ФИРСОВ АЛЕКСЕЙ ПЕТРОВИЧ
DESCRIPTION
ФИРСОВ АЛЕКСЕЙ ПЕТРОВИЧ С.Н.С. ЛАБОРАТОРИИ ЭКСПРЕССИОННЫХ СИСТЕМ И МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА РАСТЕНИЙ (БИОТРОН) ФИЛИАЛА ИБХ РАН. Тема исследований: «Разработка систем синтеза рекомбинантных белков на основе растительных экспрессионных платформ (биофарминг)», включая - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
ФИРСОВ АЛЕКСЕЙ ПЕТРОВИЧС.Н.С. ЛАБОРАТОРИИ ЭКСПРЕССИОННЫХ СИСТЕМ И МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА РАСТЕНИЙ (БИОТРОН) ФИЛИАЛА ИБХ РАН
• Тема исследований: «Разработка систем синтеза рекомбинантных белков на основе растительных экспрессионных платформ (биофарминг)», включая
• Конструирование трансформационных векторов и экспрессионных кассет • Генетическая трансформация объектов исследований для получения трансгенных
растений-продуцентов рекомбинантных протеинов. • Молекулярно-биологический анализ полученных трансгенных растений. • Анализ экспрессии целевых протеинов.
Основные направления проводимых исследований: •Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с β-глюкуронидазой или субъединицей В рицина в трансгенных растениях табака и ряски малой с целью разработки съедобных вакцин•Экспрессия сверхсладкого белка тауматина II в трансгенных растениях томата•Анализ устойчивости трансгенных растений к фитопатогенным вирусам
М130 MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDPLVVAAPGGQSLMLRP ~~~ KRWTGMNFGEKPQQGGKQ*М122 MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSPGGQSLMLRP ~~~ KRWTGMNFGEKPQQGGKQ*
LB nos β-глюкуронидаза 35S CaMV nos NPT II nos RB ter prom ter prom
XbaIBamHI
84 кДа
К- К+ м1 м2 м3 М
А2A1
Вестерн-блот анализ трансгенных растений табака, полученных после трансформации вектором pBIM130. Рис. А1- с использованием антител к β-глюкуронидазе, рис.А2 – антител к пептиду М2е. М- маркер молекулярной массы, К- - нетрансгенное растение, К+- трансгенное растение трансформированное вектором pBI121, м1, м2 и м3- различные трансгенные линии. Красной стрелкой показан слитый белок М2е-β-глюкуронидаза.
Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с β-глюкуронидазой в трансгенных растениях табака, трансформированных векторами pBIM130 и pBIM122
Структура экспрессионных кассет векторов pBIM130 и pBIM122. Красным шриф-том показана аминокислот-ная последовательность пептида М2е
м1 м2 К- М м3 К+
84 кДа
т1 т2 т3 К- М
Б184 кДа 84 кДа
т1 т2 т4 К1 М т6 т3 К1 М
Б2
Вестерн-блот анализ трансгенных растений табака, полученных после трансформации вектором pBIM122. Рис. Б1- с использованием антител к β-глюкуронидазе, рис. Б2 – антител к пептиду М2е. М- маркер молекулярной массы, К- - нетрансгенное растение, К1 - растение, трансформированное вектором pBI121, т1-т6- различные трансгенные линии. Красной стрелкой показан слитый белок М2е-β-глюкуронидаза.
Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с β-глюкуронидазой в трансгенных растениях ряски малой (Lemna minor), трансформированных вектором pBIM130.
А 71 60 54 51 К+ 50 18 17 13 М
Б50 49 26 18 К+ 17 16 К- М 13
В 72 70 69 К+ 66 65 К- М 54 51
Вестерн-блот анализ трансгенных растений ряски, полученных после трансформации вектором pBIM130. А- с использованием антител к β-глюкуронидазе, Б и В-антител к пептиду М2е. М- маркер молекулярной массы, К- - нетрансгенное растение, К+- трансгенное растение, трансформированное вектором pBI121, цифрами обозначены различные трансгенные линии ряски. Стрелкой показан слитый белок М2е-β-глюкуронидаза.
Содержание слитого белка М2е- β- глюку-ронидаза в трансгенных растениях ряски малой , % от ОРБ.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
соде
ржан
ие М
2е-
β- гл
юку
рони
дазы
, % О
РБ
K+ K- 13 17 18 50 51 54
Экспрессия пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с субъединицей В рицина (RTB) в трансгенных растениях табака и ряски малой, трансформированных вектором pBI-M2eRTB.
pBI -M2eRTB14026 bp
nptII
T-DNA RB
CBDM2e
RTBPR1 SP
T-DNA LB
Rep Origin 2
promoter NOS
promoter 35S CaMV
Rep Origin 1
terminator NOS
terminator NOS
Схематическая карта вектора pBI-M2eRTB. PR1 SP- сигнальный пептид PR1 белка табака, RTB- субъединица В рицина, M2e- N-концевой фрагмент белка М2 (30 а.к.), включающий пептид М2е, CBD- хитин-связывающий домен хитиназы А.
А Б
Вестерн блот анализ препаратов общего растворимого белка трансгенных линий табака с использованием антител к RTB (A) и M2e (Б). T1- T14- трансгенные линии, K- не транс-формированное растение табака, R+- рицин, экстрагированный из семян клещевины, M2+- пептид M2e экспрессированный в E. coli в слиянии с интеином (вектор pTYB11). Стрелки показывают слитый белок RTB-M2е.
M T14 T7 T5 T4 T3 T2 T1 M2+ K-M R+ T14 T7 T5 T4 T3 T2 T1 K-
K- L101 L 83 L60 L57 L48 L 41 L34 M K-
L12 M L88a L59 L46 L43 L36 L24a L7b К-
Вестерн блот анализ препаратов общего растворимого белка трансгенных линий ряски с использованием антител к пептиду M2e. L- различные трансгенные линии, K- не трансформированные растения ряски, Стрелки показывают слитый белок RTB-M2е.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
трансгенные линии
мкг
RTB
-M13
0-CB
D/г с
ыро
го в
еса
В
Количественная асиалофетуин-ИФА препаратов общего белка из трансгенных растений табака и ряски. А. Концентрационная зависимость связы-вания рицина с иммобилизованным асиалофе-туином. В, С. Накопление слитого белка RTB-М2е-CBD в трансгенных растениях табака (В) и ряски (С). Использовались антитела к RTB, экви-валент RTB-М2е-CBD был вычислен исходя из графика концентрационной зависимости связыва-ния рицина с иммобилизованным асиалофетуином (А). К- нетрансформированное растение.
R2 = 0,9637
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 20 40 60 80 100 120
ng ricin/well
OD4
05, u
nit
А
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
K- T1 T2 T3 T4 T7 T10 T14 T15
трансгенные линии
мкг
RTB
-M13
0-CB
D/г с
ыро
го в
есаБ
Связывание слитого белка RTB-М2е-CBD с асиалофетуином, иммобилизованным на CNBr-активированной сефарозе (Donayre-Torres et al., 2009). Препарат общего белка из трансгенных растений табака пропускали через колонку с иимобилизованным асиало-фетуином. После промывки связанный с асиалофетуином слитый белок снимали глици-ном (рН4,0). А. Электрофорез двух фракций в 12,5% ПААГ. Б. Вестерн-блот анализ фракций этих же фракций с использованием антител к RTB. Стрелками показан слитый белок RTB-М2е-CBD.
А Б
Анализ экспрессии пептида М2е вируса гриппа птиц H5N1 трансляционно слитого с субъедини-цей В рицина (RTB) в трансгенных растениях табака и ряски малой, трансформированных вектором pBI-M2eRTB.