデル（２）

sub-optimal 構造の探索 (Wuchty et al., 1999) mfe+δ 以下の自由エネルギーの構造（ sub-optimal 構

造）を，網羅的に見つける。partition function の計算 (McCaskill, 1990)

構造の出現頻度の計算Vienna RNA Package （各アルゴリズムの実装）(Hofacker et al., 1994)二次構造間のエネルギー障壁の予測(Flamm et al., 2000)

DNA computing

DNA 分子による分子レベルの超並列計算 (Adleman, 1994)DNA nanotechnology(DNA nanomachine) molecular tweezer

(Yurke et al., 2000) DNA の B-Z 遷移に基づく DNA

motor (Seeman et al., 1999)

bistable な二次構造を持つ RNA 塩基配列の設計 (Flamm et al., 2001)

分子レベルのmulti-state machine



逐次的に状態変化する分子機械

入力１

入力２

入力３

２

１

２

３

１

３

３３

１

２

……

……

……

分子機械の設計目標

DNA oligomer の投入により，連続したヘアピン構造が逐次的に開裂動作する分子機械既存の二次構造設計との違い単一の配列ではなく，複数種類の配列の複合体に

よる，構造変化を前提とする二次構造（分子機械の二次構造設計）

複数の安定な構造をもちうる，大規模な二次構造（適切な sub-optimal 構造の出現頻度の考慮）

構造変化経路に強く依存する分子機械の二次構造（構造変化経路の考慮）

分子機械の二次構造設計の概要（中間発表分）



分子機械の動作特性に基づく二次構造設計

分子機械の動作の本質を単純な規則に還元し，それをみたす配列セットを設計する。連続ヘアピン構造の逐次的開裂モデルでは，次の性質が保たれることを検証する。順序性：

ヘアピンが端から順番に開裂する性質選択性：

ヘアピンがそれに適合する oligomer によってのみ開裂する性質

出現頻度を考慮すべき適切な sub-optimal 構造とは

mfeδ

二次構造

自由エネルギー

sub-optimal な二次構造の集合目標構造

出現頻度を考慮する構造

分子の構造変化経路

ΔG1

ΔG2

二次構造

ΔG1 の最小化⇒構造変化の高速化

妥当な変化経路の予測が必要

局所最適最短経路

大域最適最短経路

大域最適経路

自由エネルギー

二次構造変化経路の予測



構造変化の最適経路課題：配列評価に構造変化経路を用いるには，十分に高速で正確な経路予測が必要。探索空間が広いので単純な探索は使えない。

局所最適最短経路初期構造から最終構造への最短経路に限定し，各１段

階の構造変化の自由エネルギー増加が最小になるように経路を生成していく。

大域最適最短経路初期構造から最終構造への最短経路を M-H 法 (Morgan

et al., 1998) に従って生成し，そのうち ΔG1 が最小のものを近似解とする。

Morgan と Higgs による構造変化経路予測アルゴリズム

B の塩基対

incompatibleな A の塩基対

６１，２７２８３９３，４１０４，５

（ B の）塩基対のうち， incompatible な（ A の）塩基対の数が少ないものから作っていくようにする。

oligomer が割り込むときの山の高さ・谷の深さ

(α)

(β)

ΔG1

ΔG2

山の高さ ΔG1 > B (= 4.0kcal/mol) かつ谷の深さ ΔG2 < V (= 3.0kcal/mol)

M-H 法で質のよい経路が線形の時間で求められるようになった。⇒配列設計に使えるようになった。

グラフに対するアルゴリズムに変換

６

７

８

９

１０

１

２

３

４

５

B　　　　　　　　　 A

1. A の頂点を１つ消す。

2. その頂点から出ていた辺を消す。

3. B の頂点のうち，辺の出ていないものがあれば，それを消す。

4. 以上を繰り返して，全ての頂点が消えるまで続ける。

塩基対は頂点，依存関係は辺　⇒　二部グラフになる

M-H 法で山の高さが最小にならない例

M-H 法による経路山の高さ = 5

別の経路山の高さ = 4

8

9

10

11

12

13

14

1

2

3

4

5

6

7

B　　　　　　　　　 A

例に対応する二次構造

1234

5 6 7

89

101112

13

14

(A) (B)

構造変化経路予測により得られた知見

ヘアピン構造の開裂のような単純な構造変化では，局所的最適化も大域的最適化に似た経路を見つける。（ただし最短経路に限定）単純なエネルギー地形である。

塩基対の個数のみに着目した M-H 法は，効率よく性質のよい経路を見つける。二次構造の自由エネルギーは塩基対の個数により近

似できる。M-H 法の二部グラフを連結成分に分解することにより，よりよい経路を生成するようにアルゴリズムを改良できる。

アゾベンゼンを利用したDNA 二重鎖形成の光制御



DNA へのアゾベンゼンの導入

DNA に挿入されたアゾベンゼンの状態により， hybridization の安定度が変化する。 (Asanuma et al., 1999)

アゾベンゼン込み hybridization のモデル化

課題：アゾベンゼンを含む DNA 二重鎖のモデルはまだない。どのようなモデルが物理的に妥当か。また計算に適しているか。

アゾベンゼンが stacking 中に存在することにより，その stacking energy を変化させている。局所的な stacking energy の変化

その他いくつかの仮定をして，普通の hybridization の自由エネルギーから，アゾベンゼンによるエネルギーの変化量を推定した。 trans の場合と cis の場合それぞれ

アゾベンゼンのVienna RNA への導入

課題：ライブラリの持つ一般性を失わず，かつ計算の効率を落とさないで，いかに単純にアゾベンゼンを扱えるようにすることができるか。

入出力ではアゾベンゼンを X と表し，あたかも１つの特殊な塩基であるかのように扱う。ただしそれは塩基対を作らない塩基である。

内部では（１塩基 bulge などではなく） stacking energy の局所的な変化として扱う。

アゾベンゼン込み hybridization に関連するプログラムの試作

アゾベンゼンをいくつかインターカレートした DNA/RNA 分子で，アゾベンゼンが transのときと cis のときで，最小自由エネルギーの二次構造が異なるような塩基配列を設計する。入力：２つの互いに異なった二次構造 (S1, S2) 出力：アゾベンゼンをインターカレートした DN

A/RNA 分子の塩基配列配列の条件：アゾベンゼンが trans のとき S1 が最

小自由エネルギー構造となり， cis のとき S2 が最小自由エネルギー構造となる。

アゾベンゼンにより bistableな二次構造を持つ配列の例

CUUGUGGCUUGUXUUGAAGCCGGUCCUAGACGGGCCGCAAG

cistrans

まとめと今後の課題



まとめ（１）

対象となるシステムに合った，配列設計方法の定式化。特に選択性と順序性の定義。各最適化を行なう，自動配列設計プログラム "DNAhairpin" の実装。大域最適最短経路の予測を含む。設計した配列の DNA を利用し，連続ヘア

ピン構造の逐次的開裂の実験が北大で行なわれつつある。

DNAhairpin

連続したヘアピン構造の逐次的開裂モデル用の二次構造設計プログラム熱力学計算には Vienna RNA Package を利用

分子機械の動作特性，選択性と順序性に基づいて配列を評価する。partition function を利用し，適切な二次構造の熱力学的出現頻度を計算する。適切な sub-optimal 構造の出現頻度総和の計算

構造変化経路予測によるエネルギー障壁の高さに基づき，配列セットの最適化を行う。

配列セットの例madrid:41% time ./DNAhairpin*##4.510002 2.820000

ordinality min barrier height: 4.510002ordinality max valley depth: 2.820000

((((((((((((((((((((.......))))))))))))))))))))GGCGTCTTATCTAGGGATCGCTTATGACGATCCCTAGATAAGACGCC -23.340000AACCGTGGTGTAGGGTTAGGCATAGATCCTAACCCTACACCACGGTT -23.270000CTGCTCGTTTGATTCGTCTCACGACTGGAGACGAATCAAACGAGCAG -23.400000

selectivity (open): 0.424054 0.825627selectivity (closed): 0.331199 0.689463ordinality: 0.006577 0.66700552.76u 0.00s 0:53.13 99.3%madrid:42%

まとめ（２）

アゾベンゼンを含む DNA 分子の hybridization に関するモデルの提案と， Vienna RNA への実装。アゾベンゼンにより bistable な構造をもつ

配列を設計するプログラムの試作。

今後の課題

配列最適化基準を，より一般の二次構造設計に適用できるように定式化。別の二次構造設計にも対応できるように，プログラ

ム実装を一般化（ライブラリー化）配列最適化基準の妥当性の検討。生物化学実験との比較計算機シミュレーション

モンテカルロ法計算理論的な解析

構造変化経路のより詳細な解析と，エネルギー障壁以外の要素も利用した反応の最適化。

逐次的構造変化による 多状態 dna 機械と その二次構造設計

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